CN106954623A - 一种哺乳动物悬浮细胞的冻存溶液及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种哺乳动物悬浮细胞的冻存溶液及冻存方法，用于低温冻存哺乳动物悬浮细胞，特别是用于冻存基因工程技术中常用的哺乳动物悬浮细胞表达系统，如CHO DG44细胞及其基因工程细胞株。本发明提供的冻存液包含二甲基亚砜、相应哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基、传代培养基。冻存方法为：收集哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基，与传代培养基混合，在进行冻存前加入DMSO；将哺乳动物细胞悬浮于上述冻存液中，进行低温冻存。本发明公开的哺乳动物悬浮细胞冻存溶液及冻存方法使哺乳动物悬浮细胞冻存后的复苏存活率在90%以上，而且步骤简单，操作方便，成本低廉，可广泛应用于生物医药领域。

Description

一种哺乳动物悬浮细胞的冻存溶液及冻存方法
技术领域
本发明涉及生物药物技术领域，特别的涉及一种哺乳动物悬浮细胞的冻存溶液及冻存方法。
背景技术
近十年来重组生物药物己经成为现代医学中越来越重要的药物，这些生物药物通常是通过大规模培养基因工程菌株或细胞株生产得到。目前应用于生产中的表达系统很多，但是蛋白质不论是结构还是功能都相当复杂，事实证明具有生物学活性的很多蛋白质是难以通过细菌和酵母生产的，虽然哺乳动物细胞非常娇气，培养成本昂贵，但可依赖它生产正确修饰的、有完全活性的生物药物。
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，Chinese Hamster Overy)第一个作为哺乳动物宿主细胞来表达重组蛋白，并且因为其诸多优势成为目前最常用的宿主细胞株。药品监管部门批准的大多数单抗与Fc融合蛋白药物都是通过该系统表达生产的，而这其中又有70%是悬浮CHO细胞重组表达，所创造的年产值己达300亿美元。
实际生产中，以持续培养来保持细胞株是不可行的，不仅因为含血清的培养基价格昂贵，而且持续培养还增加了微生物污染的可能性，哺乳动物细胞的广泛应用使其保存技术显得至关重要。目前细胞株多采用液氮冻存法，采用细胞冻存技术还可以减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变，避免有限细胞系出现衰老或恶性转化，减少频繁传代，降低人力和物力。
但是低温冻存对细胞也会产生很强的副作用，其对细胞造成的伤害主要有以下几个方面：（1）细胞膜流动性减小，细胞膜僵化导致细胞的进一步损伤；（2）抑制了Na＋/K＋ ATP酶，引起细胞膨胀；（3）导致细胞坏死和凋亡；(4）产生氧自由基。为了减轻低温冻存的副作用，保持哺乳动物细胞较高的复苏存活率和较好的细胞状态，关键因素之一是选择合适的冻存保护溶液和冻存方法。
冻存溶液通过减少冷冻和解冻过程中对细胞造成的损伤，最大限度保存细胞的活性，提高细胞的复苏成活率。影响冻存哺乳动物细胞存活率与状态的因素非常复杂，细胞冷冻保存液通常使用高浓度血清作为蛋白保护剂，并加入二甲基亚砜或甘油以保护细胞冷冻过程中免受冰晶破坏，目前最常用的细胞冻存液配方为： (1)10％DMSO+传代培养液；(2)10％甘油+传代培养液。
但是在实际操作中仍然存在哺乳动物悬浮细胞冻存后，细胞活性与状态受到严重破坏，细胞复苏存活率低的问题，从而严重影响相关生物药物的生产与科研活动。本发明要解决的技术问题就是提供一种改良的哺乳动物悬浮细胞的冻存溶液及冻存方法，改善相应细胞低温冻存的效果，有效地提高细胞的复苏存活率。
发明内容
本发明公开的细胞冻存液及冻存方法能够有效保护哺乳动物悬浮细胞免受冷冻损伤，保持细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种哺乳动物悬浮细胞冻存液，包含二甲基亚砜、哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基、传代培养基。哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基按体积百分比含量为30%~80%，优选55%；所述传代培养基按体积百分比含量为10%~60%，优选35%；所述二甲基亚砜按体积百分比含量为5%~15%，优选10%。
