CN112679489B - N-磺酰基杂环衍生物及其制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了N‑磺酰基杂环衍生物及其制药用途。该N‑磺酰基杂环衍生物的结构如式I所示。实验表明，本发明提供的化合物能够有效抑制乙型肝炎病毒核心蛋白组装和乙型肝炎病毒的复制。本发明提供的化合物在制备乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂、抗乙型肝炎病毒的药物、以及预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病(例如乙型肝炎、肝硬化、肝癌)的药物中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于化学医药领域，具体涉及一类N-磺酰基杂环衍生物，及其在制备病毒核心蛋白组装抑制剂和抗乙型肝炎病毒感染相关疾病的药物中的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝DNA病毒科。全球乙肝病毒携带者约有3.5亿，我国8-9％的人群(约1.2亿人)处于乙肝病毒携带状态。乙肝病毒携带者可能发展为慢性乙型肝炎患者，慢性乙型肝炎患者与普通人群相比，发生肝硬化、肝癌的风险更高，每年约100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。因此，治疗慢性HBV感染，阻止其致死性后果是事关公共健康的重要任务。
目前，治疗HBV感染引起的乙型肝炎的主要方法为利用干扰素抑制病毒复制，这种干扰素能够与细胞膜接触并激活靶细胞抗病毒蛋白基因,产生一种特殊的蛋白质,即抗病毒蛋白,此蛋白可抑制HBV病毒mRNA的信息传递,从而阻止病毒在宿主细胞内繁殖。研究还发现，阻断HBV核衣壳的形成是治疗乙型肝炎的新治疗策略。HBV核衣壳由核心蛋白组装形成，HBV逆转录酶和前基因组RNA(pgRNA)被包裹在核衣壳内。因此，研究能够有效抑制乙型肝炎病毒核心蛋白组装的化合物对抗乙型肝炎病毒，以及治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病(例如乙型肝炎、肝硬化、肝癌)具有非常重要的意义。
目前，用于治疗乙型肝炎的药物包括核心蛋白组装抑制剂Bay 41-4109(未上市)、PEG-IFNα和核苷(酸)类似物(例如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、替诺福韦阿拉酚胺)。但是，Bay 41-4109对肝脏的毒副作用明显，大量服用对肝脏细胞功能有较大影响；核苷(酸)类似物虽然在大多数乙型肝炎患者中表现出较强的病毒抑制效果，但是，也存在停药后的反弹问题、长期用药筛选耐药突变株从而导致的耐药问题。
现有的药物还远不足以彻底解决乙型肝炎问题，因此，开发新型抗HBV的药物已成为目前乙型肝炎研究领域的当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一类N-磺酰基杂环衍生物，及其在制备乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂、抗乙型肝炎病毒的药物、以及预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病(例如乙型肝炎、肝硬化、肝癌)的药物中的用途。
本发明提供了式(I)所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途：
其中，n为0～5的整数；
R1选自取代或未取代的以下基团：芳基、杂芳基；所述取代基各自独立的选自卤代或未取代的C1～6烷基、卤代或未取代的C1～6烷氧基、卤素、C1～3烷基取代或未取代的3～6元饱和环烷基、C1～3烷基取代或未取代的3～6元饱和杂环基、C1～3烷基取代或未取代的3～6元不饱和环烷基、C1～3烷基取代或未取代的3～6元不饱和杂环基、L1CORb、L2COOR9、L3R10；其中L1为无或C1～4亚烷基，Rb为卤代或未取代的C1～6烷基、5～6元饱和杂环基，L2为无或C1～4亚烷基，R9为氢或C1～6烷基；L3为无、C1～4亚烷基或C2～4烯基，R10为C1～3烷基取代的苯基、卤素取代的苯基、苯基；
R2各自独立的选自氢、卤素、氰基、卤代或未取代的C1～6烷基、卤代或未取代的C1～6烷氧基；
X为C(Ra)2、O或S；Ra选自氢、C1～6烷基、C1～6烷氧基或卤素。
本发明还提供了式(I)所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物在制备乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂中的用途，式(I)如上所述。
进一步地，所述抗乙型肝炎病毒的药物或乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂为预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病的药物；优选的，所述乙型肝炎病毒感染相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌；
和/或，所述抗乙型肝炎病毒的药物或乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂是降低乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒DNA的水平，降低乙型肝炎病毒3.5kb前基因组RNA的水平，抑制乙型肝炎病毒的复制的药物。
