CN110257321A - 一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法，通过将卵母细胞在含有褪黑素的冷冻液中冷冻，后经含有褪黑素的蔗糖溶液中解冻，最后将卵母细胞在含有褪黑素的培养液中进行体外成熟培养完成。本发明方法工艺简单、耗时短，且能有效提高玻璃化冷冻后生发泡期卵母细胞体外成熟。
Description
技术领域
本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法。
背景技术
卵母细胞超低温冷冻保存是一项非常重要的辅助生殖技术，在生物科学，农业和医学领域都非常有应用价值。在早期研究中，已有关于生发泡(Germinal Vesicle,GV)期卵母细胞被成功超低温保存的报道，其存活率，受精率和发育能力都较低。目前，小鼠生发泡期卵母细胞冻融后体外成熟率为53-92.6％，体外受精后囊胚率为20-42.9％；猪GV期卵母细胞冻融后体外成熟，孤雌激活后囊胚率为9.6-35.6％。卵母细胞经冻融后其活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平上升，线粒体膜电位降低，腺苷三磷酸(adenosinetriphosphate，ATP)水平降低，成熟卵母细胞纺锤体出现异常形态以及纺锤体组装检测点相关基因表达异常仍然是其发育潜力低下的重要原因。
褪黑素，主要在脊椎动物松果体腺中产生，是一种多功能分子。褪黑素及其代谢产物是强力的自由基清除剂和抗氧化剂，可以直接清除ROS，刺激抗氧化酶，增加谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平，并抑制细胞和组织的促氧化酶，促进抗凋亡基因Bcl-xl的表达。褪黑素被广泛添加于鼠，猪，牛和人卵母细胞的培养体系中，以降低体外培养过程中应激以及ROS对细胞的损伤；其对卵母细胞体外成熟的有益作用主要是通过褪黑激素的间接抗氧化作用来解释的。申请人发现在玻璃化冷冻解冻液、解冻后体外培养液中均添加10-7mol/L褪黑素可提高玻璃化小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟率。而研究表明人GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后，在体外培养液中添加1nM褪黑素可促进其体外成熟。但是在玻璃化冷冻解冻液和解冻后体外培养液中均添加褪黑素对生发泡期卵母细胞体外成熟的影响鲜见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法，用于生产应用。具有工艺简单，耗时短的特点。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法，包括以下步骤：
1)卵母细胞收集：采集7-8周龄雌性卵巢，选取带有2-3层颗粒细胞的生发泡期卵母细胞，洗涤后待用；
2)卵母细胞冷冻：采用OPS法玻璃化冷冻，将卵母细胞依次经预处理液和冷冻液中处理后，将装载有卵母细胞的OPS投入到液氮中；
3)卵母细胞解冻：OPS从液氮中取出立即浸入37.5℃恒温的蔗糖溶液中，吹出卵母细胞至蔗糖溶液大液滴中，洗涤后转移至蔗糖溶液小液滴中，置于M16中培养1小时；
4)卵母细胞体外成熟：生发泡期卵母细胞继续在培养箱中培养。
进一步的，步骤(2)中所述的预处理液为10％EG(ethylene glycol)+10％DMSO(Dimethyl sulfoxide)，其中含有褪黑素(浓度为10-7mol/L)；
进一步的，步骤(2)中所述的冷冻液选自含褪黑素浓度为10-7mol/L的EDFS30(EG和DMSO以DPBS为溶剂稀释成10％(v/v)EG+10％(v/v)DMSO；含有30％(w/v)Ficoll和0.5mol/L蔗糖的冷冻液称为FS液，EG、DMSO和FS液按体积比为1.5:1.5:7混合后即得EDFS30)。
进一步的，步骤(3)中蔗糖溶液的浓度为0.5mol/L，所述的蔗糖溶液和M16中均含有浓度为10-7mol/L的褪黑素。
进一步的，步骤(3)中培养条件为：5％CO2，37.5℃，100％湿度。
进一步的，步骤(4)中体外成熟培养液为添加10-7mol/L褪黑素的M16。
本发明的有益效果为：
1)在卵母细胞玻璃化冷冻解冻液、解冻后体外培养1小时、体外成熟培养液M16中均添加10-7mol/L褪黑素，增加了褪黑素对卵母细胞的作用时间。
