CN110833542A

CN110833542A - 褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用

Info

Publication number: CN110833542A
Application number: CN201911042765.0A
Authority: CN
Inventors: 程金妹; 孙斐; 米盼盼
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2020-02-25

Abstract

本发明公开了褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用，通过直接在卵母细胞体外成熟培养液中添加褪黑素，证明褪黑素能缓解可替宁诱导的卵母细胞质量下降，表现为降低卵母细胞内ROS水平、降低非整倍体的形成、促进肌动蛋白的均匀分布、改善纺锤体的形态和改善线粒体的功能，进而显著提高卵母细胞后期受精率。本发明提供了改善吸烟者血液中尼古丁的主要代谢产物可替宁影响雌性卵母细胞质量的方法，为吸烟女性提高生殖能力提供有效的方法。

Description

褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。

背景技术

褪黑素（Melatonin,MT）是松果体分泌的一种高亲脂性和部分亲水性的神经内分泌激素，其分泌有明显的昼低夜高的节律性。近年来，褪黑素得到广泛的应用和关注，国内外均有对其抗氧化作用的研究，并表明它是一种强效的的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的自由基清除剂，保护器官和细胞免受损伤。褪黑素能够改善有害物质对卵母细胞质量的影响已有相关研究。

虽然烟草是最可避免的死亡原因，但在发展中国家，每年大约有500 万与烟草相关的疾病导致死亡。早在30年以前就有研究报道怀孕女性吸烟对对胎儿产生不良的影响。Zenzes MT（2000）等人发现吸烟能够导致女性卵巢储备库中卵母细胞数量的减少。烟草中含有碳水化合物、蛋白质和生物碱，生物碱中90%-95%均是尼古丁。大部分尼古丁通过CYP2A6诱导5-羟基化反应形成可替宁（cotinine）和相关代谢物。可替宁会以等离子体形式存在血浆中，并在非怀孕成年人半衰期16小时，怀孕成年人半衰期9小时。Kendall V 等人发现当在小鼠早期胚胎培养液中添加8mM的可替宁时，能够导致小鼠囊胚形成率显著下降。但是可替宁是否影响卵母细胞的成熟，目前仍未报道。

目前现有技术中并没有对可替宁与卵母细胞质量的相关性研究，如能够研发出一种缓解可替宁影响卵母细胞质量的方法，将对吸烟引起的女性不孕不育的治疗具有重要的理论指导意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：

褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。

一种用于改善卵母细胞质量的药物，包含褪黑素。

进一步地，所述药物中褪黑素的含量为0.1-20μmol/L。

褪黑素在制备用于改善可替宁诱导卵母细胞质量下降药物中的应用。

一种用于改善可替宁诱导卵母细胞质量下降的药物，包含褪黑素。

进一步地，所述药物中褪黑素的含量为0.1-20μmol/L。

本发明通过直接在卵母细胞体外成熟培养液中添加褪黑素，证明褪黑素能缓解可替宁诱导的卵母细胞质量下降，具体包括：显著缓解可替宁诱导的卵母细胞成熟率低下、第二次减数分裂中期（MII）卵母细胞内高水平ROS、MII期卵母细胞线粒体功能的损伤、MII期卵母细胞染色体非整倍体的增加、肌动蛋白（α-actin）分布紊乱、纺锤体形态的异常和孤雌激活后原核率低下。本发明通过大量客观试验，针对不同的卵母细胞质量的功能表现，提供了褪黑素不同的最佳添加量，以实现最佳的延缓可替宁诱导卵母细胞质量的下降。

