CN117099771A - 用于中国仓鼠卵巢细胞的高通量冻存的细胞冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量深低温冻存细胞样品的无血清冻存液和使用该冻存液进行冻存的方法。本发明提供的冻存液能够保证中国仓鼠卵巢细胞在经过深低温冻存后，复苏的细胞仍具有良好生物活性，其表达的产物仍具有稳定的表达量和良好的生物学功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存领域，具体地涉及一种高通量深低温保存中国仓鼠卵巢细胞的冻存液及使用所述冻存液进行冻存的方法。
背景技术
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用细胞冻存技术将细胞储存于液氮中深低温保存，可以使细胞达到长期储存的目的。同时，良好的冻存质量可以使细胞在复苏时具备与冻存前一致的细胞特性，如细胞倍增时间、表达产物的数量和品质的高度稳定和一致等，从而为生产和实验等工作长期稳定的开展提供了必要的支撑。
生物制药领域中，工程细胞株是生产和实验的重要原材料。中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞是目前蛋白生产的重要的宿主细胞系，与其他表达系统相比，它具有许多优点。已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，并商业化。CHO细胞的有效保存和培养，对生产的稳定性、连续性、重现性及可控性起到举足轻重的作用。规模较大的、标准化的和具备长期贮存稳定性的CHO细胞库，能够为企业持续性地提供稳定表达目标蛋白的CHO细胞。这样的细胞库的贮存稳定主要依赖细胞冻存的质量，其中细胞冻存液又是影响细胞冻存质量的重要因素。
目前细胞冻存常采用包含血清组分的冻存液进行细胞冻存，一般冻存数量在20-50支左右。而对于生物制药企业，20-50支的细胞库规模，不能满足其长期稳定连续的生产需要，同时细胞库制备和检测的成本较高，特别是细胞库外检的时间周期较长。因此，本领域对高通量(例如超过200支)且高质量细胞冻存的技术仍有需求。
本发明的发明人针对中国仓鼠卵巢细胞，开展了建立高通量标准化细胞库的研究，其中研究核心是提供一种用于高通量冻存细胞的细胞冻存液，以及提供一种使用这种细胞冻存液进行冻存的方法。
发明内容
本申请的一个方面提供了一种用于冻存中国仓鼠卵巢细胞的无血清冻存液，其包含无血清培养基、5％-10％(v/v)DMSO、0.05-0.1M海藻糖、5-10g/L人白蛋白和2-5g/L甲基纤维素，其中所述无血清培养基选自CD CHO培养基、CD OptiCHOTM培养基、Hycell CHO培养基、S3 CD CHO培养基和S4 CHO培养基。
在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含7.5％(v/v)DMSO。在某些的实施方式中，上述无血清冻存液包含10％(v/v)DMSO。
在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含0.05M海藻糖。在某些实施方式中，海藻糖的浓度为0.1M。
在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含5g/L人白蛋白。在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含10g/L人白蛋白。在某些实施方式中，无血清冻存液包含的人白蛋白系通过重组表达获得的。在某些实施方式中，无血清冻存液包含的人白蛋白包含天然人白蛋白序列或者是突变的人白蛋白序列。
在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含2g/L甲基纤维素。在某些实施方式中，上述无血清冻存液包含5g/L甲基纤维素。
在某些实施方式中，上述无血清冻存包含无血清培养基、10％(v/v)DMSO、0.05M海藻糖、10g/L人白蛋白和2g/L甲基纤维素。
在某些实施方式中，上述无血清冻存包含无血清培养基、7.5％(v/v)DMSO、0.1M海藻糖、5g/L人白蛋白和2g/L甲基纤维素。
在某些实施方式中，本申请的中国仓鼠卵巢细胞为重组中国仓鼠卵巢细胞。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞导入了编码目标蛋白的核酸。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞包含带有稳定整合的编码目标蛋白的核酸的载体。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞稳定地表达目标蛋白。
在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞包含编码抗CD147单克隆抗体的核酸。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞稳定地表达抗CD147单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗CD147单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者所述重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列和所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗CD147单克隆抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量达到2.0g/L。
