CN111838131B - 一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法 - Google Patents

一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生育力保护保存技术。技术方案是：一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：1)卵巢组织冷冻：先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5‑20分钟后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；2)卵巢组织的解冻：先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热。该方法应具有可减少解冻后卵巢组织中颗粒细胞凋亡、提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率的特点。

Description

一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法
技术领域
本发明涉及一种生育力保护保存技术，具体涉及一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法。
背景技术
随着恶性肿瘤发病率逐年增加、发病年龄逐渐年轻化以及推迟生育年龄等个人原因，对生育力保存的需求急剧增加。保持女性生育力方法主要有胚胎冷冻、卵子冷冻及卵巢组织冷冻。卵巢冻存在生育力保存方面有其独特优势，如可保存青春期前女性患者的生育功能、可随时进行而不会延迟肿瘤本身的治疗、可保存诸如乳腺癌等激素敏感性肿瘤患者的生育功能、维持女性性腺内分泌功能等。2004年，Donnez等报告了通过卵巢组织冷冻保存和移植获得的第1个婴儿，是人类生殖医学的里程碑。截至2017年6月，全世界报道的活产婴儿数量已经超过130个，并且在2016～2017年呈对数增长，可见卵巢冷冻移植技术具有临床应用可行性，但是仍然存在移植后妊娠率低的问题。颗粒细胞的增殖与分化既是始基卵泡生长启动的重要前提，又为生长期卵泡的进一步发育成熟提供必要的营养与信息支持，在正常卵巢的周期性卵泡发育过程中，各期卵泡的闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关。玻璃化冻融过程对卵泡内颗粒细胞损伤较大，推测颗粒细胞损伤可能是冷冻过程中卵泡损伤的关键因素。因此优化卵巢组织冻存、改善复苏新技术，减少颗粒细胞凋亡显得尤为重要。
褪黑素(melatonin,MT)，化学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是松果体分泌的一种重要激素，褪黑素通过抑制凋亡、减少氧化应激等机制发挥其作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；该方法应具有可减少解冻后卵巢组织中颗粒细胞凋亡、提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率的特点。
本发明提供的技术方案是：
一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：
1)卵巢组织冷冻
先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素(melatonin,MT)，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5-20分钟(优选15分钟)后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；
所述基础液中含有20份牛血清与80份磷酸盐缓冲液；
所述平衡液中含有7.5份乙二醇、7.5份二甲基亚砜以及85份基础液；
所述冷冻液中含有15份乙二醇、15份二甲基亚砜、70份基础液以及0.5mol/L的蔗糖。
2)卵巢组织的解冻
先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热；
接着取出冷冻1周后的冷冻管，打开冷冻管帽将卵巢组织依次迅速浸入经37℃预热后的三种复苏液中逐步稀释去除冷冻保护剂；解冻浸入次序依次为含1mol/L蔗糖液的复苏液、含0.5mol/L蔗糖液的复苏液以及含0.25mol/L蔗糖液的复苏液；每次解冻平衡时间为5min；最后将卵巢组织用基础液冲洗2遍，每次5min。
所述基础液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含20ml胎牛血清及80ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，经0.22μm滤器过滤混匀后4℃备用。
所述平衡液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml平衡液中包含7.5ml分析纯乙二醇、7.5ml二甲基亚砜及85ml基础液，混匀后4℃保存备用。
