CN115885971A - 一种卵巢组织的冻存复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卵巢组织的冻存复苏方法，该方法包括卵巢组织预处理，冻存和复苏。冻存液包括2‑8V/V％人血清白蛋白、2‑8V/V％DMSO和Leibovitz'sL‑15培养基。复苏液包括#1复苏液：DPBS，4‑17V/V％人血白蛋白，0.5‑1mol/L蔗糖；#2复苏液：DPBS，4‑17V/V％人血白蛋白，0.1‑0.7mol/L蔗糖；#3复苏液：DPBS，4‑17V/V％人血白蛋白，0.05‑0.4mol/L蔗糖；#4复苏液：DPBS，4‑17V/V％人血白蛋白。采用本发明冻存液和复苏液以及冻存复苏方法进行卵巢组织的冻存和复苏，可最大限度减少对细胞的损伤。
Description
技术领域
本发明属于生殖临床领域，具体涉及一种卵巢组织的冻存复苏方法。
背景技术
目前对生殖力保护的方法有几种：卵子冻存、胚胎冻存和卵巢组织冻存。胚胎冻存为试管婴儿的常规技术。卵子冻存，目前中国限于不孕不育IVF患者取精失败或卵巢过度刺激放弃周期的患者，不适用于青春期前女孩及大多急需放化疗的癌症患者，有很大的局限性。
而卵巢组织冻存与再移植技术是目前国际上最新的、最有前景的生殖力保护方法。在放化疗前取部分卵巢组织经特殊处理冻存起来，待其临床痊愈后移植回体内，不仅可以恢复患者的生育能力，还可以恢复其卵巢的内分泌功能，也是抗衰老的热点话题。在欧美发达国家，卵巢组织冻存与再移植技术已作为常规生殖力保护技术应用了十余年，而在我国尚无妊娠分娩成功案例报道。
为了保证卵巢组织再移植回所有者体内后的活性，卵巢组织的冻存和复苏的试剂和方法至关重要。卵巢组织的冻存和复苏液和方法直接影响再移植后的活性，因此，需要提供一种能够适宜卵巢组织冻存、复苏，提高卵巢组织再移植活性的试剂及其方法。
目前现有生育力保存技术需要对患者进行促排卵，这将耽误患者数月治疗时间，且该技术只能为患者保存一定数量卵子，也无法再为患者提供卵巢正常分泌功能。
发明内容
本发明提供一种卵巢组织的冻存复苏方法，可在患者发现病情，及时进行生育力保存服务，无需耽误患者病情治疗最佳时间。同时本发明具有较高概率为患者重新提供正常卵巢分泌功能。相比现有生育力保存技术，可为患者提供更多的卵泡储备，具体包括以下内容：
本发明第一方面提供一种用于冻存卵巢组织的冻存液，所述冻存液包括如下组分：2-8V/V％人血清白蛋白、2-8V/V％DMSO和Leibovitz's L-15培养基。
优选地，所述冻存液包括如下组分：5V/V％人血清白蛋白、5V/V％DMSO和Leibovitz'sL-15培养基。
进一步地，采用上述冻存液进行卵巢组织冻存时，包括如下步骤：
卵巢组织去除髓质，保留皮质，处理成卵巢皮质片段；将卵巢皮质片段置于冷冻管中，加入所述冻存液，然后进行降温，降温程序包括：4℃，放置15min；以2℃/min的速度降至-6℃；升至-5.7℃，保持10min；以0.5℃/min的速度降至-40℃；以50℃/min的速度降至-140℃，转移至-196℃液氮中储存。
本发明第二方面提供一种用于冻存卵巢组织的复苏液，所述复苏液包括#1复苏液、#2复苏液、#3复苏液和#4复苏液，包括如下组分：
#1复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白，0.5-1mol/L蔗糖；
#2复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白，0.1-0.7mol/L蔗糖；
#3复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白，0.05-0.4mol/L蔗糖；
#4复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白；
优选地，所述复苏液包括#1复苏液、#2复苏液、#3复苏液和#4复苏液，包括如下组分：
#1复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.75mol/L蔗糖；
#2复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.45mol/L蔗糖；
#3复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.125mol/L蔗糖；
#4复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白。
进一步地，采用所述复苏液进行冻存卵巢组织复苏时，包括如下步骤：
将冻存卵巢组织从液氮中取出，水浴融化后将组织置入所述复苏液中，其中置入#1复苏液，室温15min；接着转入#2复苏液，室温15min；然后转入#3复苏液，室温15min；再转入#4复苏液，室温10min；最后转入#4复苏液，室温10min。
本发明所述的冻存液或复苏液技术方案中，所述卵巢组织为小鼠卵巢组织、大鼠卵巢组织、兔卵巢组织、猪卵巢组织或人卵巢组织。
本发明第三方面提供一种卵巢组织的冻存复苏方法，包括以下步骤：
(1)卵巢组织预处理：卵巢组织去除髓质，保留皮质，处理成卵巢皮质片段；
(2)卵巢组织冻存：将卵巢皮质片段置于冷冻管中，加入所述冻存液，然后进行降温，降温程序包括：4℃，放置15min；以2℃/min的速度降至-6℃；升至-5.7℃，保持10min；以0.5℃/min的速度降至-40℃；以50℃/min的速度降至-140℃，转移至-196℃液氮中储存；