本申请的另一方面提供了一种冻存中国仓鼠卵巢细胞的方法，包括使用本申请公开的无血清冻存液对所述中国仓鼠卵巢细胞进行冻存，包括将中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合形成细胞悬液，在90分钟之内将所述细胞悬液降温至-80℃以下，随后将所述细胞悬液转移至液氮中储存。
在一些实施方式中，所述中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合后的细胞悬浮液的的起始浓度为1×107–5×108细胞/mL。在一些实施方式中，所述中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合后的细胞悬浮液的起始浓度为5×107细胞/mL。
附图说明
图1显示了采用实验例1-11和实验例1-14的冻存液进行冻存的细胞的贮存稳定性考察结果。
具体实施方式
尽管本申请将公开各种方面和实施方式，但是显而易见的是，在不偏离本申请的主旨和范围的前提下，本领域技术人员可以对这些方面和实施方式进行各种等同改变和修改。本申请公开的各个方面和实施方式仅用于说明目的，并非旨在限制，真正的范围由所附权利要求表示。本申请引用的所有出版物、专利或专利申请通过引用整体并入本申请。除非另外说明，否则本申请中使用的所有科技术语具有的含义与本申请所属领域技术人员通常理解的含义相同。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象，除非上下文清楚地表示不是这样。术语“一个或多个”和“至少一个”在本申请中可以互换使用。还应当注意的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
本申请的一个方面公开了一种用于冻存中国仓鼠卵巢细胞的无血清冻存液，其包含无血清培养基、5％-10％(v/v)DMSO、0.05-0.1M海藻糖、5-10g/L人白蛋白和2-5g/L甲基纤维素。
在本文中使用的“无血清培养基”选自CD CHO培养基、CD OptiCHOTM培养基、HycellCHO培养基、S3 CD CHO培养基和S4 CHO培养基的培养基。在本文中使用的“无血清培养基”是无动物来源成分、无血清且化学成分确定的培养基，适用于中国仓鼠卵巢细胞的培养。具体地，CD CHO培养基适用于中国仓鼠卵巢细胞的生长和悬浮培养中的重组蛋白表达。CDCHO培养基可以购自Thermo Fisher Scientific公司(货号为12490003)或者选自其他具有相同组分的培养基。CD OptiCHOTM培养基能够提供重组CHO细胞的高性能和产量。CDOptiCHOTM培养基可以购自Thermo Fisher Scientific公司(货号为12681011)或者选自其他具有相同组分的培养基。Hycell CHO培养基适用于高收率中国仓鼠卵巢细胞培养和重组蛋白生产。Hycell CHO培养基可以购自Hyclone公司(货号为SH30933.04)或者选自其他具有相同组分的培养基。S3 CD CHO培养基和S4 CHO培养基适合中国仓鼠卵巢细胞的分批培养、补料分批培养和灌流培养。S3 CD CHO培养基和S4 CHO培养基均可以购自上海多宁生物科技股份有限公司，产品编号分别为M014-001(或MNP014)和MT022-1L(或MNP022-001)；也可以选自其他具有相同组分的培养基。
本文中的“DMSO”是指“二甲基亚砜”，其分子式为(CH3)2SO。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖。
本文中的“人白蛋白”即人血清白蛋白(HSA)。其中人血清白蛋白是一种可溶性的单链蛋白质，是人体血液中的主要蛋白质。人血清白蛋白在人体内负责许多细胞功能。在某些实施方式中，所述人白蛋白具有天然人白蛋白序列。在某些实施方式中，所述人白蛋白具有突变的人白蛋白序列，所述突变包括例如截短(在N端、C端或者二者)、缺失、添加或替换。在某些实施方式中，本文的无血清冻存液包含人白蛋白的功能性片段。人白蛋白的示例性氨基酸的序列如SEQ ID NO:19所示。在某些实施方式中，人白蛋白包含与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，人白蛋白包含选自SEQ ID NO:19-23所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，人白蛋白包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，人白蛋白包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，人白蛋白包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，人白蛋白包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述人白蛋白是通过重组表达获得的。在某些实施方式中，所述人白蛋白通过植物细胞表达获得。在某些实施方式中，所述人白蛋白通过转基因水稻细胞表达获得。人白蛋白可以购自Sigma-Aldrich公司，货号A9731。
