CN102766674A - 食蟹猴抗利尿激素受体v1a拮抗剂筛选平台的建立 - Google Patents

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夏远峰
张玉珂
秦旭钊
陈景才
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Abstract

一种食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，方法是，首先培养中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞，弃去培养基后加入钙离子检测染料继续培养，弃去钙离子检测染料后加入待测药物孵育，然后再加入激动剂d[Cha4]-AVP，用酶标仪检测，能够抑制激动剂引起的钙离子释放的药物为食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂。本发明以细胞水平的钙流水平为主要检测方法，建立了一套对筛选食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂药物的方法。首次实现了在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体，首次建立并优化了对食蟹猴抗利尿激素受体药物高通量筛选的平台。

Description

食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立
技术领域
本发明涉及一种药物筛选方法，尤其涉及一种食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立。
背景技术
最近一段时间，抗利尿激素受体选择性拮抗剂的研发成为热点，已经证明有着广阔的临床应用前景。抗利尿激素是由下丘脑的视上核和室旁核的神经细胞分泌的9肽激素，经下丘脑-垂体束到达神经垂体后释放出来。其主要作用是提高远曲小管和集合管对水的通透性，促进水的吸收，是尿液浓缩和稀释的关键性调节激素。当给药剂量远远大于其发挥抗利尿激素效应时，它将作为一种非肾上腺素能样的周围血管收缩药发挥作用。此外，该激素还能增强内髓部集合管对尿素的通透性。血管加压素AVP受体是G蛋白偶联受体，包括血管紧张性受体(V1a)、血小板聚集性受体(V1b)、刺激同性离子和心肌蛋白合成受体(V1a)和下丘脑ACTH分泌受体(V1b)。在最近的临床研究中，V1a受体的拮抗剂最近发现可以有效地抑制攻击性行为，这些结果意味着这些拮抗剂可以应用在针对自闭症，双重人格以及吸毒者的暴力行为的控制上。作为一种重要的实验动物，食蟹猴V1a受体细胞系的建立能够对V1a受体拮抗剂的研发提供有效的筛选平台。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题，提供一种食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，其特征在于，包括以下步骤：
A、在384孔板里每孔植入1.5万个中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养16-24小时；
B、弃去培养基，200转/分离心10秒去除残留培养基，每孔加入30微升钙离子检测染料，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；
C、用钙离子检测缓冲液配制4X的激动剂d[Cha4]-AVP和1X的待测药物；
D、细胞孵育90分钟后，弃去钙离子检测染料，200转/分离心10秒去除残留染料；
E、每孔加入30微升1X的待测药物，25℃孵育15分钟，然后每孔再加入10微升4X的激动剂d[Cha4]-AVP；
F、在室温下用酶标仪检测，能够抑制激动剂引起的钙离子释放的药物为食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂。
2、根据权利要求书1所述的食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，其特征在于：所述的中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞按以下步骤制备：
一、质粒转染
A、在6孔板里，每孔植入两百万个中国仓鼠卵巢细胞，用F12/10％胎牛血清的培养基培养16-24小时；
B、稀释5微升脂质体到125微升OptiMEM I低血清培养基，温和混匀，室温放置5分钟；稀释2微克食蟹猴抗利尿激素受体克隆质粒到125微升OptiMEMI低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；将上述两者温和混匀，室温放置30分钟后，加入6孔板中，轻轻混匀；
C、在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养24小时后，形成转染体以备筛选；
二、克隆筛选
D、将F12/10％胎牛血清的培养基培养过夜，将转染体分别稀释成1∶20、1∶40和1∶80浓度，分别加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培养过夜的培养基培养；
E、接下来2周内每天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克隆挑选，挑选出克隆的稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体细胞进行下一步骤；
三、用酶标仪筛选阳性克隆细胞
F、将挑选出的克隆细胞以5万个细胞/孔的浓度植入96孔板中，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养过夜，然后弃去培养基，每孔加入100微升钙离子检测染料，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；
G、准备浓度为1.5微摩的激动剂d[Cha4]-AVP，每孔加入25微升激动剂；
H、用酶标仪检测克隆细胞的钙离子水平，激动剂能够有效刺激钙离子水平提高的克隆细胞为阳性克隆细胞。
本发明食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，以细胞水平的钙流水平为主要检测方法，建立了一套对筛选食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂药物的方法。首次实现了在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体，首次建立并优化了对食蟹猴抗利尿激素受体药物高通量筛选的平台。
具体实施方式
实施例1稳定表达食蟹猴抗利尿激素的受体克隆中国仓鼠卵巢细胞系的建立
一、质粒转染
A、在6孔板里，每孔植入两百万个中国仓鼠卵巢细胞，用F12/10％胎牛血清的培养基培养16-24小时；
B、稀释5微升脂质体到125微升OptiMEM I低血清培养基，温和混匀，室温放置5分钟；稀释2微克食蟹猴抗利尿激素受体克隆质粒到125微升OptiMEMI低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；将上述两者温和混匀，室温放置30分钟后，加入6孔板中，轻轻混匀；
C、在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养24小时后，形成转染体以备筛选；
二、克隆筛选
D、将F12/10％胎牛血清的培养基培养过夜，将转染体分别稀释成1∶20、1∶40和1∶80浓度，分别加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培养过夜的培养基培养；
E、接下来2周内每天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克隆挑选，挑选出克隆的稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体细胞进行下一步骤；
三、用酶标仪筛选阳性克隆细胞
F、将挑选出的克隆细胞以5万个细胞/孔的浓度植入96孔板中，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养过夜，然后弃去培养基，每孔加入100微升钙离子检测染料，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；
G、准备浓度为1.5微摩的激动剂d[Cha4]-AVP，每孔加入25微升激动剂；
H、用酶标仪检测克隆细胞的钙离子水平，激动剂能够有效刺激钙离子水平提高的克隆细胞为阳性克隆细胞。
用酶标仪检测时，各项参数设置如表1所示：
表1
  参数   96孔细胞板
  激发光波长(纳米)   485
  发射光波长(纳米)   525
  激发光消除(纳米)   515
  荧光染料孵育体积(微升)   100
  化合物添加体积(微升)   25
  移液头高度(微升)   110
  移液速度(微升/秒)   1
实施例2食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立
A、在384孔板里每孔植入1.5万个中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养16-24小时；
B、弃去培养基，200转/分离心10秒去除残留培养基，每孔加入30微升钙离子检测染料，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；
C、用钙离子检测缓冲液配制4X的激动剂d[Cha4]-AVP和1X的待测药物；
D、细胞孵育90分钟后，弃去钙离子检测染料，200转/分离心10秒去除残留染料；
E、每孔加入30微升1X的待测药物，25℃孵育15分钟，然后每孔再加入10微升4X的激动剂d[Cha4]-AVP；
F、在室温下用酶标仪检测，能够抑制激动剂引起的钙离子释放的药物为食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂。
用酶标仪检测时，各项参数设置如表2所示：
表2
Figure BDA00001932750300041
Figure BDA00001932750300051