(3)卵巢组织复苏：将冻存管从液氮中取出，水浴融化后将组织取出，置入所述复苏液中，其中置入#1复苏液，室温15min；接着转入#2复苏液，室温15min；然后转入#3复苏液，室温15min；再转入#4复苏液，室温10min；最后转入#4复苏液，室温10min。
进一步地，所述卵巢组织用预冷的PBS清洗，置于预冷的器官移植液中，放置于低温转运箱中，24小时内运输至实验室，在4℃温控板上进行卵巢组织预处理；
优选地，所述的器官移植液组分包括：Leibovitz's L-15培养基、2-8％人血清白蛋白。
进一步地，所述卵巢皮质片段的大小为0.5×1.0cm，厚度为1-2mm。
进一步地，所述冻存管为2mL冻存管，所述冷冻管中加入冻存液的量为1.5mL；
优选地，1个冻存管中置入1个卵巢皮质片段；
优选地，所述#1-#4复苏液的用量均为5mL。
本发明上述卵巢组织的冻存复苏方法技术方案中，所述卵巢组织为小鼠卵巢组织、大鼠卵巢组织、兔卵巢组织、猪卵巢组织或人卵巢组织。
与现有技术相比，本发明取得了以下优势：
(1)为了更好保存卵巢组织中细胞活性，含有大量细胞的组织具有一定厚度，本发明在冻存过程中，采用缓慢冻存技术，让DMSO缓慢渗入组织细胞中，降低细胞内冰点、延缓冻存过程；同时提高细胞内离子浓度，防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。
(2)在复苏时，本发明中的缓慢复苏技术，可防止细胞内冰晶重形成以及降低DMSO含量，保护组织细胞免受损伤。
(3)本发明的方法可为患者在不耽误最佳治疗时间情况下，及时进行生育力保存，尤其对于青春期前女性生育力保存非常有效。
(4)本发明的一片组织中可保存数百个甚至上千个不同成熟程度的卵泡。
(5)采用本发明所述的方法，患者移植回组织可在一定程度上恢复卵巢分泌功能。
附图说明
图1为本发明的卵巢组织冻存复苏方法流程图。
具体实施方式
为了更好保存卵巢组织中细胞活性，含有大量细胞的组织具有一定厚度，在冻存过程中，需要DMSO缓慢渗入组织细胞中，降低细胞内冰点、延缓冻存过程；同时提高细胞内离子浓度，防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。本发明采用缓慢降温程序最大限度减少冷冻过程对细胞的损伤。在复苏过程，为减少因细胞内冰晶再形成对细胞成分造成的损伤，以及同时降低DMSO对组织细胞的毒性作用，本发明采用慢速低温复苏程序，减少冰晶形成的同时低温梯度稀释冻存液中DMSO含量，保护组织细胞免受DMSO毒性损伤。冷冻保存卵巢组织，若干年后复苏卵巢组织，移植回体内，使卵巢组织继续在体内发挥功能。
本发明中所述的小鼠卵巢为C57小鼠卵巢。
大鼠卵巢为SD大鼠卵巢。
兔卵巢为新西兰白兔卵巢。
猪卵巢为长白猪卵巢。
实施例中所述的器官移植液组分包括：Leibovitz's L-15培养基、5V/V％人血清白蛋白。
实施例中所述的冻存液组分包括：5V/V％人血清白蛋白、5V/V％DMSO、Leibovitz'sL-15培养基。
实施例中所述的复苏液组分为：#1复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.75mol/L蔗糖；#2复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.45mol/L蔗糖；#3复苏液：DPBS，10％人血白蛋白，0.125mol/L蔗糖；#4复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
小鼠1的卵巢组织冻存复苏
(1)小鼠1的卵巢组织用预冷的PBS洗两遍，置于预冷的器官移植液中，放置于5-8℃的转运箱中，24小时内运输至实验室；
(2)在4℃温控板上，取出组织，用预冷的无菌刀片刮去髓质，再用无菌剪刀将卵巢处理成1-2mm厚度卵巢皮质；
(3)用无菌剪刀将卵巢皮质剪至0.5×1.0cm大小的片段；
(4)每片段置入2ml冻存管中，加入1.5ml冻存液；
(5)将冻存管转移至程序降温仪，降温程序：4℃，15min→2℃/min，降至-6℃→升至-5.7℃，保持10min→0.5℃/min，降至-40℃→50℃/min，降至-140℃，转移至-196℃液氮中储存。
(6)复苏：将冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴中，不停摇晃，待冻存管中溶液大部分融化时，将组织取出，置入5ml#1复苏液，室温15min；接着转入5ml#2复苏液，室温15min；然后转入5ml#3复苏液，室温15min；再转入5ml#4复苏液，室温10min；最后转入5mll#4复苏液，室温10min。
实施例2
按照实施例1所述的方法，又对2例小鼠卵巢、3例大鼠卵巢、3例兔卵巢、3例猪卵巢组织冻存复苏。
实施例3
对实施例1和2中完成冻存复苏的卵巢组织进行活率检测实验，检测方法如下：
(1)取2mm大小组织，剪碎，加入500μL，1mg/mL I型胶原酶，37℃，消化2h，每半小时颠倒混匀一次；
(2)加入500μL 50％牛血清白蛋白终止消化，70um滤膜过滤；
(3)1500rpm离心5min，收取细胞沉淀；
(4)细胞沉淀用50μLPBS重悬；取10μL细胞悬液加入10μL台盼蓝进行染色，取10μL上述混合液进行滴入细胞计数板，显微镜下进行活细胞计数，计算活率；检测结果如表1所示。