甲基纤维素又名纤维素甲醚(MC)，是一种长链取代纤维素，其分子量(平均数)的范围在10,000-220,000Da之间，不同分子量的甲基纤维素具有不同的粘度。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为12-2,000cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为12-1,200cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为1,200-1,800cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为12-30cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为30-100cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为100-300cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为300-600cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为600-900cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为900-1,200cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为1,200-1,400cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为1,400-1,600cp。在一些实施方式中，无血清冻存液中添加的甲基纤维素粘度为1,600-1,800cp。在一些实施方式中，甲基纤维素可以购自Sigma-Aldrich公司，货号M0387。
在某些实施方式中，本发明的无血清冻存液包含无血清培养基、5％-10％ DMSO(v/v)、0.05-0.1M海藻糖、5-10g/L人白蛋白和2-5g/L甲基纤维素。即，所述无血清冻存液包含：
(1)无血清培养基溶液，其选自CD CHO培养基、CD OptiCHOTM培养基、Hycell CHO培养基、S3 CD CHO培养基和S4 CHO培养基，
(2)5％-10％(v/v)DMSO，其中5％-10％(v/v)是指使用的DMSO的体积相比于无血清冻存液的总体积的比值为5％-10％，
(3)0.05-0.1M海藻糖，即无血清冻存液中的海藻糖的浓度为0.05-0.1mol/L，
(4)5-10g/L人白蛋白，即无血清冻存液中的人白蛋白的浓度为5-10g/L，和
(5)2-5g/L甲基纤维素，即无血清冻存液中的甲基纤维素的浓度为2-5g/L。其中，所述无血清冻存液的总体积为冻存液中各组分加入后的体积之和。
在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含7.5％-10％(v/v)DMSO。在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％(v/v)DMSO。在某些实施方案中，无血清冻存液包含7.5％(v/v)DMSO。在某些实施方案中，无血清冻存液包含10％(v/v)DMSO。
在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M或0.1M海藻糖。在某些实施方案中，无血清冻存液包含0.05M海藻糖。在某些实施方案中，无血清冻存液包含0.1M海藻糖。
在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L或10g/L人白蛋白。在某些实施方案中，无血清冻存液包含5g/L人白蛋白。在某些实施方案中，无血清冻存液包含10g/L人白蛋白。
在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L或5g/L甲基纤维素。在某些实施方式中，无血清冻存液包含2g/L甲基纤维素。在某些实施方式中，无血清冻存液包含5g/L甲基纤维素。
在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含无血清培养基溶液、10％(v/v)DMSO、0.05M海藻糖、10g/L人白蛋白和2g/L甲基纤维素。
在上述实施方式中的某些实施方案中，无血清冻存液包含无血清培养基溶液、7.5％(v/v)DMSO、0.1M海藻糖、5g/L重组人白蛋白和2g/L甲基纤维素。
中国仓鼠卵巢细胞是一类便于基因操作并易于培养和生产目标蛋白的哺乳动物细胞。在某些实施方式中，中国仓鼠卵巢细胞是CHO-K1细胞、CHO-S细胞或CHO-DG44细胞(CHO-DHFR细胞)。可以通过基因工程手段来提供表达目标蛋白的重组中国仓鼠卵巢细胞。例如可以通过下列步骤来提供：(1)构建包含编码目标蛋白的核酸序列的载体；(2)于中国仓鼠卵巢细胞(例如二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞，即CHO-DHFR细胞)中导入前述包含编码目标蛋白的核酸序列的载体以产生重组中国仓鼠卵巢细胞；(3)筛选稳定表达目标蛋白的1个或多个的重组中国仓鼠卵巢细胞；(4)培养筛选获得的能够稳定表达目标蛋白的重组中国仓鼠卵巢细胞，以生产目标蛋白。上述步骤中涉及的构建和导入载体、筛选和培养稳定表达目标蛋白的重组细胞或细胞系的方法及其中使用的载体元件等已为本领域技术人员所熟知，例如分子生物学实验手册等中所示的各种技术，包括但不限于MichaelR.Green和Joseph Sambrook的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版，ColdSpring Laboratory出版社)。
在某些实施方式中，本发明的无血清冻存液用于冻存重组中国仓鼠卵巢细胞。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞中导入了编码目标蛋白的核酸。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞包含带有稳定整合的编码目标蛋白的核酸的载体。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞稳定地表达目标蛋白。在某些实施方式中，所述目标蛋白为抗体，例如人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体或抗体的抗原结合片段。所述抗体的“抗原结合片段”是指保留了与抗原特异性结合的能力的抗体片段，包括例如Fab片段、F(ab’)2、Fd片段(由VH和CH1区所组成)和Fv片段等。