所述冷冻液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含15ml分析纯乙二醇、15ml二甲基亚砜、70ml基础液及0.5mol/L的蔗糖，混匀后4℃保存备用。
所述1mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖3.42克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存，使用期限为1周。
所述0.5mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖1.71克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存，使用期限为1周。
所述0.25mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖0.855克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存，使用期限为1周。
本发明的独特点(与现有相同或相近技术比较)：
1.在玻璃化冷冻液(基础液、平衡液、冷冻液)及复苏液(1mol/L蔗糖、0.5mol/L蔗糖、0.25mol/L蔗糖)均添加0.01mM褪黑素，提升了冷冻卵巢组织抗凋亡的能力。
2.本发明的亮点是在玻璃化冷冻液及复苏液中均添加0.01mM褪黑素。
3.通过本发明的应用，玻璃化冷冻解冻后小鼠卵巢组织中颗粒细胞凋亡减少，说明褪黑素具有一定的抗凋亡作用，从而提高卵巢组织冷冻的效率。
本发明的有益效果是
1、本发明通过冷冻前在玻璃化冷冻液中添加0.01mM褪黑素，以及复苏时在复苏液中添加0.01mM褪黑素可以减少解冻后卵巢组织中颗粒细胞凋亡，从而提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率。
2、本发明方法简单，耗时短，且能有效减少卵巢组织玻璃化冷冻后颗粒细胞的凋亡，提高卵巢组织玻璃化冷冻的效率。
附图说明
图1是褪黑素作用浓度梯度以及时间梯度示意图；其中：
A图是在CVC434细胞培养液中加入不同浓度的褪黑素作用24小时后行蛋白印迹检测凋亡相关因子Bcl-2及Caspase-8的表达图；
B图是在CVC434细胞培养液中加入0.01mM的褪黑素，作用不同时间，通过蛋白印迹检测凋亡相关因子Bcl-2和Caspase-8的表达图；
C图是CVC434细胞经凋亡诱导剂CCCP 75uM处理40分钟后添加褪黑素0.01mM处理24小时，通过蛋白印迹检测凋亡相关因子Caspase-3、cleaved-parp和Bcl-2和的表达图。
图2为流式细胞术验证MT的抗凋亡作用示意图；其中：
A图为CVC 434细胞培养液空白对照组(A组)示意图；
B图为CVC 434细胞培养液经凋亡诱导剂CCCP 75uM处理40分钟(B组)示意图；
C图为0.01mM MT处理24小时后CCCP 75uM处理40分钟(C组)示意图；
D图为对A、B、C三组晚期凋亡细胞百分率(每组左边格子填充柱子)、以及总凋亡细胞百分率(每组右边斜条纹填充柱子)统计分析；P<0.001。格子柱子代表晚期凋亡细胞百分率，斜条纹柱子代表总凋亡细胞百分率。表明CVC 434细胞培养液进行0.01mM的MT处理后抗凋亡能力明显增强。
图3为组织学验证MT的抗凋亡作用示意图，表明褪黑素作用可降低冷冻卵巢组织凋亡水平；其中：
A图为ICR小鼠卵巢新鲜组照片(HE200X)；
B图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻组复苏后照片(HE200X)；
C图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻前在冷冻液中添加0.01mM MT复苏后照片(HE200X)；
D图为ICR小鼠卵巢新鲜组免疫组化图像(200X)；
E图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻组免疫组化图像(200X)；
F图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻前在冷冻液中添加0.01mM MT复苏后免疫组化图像(200X)。
图4为小鼠卵巢组织新鲜组、玻璃化冷冻组、0.1mM MT、0.01mM MT冷冻组石蜡切片行TUNEL检测图像。
图5为人卵巢组织玻璃化冷冻前后添加褪黑素后卵泡形态评估(箭头所指为始基卵泡)，表明褪黑素可以提高人卵巢组织玻璃化冷冻结局。
具体实施方式
申请人发现在玻璃化冷冻液、复苏液中均添加褪黑素可保护卵巢组织玻璃化冷冻卵泡及颗粒细胞的凋亡。因此，本发明拟通过在小鼠卵巢组织玻璃化冷冻过程中加入0.01mM褪黑素，和在复苏过程中加入0.01mM褪黑素，与常规玻璃化冻存方法相比，评估其有效性。
本发明采用了小鼠卵巢组织进行了玻璃化冷冻以及复苏的实验；具体如下：
1.小鼠卵巢组织的获取：采集6-8周龄雌性ICR小鼠卵巢，断颈处死后，取出其双侧卵巢并立即放入无菌PBS中。在盛放有PBS的培养皿中反复漂洗以去除组织中的血迹，并切除卵巢周围的脂肪和结缔组织。