2)本研究的一个亮点是在玻璃化冷冻解冻液中也添加10-7mol/L褪黑素后ROS含量显著下降，线粒体膜电位和ATP水平上升，纺锤体形态异常率下降以及纺锤体组装检测点相关基因表达更加稳定。
3)实验结果表明本发明工艺对玻璃化冷冻解冻后小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟有显著提高的作用。
附图说明
图1是褪黑素降低玻璃化冻融后卵母细胞体外成熟过程中ROS水平，其中A为光镜图，B为活性氧水平柱状图；
图2是褪黑素提高了冻融后卵母细胞体外成熟过程中的GSH水平，其中A为光镜图，B为谷胱甘肽水平柱状图；
图3是褪黑素提高了冻融后卵母细胞体外成熟过程中的线粒体膜电位水平，其中A为光镜图，B为荧光比值柱状图；
图4是褪黑素提高了冻融后卵母细胞体外成熟过程中的ATP水平；
图5是褪黑素提高了体外成熟至MII期小鼠卵母细胞的纺锤体的正常形态，其中A为光镜图，B为平均级数柱状图；
图6是褪黑素改变了各组不同时期(GV、MI和MII期)卵母细胞纺锤体组装检测点相关基因的相对表达量；其中A为Mps1基因，B为BubR1基因，C为Mad1基因，D为Mad2基因。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法，具体通过以下步骤完成：
1)卵母细胞收集
5-6周龄雌性小鼠，饲养于18-22℃，自由采食与饮水，控光(14小时/天)。经两周适应性饲养后，每只小鼠注射10IU PMSG，44-48小时后采集卵巢，收集带有2-3层颗粒细胞的生发泡期卵母细胞，并经M2液洗涤3遍后待用。
2)卵母细胞玻璃化冷冻解冻和体外培养1小时
塑料细管(250mL；IMV,L’Aigle,France)被加热变软，手动拉成内径0.10mm，外径0.15mm的细管，并用刀片从细端割开成长约3cm的OPS，备用。
卵母细胞冷冻：采用OPS法玻璃化冷冻，取8枚卵母细胞在预处理液10％EG+10％DMSO(含10-7mol/L的褪黑素)中处理30秒，然后转移至EDFS30(含10-7mol/L的褪黑素)中处理25秒，最后迅速将OPS投入液氮。
卵母细胞解冻：OPS从液氮中取出后，立即将含有卵母细胞的细管部分浸入37.5℃恒温台上的0.5mol/L蔗糖溶液中，通过口吸管将卵母细胞轻轻吹出至0.5mol/L蔗糖溶液大液滴中，洗涤3-5次后转移至0.5mol/L蔗糖小液滴中(从吹出卵母细胞至大液滴洗涤到转移至小液滴平衡共5分钟)，最后将卵母细胞转入M2液中洗涤3次，转移至预先在培养箱中孵育约8小时的M16中，并于培养箱(5％CO2，37.5℃，100％湿度)中培养1小时，1小时后统计形态正常细胞数，计算形态正常率，待用。
3)卵母细胞体外成熟培养
在含有10-7mol/L褪黑素的M16培养液中进行体外培养。分别培养4、8和12小时统计GVBD、MI和MII期卵母细胞的发育率。
实施例2褪黑素降低了体外成熟过程中小鼠卵母细胞的ROS水平
当冷冻卵母细胞解冻后，将体外培养0、8、12小时的各组不同时期(GV、MI和MII期)卵母细胞进行ROS水平检测。将各组不同时期(GV、MI和MII期)卵母细胞分别置于1mmol/LDCFH-DA(ROS染色液)染色液(DPBS为溶剂)中洗涤3次，再放入37.5℃，5％CO2饱和湿度培养箱内染色30分钟，经M2液洗涤3遍后，进行DAPI染色压片，于4℃避光放置2小时后在荧光显微镜下(IX53 Olympus，Tokyo，Japan)观察。ROS检测用蓝光激发。获得图像保存为TIFF格式，用ImageJ 1.48分析图片得出每个卵母细胞荧光强度，并扣除背景值。
如图1所示，在各组卵母细胞体外培养0、8、12后，卵母细胞分别处于GV、MI和MII期，检测此时的ROS水平发现，与冷冻+褪黑素组相比，冷冻组的ROS水平显著上升(P<0.05)，而冷冻+褪黑素组与新鲜组的ROS水平相比差异并不显著(P>0.05)。
实施例3褪黑素提高了体外成熟过程中小鼠卵母细胞的GSH水平
当冷冻卵母细胞解冻后，将体外培养0、8、12小时的各组不同时期(GV、MI和MII期)卵母细胞进行进行GSH染色。将各组不同时期(GV、MI和MII期)卵母细胞分别置于1mmol/LDCFH-DA(ROS染色液)染色液(DPBS为溶剂)中洗涤3次，再放入37.5℃，5％CO2饱和湿度培养箱内染色30分钟，经M2液洗涤3遍后，进行DAPI染色压片，于4℃避光放置2小时后在荧光显微镜下(IX53 Olympus，Tokyo，Japan)观察。GSH采用10μmol/L的Cell Tracker Blue染色，具体操作如上，用紫光激发。