在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞导入了编码抗CD147单克隆抗体的核酸。在某些实施方式中，所述重组中国仓鼠卵巢细胞包含稳定整合的编码抗CD147单克隆抗体的核酸。在某些实施方式中，重组中国仓鼠卵巢细胞表达抗CD147单克隆抗体。CD147分子是一个跨膜糖蛋白家族，高表达于上皮来源的肿瘤细胞表面，如肺癌、乳腺癌及肝癌等。有研究表明，CD147还与疟原虫的侵袭和病毒的感染有关。抗CD147抗体在肿瘤、疟疾、炎症等疾病的治疗中发挥重要的作用。
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147单克隆抗体包括如SEQ IDNO:3所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:4所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:5所示的重链CDR3、如SEQ ID NO:6所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:7所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:8所示的轻链CDR3。
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147单克隆抗体包括包含如
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147单克隆抗体包括包含如
SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链。
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147单克隆抗体包括如SEQ IDNO:13所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:14所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:15所示的重链CDR3、如SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3。
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147单克隆抗体包括包含如SEQID NO:11所示的氨基酸序列的重链可变区和如包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的轻链可变区。
表1氨基酸序列
在上述实施方式中的某些实施方案中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量可以达到2.0g/L至3.8g/L。在某些实施方式中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量可以达到2.0g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L、2.6g/L、2.7g/L、2.8g/L、2.9g/L、3.0g/L、3.1g/L、3.2g/L、3.3g/L、3.4g/L、3.5g/L、3.6g/L、3.7g/L或3.8g/L。
在某些实施方式中，中国仓鼠卵巢细胞中的抗体表达量在冻存后的细胞中没有降低，或者降低不超过5％、10％、15％或者20％。在某些实施方式中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量在冻存后的细胞中没有降低。在某些实施方式中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量在冻存后的细胞中降低不超过5％。在某些实施方式中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量在冻存后的细胞中降低不超过4.9％、4.8％、4.7％、4.6％、4.5％、4.4％、4.3％、4.2％、4.1％、4.0％、3.9％、3.8％、3.7％、3.6％、3.5％、3.4％、3.3％、3.2％、3.1％、3.0％、2％或1％。
在某些实施方式中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量在细胞冻存后可以达到2.0g/L至3.8g/L。在某些实施方式中，所述抗CD147抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量在细胞冻存后可以达到2.0g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L、2.6g/L、2.7g/L、2.8g/L、2.9g/L、3.0g/L、3.1g/L、3.2g/L、3.3g/L、3.4g/L、3.5g/L、3.6g/L、3.7g/L或3.8g/L。
在一些实施方式中，本申请中的无血清冻存液特别适用于高通量深低温保存CHO细胞。在实验室及工业化冻存细胞过程中，由于细胞在冻存液中的沉降，限制了一次性冻存的冻存管数量，难以获得规模较大的、高一致性的和具备长期贮存稳定性的CHO细胞库。本申请中的无血清冻存液基于其添加的成分组合和含量，出乎意料地使得细胞能够长时间(例如1、1.5、2、2.5、3小时)地稳定地悬浮于冻存液中，以允许一次性大量地进行细胞冻存。具体地，可以一次性为含有200支、300支、400支、450支、或500支甚至更多支的冻存管(2mL/支)的CHO细胞库提供冻存液，从而实现高通量冻存。同时，本申请的冻存液允许被冻存的细胞悬液(即中国仓鼠卵巢细胞和冻存液混合后的细胞悬浮液)的冻存起始浓度大于1×107细胞/mL，例如可以是5×107细胞/mL、6×107细胞/mL、7×107细胞/mL、8×107细胞/mL、9×107细胞/mL、1×108细胞/mL、2×108细胞/mL、3×108细胞/mL、4×108细胞/mL或5×108细胞/mL。包含中国仓鼠卵巢细胞和本申请的冻存液的细胞悬浮液的冻存起始浓度远高于比本领域一般冻存液冻存的细胞悬浮液的起始浓度。