进一步地，所述R1选自取代或未取代的以下基团：
所述取代基各自独立的选自卤代或未取代的C1～4烷基、卤代或未取代的C1～4烷氧基、卤素、L1CORb、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基、L2COOR9、其中L1为无或C1～4亚烷基，Rb为卤代或未取代的C1～4烷基，L2为无或C1～2亚烷基，R9为氢或C1～4烷基。
进一步地，所述化合物的结构如式II所示：
其中，当R8为氢、氰基、卤代或未取代的C1～4烷基、卤代或未取代的C1～4烷氧基时：
X为C(Ra)2、O或S；Ra选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R3选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R4选自氢、卤代或未取代的C1～4烷基、L1CORb、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基；L1为无或C1～4亚烷基，Rb为卤代或未取代的C1～4烷基；
R5选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R6为L2COOR9；L2为无或C1～2亚烷基，R9为氢或C1～4烷基；
R7为卤素；
当R8为卤素时：X为C(Ra)2、O或S；Ra选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R3为甲基；
R4为甲基；
R5为甲基；
R6为COOH或COOCH3；
R7为卤素；
优选的，所述化合物的结构如式III所示：
其中，R8选自氢、氰基、C1～4烷基或C1～4烷氧基；
X为CH2、O或S；
R4选自卤代或未取代的C1～2烷基、3～6元饱和环烷基；
R9为氢或C1～2烷基。
进一步地，所述化合物选自如下结构式之一：
本发明还提供了式II所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物：
其中，当R8为氢、氰基、卤代或未取代的C1～4烷基、卤代或未取代的C1～4烷氧基时：
X为C(Ra)2、O或S；Ra选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R3选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R4选自氢、卤代或未取代的C1～4烷基、L1CORb、3～6元饱和环烷基、3～6元饱和杂环基；L1为无或C1～4亚烷基，Rb为卤代或未取代的C1～4烷基；
R5选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R6为L2COOR9；L2为无或C1～2亚烷基，R9为氢或C1～4烷基；
R7为卤素；
当R8为卤素时：X为C(Ra)2、O或S；Ra选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基或卤素；
R3为甲基；
R4为甲基；
R5为甲基；
R6为COOH或COOCH3；
R7为卤素。
进一步地，所述化合物的结构如式III所示：
其中，R8选自氢、氰基、C1～4烷基或C1～4烷氧基；
X为CH2、O或S；
R4选自卤代或未取代的C1～2烷基、3～6元饱和环烷基；
R9为氢或C1～2烷基。
进一步地，所述化合物为以下化合物之一：
本发明还提供了一种抗乙型肝炎病毒的药物，所述药物是以上述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。
本发明中，“乙型肝炎病毒e抗原”即HBeAg；“乙型肝炎病毒表面抗原”即HBsAg。
“乙型肝炎病毒3.5kb前基因组RNA”指HBV病毒核衣壳中包裹的长度为3.5kb的RNA，可由HBV逆转录酶逆转录为完整的HBV DNA。
试验结果表明，本发明提供的化合物能够抑制乙型肝炎病毒核心蛋白组装，降低乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒DNA的水平，降低乙型肝炎病毒3.5kb前基因组RNA(pgRNA)的水平，有效抑制乙型肝炎病毒的复制。本发明提供的化合物在制备乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂、抗乙型肝炎病毒的药物、以及预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病(例如乙型肝炎、肝硬化、肝癌)的药物中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：化合物1在HepAD38细胞(左)和HepG2细胞(右)上对HBV核衣壳形成的影响。
图2：化合物1在HepAD38细胞上对乙型肝炎病毒HBeAg、HBsAg、核心蛋白DNA和3.5kb前基因组RNA(pgRNA)形成的影响。
图3：化合物1在HepG2细胞上对乙肝病毒HBeAg，HBsAg，核心蛋白DNA和3.5kb前基因组RNA(pgRNA)形成的影响。
图4：化合物1对HBV rcDNA、dslDNA和ssDNA形成的抑制作用。
