CN1585602A - 源于非造血组织的非胚胎细胞的保存 - Google Patents

源于非造血组织的非胚胎细胞的保存 Download PDF

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Abstract

本发明涉及来源于脂肪组织的被低温保存的含有干细胞和祖细胞的细胞群、回收和存储这些细胞群的方法和这些细胞群在解冻后的治疗用途。本发明进一步涉及结缔组织基质，它可从脂肪组织中提取，经过保存后用于哺乳动物患者的治疗、结构性或美容用途。

Description

源于非造血组织的非胚胎细胞的保存
本申请要求2001年9月14日提交的美国临时专利申请60/322,070的权益。
本发明涉及脂肪组织来源的细胞群，特别是源自脂肪组织的干细胞和祖细胞，它们可被低温保存备用并将低温保存的细胞用于疾病治疗。本发明也涉及结缔组织基质的制备和存储，所述基质是从脂肪组织中提取的；本发明也涉及这些材料在存储后的治疗和美容用途。这些细胞群和基质可用于不同疾病或不适的患者的治疗、构建和/或美容方法。优选方案中，低温保存的细胞解冻后，可用于自身修复、重组(reconstitution)、重建(reconstruction)以及诊断应用。本发明还涉及本发明的干细胞、祖细胞以及结缔组织的收集、处理和低温保存的方法。虽然本文所述的方法以及回收和保存的材料主要是给人用的，但它们也可以用于兽医学，能够用于其它的哺乳动物。
                           发明背景
组织工程(tissue engineering)
组织工程是特定的术语，通常是指用生物组织构建单元来再生、修复或重建受损的或有缺陷的身体结构或器官。比如，有望通过生长新心脏组织治疗心脏病发作，或用成骨细胞治疗骨折愈合缓慢。
组织工程的核心构建单元是(1)细胞，优选的细胞具有高增殖性和分化能力，能够以使用者定义的方式制备大量的多种不同的组织；(2)支架结构(scaffolds)，提供组织在其上发育的三维结构，这类结构可以是天然的、人工的或复合材料；(3)生长因子和化学药物，能够使细胞利用支架结构并生成新的或修复的组织。
本发明的目的是提取脂肪组织，分离该脂肪组织中的目的组分，然后保存上述前两种构建单元，即脂肪组织来源的细胞群和结缔组织基质，其中所述细胞群包括干细胞和祖细胞，而结缔组织材料是天然的支架结构。
                        背景技术
干细胞和祖细胞
干细胞是身体的母细胞(Blau HM，TR Brazelton和JM Weimann“干细胞的进化概念：实体或功能？”，Cell，105，p829-841，(2001))。已知源于胚胎的干细胞或胚胎干细胞(ESCs)能够发育成身体的多种甚至全部的细胞或组织类型。这些ESCs，也称早期胚胎细胞，不仅包含了个体的全部遗传信息，而且还具有生成200多种不同身体细胞和组织的新生能力。进一步的研究表明这些细胞具有巨大的科学和临床应用价值(Weissman IL“干细胞和祖细胞生物学向临床的转变：困难和机会”，Science 287，p1442-1446，(2000))。
然而，ESCs的应用有其理论上的局限性。如果临床使用，它们必须是源于同一个体的胚胎。当源于某人的干细胞或组织移植给另外一个人时，可能需要给细胞接受者使用有毒的免疫抑制剂，以防止排斥反应。另外，来自某个体的细胞可能携带病毒或其它罕见但重要的疾病。而且，已知ESC样细胞(如畸胎瘤)能够形成肿瘤。从ESCs发育的、给患者使用的任何组织，必须是不能致瘤的，且具有天然的对正常信号应答的能力，这些信号使组织生长、停止生长或愈合。
最近，已经鉴定出一些非胚胎或“成熟”干细胞，它们是ESCs临床应用的重要的潜在的备选细胞(Pittenger MF，Mackay AM，BeckSC，Jaiswal RK，Douglas R.Mosca JD，Moorman MA，Simonetti DW，Craig S和Marshak DR“成人间质干细胞的多谱系潜能”，Science，284，p143-147(1999)；Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，Huang J Futrell JW，KatzAJ，Benhaim P，Lorenz HP和Hedrick MH“来自人脂肪组织的多谱系细胞：适于基于细胞的治疗”Tissue Eng 7，p211-218，(2001))。这些细胞隐秘地定位于多种组织甚至所有组织中，推测其准备应答创伤或其它破坏性疾病过程，这样它们就能治愈受损的组织。新出现的科学证据提示：每个个体都带有一定数量的(a pool of)干细胞，它们同ESCs一样具有发育为多种甚至全部类型的细胞或组织的能力。
祖细胞是一类介于干细胞和成熟细胞之间的中间细胞。通常这些细胞发育为多种成熟细胞类型的能力被进一步的限制，而且其增值能力也有相当大的局限性或无自我更新能力。祖细胞的实例包括造血系统的CFU-GM和BFU-E细胞，以及间质系统的前脂肪细胞和前成骨细胞。
作为组织工程的细胞来源的脂肪组织