本申请的另一方面提供了一种冻存中国仓鼠卵巢细胞的方法，包括使用本申请公开的无血清冻存液对所述中国仓鼠卵巢细胞进行冻存，包括将所述中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合形成细胞悬液，在90分钟内将所述细胞悬液降温至-80℃以下，随后将所述细胞悬液转移至液氮中储存。本申请提供的冻存细胞的方法，通过设定多个变温环节(包括变温起始温度和终止温度，以及降温的速率)，精准地控制细胞悬液温度和环境温度的变化，达到了可控性强、在冻存过程中充分保护细胞的性能不受损害的效果。
在某些实施方式中，在90分钟内将所述细胞悬液从2℃、或者3℃、或者5℃、或者6℃、或者7℃、或者8℃降温至-80℃以下。在某些实施方式中，在90分钟内将所述细胞悬液从4℃降温至-80℃。在某些实施方式中，在90分钟内将所述细胞悬液从4℃降温至-90℃。在某些实施方式中，在90分钟内将所述细胞悬液从4℃降温至-100℃。在某些实施方式中，在90分钟内完成降温至-80℃以下的程序。在某些实施方式中，在65-75分钟完成降温至-80℃以下的程序。在某些实施方式中，在约90分钟、约89分钟、约88分钟、约87分钟、约86分钟、约85分钟、约84分钟、约83分钟、约82分钟、约81分钟、约80分钟、约79分钟、约78分钟、约77分钟、约76分钟、约75分钟、约74分钟、约73分钟、约72分钟、约71分钟、约70分钟、约69分钟、约68分钟、约67分钟、约66分钟、约65分钟、约64分钟、约63分钟、约62分钟、约61分钟、约60分钟、约59分钟、约58分钟、约57分钟、约56分钟、约55分钟、约54分钟、约53分钟、约52分钟、约51分钟或约50分钟完成降温至-80℃以下的程序。在某些实施方式中，在70分钟内将所述细胞悬液从4℃降温至-80℃。在某些实施方式中，在70分钟内将所述细胞悬液从4℃降温至-90℃。
在一些实施方式中，通过设定变温步骤来对所述细胞悬液进行降温。在一些实施方式中，通过设定变温步骤来对所述细胞悬液进行阶段性匀速变温，以最终达到降温目的。在一些实施方式中，所述阶段性匀速变温包括匀速降温和匀速回温步骤。在一些实施方式中，所述匀速回温步骤发生在快速降温步骤之后，所述快速降温步骤是指以大于10℃/分钟的降温速度进行降温。在一些实施方式中，所述匀速回温步骤发生在以20℃-80℃/分钟的降温速度进行降温的快速降温步骤之后。在一些实施方式中，所述匀速回温步骤发生在以30℃-80℃/分钟的降温速度进行降温的快速降温步骤之后。在一些实施方式中，所述匀速回温步骤发生在以40℃-80℃/分钟的降温速度进行降温的快速降温步骤之后。在一些实施方式中，所述匀速回温步骤发生在以40℃-60℃/分钟的降温速度进行降温的快速降温步骤之后。在一些实施方式中，所述匀速回温步骤发生在以50℃-55℃/分钟的降温速度进行降温的快速降温步骤之后。
在一些实施方式中，阶段性匀速地变温包括6个阶段：第一预冷阶段、第二降温阶段、第三降温阶段、第四回温阶段、第五降温阶段和第六降温阶段。其中，第一预冷阶段将冻存管置于2℃至8℃的第一温度中30分钟至60分钟；第二降温阶段，将冻存管以0.2℃-10℃/分钟的降温速度从第一温度降温至0℃至-18℃的第二温度；第三降温阶段，将冻存管以20℃-80℃/分钟的降温速度快速地从第二温度降温至-60℃至-90℃的第三温度；第四回温阶段，将冻存管以10℃-40℃/分钟的升温速度从第三温度升温至-10℃至-25℃的第四温度；第五降温阶段，将冻存管以0.2℃-10℃/分钟的降温速度从第四温度降温至-36℃至-50℃的第五温度；第六降温阶段，将冻存管以大于5℃/分钟的降温速度从第五温度降温至-80℃以下的第六温度。
在一些实施方式中，第一温度为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。在一些实施方式中，第一温度为4℃。在一些实施方式中，第一预冷阶段持续时间为30分钟、31分钟、32分钟、33分钟、34分钟、35分钟、36分钟、37分钟、38分钟、39分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟。在一些实施方式中，第一预冷阶段持续时间为30分钟。
在一些实施方式中，第二温度为0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、或-18℃。在一些实施方式中，第二温度为-10℃。在一些实施方式中，第二降温阶段的降温速度为0.2℃/分钟、0.3℃/分钟、0.4℃/分钟、0.5℃/分钟、0.6℃/分钟、0.7℃/分钟、0.8℃/分钟、0.9℃/分钟、1℃/分钟、2℃/分钟、3℃/分钟、4℃/分钟、5℃/分钟、6℃/分钟、7℃/分钟、8℃/分钟、9℃/分钟或10℃/分钟。在一些实施方式中，第二降温阶段的降温速度为2℃/分钟。
在一些实施方式中，第三温度为-60℃、-61℃、-62℃、-63℃、-64℃、-65℃、-66℃、-67℃、-68℃、-69℃、-70℃、-71℃、-72℃、-73℃、-74℃、-75℃、-76℃、-77℃、-78℃、-79℃、-80℃、-81℃、-82℃、-83℃、-84℃、-85℃、-86℃、-87℃、-88℃、-89℃或-90℃。在一些实施方式中，第三温度为-80℃。在一些实施方式中，第三降温阶段的降温速度为30℃-80℃/分钟。在一些实施方式中，第三降温阶段的降温速度为40℃-80℃/分钟。在一些实施方式中，第三降温阶段的降温速度为40℃-60℃/分钟。在一些实施方式中，第三降温阶段的降温速度为41℃/分钟、42℃/分钟、43℃/分钟、44℃/分钟、45℃/分钟、46℃/分钟、47℃/分钟、48℃/分钟、49℃/分钟、50℃/分钟、51℃/分钟、52℃/分钟、53℃/分钟、54℃/分钟、55℃/分钟、56℃/分钟、57℃/分钟、58℃/分钟、59℃/分钟或60℃/分钟。在一些实施方式中，第三降温阶段的降温速度52℃/分钟。