通过GSH染色分析发现(图2)，与新鲜组相比，冷冻组卵母细胞在GV，MI和MII期卵母细胞的GSH水平显著降低(P＜0.05)，褪黑素组卵母细胞这三个时期的GSH水平无显著差异；与冷冻组相比，褪黑素组卵母细胞GSH水平显著上升(P＜0.05)。
实施例4褪黑素提高了体外成熟过程中小鼠卵母细胞的线粒体膜电位水平
当冷冻卵母细胞解冻后，将体外培养0、8、12小时的各组不同时期(GV，MI和MII)卵母细胞进行线粒体膜电位水平检测。将各组不同时期(GV、MI和MII期)卵母细胞分别置于工作浓度为10μg/ml的JC-1染色液(M2为溶剂)中洗涤3次，再放入37.5℃，5％CO2饱和湿度培养箱内染色15分钟，经M2液洗涤3遍后，将这些细胞置于载玻片上进行压片，于4℃避光放置2小时后在荧光显微镜下(IX53Olympus，Tokyo，Japan)观察。获得图像保存为TIFF格式，用Image J1.48分析图片得出每个卵母细胞红色和绿色荧光的强度，并扣除背景值。红色荧光与绿色荧光的比值记为Δψm，作为该细胞线粒体膜电位的衡量指标。
如图3所示，在GV期，与新鲜组相比，冷冻组和冷冻加褪黑素组线粒体膜电位显著降低(P＜0.05)；与冷冻组相比，褪黑素组卵母细胞线粒体膜电位水平显著上升(P＜0.05)。在MI和MII期，与新鲜组相比，冷冻组卵母细胞线粒体膜电位水平显著降低(P＜0.05)，褪黑素组与新鲜组卵母细胞线粒体膜电位水平无差异；与冷冻组相比，褪黑素处理卵母细胞可显著提高卵母细胞线粒体膜电位(P＜0.05)。
实施例5褪黑素提高了体外成熟至MII期小鼠卵母细胞的ATP水平
当冷冻卵母细胞解冻后，将体外培养0、8、12小时的各组不同时期(GV，MI和MII)卵母细胞进行ATP水平检测。将卵母细胞随机分为新鲜组，冷冻组，冷冻+褪黑素组平行培养，并分别在冷冻解冻后体外培养0、8和12小时，收集此时的卵母细胞(分别为GV、MI和MII期卵母细胞)。将所得的卵母细胞用M2洗3次，按10个卵母细胞为一组加入含20微升ATP裂解液的EP管中，用于ATP检测。使用ATP含量测试盒并根据制造商说明书进行ATP水平的检测。简而言之，在96孔板中添加100微升的酶工作液，室温放置5分钟；再将含有20微升裂解液的卵母细胞转移至96孔板中，迅速用移液枪混匀，至少间隔2秒后，进行检测。用含有化学发光法的多功能酶标仪检测ATP水平。
如图4所示，在GV期和MI期，各组卵母细胞的ATP水平均无差异。在MII期，与新鲜组相比，冷冻组卵母细胞ATP水平显著降低(P＜0.05)，褪黑素组卵母细胞ATP水平无显著差异；与冷冻组相比，褪黑素组ATP水平显著升高(P＜0.05)。
实施例6褪黑素提高了体外成熟至MII期小鼠卵母细胞的纺锤体的正常形态
当冷冻卵母细胞解冻后，体外成熟至MII期时，对该时期卵母细胞进行免疫荧光染色。对于纺锤体染色，将卵母细胞固定在4％(W/V)多聚甲醛中，然后在渗透液(含有1％Triton X-100(v/v)的PBS)中渗透1h，室温。在室温下用1％BSA封闭卵母细胞1h后，将它们以1:2000的稀释度用FITC-anti-α-tubulin抗体(sigma，F2168)染色1h，室温。用洗涤缓冲液(含有0.01％TritonX-100和0.1％Tween 20的PBS)洗涤三次。洗涤5次，每次5min。并用DAPI染色DNA。最后将这些细胞置于载玻片上。通过共焦显微镜(AIR-Si Nikon，Tokyo，Japan)浏览(扫描)载玻片。
通过对MII期卵母细胞纺锤体进行分级后，由图5可知，新鲜组卵母细胞纺锤体形态的平均等级为3级，与新鲜组相比，冷冻组卵母细胞纺锤体形态的平均等级显著降低(P＜0.05)，为1.99级；褪黑素组卵母细胞纺锤体形态的平均等级为2.74级，与新鲜组无差异。与冷冻组相比，褪黑素组卵母细胞纺锤体形态的平均等级显著升高(P＜0.05)。
实施例7褪黑素改变了体外成熟过程中小鼠卵母细胞的纺锤体组装检测点相关基因的mRNA表达
当冷冻卵母细胞解冻后，将卵母细胞随机分为新鲜组，冷冻组，冷冻+褪黑素组平行培养，并分别在冷冻解冻后体外培养0、4、8、12小时，收集此时的卵母细胞(分别为GV、GVBD、MI和MII期卵母细胞)，每组细胞收集20个。使用Trans的TransScript-Uni Cell tocDNA和Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行样品抽提，反转录和荧光定量。此时检测纺锤体组装检测点的相关基因MPS1、BubR1、Mad1和Mad2的mRNA相对表达量。