图5：化合物14在HepAD38细胞上对HBV的抑制效果；其中，A图表示化合物14抑制HBV核衣壳的形成，B图表示化合物14抑制乙型肝炎病毒HBeAg的产生，C图表示化合物14对乙型肝炎病毒HBsAg的产生无影响，D图表示化合物14抑制乙型肝炎病毒3.5kb前基因组RNA(pgRNA)的产生，E图表示化合物14降低乙型肝炎病毒核心蛋白DNA的产生，F图表示化合物14对HBV rcDNA、dsDNA和ssDNA的产生具有抑制作用。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
化合物1～18为购买市售产品所得。
化合物19～29的制备方法如下：
实施例1：本发明化合物19，20的合成
(1)(S)-N-(4-氟-3-甲基苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐的合成
步骤i.(S)-3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
向N-Boc-(S)-3-甲酸(3.0g，13.1mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入4-氟-3-甲基苯胺(1.64g，13.1mmol)，HATU(6.0g，15.7mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.69g，2.16mL,15.7mmol)。将混合物在40℃下搅拌过夜，并待反应完成后，减压浓缩反应液。将残余物溶于乙酸乙酯(30mL)中并用0.05M的稀盐酸(2×30mL)和饱和NaHCO3水溶液洗涤(2×30mL)。将有机相真空浓缩，并通过柱色谱纯化，得到(S)-3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.75g，11.1mmol，85.2％)，为淡黄色固体。
步骤ii.(S)-N-(4-氟-3-甲基苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐的合成
向(S)-3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.50g，10.4mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入10mL三氟乙酸，室温下搅拌过夜，薄层色谱监测反应完成后，将反应液减压蒸馏除去溶剂，所得黄褐色油状残余物为(S)-N-(4-氟-3-甲基苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐，不经过进一步纯化直接投入下步使用。
(2)(S)-4-((3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(本发明化合物19)的合成
步骤i.4-(氯磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯的合成
称取1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(2.0g，11.96mmol)溶于20mL乙腈中，搅拌并用冰水浴冷却至0℃，慢慢滴加氯磺酸(13.94g,119.6mmol)，滴加完成后于0-20℃下反应3小时，待反应完成，取反应液滴加到碎冰上，然后用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得粗产物4-(氯磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯，直接投入下一步使用。
步骤ii.(S)-4-((3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(本发明化合物19)的合成
取4-(氯磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯和(S)-N-(4-氟-3-甲基苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐溶于二氯甲烷(10mL)中，常温下搅拌，加入N,N-二异丙基乙胺(1.69g,15.7mmol)，1小时候监测反应完成后，加入20mL二氯甲烷和水(2×30mL)萃取，有机相经过减压蒸馏和柱色谱纯化得到目标化合物19，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.00(s,1H),7.51(dd,J＝7.2,2.7Hz,1H),7.41–7.35(m,1H),7.06(t,J＝9.2Hz,1H),3.79–3.74(m,1H),3.67(s,4H),3.44(s,3H),2.62–2.53(m,2H),2.48–2.40(m,4H),2.25(s,3H),2.20(d,J＝1.9Hz,3H),1.93–1.87(m,1H),1.79(dq,J＝12.5,2.8Hz,1H),1.54–1.40(m,2H)。
(3)本发明化合物20的合成
将N-Boc-(R)-3-甲酸作为起始原料，按照制备19的方法合成本发明化合物20，白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),7.51(dd,J＝7.2,2.6Hz,1H),7.39(ddd,J＝7.8,4.5,2.7Hz,1H),7.05(t,J＝9.2Hz,1H),3.82–3.74(m,1H),3.73–3.61(m,4H),3.44(d,J＝0.9Hz,3H),2.64–2.53(m,2H),2.49–2.37(m,4H),2.29–2.16(m,6H),1.95–1.86(m,1H),1.79(dt,J＝12.5,3.2Hz,1H),1.55–1.39(m,2H).