本发明的哺乳动物悬浮细胞传代培养基可以使用本领域公知的适用于哺乳动物悬浮细胞传代的任意培养基，优选Hycell CHO、SFM4、Forti CHO、Opti CHO、Gowth A培养基其中的一种或两种及以上的混合，但并不限于此。
本发明中的哺乳动物悬浮细胞为CHO DG44、CHO-S，以及以CHO DG44、CHO-S为宿主细胞构建的基因工程细胞株，优选为表达人源抗狂犬病毒抗体NM57的CHO DG44。NM57 抗体重链和轻链的核苷酸序列分别见GENEBANK gi：27728677 和gi：27728683。
B.Dietzschold 利用细胞融合技术制备了多株人抗狂犬病毒单克隆抗体，发现能特异结合狂犬病毒G蛋白的一株抗体MAb57能够高效和广泛地中和狂犬病毒并且对狂犬病毒攻击的实验室啮齿动物可以起保护作用(J Virol.1990June ；64(6) ：3087-3090)。贾茜等人将该抗体基因构建重组载体导入CHO细胞表达系统表达，所得抗体即为NM57（中国专利《重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法》，ZL200610012910.7）。本发明中表达人源抗狂犬病毒抗体NM57的CHO DG44即参照该专利的细胞株构建方法得到。
本发明的细胞冻存液中包含了细胞对数生长期的传代培养基。本领域技术人员都知道培养的群体细胞都经过四个生长时期：潜伏期、对数生长期、稳定生长期、衰亡期。潜伏期细胞开始适应环境，并为快速增长做准备，生长速率常数基本为零，生长曲线基本呈平线状。经过潜伏期的适应与准备，细胞慢慢进入最具活力的时期—对数生长期。在这个时期，细胞分裂旺盛，细胞分裂相增多，细胞群体数与细胞增长速率成正比例函数，生长曲线陡然上升。对数生长期的细胞对各种不利条件的抵抗能力最强，是进行各种实验最好和最主要的阶段。也是对细胞进行保存的好时机。
动物细胞对数生长期是细胞生长最旺盛的时期，在此时的培养条件下细胞达到了最佳状态，细胞有可能在之前适应过程中向培养基中分泌了某些更适合其生长的物质，所以此时培养基的微环境最有利于细胞存活；并且冻存细胞时要选择细胞状态最好的对数生长期细胞，细胞显然已经充分适应了这种培养基的环境。本发明在哺乳动物悬浮细胞冻存液中加入哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基，所冻存悬浮细胞复苏后细胞活率在90%以上，大大提高了细胞的存活率与状态。
另一方面，本发明提供一种哺乳动物悬浮细胞的冻存方法，包括如下步骤：收集哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基，与传代培养基混合，在进行冻存前加入DMSO；将哺乳动物细胞悬浮于上述冻存液中，进行低温冻存。
冻存方法中的哺乳动物悬浮细胞传代培养基可以使用本领域公知的适用于哺乳动物悬浮细胞传代的任意培养基，优选Hycell CHO、SFM4、Forti CHO、Opti CHO、Gowth A培养基其中的一种或两种及以上的混合，但并不限于此；所述哺乳动物悬浮细胞为CHO DG44、CHO-S，以及以CHO DG44、CHO-S为宿主细胞构建的基因工程细胞株，优选为表达人源抗狂犬病毒抗体NM57的CHO DG44。
冻存方法中的哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基按体积百分比含量为30%~80%，优选55%；所述传代培养基按体积百分比含量为10%~60%，优选35%；所述二甲基亚砜按体积百分比含量为5%~15%，优选10%。
本发明中所述低温冻存可以使用本领域公知的多种方法，优选在程序冷冻仪，以-1℃/min的速度进行冷冻。