2.小鼠卵巢组织冷冻：采用玻璃化冷冻法，将卵巢组织依次经含有0.01mM褪黑素(melatonin,MT)的基础液、平衡液、冷冻液中分别处理15分钟后，再将卵巢组织分别装入1.8ml冷冻管内密封直接投入液氮中保存。
冷冻过程溶液配制：
(1)基础液的配制：在超净工作台上进行无菌操作。基础液含有20％胎牛血清的PBS液，每100ml基础液中包含20ml胎牛血清及80ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)经0.22μm滤器过滤混匀后4℃备用。
(2)平衡液的配制：在超净工作台上进行无菌操作。平衡液为含7.5％乙二醇、7.5％二甲基亚砜的基础液。每100ml平衡液中包含7.5ml分析纯乙二醇、7.5ml二甲基亚砜及85ml基础液。混匀后4℃保存备用。
(3)冷冻液的配制：在超净工作台上进行无菌操作。冷冻液为含15％乙二醇、15％二甲基亚砜、0.5mol/l蔗糖的基础液。每100ml平衡液中包含15ml分析纯乙二醇、15ml二甲基亚砜及70ml基础液。混匀后4℃保存备用。
(4)使用时在超净台向上述三种液体中加入褪黑素，使其浓度为0.01mM即可。
3.小鼠卵巢组织的解冻：1周后取出冷冻管，打开冷冻管帽将卵巢组织迅速浸入依次含37℃预热的含0.01mM褪黑素复苏液(1mol/L蔗糖、0.5mol/L蔗糖、0.25mol/L蔗糖)培养皿中逐步稀释去除冷冻保护剂，每次平衡时间为5min。最后将卵巢组织用基础液冲洗2遍，每次5min。
解冻过程溶液配制：
(1)1mol/L蔗糖液：在超净工作台上进行无菌操作，电子天平称取蔗糖3.42克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用。4℃保存，使用期限为1周。
(2)0.5mol/L蔗糖液：在超净工作台上进行无菌操作，电子天平称取蔗糖1.71克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用。4℃保存，使用期限为1周。
(3)0.25mol/L蔗糖液：在超净工作台上进行无菌操作，电子天平称取蔗糖0.855克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用。4℃保存，使用期限为1周。
(4)当使用时在超净台向上述三种液体中加入褪黑素，使其浓度为0.01mM即可。
验证：
1、采用组织学验证MT的抗凋亡作用(参见图3)；其中：
A图为ICR小鼠卵巢新鲜组照片(HE200X)；显示卵泡形态正常；
B图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻组复苏后照片(HE200X)；显示卵泡形态发生异常改变；
C图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻前在冷冻液中添加0.01mM MT复苏后照片(HE200X)，显示卵泡形态接近正常；
D图为ICR小鼠卵巢新鲜组免疫组化图像(200X)，颗粒细胞Bcl-2表达丰富；
E图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻组免疫组化图像(200X)，颗粒细胞未见Bcl-2明显表达；
F图为ICR小鼠卵巢玻璃化冷冻前在冷冻液中添加0.01mM MT复苏后免疫组化图像(200X)，显示颗粒细胞Bcl-2表达丰富。
显然，图3中的D图与F图均显示颗粒细胞Bcl-2表达丰富；表明褪黑素作用可降低冷冻卵巢组织凋亡水平。
2、对小鼠卵巢组织新鲜组、玻璃化冷冻组、0.1mM MT、0.01mM MT冷冻组进行石蜡切片行TUNEL检测(参见图4中A至R的18张图)；
图4中的A图-F图为TUNEL荧光染色图，其荧光强度表明凋亡程度；G图-L图为细胞核DAPI荧光染色图，其荧光强度说明细胞的定位和存在；M图-R图为纵向TUNEL染色和DAPI染色的融合图，说明TUNEL和DAPI染色的叠加程度。其中：
A、G、M图为TUNEL染色的阳性对照实验，A图荧光表达明显，说明TUNEL染色实验步骤可行；
B、H、N图为TUNEL染色的阴性对照实验，B图荧光几乎不表达，说明该实验无非特异性染色；
C、I、O图为新鲜卵巢的TUNEL染色图，C图荧光几乎不表达，说明新鲜卵巢组织几乎不发生凋亡；
D、J、P图为常规玻璃化冷冻的TUNEL染色图，D图荧光表达强烈，说明常规卵巢组织玻璃化冷冻后卵巢组织发生凋亡明显；
E、K、Q图和F、L、R图为小鼠卵巢玻璃化冷冻前在冷冻液中添加0.1mM和0.01mM褪黑素复苏后的TUNEL染色，E图和F图荧光表达很弱，说明小鼠卵巢玻璃化冷冻前在冷冻液中添加0.01-0.1mM褪黑素后可以减少卵巢组织凋亡的发生。
结果证实0.01mM MT冷冻组较常规玻璃化冷冻组颗粒细胞凋亡明显减少，显示通过褪黑素作用可降低冷冻卵巢组织凋亡水平。
本发明还进行了以下实验进行验证：
3、CVC434细胞培养液中加入不同浓度的褪黑素(0mM,10-5mM,10-4mM,10-3mM,10- 2mM,10-1mM)作用24小时后行蛋白印迹检测凋亡相关因子Bcl-2及Caspase-8的表达(参见图1中的A图)；说明10-2mM，即0.01mM，为褪黑素作用的最佳浓度。