实施例2：本发明化合物21-23的合成
(1)4-(氯磺酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯的合成
称取2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(1.5g，11.96mmol)溶于20mL乙腈中，搅拌并用冰水浴冷却至0℃，慢慢滴加氯磺酸(13.94g,119.6mmol)，滴加完成后于0-20℃下反应3小时，待反应完成，取反应液滴加到碎冰上，然后用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得粗产物4-(氯磺酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯，直接投入下一步使用。
(2)4-((3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(本发明化合物21)的合成
取4-(氯磺酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(1.6g，mmol)和N-(4-氟-3-甲基苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐(，mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，常温下搅拌，加入N,N-二异丙基乙胺(g,mmol)，1小时候监测反应完成后，加入20mL二氯甲烷和水(2×30mL)萃取，有机相经过减压蒸馏和柱色谱纯化得到目标化合物21(160mg，0.29mmol)，为白色固体。
(3)4-((3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)1-(丙基-2-酮)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(本发明化合物22)的合成
将4-((3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯溶于20mL乙腈中，然后加入氯丙酮。搅拌并在80℃下反应1h，监测反应完成后浓缩反应液，用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，减压蒸馏浓缩，经过柱色谱纯化得到目标化合物22，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),7.54–7.49(m,1H),7.38(ddd,J＝8.9,4.6,2.7Hz,1H),7.06(t,J＝9.2Hz,1H),5.03(s,2H),3.77(dq,J＝11.5,1.9Hz,1H),3.68(s,3H),3.64(d,J＝12.2Hz,1H),2.64–2.53(m,2H),2.48–2.42(m,1H),2.25(d,J＝10.9Hz,6H),2.20(d,J＝1.9Hz,3H),2.11(s,3H),1.92(dd,J＝9.5,5.4Hz,1H),1.79(dq,J＝12.4,2.5Hz,1H),1.54–1.38(m,2H).
(4)本发明化合物23的合成
以二氟溴乙酸乙酯和化合物21作为原料，按照制备化合物22的方法制得化合物23，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),7.84(t,J＝56.6Hz,1H),7.58–7.54(m,1H),7.43(ddd,J＝9.2,4.6,2.8Hz,1H),7.12(t,J＝9.2Hz,1H),3.82(ddd,J＝12.1,3.9,2.0Hz,1H),3.78(s,3H),3.69(d,J＝11.9Hz,1H),2.73(t,J＝11.6Hz,1H),2.66–2.58(m,5H),2.39(s,3H),2.25(d,J＝1.9Hz,3H),1.97(d,J＝9.7Hz,1H),1.89–1.84(m,1H),1.59–1.48(m,2H).