如图6A所示，新鲜组、冷冻组和褪黑素组三组在GV期MpsI的表达量无显著差异；在GVBD和MI期，与新鲜组相比，冷冻组和褪黑素组Mps1基因的表达量显著下调(P＜0.05)，与冷冻组相比，褪黑素组Mps1的表达量无显著差异。在MII时期，与新鲜组相比，冷冻组Mps1基因表达量显著下调(P＜0.05)，与冷冻组相比，褪黑素组Mps1的表达量显著上调(P＜0.05)。在图6B中，与新鲜组GV期相比，冷冻组BubR1基因的表达量显著下调(P＜0.05)，褪黑素组基因表达无显著差异；与冷冻组相比，褪黑素组BubR1基因表达量显著上调(P＜0.05)。在GVBD和MI期，与新鲜组相比，冷冻组和褪黑素组BubR1基因的表达量显著下调(P＜0.05)；与冷冻组相比，褪黑素组该基因的表达量无显著差异。在MII期，新鲜组、冷冻组和褪黑素组三组间无显著差异。在图6C中,与新鲜组相比，冷冻组和褪黑素组在GV和GVBD期时Mad1基因的表达量都显著下调(P＜0.05)，且两者之间无显著差异。在MI期三组之间基因无显著差异。在MII期，与新鲜组相比，冷冻组基因的表达量显著下调(P＜0.05)，褪黑素组基因的表达量无显著差异；与冷冻组相比，褪黑素组基因表达量显著上调(P＜0.05)。基因Mad2的mRNA表达量如图6D所示,与新鲜组相比，冷冻组在GV期Mad2基因表达量显著下调(P＜0.05)；在GVBD和MI期，与新鲜组相比，冷冻组和褪黑素组Mad2基因表达量显著下调(P＜0.05)，且二者间无显著差异；在MII期，新鲜组，冷冻组和褪黑素组三组间Mad2基因的mRNA表达量无差异显著。
实施例8褪黑素提高了冻融小鼠生发泡期卵母细胞的体外成熟能力
新鲜组、冷冻组和冷冻+褪黑素组的卵母细胞在M16培养液中进行体外培养。体外培养后0、4、8和12小时分别统计GV期卵母细胞、GVBD期卵母细胞、MI期卵母细胞和MII期卵母细胞的发育比例。结果如表1所示：相比与新鲜组，冷冻组卵母细胞体外成熟过程中的GVBD期卵母细胞、MI期卵母细胞和MII期卵母细胞发育率明显下降(P<0.05)，冷冻组添加褪黑素(冷冻+褪黑素组)后，卵母细胞的体外发育率(不含GVBD期和MI期发育率)与新鲜组无显著差异(P>0.05)。
表1褪黑素对冻融小鼠生发泡期卵母细胞体外成熟的影响
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种提高玻璃化冷冻生发泡期卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)卵母细胞收集：采集7-8周龄雌性卵巢，选取带有2-3层颗粒细胞的生发泡期卵母细胞，洗涤后待用；
2)卵母细胞冷冻：采用开放式拉长塑料细管(open-pulled straw，OPS)法玻璃化冷冻，将卵母细胞依次经预处理液和冷冻液中处理后，将装载有卵母细胞的OPS投入到液氮中；
3)卵母细胞解冻：OPS从液氮中取出立即浸入37.5℃恒温的蔗糖溶液中，吹出卵母细胞至蔗糖溶液大液滴中，洗涤后转移至蔗糖溶液小液滴中，蔗糖溶液中时长共5分钟，然后将卵母细胞置于M16中培养1小时；
4)卵母细胞体外成熟：生发泡期卵母细胞继续在培养箱中培养4-12小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的预处理液为含褪黑素浓度为10-7mol/L的10％EG+10％DMSO；所述的冷冻液为含褪黑素浓度为10-7mol/L的EDFS30。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中蔗糖溶液的浓度为0.5mol/L，所述的蔗糖溶液和M16中均含有浓度为10-7mol/L的褪黑素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中培养条件为：5％CO2，37.5℃，100％湿度。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中体外成熟培养液为添加10-7mol/L褪黑素的M16。
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