本发明公开的哺乳动物悬浮细胞冻存溶液及冻存方法使冻存的哺乳动物悬浮细胞复苏存活率在90%以上，比现有方法存活率大大提高，而且步骤简单，操作方便，成本低廉，可广泛应用于生物医药领域。
具体实施方式
下面通过本发明实施例中的技术方案对本发明进行清楚、完整地描述。
实验材料：CHO-S、CHO DG44细胞株购自Biovector Co.,LTD； CHO DG44-8细胞株，参照中国专利《重组人抗狂犬病毒单克隆抗体的制备方法》，ZL200610012910.7制备。
实验试剂：
传代培养基：Hycell CHO（Hyclone）、SFM4（Hyclone）、Forti CHO（Gibco）、Opti CHO（Gibco）、Gowth A（Gibco）；台盼兰（Gibco）；DMSO（默克-102952）；Cryopreservation冻存液（Cyagen）
仪器设备：
恒温摇床（1SF-1-W、科耐）；细胞计数仪（Countstar IC 1000）；细胞培养瓶（Corning）；细胞冻存管（Corning）；程序降温冻存盒（Nalgene CryoBoxes）
实施例1 细胞冻存液的制备方法
1、绘制相应哺乳动物悬浮细胞株生长曲线
哺乳动物悬浮细胞复苏后传代4~6次，当细胞生长状态较好、比生长速率稳定、活率在95%以上，取此时的细胞作为种子，以3×105cells/ml的密度接种到传代培养基中，共接3瓶，每瓶30ml，进行培养并以此培养过程绘制细胞生长曲线。
24h后开始进行计数，以后每隔24h计数一次，每次分别从3瓶细胞中取0.3ml细胞悬液，用1%的台盼兰染色、充分混匀后用细胞计数仪计数并观察细胞活率。活细胞由于细胞膜的保护不会被台盼兰染色，而死细胞会被台盼兰染成蓝色，细胞活率=（活细胞数/细胞总数）×100%，当细胞活率下降到80%以下停止计数。根据细胞计数结果，3瓶细胞求平均值，以单位细胞数（活细胞数/ml）为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。以此确定相应哺乳动物悬浮细胞株的对数生长期。
2、制备冻存液
与冻存细胞同步培养相应哺乳动物悬浮细胞，使用无压力传代培养基，细胞处于对数生长期时，将细胞悬液转移至离心管中，1200rpm离心5min，取上清液至干净的离心管中，与新配的无压力传代培养基混合，4℃保存，冻存前加入DMSO，置于4℃预冷待用。按不同比例共配置4组冻存液，冻存液配方详见表1。
其中4号细胞冻存液与5号商业化的Cryopreservation冻存液（购自cyagen）作为本发明提供冻存液的对照例。
实施例2 CHO DG44基因工程细胞株的冻存
CHO DG44基因工程细胞株为CHO DG44-8，传代培养基为Hycell CHO。
通过实施1确定对数生长期的方法，发现CHO DG44基因工程细胞株的对数生长期为传代培养的第3~4天，根据实施例1所述方法配置相应冻存液。
CHO DG44-8细胞株传代4~6次，细胞生长状态较好、比生长速率稳定、活率在95%以上，取此时的细胞作为种子扩增细胞。以3×105cells/ml的密度接种到传代培养基中。
细胞培养至第4天处于对数生长期，此时活细胞密度在2.75×106cells/ml左右，活率在96%以上（如表2所示），收集细胞至50ml离心管，20℃，1200rpm(250g)离心3~5min，弃上清，尽量将上清倒干净，分别用5种冻存液重悬细胞（5种冻存液配置方法详见实施例1），使细胞终浓度为1×107cells/ml，分装到冻存管中，每管1ml。
将冻存管封口、贴标签，放入程序降温冻存盒中，然后放入-80℃冰柜中，24小时后放入液氮罐中。
实施例3 CHO DG44基因工程细胞株的复苏
复苏细胞时，将冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，用止血钳不停地摇动，约3min直至全部融化，然后用两种方法进行后续实验。方法一：将冻存管中的细胞直接转移至30ml传代培养基中，取样计数，计算细胞活率（同实施例1的方法）。方法二：将细胞转入5ml传代培养基中，1200rpm离心5min，弃上清，重悬细胞至30ml传代培养基中，取样计数，计算细胞活率（同实施例1所描述方法）。