实施例3：本发明化合物24，25的合成
(1)2-乙酰基-4-氧戊酸乙酯的合成
取乙酰乙酸乙酯(10g，76.84mmol)溶于搅拌的无水四氢呋喃(100mL)中，冰浴下加入60％NaH(3.69g，92.21mmol)，30min后慢慢滴加氯丙酮(7.11g,76.84mmol)，常温下反应5h，减压浓缩反应液，加入乙酸乙酯2次，合并有机相，减压蒸馏浓缩，得到褐色油状粗产物直接投入下一步反应。
(2)2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯的合成
取上一步制备的2-乙酰基-4-氧戊酸乙酯粗产物4mL溶于20mL醋酸，加入三氟乙酸盐酸盐(2.0g，14.8mmol)，80℃下反应4h，减压蒸馏除去溶剂，经过乙酸乙酯萃取和柱色谱纯化得到目标产物2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(318mg，1.28mmol)，为淡黄色固体。
(3)4-(氯磺酰基)-2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯的合成
称取2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(300mg，1.20mmol)溶于10mL乙腈中，搅拌并用冰水浴冷却至0℃，慢慢滴加氯磺酸(3.2g,27.5mmol)，滴加完成后于0-20℃下反应3小时，待反应完成，取反应液滴加到碎冰上，然后用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得粗产物4-(氯磺酰基)-2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯，为褐色固体，直接投入下一步使用。
(4)(S)-4-((3-((4-氟-3-甲基苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(本发明化合物24)的合成
取4-(氯磺酰基)-2,5-二甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(150mg，0.43mmol)和(S)-N-(4-氟-3-甲基苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐(175mg，0.5mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，常温下搅拌，加入N,N-二异丙基乙胺(1.69g,15.7mmol)，1小时候监测反应完成后，加入20mL二氯甲烷和水(2×30mL)萃取，有机相经过减压蒸馏和柱色谱纯化得到目标化合物24(160mg，0.29mmol)，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.01(s,1H),7.49(dd,J＝7.1,2.6Hz,1H),7.37(ddd,J＝8.8,4.6,2.7Hz,1H),7.06(t,J＝9.2Hz,1H),5.04(q,J＝9.0Hz,2H),4.16(qq,J＝6.9,3.7Hz,2H),3.79(t,J＝9.2Hz,1H),3.66(dd,J＝12.2,4.1Hz,1H),2.61–2.52(m,2H),2.45(s,3H),2.42(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),2.26(s,3H),2.19(d,J＝1.9Hz,3H),1.92–1.87(m,1H),1.79(dt,J＝12.5,3.0Hz,1H),1.54–1.39(m,2H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H).
(5)本发明化合物25的合成
将环丙甲胺和2-乙酰基-4-氧戊酸乙酯作为起始原料，按照制备24的方法合成本发明化合物25，白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),7.54(dd,J＝7.1,2.7Hz,1H),7.42(ddd,J＝8.9,4.6,2.7Hz,1H),7.10(t,J＝9.2Hz,1H),4.24–4.13(m,2H),3.87–3.80(m,1H),3.70(d,J＝12.3Hz,1H),3.17–3.10(m,1H),2.65–2.58(m,2H),2.53(s,3H),2.49(dd,J＝11.8,2.8Hz,1H),2.35(s,3H),2.24(d,J＝1.9Hz,3H),1.96–1.90(m,1H),1.84(dq,J＝12.4,3.2,2.8Hz,1H),1.59–1.46(m,2H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H),1.16(tt,J＝7.1,3.1Hz,2H),1.04–0.98(m,2H).
实施例4：本发明化合物26的合成
(1)N-(3-氯-4-氟苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐的合成
步骤i.3-((3-氯-4-氟苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
向N-Boc-3-甲酸(3.0g，13.1mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入3-氯-4-氟苯胺(1.64g，13.1mmol)，HATU(6.0g，15.7mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.69g，2.16mL,15.7mmol)。将混合物在40℃下搅拌过夜，并待反应完成后，减压浓缩反应液。将残余物溶于乙酸乙酯(30mL)中并用0.05M的稀盐酸(2×30mL)和饱和NaHCO3水溶液洗涤(2×30mL)。将有机相真空浓缩，并通过柱色谱纯化，得到3-((3-氯-4-氟苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.75g，11.1mmol，85.2％)，为淡黄色固体。
步骤ii.N-(3-氯-4-氟苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐的合成
向3-((3-氯-4-氟苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.50g，10.4mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入10mL三氟乙酸，室温下搅拌过夜，薄层色谱监测反应完成后，将反应液减压蒸馏除去溶剂，所得黄褐色油状残余物为N-(3-氯-4-氟苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐，不经过进一步纯化直接投入下步使用。
(2)4-((3-((3-氯-4-氟苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(本发明化合物26)的合成
取4-(氯磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯和N-(3-氯-4-氟苯基)哌啶-3-羧酰胺三氟乙酸盐溶于二氯甲烷(10mL)中，常温下搅拌，加入N,N-二异丙基乙胺(1.69g,15.7mmol)，1小时候监测反应完成后，加入20mL二氯甲烷和水(2×30mL)萃取，有机相经过减压蒸馏和柱色谱纯化得到目标化合物26，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.24(s,1H),7.92(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.46(ddd,J＝9.0,4.3,2.6Hz,1H),7.36(t,J＝9.1Hz,1H),3.80–3.74(m,1H),3.67(s,3H),3.63(d,J＝12.1Hz,1H),3.44(s,3H),2.63–2.54(m,2H),2.47(td,J＝11.9,2.8Hz,1H),2.41(s,3H),2.25(s,3H),1.94–1.89(m,1H),1.80(dq,J＝12.4,3.1Hz,1H),1.53–1.41(m,2H).