在一些实施方式中，第四温度为-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或-25℃。在一些实施方式中，第四温度为-20℃。在一些实施方式中，第四回温阶段的升温速度为20℃-40℃/分钟。在一些实施方式中，第四回温阶段的升温速度为25℃-35℃/分钟。在一些实施方式中，第四回温阶段的升温速度为25℃/分钟、26℃/分钟、27℃/分钟、28℃/分钟、29℃/分钟、30℃/分钟、31℃/分钟、32℃/分钟、33℃/分钟、34℃/分钟、35℃/分钟、36℃/分钟、37℃/分钟、38℃/分钟、39℃/分钟或40℃/分钟。在一些实施方式中，第四回温阶段的升温速度为30℃/分钟。
在一些实施方式中，第五温度为-36℃、-37℃、-38℃、-39℃、-40℃、-41℃、-42℃、-43℃、-44℃、-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃或-50℃。在一些实施方式中，第五温度为-40℃。在一些实施方式中，第五降温阶段的降温速度为0.2℃/分钟、0.3℃/分钟、0.4℃/分钟、0.5℃/分钟、0.6℃/分钟、0.7℃/分钟、0.8℃/分钟、0.9℃/分钟、1℃/分钟、2℃/分钟、3℃/分钟、4℃/分钟、5℃/分钟、6℃/分钟、7℃/分钟、8℃/分钟、9℃/分钟或10℃/分钟。在一些实施方式中，第五降温阶段的降温速度为1℃/分钟。
在一些实施方式中，第六温度为-80℃、-81℃、-82℃、-83℃、-84℃、-85℃、-86℃、-87℃、-88℃、-89℃、-90℃、-91℃、-92℃、-93℃、-94℃、-95℃、-96℃、-97℃、-98℃、-99℃、-100℃或更低。在一些实施方式中，第六温度为-80℃。在一些实施方式中，第六温度为-90℃。在一些实施方式中，第六降温阶段的降温速度为5℃-40℃/分钟。在一些实施方式中，第六降温阶段的降温速度为5℃-30℃/分钟。在一些实施方式中，第六降温阶段的降温速度为5℃/分钟、6℃/分钟、7℃/分钟、8℃/分钟、9℃/分钟、10℃/分钟11℃/分钟、12℃/分钟、13℃/分钟、14℃/分钟、15℃/分钟、16℃/分钟、17℃/分钟、18℃/分钟、19℃/分钟、20℃/分钟、21℃/分钟、22℃/分钟、23℃/分钟、24℃/分钟、25℃/分钟、26℃/分钟、27℃/分钟、28℃/分钟、29℃/分钟或30℃/分钟。在一些实施方式中，第六降温阶段的降温速度10℃/分钟。
在某些实施方式中，本申请中所述阶段性匀速地变温包括以下6个阶段：第一预冷阶段，将冻存管置于4℃中30分钟至45分钟；第二降温阶段，将冻存管以2℃/分钟的降温速度从4℃降温至-10℃至-18℃；第三降温阶段，将冻存管以40℃-60℃/分钟的降温速度快速地从前一阶段的-10℃至-18℃降温至-80℃；第四回温阶段，将冻存管以25℃-35℃/分钟的升温速度从-80℃升温至-20℃；第五降温阶段，将冻存管以0.2℃-2℃/分钟的降温速度从-20℃降温至-40℃；第六降温阶段，将冻存管以5℃-15℃/分钟的降温速度从-40℃降温至-80℃以下。
在某些实施方式中，本申请中所述阶段性匀速地变温包括以下6个阶段：第一预冷阶段，将冻存管置于4℃中30分钟；第二降温阶段，将冻存管以2℃/分钟的降温速度从4℃降温至-10℃；第三降温阶段，将冻存管以52℃/分钟的降温速度快速地从-10℃降温至-80℃；第四回温阶段，将冻存管中以30℃/分钟的升温速度从-80℃升温至-20℃；第五降温阶段，将冻存管以1℃/分钟的降温速度从-20℃降温至-40℃；第六降温阶段，将冻存管以10℃/分钟的降温速度从-40℃降温至-90℃。
可以使用本领域公知的能实现上述变温步骤的任何方法或仪器来控制温度的变化。在某些实施方式中，使用程序降温仪来控制温度的变化。程序降温仪可以购自Thermofisher Scientific公司，型号为7455。
在某些实施方式中，中国仓鼠卵巢细胞与本申请的冻存液混合后的细胞悬浮液的起始浓度为1×107-1×108细胞/mL。在一些实施方式中，所述细胞悬浮液的起始浓度为5×107细胞/mL、6×107细胞/mL、7×107细胞/mL、8×107细胞/mL、9×107细胞
/mL、1×108细胞/mL、2×108细胞/mL、3×108细胞/mL、4×108细胞/mL或5×108细胞/mL。在一些实施方式中，所述细胞悬浮液的起始浓度为5×107细胞/mL。在一些实施方式中，所述细胞悬浮液的起始浓度为1×108细胞/mL。
以下将通过具体实施例更详细地描述本申请。提供以下实施例仅用于说明目的，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地意识到可以对多种非关键参数进行改变或修改以产生基本上相同的结果。
实施例
以下实施例旨在进一步说明本申请。通过描述，本申请的优点和特征将变得清楚。然而，这些说明仅仅是示例性的，并且不应将其理解为对本申请的范围的限制。
实施例1
1、冻存液的制备
(1)海藻糖母液(400g/L)配制
称取1.9g CD培养基粉末(Thermo Fisher Scientific公司，货号12681011)溶于70mL纯化水中，搅拌溶解。溶解完全后加入40g海藻糖，继续搅拌溶解；溶解完全后定容至100mL，过滤除菌，置于4℃冰箱保存。
(2)人白蛋白母液(100g/L)的配制
称取1.9g CD培养基粉末(Thermo Fisher Scientific公司，货号12681011)溶于100mL纯化水中，搅拌溶解获得培养基溶液。过滤除菌后，采用注射器取100mL CD培养基溶解10g的重组人白蛋白(Sigma-Aldrich公司，货号A9731)，置于4℃冰箱保存。