用以上两种复苏方法，于细胞株冻存两周、四周、八周后分别复苏5种冻存液冻存的细胞，每种冻存液复苏三支，比较细胞活率，结果如表3所示，数值为每组三支细胞存活率的平均值。
由表3显示数据可见，方法一明显优于方法二，方法二中的离心只是为了消除冻存液中DMSO对细胞的毒性，而事实证明细胞在加入传代培养基中后DMSO的浓度低于1%，此时对细胞的毒性可以忽略；而离心对细胞造成的机械损伤却不容忽视，因此在复苏悬浮细胞时离心是不必要的。对于五种冻存液的比较也很明显，冻存液对CHO DG44-8细胞株保护效力，从细胞复苏存活率看从强到弱依次排序为2、3、1、5、4，可见使用本发明公开的冻存液，细胞复苏存活率在90%以上，与对照实验组相比，细胞复苏存活率大大提高。
实施例4 CHO-S细胞株的冻存与复苏
参照实施例2和实施例3的方法，对CHO-S细胞株进行冻存与复苏，传代培养基为SFM4。复苏时只采用实施例3中的方法一，每种冻存液复苏三支，结果如表4所示。实验结果也证实了冻存液优劣排序依次为2、3、1、5、4。
上述实施例数据可以看出，在哺乳动物悬浮细胞基因工程株与哺乳动物悬浮细胞的冻存液中，加入哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基，对冻存的哺乳动物细胞具有明显的保护效果，细胞的复苏存活率明显提高。因此该冻存液和冻存方法可广泛应用于各种哺乳动物悬浮细胞的低温冻存，而且冻存步骤简单，操作方便，成本低廉，可广泛应用于生物医药领域。

Claims (9)

1.一种哺乳动物悬浮细胞的冻存溶液，主要成分包括：二甲基亚砜、哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基、传代培养基。
2.权利要求1所述的冻存溶液，所述哺乳动物悬浮细胞传代培养基为Hycell CHO、SFM4、Forti CHO、Opti CHO、Gowth A培养基其中的一种或两种及以上的混合。
3.权利要求1所述的冻存溶液，所述哺乳动物悬浮细胞为CHO DG44、CHO-S，以及以CHO DG44、CHO-S为宿主细胞构建的基因工程细胞株。
4.权利要求3所述的冻存溶液，所述基因工程细胞株为表达人源抗狂犬病毒抗体NM57的CHO DG44。
5.权利要求1所述的冻存溶液，所述二甲基亚砜按体积百分比含量为5%~15%，优选10%；所述哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基按体积百分比含量为30%~80%，优选55%；所述传代培养基按体积百分比含量为10%~60%，优选35%。
6.一种哺乳动物悬浮细胞的冻存方法，包括如下步骤：收集哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基，与传代培养基混合，在进行冻存前加入DMSO；将哺乳动物细胞悬浮于上述冻存液中，进行低温冻存。
7.权利要求6所述的冻存方法，所述哺乳动物悬浮细胞传代培养基为Hycell CHO、SFM4、Forti CHO、Opti CHO、Gowth A培养基其中的一种或两种及以上的混合；所述哺乳动物悬浮细胞为CHO DG44、CHO-S，以及以CHO DG44、CHO-S为宿主细胞构建的基因工程细胞株，优选为表达人源抗狂犬病毒抗体NM57的CHO DG44。
8.权利要求6所述的冻存方法，所述哺乳动物悬浮细胞对数生长期的传代培养基按体积百分比含量为30%~80%，优选55%；所述传代培养基按体积百分比含量为10%~60%，优选35%；所述二甲基亚砜按体积百分比含量为5%~15%，优选10%。
9.权利要求6所述的冻存方法，所述低温冻存采用程序冷冻仪，以-1℃/min的速度进行冷冻。
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