有益效果：本发明提供了改善吸烟者血液中尼古丁的主要代谢产物可替宁影响雌性卵母细胞质量的方法，为吸烟女性提高生殖能力提供有效的方法。

附图说明

图1为实施例1中加入可替宁和褪黑素对卵母细胞成熟率的影响。

图2为实施例1中加入可替宁和褪黑素对MII期卵母细胞α-actin表达分布的影响。

图3为实施例1中加入可替宁和褪黑素对MII期卵母细胞纺锤体形态的影响。

图4为实施例1中加入可替宁和褪黑素对卵母细胞染色体非整倍性的影响。

图5为实施例1中加入可替宁和褪黑素对MII期卵母细胞线粒体膜电位和胞内ROS水平的影响。

图6为实施例2中加入可替宁和褪黑素对MII期卵母细胞孤雌激活后原核形成率的影响。

图1-图6中所示显著性均是与800μM cotinine+0μM MT组相比得出；图1-图6中肩标不同小写字母代表差异显著P<0.05，肩标不同大写字母代表差异显著P<0.01。

具体实施方式

随着时代进步和社会发展，女性抽烟已经成为一种常见得现象。已有研究表明，女性抽烟能够导致生殖机能急剧下降，导致胎儿流产、畸形和发育不良。

因此，如何缓解可替宁诱导的卵母细胞质量的下降可为吸烟导致的不孕女性的治疗带来曙光。

发明人经过实验发现，在卵母细胞成熟液中添加褪黑素能够缓解可替宁对卵母细胞质量的影响。具体为在卵母细胞成熟液中添加一定量的褪黑素。所述缓解可替宁诱导卵母细胞质量下降的表现为：显著缓解可替宁诱导的卵母细胞成熟率低下、第二次减数分裂中期（MII）卵母细胞内高水平ROS、MII期卵母细胞线粒体功能的损伤、MII期卵母细胞染色体非整倍体的增加、肌动蛋白（α-actin）分布紊乱、纺锤体形态的异常和体外受精率低下。

进一步地，通过实验摸索得到缓解可替宁诱导卵母细胞质量下降的最佳添加浓度，具体是在体外成熟培养液中添加0.1-20μmol/L褪黑素。

更进一步地，本实通过大量的客观试验，针对不同的卵母细胞质量评价体系提供不同的褪黑素添加量，以实现最佳缓解可替宁诱导的卵母细胞质量下降的效果。具体地：

（1）缓解可替宁诱导卵母细胞成熟率低下的褪黑素添加量为0.1-10μmol/L；

（2）缓解可替宁诱导卵母细胞成熟后细胞内ROS水平和线粒体功能的褪黑素添加量为10-20μmol/L；

（3）缓解可替宁诱导卵母细胞成熟后染色体非整倍性、纺锤体形态和肌动蛋白分布的褪黑素添加量为0.1-20μmol/L；

（4）缓解可替宁诱导卵母细胞成熟后体外受精卵率能的褪黑素添加量为10±5μmol/L。

本发明研究针对的动物对象为实验小鼠，实施列中使用的动物为8周龄的CD1母鼠，购自南通大学实验动物中心，自由采食和饮水。控光（光照12h/d），室内温度为20-22℃。

实验小鼠是哺乳动物模式生物，被广泛运用于世界各地的实验室，新技术的开发、运用和检测多在实验小鼠上进行，以检测该技术的可施性和安全性。其中CD1是国际认可的远交群小鼠。对小鼠行之有效的实验手段，也可以考虑运用于其他物种。因此，所述动物可为小鼠、大鼠、猪和兔等，成熟培养液中添加的方式与小鼠雷同。此外，所采用的培养液可以为适用于各种动物胚胎的现有技术公开的各种培养液或其它未公开的培养液，包括但不限于常用的培养液如KSOM、M16、PZM-3等。作为本发明的优选实施方式，所述添加为在卵母细胞体外培养的开始时添加。

本发明所述的缓解可替宁诱导卵母细胞质量下降的方法包括如下步骤：

（1）生发泡时期（GV）卵母细胞的采集：采用体外剥离8-10周龄CD1磁性小鼠卵巢，通过口吸管和玻璃针将GV期卵母细胞收集起来。

（2）卵母细胞体外成熟培养：将所述的GV期卵母细胞置于含浓度为800μmol/L可替宁和0μmol/L、0.1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L的褪黑素中进行体外成熟培养。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。使用的褪黑素(Melatonin,MT)购自Sigma公司（St.Louis,MO,USA）。所有试验数据均采用SPSS软件进行统计分析。