(3)甲基纤维素母液(100g/L)的配制
取10g甲基纤维素粉末(Sigma-Aldrich公司，货号M0387)溶于50mL纯化水(70-80℃)中，高压灭菌，经降温冷却后得到均匀的水溶液。再称取1.9g CD培养基粉末(ThermoFisher Scientific公司，货号12681011)溶于50mL纯化水中，搅拌溶解；过滤除菌。将其与上述的甲基纤维素高压灭菌后的液体混匀，置于4℃冰箱保存。
(4)无血清培养基溶液的配制
a).添加80％配制体积的纯化水(根据供应商的标准配置流程确定配制体积)，将19.3g的CD培养基粉末(Thermo Fisher Scientific公司，货号
12681011)加入纯化水中，完全溶解；
b).用5M NaOH或5M HCl调节(a)步骤获得的培养基的PH值至7.00±0.05；
c).加入纯化水进行定容(即将培养基溶液调整到配制体积)，CD培养基的密度默认为1Kg/L；
d).定容后混合15分钟，检测培养基的PH值和渗透压值，检测结果标准：培养基的PH值为7±0.2、渗透压为275-320mOsm/Kg，检测结果合格可继续进行；
e).使用0.2μm滤器进行除菌过滤；将过滤后培养基储存于4℃冰箱备用。
(5)在生物安全柜中，将步骤(4)获得的无血清培养基和DMSO按照特定体积比例(参见以下表2)混合，用移液枪吹打均匀，所得混合液放置在4℃的冰盒上或者冰箱中，备用。
(6)在生物安全柜中，以最终所需冻存的体积为准，按照配方浓度添加海藻糖、人白蛋白、甲基纤维素等添加物，移液枪吹打均匀后，放置在4℃的冰盒上或者冰箱中备用。
各实验例和对照例的冻存液中无血清培养基和DMSO的体积比例以及海藻糖、人白蛋白和甲基纤维素的终浓度如以下表2所示。
表2细胞冻存液中包含的成分及其浓度
注：表2中“CD”表示上述步骤(4)配制的无血清培养基；“MC”表示甲基纤维素；“HSA”表示人白蛋白，购自Sigma-Aldrich公司，货号A9731。
2、冻存细胞
(1)取1mL左右的包含重组CHO-1细胞(该CHO细胞表达抗CD147抗体，所述CD147抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)的细胞悬液，进行细胞计数。
(2)当细胞悬液的密度约为5×106细胞/mL、细胞活性>95％时，取5000mL细胞悬液，用10个500mL离心杯离心细胞悬液，离心速度1500rpm，离心时间10分钟。
(3)分别采用各个实验例和对照例的冻存液重悬步骤(2)获得的离心后的细胞沉淀，将细胞密度调整至5×107细胞/mL。
(4)重悬的细胞放置在4℃冰盒上。
(5)采用多道旋盖器打开冻存管，接着采用多道移液枪在微环境4℃的条件下，将获得的细胞悬液迅速分装至2mL冻存管中，每支冻存管1mL细胞悬液，共480支。
(6)将分装好的冻存管放在转运冰盒(提前12小时放置在4℃冷库中)。
(7)按如下变温步骤和变温速率设置程序降温仪(购自Thermo fisherScientific公司，型号为7455)，随后将转运冰盒内的冻存管放入程序降温仪中进行降温。共用时65.4分钟。
a).冻存管放入程序降温仪中，在4℃等待30分钟；
b).以2℃每分钟的速率降温至-10℃；
c).以52℃每分钟的速率降温至-80℃；
d).以30℃每分钟的速率升温至-20℃；
e).以1℃每分钟的速率降温至-40℃；
f).以10℃每分钟的速率降温至-90℃。
(8)将冻存管转入液氮罐中保存。
3、细胞活性检测
(1)在第二天，从液氮罐中取出冻存的细胞，每个实验例和对照例随机取出3支冻存管的细胞进行复苏。
(2)细胞复苏：
a).在水浴锅(37℃)内缓慢旋转冻存管直至冻存管内冰晶融化，将冻存管移出水浴(溶解时间约2分钟)，放入生物安全柜中。
b).用移液管将冻存管内的细胞悬液移入40mL预热的无血清培养基溶液中。
c).吸取步骤(b)中的细胞悬液约1mL，采用台盼蓝与细胞悬液1：1的方式混合并进行细胞计数。
(3)在显微镜下观察细胞状态。同时，用细胞计数仪对活细胞和死细胞数量进行统计，并计算细胞活性(细胞活性＝(活细胞数/总细胞数)×100％)。
(4)结果和分析
各对照例和实验例的复苏后细胞活性如以下表3所示。
表3各对照例和实验例冻存的细胞复苏后的细胞活性
与对照例1和对照例2相比，添加了单组分的实验例(即实验例1-1至1-6)中的0.05M海藻糖和0.1M海藻糖、2g/L甲基纤维素和5g/L甲基纤维素对提高细胞复苏活性有一定程度的效果，但效果有限。
组合添加了海藻糖和HSA的实验组(即实验例1-7至1-9)中，细胞复苏活性有了一定提高。而组合添加了海藻糖、HSA和甲基纤维素的实验组(即实验例1-10至1-14)中，细胞复苏活性有了显著地提高。具体地，组合添加了海藻糖、HSA和甲基纤维素的实验组(即实验例1-10至1-14)，细胞复苏活性均高于95％，甚至达到了97.8％。除了冻存效果更好之外，本发明的冻存液由于成本低和便于操作，非常适合在生产中大规格地进行细胞冻存。
实施例2
与实施例1的冻存液制备、细胞冻存、细胞复苏和活性检测等操作方式一致，采用重组CHO-2细胞株(该CHO细胞表达CD147抗体，所述CD147抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列)进行冻存液配方的适用性研究。其中，冻存液中无血清培养基和DMSO的体积比例以及海藻糖、人白蛋白和甲基纤维素的终浓度如以下表4所示。
表4细胞冻存液中包含的成分及其浓度
注：表4中“S3 CD”为使用S3 CD培养基按照上述实施例1中的步骤(4)来配制的无血清培养基，其中将实施例1的“冻存液配制”的步骤(4)无血清培养基中的ThermoFisherScientific公司的CD CHO培养基替换为上海多宁生物科技股份有限公司的S3 CD培养基，货号MNP014。