表1
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于冻存卵巢组织的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：2-8V/V％人血清白蛋白、2-8V/V％DMSO和Leibovitz's L-15培养基。
2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括如下组分：5V/V％人血清白蛋白、5V/V％DMSO和Leibovitz's L-15培养基。
3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于，采用权利要求1所述冻存液进行卵巢组织冻存时，包括如下步骤：
卵巢组织去除髓质，保留皮质，处理成卵巢皮质片段；将卵巢皮质片段置于冷冻管中，加入权利要求1所述冻存液，然后进行降温，降温程序包括：4℃，放置15min；以2℃/min的速度降至-6℃；升至-5.7℃，保持10min；以0.5℃/min的速度降至-40℃；以50℃/min的速度降至-140℃，转移至-196℃液氮中储存。
4.一种用于冻存卵巢组织的复苏液，其特征在于，所述复苏液包括#1复苏液、#2复苏液、#3复苏液和#4复苏液，包括如下组分：
#1复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白，0.5-1mol/L蔗糖；
#2复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白，0.1-0.7mol/L蔗糖；
#3复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白，0.05-0.4mol/L蔗糖；
#4复苏液：DPBS，4-17V/V％人血白蛋白；
优选地，所述复苏液包括#1复苏液、#2复苏液、#3复苏液和#4复苏液，包括如下组分：
#1复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.75mol/L蔗糖；
#2复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.45mol/L蔗糖；
#3复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白，0.125mol/L蔗糖；
#4复苏液：DPBS，10V/V％人血白蛋白。
5.根据权利要求4所述的复苏液，其特征在于，采用权利要求3所述复苏液进行冻存卵巢组织复苏时，包括如下步骤：
将冻存卵巢组织从液氮中取出，水浴融化后将组织置入权利要求3所述复苏液中，其中置入#1复苏液，室温15min；接着转入#2复苏液，室温15min；然后转入#3复苏液，室温15min；再转入#4复苏液，室温10min；最后转入#4复苏液，室温10min。
6.根据权利要求1所述的冻存液或权利要求4复苏液，其特征在于，所述卵巢组织为小鼠卵巢组织、大鼠卵巢组织、兔卵巢组织、猪卵巢组织或人卵巢组织。
7.一种卵巢组织的冻存复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)卵巢组织预处理：卵巢组织去除髓质，保留皮质，处理成卵巢皮质片段；
(2)卵巢组织冻存：将卵巢皮质片段置于冷冻管中，加入权利要求1所述冻存液，然后进行降温，降温程序包括：4℃，放置15min；以2℃/min的速度降至-6℃；升至-5.7℃，保持10min；以0.5℃/min的速度降至-40℃；以50℃/min的速度降至-140℃，转移至-196℃液氮中储存；
(3)卵巢组织复苏：将冻存管从液氮中取出，水浴融化后将组织取出，置入权利要求3所述复苏液中，其中置入#1复苏液，室温15min；接着转入#2复苏液，室温15min；然后转入#3复苏液，室温15min；再转入#4复苏液，室温10min；最后转入#4复苏液，室温10min。
8.根据权利要求7所述的冻存复苏方法，其特征在于，所述卵巢组织用预冷的PBS清洗，置于预冷的器官移植液中，放置于低温转运箱中，24小时内运输至实验室，在4℃温控板上进行卵巢组织预处理；
优选地，所述的器官移植液组分包括：Leibovitz's L-15培养基、2-8V/V％人血清白蛋白；
优选地，所述卵巢皮质片段的大小为0.5×1.0cm，厚度为1-2mm。
9.根据权利要求6所述的冻存复苏方法，其特征在于，所述冻存管为2mL冻存管，所述冷冻管中加入冻存液的量为1.5mL；
优选地，1个冻存管中置入1个卵巢皮质片段；
优选地，所述#1-#4复苏液的用量均为5mL。
10.根据权利要求6所述的冻存复苏方法，其特征在于，所述卵巢组织为小鼠卵巢组织、大鼠卵巢组织、兔卵巢组织、猪卵巢组织或人卵巢组织。
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| CN117099771A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-11-24 | 江苏太平洋美诺克生物药业股份有限公司 | 用于中国仓鼠卵巢细胞的高通量冻存的细胞冻存液 |
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