实施例5：本发明化合物27的合成
取100mg 4-((3-((3-氯-4-氟苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸甲酯(本发明化合物26)溶于20mL EtOH：2M NaOH aq＝1:1的溶液中，50℃下搅拌1小时。冷却后用盐酸将反应液调至pH＝5,然后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩和柱层析得到4-((3-((3-氯-4-氟苯基)氨基甲酰基)哌啶-1-基)磺酰基)-1,2,5-三甲基-1H-吡咯-3-羧酸，白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.28(s,1H),7.92(dd,J＝6.9,2.6Hz,1H),7.45(ddd,J＝9.1,4.3,2.6Hz,1H),7.37(t,J＝9.1Hz,1H),3.72(dd,J＝11.2,3.8Hz,1H),3.61(d,J＝11.4Hz,1H),3.50(s,3H),2.62(tt,J＝11.3,3.8Hz,1H),2.41(s,4H),2.35(s,4H),1.93–1.87(m,1H),1.83(dt,J＝13.4,3.4Hz,1H),1.59–1.50(m,1H),1.43–1.37(m,1H).
实施例6:本发明化合物28,29的合成
分别以3-氰基-4-氟苯胺和4-Boc-2-吗啡啉甲酸作为原料，按照制备化合物26的方法制得化合物28和29，均为白色固体。核磁1H NMR谱图表征数据见表1所示。
表1、化合物1-29结构和核磁表征数据
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以下通过试验证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明化合物对HBV的抑制活性
(1)试验方法
细胞系和培养条件：在补充有10％胎牛血清(Gibco)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(HyClone)的DMEM培养基中培养HepAD38细胞。加入500ng/mL四环素抑制HBVpgRNA逆转录，加入500μg/ml G418维持稳定转染的HBV基因组。用腺病毒Ad-HBV1.3感染HepAD38细胞12小时，维持HBV复制的所有过程。所有转染均使用Lipofectamine 3000转染试剂进行。
血清HBV DNA检测。将上述培养的HepAD38细胞以大约1×104个细胞/孔的量的体积接种到96孔培养板中(每孔100μL)，并在细胞贴壁后用化合物或DMSO处理6天。每三天更换一次含有化合物或DMSO的新鲜培养基。6天后，使用移液器将60μL细胞上清液转移至PCR试管中。将样品在PCR扩增仪中于95℃加热15分钟，然后以4000rpm离心10分钟。使用q-PCR检测HBV DNA。实验以DMSO作为空白对照，Bay 41-4109作为阳性对照。
(2)试验结果
受试化合物在HepAD38细胞上对HBV DNA的影响如表2中的“HepAD38 EC50”、“HepAD38％DMSO”所示。表2中，“HepAD38 EC50”表示血清中HBV DNA含量相对于空白对照DMSO降低一半时的药物浓度；“HepAD38％DMSO”表示指定药物浓度下血清中HBV DNA含量相对于DMSO组的比值；“-”表示未检测。
表2、化合物在HepAD38细胞上对HBV的抑制活性和细胞毒性
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从表2可以看出，受试化合物可以有效降低血清中HBV DNA的含量，抑制乙型肝炎病毒的复制。特别是化合物2、3、7、12、14，其抑制效果与阳性对照Bay 41-4109相当。
对于本发明实施例合成的新化合物19～29，可以看出，化合物在10μM浓度下能够明显降低血清中HBV DNA的含量，抑制乙型肝炎病毒的复制，特别是化合物19-20、23-29。
试验例2、本发明化合物的细胞毒性试验
(1)试验方法