采用实验例2-1至2-5冻存液进行冻存的细胞，进行细胞复苏后的细胞活性如表5所示。从表5可知，上述5组冻存液配方所冻存的细胞复苏活性均较高。可见，这些冻存液配方针对不同的CHO细胞均能起到同样好的冻存效果。
表5实验例冻存的细胞复苏后的细胞活性
实施例3
采用实验例1-11和实验例1-14的冻存液，按照实施例1中的步骤和方法分别冻存重组CHO-1和重组CHO-2细胞。分别在冻存24小时、1个月、3个月、6个月、1年和3年年后对冻存的细胞进行细胞复苏和评估，考察冻存配方对细胞长期贮存稳定性影响。具体地，在冻存24小时、1个月、3个月、6个月、1年和3年时，分别取出3支冻存管并对冻存的细胞进行复苏，考察细胞活性、细胞形态、倍增期以及目的基因(编码抗CD-147抗体的核酸序列)和产生的抗体的结合活性等指标。以下表6和表7分别列出了采用实验例1-11的冻存液来冻存重组CHO-1细胞和采用实验例1-14的冻存液来冻存重组CHO-2细胞的稳定性考察结果。
表6使用实验例1-11冻存液冻存重组CHO-1细胞的稳定性考察结果
注：重组CHO-1细胞在冻存前的抗CD147抗体的表达量为2.5±0.2g/L。
表7实验例1-14冻存液冻存重组CHO-2细胞的稳定性考察结果
注：重组CHO-2细胞在冻存前的抗CD147抗体的表达量为3.5±0.2g/L。
从表6和表7可知，采用实验例1-11和实验例1-14的冻存液配方冻存的细胞在冻存后24小时、1月、3月、6月、1年和3年后复苏，细胞形态良好，倍增时间稳定，且目的基因序列与理论序列一致，抗体表达量以及抗体的结合活性受冻存的影响很小。可见，包含10％(v/v)DMSO+0.05M海藻糖+10g/L HSA+2g/L MC的细胞冻存液和包含7.5％(v/v)DMSO+0.1M海藻糖+5g/L HSA+2g/L MC细胞冻存液在CHO长期深低温贮存的过程中起到了较好的作用。
同时，采用实验例1-11和实验例1-14的冻存液配方冻存的细胞的复苏后的细胞活性如图1所示。从图1可见，分别采用实验例1-11和实验例1-14的冻存液配方进行冻存的细胞在冻存24小时、1月、3月、6月、1年和3年后复苏，细胞活性均大于90％，远高于《中国药典》(2020版第三部)细胞复苏活性＞80％的要求。
Claims (17)
1.一种用于冻存中国仓鼠卵巢细胞的无血清冻存液，包含无血清培养基、5％-10％(v/v)DMSO、0.05-0.1M海藻糖、5-10g/L人白蛋白和2-5g/L甲基纤维素，其中所述无血清培养基选自CD CHO培养基、CD OptiCHOTM培养基、Hycell CHO培养基、S3 CD CHO培养基和S4 CHO培养基。
2.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含7.5％(v/v)DMSO。
3.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含10％(v/v)DMSO。
4.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含0.05M海藻糖。
5.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含0.1M海藻糖。
6.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含5g/L人白蛋白。
7.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含10g/L人白蛋白。
8.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含2g/L甲基纤维素。
9.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含5g/L甲基纤维素。
10.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含无血清培养基、10％(v/v)
DMSO、0.05M海藻糖、10g/L人白蛋白和2g/L甲基纤维素。
11.根据权利要求1所述的无血清冻存液，包含无血清培养基、7.5％(v/v)
DMSO、0.1M海藻糖、5g/L人白蛋白和2g/L甲基纤维素。
12.根据权利要求1所述的无血清冻存液，所述中国仓鼠卵巢细胞表达抗CD147单克隆抗体。
13.根据权利要求12所述的无血清冻存液，所述抗CD147单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者所述重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列和所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求12所述的无血清冻存液，所述抗CD147单克隆抗体在所述中国仓鼠卵巢细胞中的表达量达到2g/L。
15.一种冻存中国仓鼠卵巢细胞的方法，包括使用根据权利要求1所述的无血清冻存液对所述中国仓鼠卵巢细胞进行冻存，所述冻存包括将所述中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合形成细胞悬液，在90分钟之内将所述细胞悬液降温至-80℃以下，随后将所述细胞悬液转移至液氮中储存。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合后的细胞悬浮液的起始浓度为1×107-5×108细胞/mL。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述中国仓鼠卵巢细胞与所述冻存液混合后的细胞悬浮液的起始浓度为5×107细胞/mL。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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