最近发现脂肪组织是适于治疗应用的干细胞、祖细胞和基质的来源(Zuk等，同前；Huang JI，SR Beanes，Zhu M，HP Lorenz，Hedrick MH和Benhaim P“作为成骨软骨祖细胞的来源的大鼠髓外脂肪组织”Plast Reconstr Surg.109；p1033-1041；discussion，p1042-1043，(2002)；Mizuno H，Zuk PA，Zhu M，Lorenz HP，Benhaim P和Hedrick MH“处理过的人吸脂细胞的成肌分化”.Plast Reconstr Surg.109：p199-209；discussion 210-1(2000))。脂肪组织同时也是血管内皮细胞的丰富来源(Kern PA，Knedler A和Eckel RH“来自人脂肪组织的微血管内皮细胞的分离和培养”，J Clin Invest 71，p1822-1829，(1983))，这些细胞在通过促进新血管生长和刺激干细胞与祖细胞生长而进行组织再生以及工程化方面有一定的作用(Hutley LJ，Herington AC，Shurety W，CheungC，Vesey DA，Cameron DP和Prins JB“人脂肪组织内皮细胞促进前脂肪细胞增殖”Am J Physiol Endocrinol Metab，281，p1037-1044，(2001))。其它组织类型也包含这类细胞，但不能从人体中抽取相当大量的其它组织而不致发病。而吸脂术是塑身美体的一种常用方法，美国美容手术协会报告的2001年间吸脂术手术超过385000例。目前，标准的操作是将吸脂术得到的和其它方法取出的脂肪组织弃掉或销毁。
脂肪组织干细胞和祖细胞群具有分化成多种细胞类型的能力(Zuk等，同前；Huang等，同前；Mizuno等，同前)。最重要的是，尽管其分化能力的最大特点是能够分化成中胚层来源的细胞系，然而有证据表明它们能够分化成内胚层和外胚层来源的细胞系。由于人体所有的细胞都来源于中胚层、内胚层或外胚层，这些资料提示：脂肪组织干细胞和祖细胞，具有发育为人体任何细胞的能力，因而具有强大的治疗潜能(WO00/53795，2000年9月14日公开)。比如，骨、软骨、肌肉和脂肪起源于中胚层，神经和皮肤细胞起源于外胚层，多种组织如胰腺和内脏都可以用内胚层细胞治疗。除这种潜在的分化全能性外，所述细胞有相当大的增殖能力，体外培养能够繁殖许多代(循环)。在组织工程和基因药物应用方面，这两种相互关联的能力(分化和增殖)赋予脂肪组织干细胞和祖细胞重要的价值。
然而，干细胞的应用不止是组织工程。因此干细胞的增殖和分化能力可用于基因转移和基因治疗，其中干细胞的子细胞可作为基因/基因产物的呈递载体。
细胞低温保存
在冷冻单个细胞、细胞沉淀或细胞悬液时，细胞内外的液体都会结冰，由于细胞内部和周围局部溶液浓度的波动和冰晶的形成，很可能会造成细胞损伤，如Karlsson JO等的讨论(Karlsson JO和Toner M，“通过低温保藏长期地存储组织：关键问题”，biomaterials 17，p243-256，(1996))。研究发现，这些事件中的副效应，能够通过使用冷冻保护剂以及控制冷冻速率来降至最低。某些冷冻保护剂能够调节细胞壁的渗透性而降低潜在的有害的浓度差别。类似地，当细胞慢速冷冻时，水的外向流出速率足够高，防止过度的超冷并促使细胞的脱水速率超过细胞间冰晶的形成。在不同的设置下使用不同的降温速率，某些方案使用数学模型实现多步的降温过程。另外，多种不同的冷冻保护剂已经在文献中有详述，在此引入作为参考(Pegg DE“组织低温保藏的现状”，Cryo Letters 22，p105，(2001)；Karlsson JO和Toner M，同前；Rowley SD“造血干细胞低温保藏：现代技术综述”，J Hematother 1，p233，(1992))。
一方面非造血系统的人干细胞和祖细胞的低温保存没有发表的文献可查，另一方面造血干细胞(常规骨髓移植的临床效力相关的细胞)在治疗白血病和某些遗传疾病中的临床效果已被证实，已经引发多项针对造血细胞低温保存条件优化的研究。在两项研究中，已经检测了源于脐带血细胞低温保存了15年后解冻后的复原(Mugishima H，Harada K，Chin M，Suzuki T，Takagi，K，Hayakawa S，Sato K，Klein JP和Gale RP“长期低温保存对脐带血中造血祖细胞的影响”，BoneMarrow Transplant 23，p395-96，(1999)；Kobylka P，Ivanyi P和Breur-Vriesendorp BS“长期(15年)低温保存的脐带血细胞的免疫和集落形成能力的维持”，Transplantation 65，p1275，(1998))。另一项由Re等进行的研究表明了低温保存了7年多的骨髓干细胞临床应用效果(Re A，Vijayaraghavan K，Basade MM，He S和Gulati SC“长期低温保存：用低温保存了7年的骨髓进行自身骨髓移植后成功的三系移植”，J Hematother 7，p185，(1998))。
相应地，已经建立了骨髓和血源性造血干细胞的低温保存方法。最近，又组建了大规模的脐带血干细胞库。目前全世界有几家私立的脐带血库，有几十家公立的、相互无关的捐献者脐带血库。美国专利5004681和5192553中就详述了脐带血干细胞库。
干细胞和祖细胞的低温保存