使用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测化合物的细胞毒性。操作如下：将约1×104个HepAD38细胞接种在96孔培养板上，并在细胞粘附后用梯度浓度的待测化合物或DMSO处理6天。以DMSO作为空白对照。在处理的六天期间，每隔72小时用含有待测化合物的新鲜培养基替换含有待测化合物的培养基。在处理的第六天，将细胞与100μL含10％CCK-8的化合物筛选培养基在37℃和5％CO2条件下孵育大约30分钟。在450nm读取OD值，拟合出药物的半数致死浓度(CC50)。
(2)试验结果
结果如表2中的“HepAD38 CC50(μM)”所示。表2中，“HepAD38 CC50(μM)”表示使50％细胞死亡时的药物浓度；“-”表示未检测。
可以看出，化合物14具有较好的安全性，其半数致死浓度CC50大于100μM。
试验例3、化合物对细胞内HBV核心蛋白组装的影响
(1)试验方法
将HepAD38和HepG2细胞分别接种在12孔板中，然后用pHBV1.3转染两种细胞。12小时后，将细胞与待测化合物温育6天。然后用裂解缓冲液(1％NP40)将细胞裂解10分钟，并通过离心(13000×g)去除细胞碎片和细胞核。然后进行非变性的1.2％琼脂糖凝胶电泳，并将HBV衣壳转移到硝酸纤维素滤膜上，用抗HBV核心抗体检测HBV衣壳。实验中使用HBV核苷类抑制剂恩替卡韦(ETV)和核心蛋白组装抑制剂Bay 41-4109作为对照。
(2)试验结果
试验结果如图1所示，可以看出，化合物1在10μM和5μM浓度时，在HepAD38(图1左)和HepG2(图1右)细胞上都显著抑制了HBV核衣壳的形成，抑制效果与阳性对照Bay 41-4109相当，而核苷类抑制剂恩替卡韦(ETV)对HBV核衣壳的形成没有影响。
试验例4、化合物对乙型肝炎病毒HBeAg、HBsAg和核心蛋白DNA形成的影响
(1)试验方法
通过ELISA试剂盒(科华生工)对HepAD38细胞培养上清液中的乙型肝炎病毒e抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBeAg)进行定量。乙型肝炎病毒核心蛋白DNA通过q-PCR进行定量(方法同试验例1中血清HBV DNA定量)。
(2)试验结果
试验结果如图2和图3所示。可以看出，化合物1在HepAD38(图2)和HepG2(图3)上都能够明显地降低HBeAg和核心蛋白DNA的水平，并且降低效果随着浓度增加而加强；但是对HBsAg无明显影响。
试验例5、化合物对细胞内HBV RNA的影响
(1)试验方法
使用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA，并使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(A3500；Promega)进行逆转录。使用Bio-Rad CFX Connect实时PCR检测系统(Bio-Rad)上的iTaq Universal SYBR Green Supermix进行qRT-PCR以定量3.5kb pgRNA水平。以基因组β-肌动蛋白(β-actin)进行标准化。
(2)试验结果
如图2和图3所示。可以看出，化合物1在HepAD38(图2)和HepG2(图3)上都能够明显降低HBV 3.5kb前基因组RNA的水平，并且降低效果随着浓度增加而加强。
试验例6、Southern印迹杂交法测试化合物1对HBV复制的抑制作用
(1)试验方法
提取的DNA样品通过在1.2％琼脂糖凝胶中的电泳分离，并转移到尼龙膜上，浸泡在变性溶液(0.5M NaOH和1.5M NaCl)中，然后在1M Tris-HCl(pH 7.4)和1.5M NaCl中中和后，通过UV交联固定膜。然后使用洋地黄毒苷(DIG)标记的全长HBV基因组探针杂交检测HBVDNA。
(2)试验结果
结果如图4所示。可以看出，随着化合物1浓度增加，HBV rcDNA,ssDNA明显减少，说明化合物1能够有效抑制HBV的复制。
试验例7、化合物14在HepAD38细胞上对HBV的抑制作用
(1)试验方法
除受试药物更换为化合物14，试验方法和条件同试验例3-6。
(2)试验结果
结果如图5所示。可以看出，化合物14能够在HepAD38细胞中有效抑制HBV核衣壳的形成，以及抑制HBV e抗原、前基因组RNA、核心蛋白DNA、rcDNA、ssDNA的产生，说明化合物14可以有效抑制HBV的复制。