以下实施例中使用的动物为8-10周龄的CD1小鼠，购置南通大学实验动物中心，自由采食和饮水。控光（光照12h/d）,室内温度为20～22℃。所有操作均在暗室中完成。

下述实施例所采用的GV期卵母细胞通过以下方法采集得到：8-10周龄的CD1雌性鼠，腹腔注射PMSG(10IU)，间隔46h，进行颈椎脱臼处死，取出卵巢组织。将卵巢放入用提前预热的含有50μmol/L IBMX的M2操作液中，运用1mL的注射器针头对卵巢进行撕碎，运用口吸管和玻璃针收集90-120微米形态正常的GV期卵母细胞。操作在25℃室温环境下、37℃的恒温台上进行。

实施例1

褪黑素缓解可替宁诱导卵母细胞质量下降的表现

提前制备含有800μmol/L可替宁和0μmol/L、0.1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L褪黑素的卵母细胞成熟培养液。在60mm培养皿中制作60μL的卵母细胞培养液滴，37℃、5%CO₂中预平衡2小时。在每个液滴中放入30-35枚采集得到的GV期卵母细胞，置于培养箱中进行培养。培养16h后，统计卵母细胞成熟率即第一极体排出率。结果如图1所示：添加褪黑素能够显著缓解可替宁对卵母细胞第一极体排出的影响。其中添加0.1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L MT均能够缓解可替宁对卵母细胞第一极体排出的影响。

收集上述排出第一极体的卵母细胞(MII期)，并将转移至2%多聚甲醛固定20min中，0.15%Triton渗透15min，0.3%BSA封闭15min，孵育一抗（α-actin和β-tubulin)，清洗，孵育二抗，清洗，DAPI染色，置于荧光显微镜下激发拍照。结果如图2和图3所示，褪黑素能够明显缓解可替宁诱导MII期卵母细胞α-actin分布和β-tubulin形态的紊乱。

染色体非整倍性、线粒体功能和胞内ROS水平是卵母细胞质量评价的重要指标之一，因此对卵母细胞非整倍性和线粒体功能进行检测结果发现，褪黑素能够明显改善可替宁对卵母细胞染色体的分离（图4）和线粒体的功能，并减少MII期卵母细胞内ROS 水平（图5）。

实施例2

褪黑素能够改善MII期卵母细胞受精率

为了直观评价MII期卵母细胞的质量，将MII期卵母细胞孤雌激活，检测原核率。

具体方法如下：

（1）配置孤雌激活液A（含100μM氯化锶和5mg/L细胞松弛素D的体外受精液）和B（含5mg/L细胞松弛素D的体外受精液），然后在60mm培养皿中制作60μL的受精液滴，37℃，5%CO₂中预平衡8-12h。

（2）将MII期卵母细胞放入孤雌激活液A中2.5h，然后在放入到孤雌激活液B中3.5h，然后统计原核率。结果如图6所示，褪黑素能够明显缓解可替宁诱导卵母细胞原核率低下，即提高MII期卵母细胞体外孤雌激活后原核形成率。

尽管以上具体实施方式中仅提供了褪黑素缓解可替宁诱导小鼠卵母细胞质量的下降，但人类卵母细胞成熟的过程和机制与小鼠的十分相似，褪黑素缓解可替宁诱导卵母细胞质量的下降同样适用于人类卵母细胞和辅助生殖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.褪黑素在制备用于改善卵母细胞质量药物中的应用。

2.一种用于改善卵母细胞质量的药物，其特征在于：包含褪黑素。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：褪黑素的含量为0.1-20μmol/L。

4.褪黑素在制备用于改善可替宁诱导卵母细胞质量下降药物中的应用。

5.一种用于改善可替宁诱导卵母细胞质量下降的药物，其特征在于：包含褪黑素。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：褪黑素的含量为0.1-20μmol/L。