与人体所有的细胞群一样，脂肪组织干细胞和祖细胞也会老化(D’Ippolito G，Schiller PC，Ricordi C，Roos BA和Howard GA“来自人类脊髓的间质(mesenchymal stromal)干细胞的年龄相关的成骨潜能”，J Bone Miner Res 14，p1115-1122，(1999)；Muschler GF，Nitto H，Boehm CA和Easley KA“人骨髓细胞结构与年龄和性别相关的改变，以及造骨祖细胞的优势”，J Orthop Res 19，P117-125，(2001)；O’Driscoll SW，Saris DB.，Ito Y和Fitzimmons JS“骨膜随年龄降低的成软骨潜能”J Orthop Res 19 p95-103，(2001)；Long MW，Ashcraft，EK Normalle D，和Mann KG“纯化的人骨前体细胞群的年龄相关的表型改变”，J Gerontol A Biol Sci Med Sci 54，pB54，(1999)；Mueller SM和Glowacki J；“在三维胶原海绵状物中培养的人骨髓细胞的成骨潜能随年龄下降”J Cell Biochem 82，p583-590，(2001)。细胞老化和细胞功能降低相关。有效低温保存这些细胞的方法是使它们处于活性停滞状态。明确的讲，在通常的低温保存温度(-196℃)，没有足够的能量进行化学反应，因而没有能量进行代谢、细胞分裂和老化。理论上，宇宙射线是唯一的导致低温保存细胞损伤和刺激的原因(Karlsson等，同前)。因此，个人应当合理地选择在早年低温保存自己的干细胞以确保在晚年体内干细胞老化和功能低下时，提供更年轻，据信更有活力的细胞。除老化之外，还有其它方面的损伤，能够为体外储存干细胞提供充分的依据。比如，有充分的证据表明常规癌症化疗和放疗对干细胞功能有负面影响，这些治疗对干细胞的有害效应可能与治疗方法的某些副反应相关(Kashyap等“异源骨髓移植对接受者骨矿物质密度的影响：预先研究”，Biol Blood Marrow Transplant 6，p344，(2000)；Banfi A，Podesta M，Fazzuoli L，Sertoli，M.R，Venturini M，Santini G，Cancedda R和Quarto R“高剂量化疗对骨髓骨祖细胞显示剂量依赖毒性：骨髓移植后骨质减少的机制”，Cancer 92，p2419，(2001)；Galotto M，Berisso G，Delfino L，Podesta M，Ottaggio L，DallorsoS，Dufour C，Ferrara G.B.，Abbondandolo A，Dini G，Bacigalupo A，Cancedda R和Quarto R“骨髓移植接受者中高剂量化疗/放疗后的间质损伤”，Exp Hematol 207，p1460，(1999))。因而，需要进行这类治疗的患者，可以合理地选择提取干细胞和祖细胞，这样这些细胞就不会受到化疗或放疗的影响。
脂肪组织来源的结缔组织基质
脂肪组织是成熟的脂肪细胞和其它细胞群形成的松散的聚集体，所述细胞由丰富的血液供应，并通过复杂的结缔组织基质将它们聚集在一起。基质大部分由胶原构成，而胶原是一种主要的结构蛋白。基质具有组织重建的价值，可作为重建器官或修复组织损伤时细胞生长的支架结构。
                      发明概述
分离并低温保存了脂肪组织来源的细胞群，这些细胞包括干细胞和祖细胞，在解冻后用于治疗。另外，也可以提取脂肪组织来源的结缔组织基质，将其储存用于以后的治疗。
具体地说，本发明涉及分离、保存包含脂肪来源的干细胞、祖细胞的细胞群和基质，以及冷冻保存的包含脂肪来源的干细胞、祖细胞的细胞群和基质的治疗用途，本发明涉及在治疗、结构性或美容应用中用它们进行修复、重组和/或重建。本发明也涉及在基因治疗中使用含异源基因序列的干细胞和祖细胞来送递替代的或新的基因。
在本发明的优选实施方案中，低温保存并解冻的细胞可用于自体重组。进一步优选的实施方案中，结缔组织基质可用于自体或非自体的修复或重建。
本发明还涉及结缔组织基质和含本发明的干细胞和祖细胞的细胞群的收集、处理与低温保存方法。
本发明进一步涉及独特的组合物，即用本文所述的过程和方法分离的细胞群和基质。
                     附图说明
图1是收集设备的简图，附用于收集脂肪组织的容器部分剖面。
图2是图1容器的部分剖面图
图3是脂肪组织来源的细胞群按照本文所述方法在低温保存后，解冻后培养后形成的软骨细胞的放大图(放大100倍)(用阿尔新蓝染色层深灰色，阿尔新蓝是一种用于染色软骨细胞的标准试剂)
图4是大鼠脂肪组织来源的细胞的放大图(放大400倍)，所述细胞按照本发明述方法在处理和保存后，解冻并移植至大鼠心脏(移植后5天处死动物)。移植的细胞群用箭头标示。
图5是人脂肪组织来源的细胞的放大图(放大400倍)，所述细胞按照本发明述方法在处理和保存后，解冻并移植至免疫缺陷鼠的膀胱，移植后30天处死动物，细胞在移植前用5溴-2脱氧尿苷标记。标记的细胞在本图中呈现深灰或黑色的核，实例中用箭头表明。
图6是人脂肪组织来源的细胞的放大图(放大400倍)，所述细胞在按照本发明的方法制备和存储的基质所作的支架结构上生长。成熟的载有脂肪的脂肪细胞用箭头表明。