综上，本发明提供了式I所示化合物在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途。实验表明，本发明提供的化合物能够抑制乙型肝炎病毒核心蛋白的组装，降低乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒DNA的水平，降低乙型肝炎病毒3.5kb前基因组RNA的水平，有效抑制乙型肝炎病毒的复制。本发明提供的化合物在制备乙型肝炎病毒核心蛋白组装抑制剂、抗乙型肝炎病毒的药物、以及预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病(例如乙型肝炎、肝硬化、肝癌)的药物中具有广阔的应用前景。
Claims (10)
1.化合物或其药学上可接受的盐在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的用途，所述化合物如式(I)所示：
其中，n为0～5的整数；
R1选自以下基团：
R2各自独立的选自氢、卤素、氰基、未取代的C1～4烷基；
X为C(Ra)2、O或S；Ra为氢。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗乙型肝炎病毒的药物为预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病的药物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述乙型肝炎病毒感染相关疾病为乙型肝炎、肝硬化或肝癌。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述化合物的结构如式II所示：
其中，当R8为氢、氰基、未取代的C1～4烷基：
X为C(Ra)2、O或S；Ra为氢；
R3为C1～4烷基；
R4选自氢、卤代或未取代的C1～4烷基、L1CORb、3～6元饱和杂环基；L1为无或C1～4亚烷基，Rb为未取代的C1～4烷基；
R5为C1～4烷基；
R6为L2COOR9；L2为无，R9为氢或C1～4烷基；
R7为卤素；
当R8为卤素时：X为C(Ra)2、O或S；Ra为氢；
R3为甲基；
R4为甲基；
R5为甲基；
R6为COOH或COOCH3；
R7为卤素。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述化合物的结构如式III所示：
其中，R8选自氢、氰基、C1～4烷基；
X为CH2、O或S；
R4选自卤代或未取代的C1～2烷基、3～6元饱和环烷基；
R9为氢或C1～2烷基。
6.根据权利要求1～2任意一项所述的用途，其特征在于：所述化合物选自如下结构式之一：
7.化合物、或其药学上可接受的盐，所述化合物为式II所示：
其中，当R8为氢、氰基、未取代的C1～4烷基：
X为C(Ra)2、O或S；Ra为氢；
R3为C1～4烷基；
R4选自氢、卤代或未取代的C1～4烷基、L1CORb、3～6元饱和杂环基；L1为无或C1～4亚烷基，Rb为未取代的C1～4烷基；
R5为C1～4烷基；
R6为L2COOR9；L2为无，R9为氢或C1～4烷基；
R7为卤素；
当R8为卤素时：X为C(Ra)2、O或S；Ra为自氢；
R3为甲基；
R4为甲基；
R5为甲基；
R6为COOH或COOCH3；
R7为卤素。
8.根据权利要求7所述的化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物的结构如式III所示：
其中，R8选自氢、氰基、C1～4烷基；
X为CH2、O或S；
R4选自卤代或未取代的C1～2烷基、3～6元饱和环烷基；
R9为氢或C1～2烷基。
9.根据权利要求7所述的化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物为以下化合物之一：
10.一种抗乙型肝炎病毒的药物，其特征在于：所述药物是以权利要求7～9任一项所述的化合物、或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。
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