4、在CVC434细胞培养液中加入0.01mM的褪黑素，作用不同时间(0min,5min,10min,15min,20min,25min)，通过蛋白印迹检测凋亡相关因子Bcl-2和Caspase-8的表达(参见图1中的B图)；说明最佳作用时间为15分钟。
5、在CVC434细胞经凋亡诱导剂CCCP 75uM处理40分钟后添加褪黑素0.01mM处理24小时收样；经蛋白印迹检测Cleaved-parp、Caspase-3、Bcl-2(参见图1中的C图)，结果表明0.01mM的褪黑素有改善细胞凋亡作用。
6、采用流式细胞术验证MT的抗凋亡作用实验(参见图2)；
由图2中的A、B、C三图可知晚期凋亡细胞、以及总凋亡细胞百分率统计分析(P<0.001)表明，CVC 434细胞培养液进行0.01mM的MT处理后抗凋亡能力明显增强。
7、人卵巢组织玻璃化冷冻前后添加褪黑素后卵泡形态评估(参见图5)；其中：
A图为人新鲜卵巢组织形态正常始基卵泡形态图像(400X)；
B图为常规玻璃化冷冻组始基卵泡图像，其形态表现异常：卵泡形态不规则，颗粒细胞分布不均(400X)；
C图为在玻璃化冷冻液中添加0.01mM MT后始基卵泡图像，可观察到：卵泡颗粒细胞大部分排列整齐，卵母细胞核膜完整(400X)；
D图为玻璃化冷冻液及复苏液中均添加0.01mM MT组后卵泡图像，可观察到：卵泡颗粒细胞分布尚均匀，排列尚整齐(400X)。
由图5中的A、B、C、D四图可知，较常规玻璃化冷冻卵巢组织中的卵泡形态，冷冻液中添加0.01mM MT后卵巢组织以及冷冻液和复苏液中均添加0.01mM MT后卵巢组织中的卵泡形态更接近于人新鲜卵巢组织中的卵泡形态。

Claims (4)

1.一种提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法；依照以下步骤进行：
1)卵巢组织冷冻
先在基础液、平衡液、冷冻液中分别加入褪黑素(melatonin,MT)，使褪黑素浓度达到0.01mM；接着将取自人体的卵巢组织依次经基础液、平衡液、冷冻液中分别进行浸没处理5-20分钟后，再分别装入冷冻管内密封直接投入液氮中冷冻保存；
所述基础液中含有20份牛血清与80份磷酸盐缓冲液；
所述平衡液中含有7.5份乙二醇、7.5份二甲基亚砜以及85份基础液；
所述冷冻液中含有15份乙二醇、15份二甲基亚砜、70份基础液以及0.5mol/l的蔗糖；
2)卵巢组织的解冻
先在1mol/L的蔗糖液、0.5mol/L的蔗糖液以及0.25mol/L的蔗糖液中分别加入褪黑素，获得褪黑素浓度为0.01mM的三种复苏液，而后进行37℃预热；
接着取出冷冻1周后的冷冻管，打开冷冻管帽将卵巢组织依次迅速浸入经37℃预热后的三种复苏液中逐步稀释去除冷冻保护剂；解冻浸入次序依次为含1mol/L蔗糖液的复苏液、含0.5mol/L蔗糖液的复苏液以及含0.25mol/L蔗糖液的复苏液；每次解冻平衡时间为5min；最后将卵巢组织用基础液冲洗2遍，每次5min；
所述基础液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含20ml胎牛血清及80ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，经0.22μm滤器过滤混匀后4℃备用；
所述平衡液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml平衡液中包含7.5ml分析纯乙二醇、7.5ml二甲基亚砜及85ml基础液，混匀后4℃保存备用；
所述冷冻液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；每100ml基础液中包含15ml分析纯乙二醇、15ml二甲基亚砜、70ml基础液及0.5mol/L的蔗糖，混匀后4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法，其特征在于：所述1mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖3.42克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存。
3.根据权利要求1所述的提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法，其特征在于：所述0.5mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖1.71克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存。
4.根据权利要求1所述的提高卵巢组织玻璃化冷冻效率的方法，其特征在于：所述0.25mol/L蔗糖液的配制，需在超净工作台上进行无菌操作；先电子天平称取蔗糖0.855克，置于15ml无菌离心管中，向离心管加入基础液5ml，颠倒离心管使蔗糖充分溶解，再加入基础液至10ml，0.22μm滤器过滤后备用；4℃保存。
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