                      发明详述
本发明涉及含干细胞和祖细胞的细胞群的低温保存以及获得这些物质的方法与处理操作，其中的细胞群源于脂肪组织，解冻后可用于治疗疾病；本发明进一步涉及来源于脂肪组织的结缔组织，涉及这些物质的提取、保存和储存。
具体地说，本发明涉及为将来使用含脂肪组织干细胞和祖细胞的细胞群和结缔组织的收集、处理和储存。这些处理集中的体现在建立脂肪组织来源的细胞和基质库(bank)。优选方案之一是将某个体来源的这些细胞和基质经储存后使用，其中所述个体被诊断出患一种疾病，可以用回输、系统的或直接给身体特定部位使用干细胞和/或祖细胞进行治疗。该方案可描述为含脂肪组织干细胞和祖细胞的细胞群和/或结缔组织的自体修复库与移植。
现在已有证据表明，干细胞的数量和能力随细胞老化而降低。因此，对每个个体而言，应当在相对年轻的时候建立他们自己的干细胞库和相关产物库，这样如果或当他们上了年纪的时候需要这些干细胞时，能够获得储存的、年轻有活力的干细胞。多种不同的疾病在回输干细胞或祖细胞时都能够取得好的医学疗效，这些疾病包括但并不限于骨质疏松、心肌梗死、骨折、事故或关节炎所致的软骨损伤、神经损伤或疾病以及美容或外伤相关的修复外科手术。这里列出的疾病并不是对本发明使用的限制，因为有许多的医疗条件在使用干细胞和/或祖细胞后获得益处，而且每天都有新的应用层面发现。细胞库的优点包括使用自身细胞不会带来输血或移植相关的疾病危险，也没有移植物抗宿主病的危险，这些是使用异源细胞(由另一个人捐献的细胞)的一种明显的危险因素。另外，在造血干细胞(制造血细胞的干细胞，他们来源于骨髓，周血或脐带血)的应用研究中发现自体细胞比异源细胞更有效，造血系统(功能性血细胞产物的发育)重建时所需的细胞量比异源的要低几倍。
细胞回收、分离和保存方法可包括，但并不限于下面的全部或部分步骤或阶段：(a)脂肪组织的收集；(b)收集部位组织的包装；(c)组织转运至处理装置(库)；(d)处理组织以获得含干细胞和祖细胞的细胞群，并分离出细胞的结缔组织基质；(e)检测或测试细胞或基质；(f)储存；(g)从储藏状态恢复细胞和基质；(h)检测将用于临床治疗的恢复的细胞和基质；(i)优选的体外细胞处理；(j)质量控制系统，能够最大化库的活性效率或质量；(k)用于人细胞和细胞系统以及组织的修复、重构和重建等的治疗用途。任何本领域内的技术人员，都将会认识到这些操作步骤的操作顺序是可以变化的。
本发明的实施归入组织库(Tissue Banking)的统一指挥下，因此，实际操作必需符合专业机构的要求，比如美国组织库协会和美国血库协会，这些机构专门解决这类问题。政府机构如美国食品药品管理局也需要给这里提出的标准授权，以指导方法应用和用途。虽然如此，本发明的新颖之处就是没有现行的标准，可供直接使用。
脂肪组织的收集
脂肪组织是本发明预期的含干细胞和祖细胞的细胞群以及结缔组织基质(首选目的组分)的来源；然而剩余部分(丢弃部分)中脂肪组织的其它组分，也有医用价值及其它方面的应用。脂肪组织可以用本领域内的任何已知方法获得。比如，可以收集多种常规吸脂术过程中的脂肪组织，如为塑身美体而作的吸脂术。可以用专门设计的、专用于建组织库的设备收集，或将脂肪组织收集至吸脂术专用的收集脂肪吸出物的通用设备中。
本文所述的干细胞收集方法比其它方法要好，其它方法如收集骨髓，皮肤或骨骼肌的方法。该方法在封闭系统中完成，正如上面明确指出的，脂肪吸出物可以大量获得而又没有骨髓收集或皮肤与肌肉解剖有关的副作用或危险。
在外科手术切除皮肤及相关的脂肪组织时，也可以收集脂肪组织。实施例包括胃打褶，切除性脂肪切除或临时的其它手术。
优选在无菌条件下收集脂肪组织。收集后立即封闭收集的脂肪组织或收集设备，然后转运至处理场所。在某些环境下，收集场所和处理场所相距很近，允许简单的封口后从一个地方转运至另一个地方。
收集的脂肪组织的量
吸出的脂肪组织中包含不同量的干细胞、祖细胞、基质、血、血清、脂类、脂肪细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和外皮细胞(Hausman G.J.和R.L.Richardson“不成熟大鼠脂肪组织中细胞和血管的发育”J Lipid Res 24，p522-532(1983)；Greenwood M.H.“脂肪组织：细胞形态学和发育”Ann Intern Med 103，p996-999，(1985)；Kern等，同前)。
在第一个实施方案中，至少可获得约400克的脂肪组织。实验表明400克脂肪组织可获得约1亿个有核细胞。然而某些情况下，少量或大量脂肪组织都是可以接受的，也有实验结果。比如，可行的或优选的是从肥胖或超重者身体中获得比瘦者身上获得量较大的脂肪组织。
如表1中所示，从肥胖者身上获得比质量指数正常的个体身上多的组织，但常规吸脂术后获得的无脂肪细胞的总细胞数并没有明显不同，因为瘦者每克脂肪组织中非脂肪细胞的量比肥胖者要高。
这些观察的一个结果是本发明的用途并不限于提取了脂肪组织的那个个体的体重指数。
而且，在低温保存前后，可以通过培养而扩增脂肪组织干细胞和祖细胞，因此可相当大的程度上增加可用于治疗的细胞数。
表1体重指数对组织和细胞产率的影响
体重指数 获得组织量 总细胞产率(×107)