Claims (2)

1.一种食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，其特征在于，包括以下步骤：
A、在384孔板里每孔植入1.5万个中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养16-24小时；
B、弃去培养基，200转/分离心10秒去除残留培养基，每孔加入30微升钙离子检测染料，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；
C、用钙离子检测缓冲液配制4X的激动剂d[Cha4]-AVP和1X的待测药物；
D、细胞孵育90分钟后，弃去钙离子检测染料，200转/分离心10秒去除残留染料；
E、每孔加入30微升1X的待测药物，25℃孵育15分钟，然后每孔再加入10微升4X的激动剂d[Cha4]-AVP；
F、在室温下用酶标仪检测，能够抑制激动剂引起的钙离子释放的药物为食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂。
2.根据权利要求书1所述的食蟹猴抗利尿激素受体V1A拮抗剂筛选平台的建立，其特征在于：所述的中国仓鼠卵巢细胞的阳性克隆细胞按以下步骤制备：
一、质粒转染
A、在6孔板里，每孔植入两百万个中国仓鼠卵巢细胞，用F12/10％胎牛血清的培养基培养16-24小时；
B、稀释5微升脂质体到125微升OptiMEM I低血清培养基，温和混匀，室温放置5分钟；稀释2微克食蟹猴抗利尿激素受体克隆质粒到125微升OptiMEMI低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；将上述两者温和混匀，室温放置30分钟后，加入6孔板中，轻轻混匀；
C、在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养24小时后，形成转染体以备筛选；
二、克隆筛选
D、将F12/10％胎牛血清的培养基培养过夜，将转染体分别稀释成1∶20、1∶40和1∶80浓度，分别加入含有潮霉素400微克/毫升的上述培养过夜的培养基培养；
E、接下来2周内每天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克隆挑选，挑选出克隆的稳定表达食蟹猴抗利尿激素受体细胞进行下一步骤；
三、用酶标仪筛选阳性克隆细胞
F、将挑选出的克隆细胞以5万个细胞/孔的浓度植入96孔板中，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养过夜，然后弃去培养基，每孔加入100微升钙离子检测染料，在37℃、5％二氧化碳氛围的培养箱里培养90分钟；
G、准备浓度为1.5微摩的激动剂d[Cha4]-AVP，每孔加入25微升激动剂；
H、用酶标仪检测克隆细胞的钙离子水平，激动剂能够有效刺激钙离子水平提高的克隆细胞为阳性克隆细胞。
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