正常 641±142  2.1±0.4
肥胖 1225±173  2.4±0.5
p值 0.03  0.6
在收集方法的实例中，使用封装在无菌容器中的收集设备。在某明确方案中，收集试剂盒10由下列组分组成：由医用级材料制成的、含医学级滤器14的无菌收集罐12，该滤器一方面允许游离脂类与吸脂术中使用的溶液和血液滤过，另一方面可将脂肪组织部分留在收集器的细胞收集部分15中。罐体12有端口16和20，其中端口16位于滤器14的一侧并通过连接管18连接至吸引源上，第二端口20通过可弯曲管22连接至一个无菌、单人使用的一次性吸脂插管上。该罐体12还有其它端口26和28以及连接机械装置30和32，用于组织处理过程中所用物质的进出。这种设备还有一个可粘贴的标记，用以标记设备以及填写需要粘贴的关于组织收集的信息(如捐献者身份，日期，时间)，该标记与血袋上贴的标志相似。罐体上还包括测量滤器截留的组织量的方法或指示(未显示)信息。可在连接管18，22或所包括的多种管路或附加端口16，20，26，28，30，32上安装夹子或阀门34，用以控制液体流速或使用的真空度。
适用的保留至少约百分之九十(90％)干细胞和祖细胞的典型过滤材料是聚酯网格，其厚度为200微米，孔径大小为265微米且有47％开放区域。
用前，可用本领域内已知的任何技术对罐体和连接组件灭菌，包括但并不限于β或γ射线处理，在蒸汽灭菌装置中对适合的物质高压灭菌，ETO暴露等。比如，某优选方案中使用γ射线处理灭菌，其确保无菌的剂量是按照预先确定的剂量实施，如由FDA或其它调节机构批准的剂量。
收集装置10可在吸脂术前摆放在手术间，以方便使用。
可以预见，本领域内的技术人员会使用许多备选部件、材料和设备，上述方案仅提供一个实施例，并非对本发明和在所申请的权利要求作范围限制。由具有医学资格的人员实施的、目的为美体塑身的吸脂术，是优选的脂肪组织来源。尽管本发明处理和储存的组织量并没有一个上限或下限，但通常这种手术可获得大于100克脂肪吸出物。其它的去脂术如电力去脂和超声去脂也可用于收集脂肪组织。同样，单独使用脂肪切除术(外科的脂肪切除手术)或如腹腔成形术等大手术前后等的技术都在本发明范围之内。
吸脂手术患者准备好后，将收集设备连接到吸脂泵上，将插管按照外科手术操作流程插入捐献者体内。
注意维持无菌，吸脂手术直至完成或收集设备装满。然后将收集设备10封口，以维持存放组织的内部空腔无菌。将连接或不连接管子的收集罐与真空泵分离并转运至处理场所，其中所述的管子如前所述是明确说明操作的收集设备的管。
收集系统使用说明
举例说明上述收集设备的操作
1.医生作好术前准备，同常规吸脂术。
2.从收集容器12引出软管18，并将其连接至吸脂泵(带常规气闸和内嵌滤器)。
◆注意：设计的收集系统用于收集组织块或凝块。盐水，血液或游离的脂类可自由穿过滤器和收集容器。所以，收集容器务必放在所带常规气闸和内嵌滤器的上游，以防止吸引泵污染。
3.确保连接收集容器吸引端口16上的管18上的阀34和连接套管24的管22开放。
4.确定套管吸头的方向，用套管作为常规吸脂套管取出脂肪组织。
5.在收集容器中最多收集1.2升脂肪组织后，关闭进口的阀34和出口的管，以彻底封闭设备。
◆系统的无菌全靠有效的密封。
6.去除(切断)设备两边的管，切割位置在阀门外侧2英寸。
7.用收集容器上的客户鉴定标签码条，记录手术日期和时间。
8.将其余的客户鉴定标签码条标记贴在记录单上，填写这些记录单。将这些表格的一份与吸出的脂肪组织装在一起，留一份作记录，第3份给患者。
在优选实施方案中，收集容器12封口后，运至处理场所。可选择性的用吸引方式，使无菌洗液(比如等渗盐溶液)穿过容器和组织洗涤组织。运输期间，也可以向组织中加入用以提高干细胞活性的保护剂。
除患者信息、吸脂手术的日期和时间外，还应适当记录组织获取部位以及关于捐献者的其它的医学资料(年龄，性别，病史等)。
当组织收集场所和组织处理场所很近时，运输时不必包装收集容器。
当脂肪组织必需转运一定距离时，应当包装以免运输物质暴露于对人组织有潜在生物危害的环境。而且转运过程中，必须最大限度的保持物质活性。
通过密封收集设备或将脂肪组织转至一个更易密封的无菌容器中，保护参与运输的人员。用第2或第3重容器包装最初使用的容器，确保转运过程中即使出现最糟的情况容器仍保持密封。
快速有效的转运至处理场所是确保组织活性的保障；温度控制也可用于保证细胞最大活性。
相应地，收集容器应当放置在一隔离容器中，并用一些本领域内已知的、可调节温度的材料(如，冰、冷冻凝胶包装)填充，能够在预期转运期间维持适当的温度。在某优选方案中，使用制冷的隔离容器以提供预先确定的温度控制功能(比如，容器保持在预定温度下保持至少一定的时间)。
对于本领域的技术人员来讲，也会使用其它的密封和包装方案，只要能够达到调节需要或能够改善系统质量的要求即可。
为了保证在收集和处理之间的脂肪组织中干细胞腔的生存活性，有必要控制运输条件。另外，根据未经检验的人体生物物质的运输要求，还有一些可控性的要求。
脂肪组织的处理
脂肪组织的处理，包括一系列的洗涤和抽提步骤，其中在提取目的细胞群前，最好洗涤脂肪组织块去除游离脂类和血液。已知脂肪组织特性，使用合适的破坏结缔组织方法分解组织。脂类的浮力密度很低，因此在常规等渗、缓冲溶液中，游离脂类和成熟载脂的脂肪细胞将漂浮在上面，而脂肪组织来源的干细胞和祖细胞将沉淀，很容易分离除去大量的脂肪细胞。适用的缓冲溶液包括，但不限于，Plasma LyteA(Baxter Inc)，Normosol R(Abbott Laboratories)，和磷酸盐缓冲液。
组织分解可以用本领域已知的任何方法，包括但不限于，用蛋白水解酶消化，如胶原酶，胰酶或木瓜蛋白酶，使用绞碎或剪切等机械分解或其它方法。也可以应用联合方法如机械分解后用酶消化，以及使用联用酶方法包括使用非蛋白酶如脱氧核糖核酸酶和脂肪酶等。
组织分解，使细胞从脂肪结缔组织基质中释放出来。然后用平衡密度离心、浮力密度浮选或其它方法去除成熟的脂肪细胞。剩下的无脂肪细胞的细胞群可以用不同的方法浓缩，方法包括但不限于，离心分离、纺丝(spinning)膜离心，差异粘附(differential adherence)和洗脱至固相结构(如抗体包被的珠子)等进行分离，或通过荧光激活细胞进行筛选以及其它分离方法，或是这些方法联用。
可以从脂肪组织(和无脂肪细胞的细胞群)中进一步分离细胞群。须注意的是要确保目的细胞类型的保留量最大。在本领域中有许多已知的细胞分离技术，可进一步用于从脂肪组织中分离细胞。
比如，利用血红细胞等渗敏感性，用低渗冲击细胞群，使红细胞裂解而去除血红细胞。可以使用离心方法如平衡密度离心或离心淘选，也可以使用如免疫磁性细胞等的抗体方法，使用荧光激活细胞筛选方法或淘选技术。阳性筛选、阴性筛选以及二者联用都包括在本发明的范围之内。
对塑料制品的粘附以及细胞培养方法也可用于细胞分离和/或处理。
通过细胞培养、抗体介导的阳性和/或阴性筛选、密度梯度离心、离心淘选或其它本领域已知的方法都可用于细胞群的分离和富集，从而将祖细胞和干细胞分开。然而，本领域内任何能够获得纯的或能够富集细胞的已知方法或方法的联用，都可以应用。
脂肪组织来源的结缔组织基质，可以直接从全脂肪组织中或从提取了干细胞和祖细胞的组织中提取。优选方案中，从收集器部分15中释放出含干细胞和祖细胞群并将这些细胞取出浓缩和保存后，基质最主要地被保留在细胞收集器部分15(靠近滤器的地方)可以用不同的方法提取基质。实施例包括，将用低渗冲击(比如，用无菌蒸馏水)促使成熟脂肪细胞裂解，用离子或非离子去污剂如十二烷基硫酸钠、曲通x-100、吐温20抽提，可以用有机溶剂如丙酮或异丙醇抽提。例如，用水裂解细胞，用去污剂洗涤残余的细胞物资，然后用丙酮抽出残余脂类。
优选实施方案中，用无菌等渗盐缓冲液洗涤脂肪组织后，用一定浓度的胶原酶，在一定温度下孵育一定时间使之适当分解。适用的胶原酶溶液浓度从10微克/毫升至约50微克/毫升，孵育温度约30℃至38℃，时间约20分钟至60分钟。为保证系统能够有效的提取目的细胞群，这些参数根据胶原酶的来源不同会有所变化，可根据研究经验来优化。一种明确的优选浓度、时间和温度参数是20微克/毫升胶原酶(Blendzyme 1，Roche)，37℃孵育45分钟。在某特别的优选方案中，使用的胶原酶是由相关权威机构批准的，可以给人使用的物质(比如，美国食品药品管理局)。所用胶原酶应当无微生物和如内毒素等的污染。
可以手工或自动处理细胞和/或基质，且包含上述部分或全部的步骤。
在优选实施方案中，使用密封处理系统将细胞群受到偶然性微生物或同时处理的其它捐献者细胞的污染危险性降到最小。
向收集设备添加试剂，从收集设备去除废物和取出细胞时，所用方法能够维持无菌、密闭的流体途径，包括添加等渗的缓冲液洗涤组织，加酶分解组织以及消化后取出分离的细胞群。
优选实施方案中所用方法是使用从缓冲液袋中引出的一段无菌连接设备，与从收集设备中引出的另一段封闭的无菌管连接。同样，洗涤后的废液去除方法是通过一段密闭、无菌的管子从收集设备引向从密闭、无菌的废物袋上引出的密闭无菌管。处理过程中从脂肪组织中释放的细胞，同样通过连接在通过密闭、无菌容器上的一段密闭、无菌管从收集设备中取出至第二个无菌、密闭的容器。在该方案中，废物收集容器或细胞收集容器是柔软的无菌塑料袋。然后将细胞收集袋放置在离心机中，400xg离心10分钟，得到稳定的细胞沉淀。
从该袋上引出的无菌、密闭的管子，与无菌、密闭的第二个废物袋上的管子连接，将无细胞的溶液转运走而保留细胞沉淀。然后重悬细胞沉淀，准备保存。最后，装细胞的袋子能够连接至与合适的低温保存容器连接的无菌密闭的管子。
按照这种方式，从收集到低温保存，细胞完全处于一个密闭、无菌的流体通路中。
也可以按照同样的总体方法，在一系列密闭、无菌的管路连接系统中处理脂肪组织来源的基质。结缔组织基质，可以从未提取含干细胞和祖细胞的细胞群的组织中直接提取，或者从组织消化后粘的废物中提取。
在优选实施方案中，尽量使用由相关权威机构批准的人用试剂和系统。目的是为了加强捐献人的安全性以及提高相应调节的顺从性。如果所需试剂是未获得人用批准，则应当保证所用试剂符合预定的适用性标准，这类标准包括纯度分析，内毒素组分，无菌等。
获准给人使用的无菌等渗缓冲溶液是医用实践中最常用的商品，可以从几个制造商和分支机构购买。同样，适用的无菌连接设备的连接无菌、密闭管子的无菌密闭袋是可以购买的血库常用品。适于低温保存的柔性塑料袋也是骨髓移植项目中常用物品，可以买到。
对获得的细胞和基质进行的常规检测包括，但并不限于：
处理后的细胞群
细胞总量
细胞的无菌性
细胞活性
终产品的细胞亚群的构成，包括但不限于：
内皮细胞
干细胞
祖细胞
血细胞
残余的成熟脂肪细胞
处理后的基质
胶原含量
无菌性
胶原的完整性
这些检测和检查，使用本领域中已知的程序方法进行。比如，细胞活性使用活性染料排阻法测定，干细胞组成用有效克隆产生检测系统的CFU-F生长来确定，或用免疫检测法检测细胞表面标致来确定，而胶原完整性则可用透射电镜来检测。这些检测方法通过实施例列出，但并未打算穷尽对本领域中技术人员已知的备选的检测方法。
细胞的低温保存和储存
如上所述，在无适当添加剂和未使用有效的低温保存程序的情况下，冷冻细胞将会对细胞造成损害。有证据表明干细胞和祖细胞在冷冻前必须将其与脂肪组织和其它生物物质分离。先低温保存脂肪组织然后解冻分离干细胞的想法，并不能获得足够使用剂量的活干细胞。
低温保存添加剂分为两大类：渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中渗透性冷冻保护剂能够穿过细胞膜。渗透性冷冻保护剂的实例包括但不限于，二甲基亚砜(DMSO)，甘油和1，2丙二醇。非渗透性冷冻保护剂的实例包括但不限于，羟乙基淀粉，白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮。
最常用的渗透性冷冻保护剂是DMSO，常与非渗透性保护剂如自身血浆，人白蛋白和/或羟乙基淀粉等联用。
优选实施方案中所用的特定冷冻保护剂，有效的保证解冻后细胞的适当回收。
低温保存后活细胞的回收，可以通过在冷冻处理过程中控制冷冻速率来优化。最常用的冷冻方法是在冷冻的关键阶段，即从开始至约-50℃的这时期，冷冻速度恒定在-1℃至-3℃。
控制降温速率方法有多种，包括但不限于使用计算机控制冷冻速率，或浸泡在冷冻的有机溶剂中，或放置于机械的冷冻箱中。优选方案中，所选用的系统能够有效的控制达到预期的冷冻速率。虽然如此，倘若所用参数能够在低温保存后提供适当的细胞回收率，那么选用的冷冻速率可以超过上述指导的参数(从开始至-50℃，速率为-1℃至-3℃)
细胞被冷冻至适当温度后，样品可被转至一个长期的保存容器中。在优选实施方案中，使用真空包装的液氮罐，可将样品浸泡在液氮中或放置于罐中的气相里。这类容器可以从许多制造商或其分支机构中获得，它们也常用于农业(储存动物精子和卵细胞)和医用(人类精子库和骨髓移植项目)
优选的一个方面是，将处理的细胞悬浮在等渗缓冲溶液中(如Plasma-lyte A Baxter)并补加5％(按体积)人血清白蛋白(AmericanRed Cross Blood Services，Washington DC)，冷却至4℃。然后加入二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂至终浓度约5％至约20％，优选加10％的DMSO。使用DMSO终浓度可高达20％体积比，倘若进行适当的有效性研究能够证明目的细胞融化后的回收率相当或更高时就可以用。缓慢加入DMSO(约接近15分钟)，比如用注射器加入并不断的与细胞混合，在加入过程中，使用冰袋使细胞温度维持在4℃。
加入DMSO后，细胞以无菌的方式转至适于在液氮中长期保存的柔软的塑料袋中，然后密封并放置于一种盒子中，比如一种铝制盒子。将该盒子放置于冷冻装置中，冷冻装置能够以每分钟降1℃的可控速率冷冻细胞，从4℃冷却至-50℃。然后按照约每分钟降低10℃速率再降至-90℃，最后将该盒子放在液氮罐的气相中。
在优选实施方案中，细胞分成多份低温保存(使用多个低温保存容器或用分成多个隔间的一个低温保存容器)。这样解冻冻存的部分细胞时就不会累及低温保存的其余细胞。
备选的低温保存技术实例包括：储存于液氮液相中，保存在机械冷冻装置中，存于一个或多个低温保存管而不是低温保存袋中，使用高或低浓度的DMSO等。同样，也可以采用这样一种方案，该方案所用系统不能使物质一直处于无菌、密闭的流体途径中，或事实上物质根本就不处于这样的一种途径。
脂肪组织来源的基质最主要由胶原构成，胶原是一种在中性pH条件下不溶于水的非常稳定的蛋白质。这种物质可以低温保存，无论是以悬液方式还是干的沉淀方式且储存在零度以下，或冻干至残余水份质量比占0.5-5％并储存于室温(＜25℃)，或采用其它本领域已知的方法。储存的物质可以是完全处理后能够直接使用的物质，或是制造的中间产物。
适于存储的容器包括但不限于，存储于预装的注射器中，玻璃安剖中，管子或柔软塑料袋中。
基质很稳定，因此存储条件并不关键。对于本领域的技术人员而言，显然有很多种长期或短期的存储方法。
低温保存细胞的回收
温度升高和细胞解冻的条件也非常关键。比如，细胞内非常小的冰粒可能导致冰晶形成和再结晶。同样，冷冻时观察到等渗透压，在解冻过程中依然是使细胞受损的一种原因。而且，有证据表明冷冻保护剂DMSO在4℃以上时对细胞是有毒性的(Hak A.M.，F.G.Offerijns和C.C.Verheul“在零度以上的温度下DMSO对培养的活的心肌细胞的毒性”Cryobiology 10，p244-250，(1973))。因此，解冻后与该试剂的接触时间应尽量短。
另外，使用无菌密闭的系统和批准使用的试剂，是本发明应用需优选的一个方面。
优选实施方案中，从液氮存储装置中取出存放细胞的盒子，然后从中取出冷冻的袋子，放置在无菌而柔软的外部容器中(比如灭菌的ziploc型的塑料袋)。封口后浸泡在37℃水浴至温度升高至约4℃。在解冻过程中轻轻翻动袋子，确保加热过程中全部物质受热均匀，至袋内物质粘稠度变成泥浆样。这时，从水浴和外部容器中取出冷冻袋，然后放置在冰袋上，同时将袋上的管子或端口与从密闭、无菌容器上引出的无菌、密闭的管子连接。所述容器装有添加了蛋白源的等渗缓冲液，蛋白源如5％人血清白蛋白。这样，通过管子细胞从冷冻袋转至含白蛋白溶液的无菌、密闭容器中。将接受了细胞的容器放置于离心机中，离心沉淀细胞。通过一种能够保证无菌、密闭的流体系统连接方式，将细胞和过量的白蛋白溶液以及DMSO分开，并将过量的白蛋白溶液以及DMSO转运至第二个无菌、密闭的袋子中。然后将细胞重新悬浮于新加入的等渗溶液中，给患者使用。
如果，如同上面特定方案中所指出的，细胞存储在多个低温保存容器中或一个低温保存容器的多个隔间中，那么解冻时仅取出需要的那些袋子或隔间的细胞即可。
多种备选方案也可能属于本发明的范围，包括无需洗涤和离心去除DMSO的方案，使用其它的洗涤条件或溶液、如补充备选蛋白源的方案，或者未使用密闭、无菌流体途径的方案。
可以在洗涤溶液中加入另外的组合物，以增强细胞的回收。例如，低温保存期间破裂的细胞会将其DNA释放至培养基，DNA的高电荷和多聚物特性，将使细胞聚集在一起。因此，加入如DNase制剂(切割DNA的酶)能够使细胞聚集解除。
Horwitz等已经报告了给成骨不全患者移植骨祖细胞的研究结果，其中所述骨祖细胞源自人骨髓细胞，而成骨不全是一种遗传性的骨产生病(Horwitz EM，Prockop DJ，Gordon PL，Koo WW，Gordon PL，Neel MD，Sussman M，Orchard P，Marx JC，Pyeritz RE和Brenner MK“来源于骨髓的间质细胞在患有成骨不全的儿童中的移植型和治疗作用”Nat Med 5，p3009，(1999)；Horwitz EM，Prockop DJ，Gordon PL，Koo WW，Gordon PL，Neel MD，McCarville ME，Orchard PJ，Pyeritz RE和Brenner MK“严重成骨不全的儿童骨髓移植的临床反应”Blood 97，p1227，(2001))。研究中患者接受了32亿个有核细胞的移植治疗。根据Muschler等发表的资料，32亿个有核骨髓细胞中约含176000骨祖细胞(CFU-AP)(Muschler GF，Nitto H，Boehm CA和Easley KA“人骨髓细胞结构与年龄和性别相关的改变，以及造骨祖细胞的优势”JOrthop Res 19，p117，(2001))。
Orilic等在动物实验研究中证明：干细胞可能用于心肌梗死后受损心肌细胞的移植治疗，以及这种移植与心脏功能改善有关(Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，Bodine DM，Leri A和Anversa P“动员的骨髓细胞修复受损心脏、改进功能和存活率”Proc Natl Acad Sci USA 98，p10344，(2001)；Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，Bodine DM，Leri A和Anversa P“移植的成体骨髓细胞修复小鼠心肌损伤”Ann NYAcad Sci 938，p221，(2001)；Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，Jakoniuk I，Anderson SM，Li B，Pickel J，McKay R，Nadal-Ginard B，Bodine DM，Leri A和Anversa P“骨髓细胞再生受损心肌”Nature 410，P701，(2001))。其研究小组在一项研究中，证实干细胞可以改善生存率(Orlic等“动员的骨髓细胞修复受损心脏、改进功能和存活率”ProcNatl Acad Sci USA 98，p10344，(2001))。Orlic等的研究结果来自实验动物研究，实验动物注射了24000个部分纯化的干细胞，该数量大约是全部骨髓开始时的1％。发表的、使用低温保存的血和骨髓干细胞获得的资料表明：血液和骨髓干细胞保留了干细胞的活性。
实施例1
下列资料来自收集自14个个体的样品。样品收集自吸脂术手术，脂肪组织收集在如图1，2所示的收集设备中。然后密封该设备，将其放置于隔离的运输容器中，并用两个冰袋保温运至处理场所。然后用等渗盐水洗涤，并用Liberase Blendzyme 1胶原酶消化(20微克/毫升；Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。释放出的细胞4℃，400×g离心10分钟；然后重悬于50毫升Plasma-Lyte A(Baxter Inc)中，其中添加了5％人血清白蛋白(American Red Cross Blood Service，Washington DC)和10％DMSO(Cryoserv；Edwards Life Sciences，Irvine，CA)，制备低温保存的细胞。
用血细胞计数器计数细胞，用台盼兰染色检测活细胞；干细胞含量用CFU-AP方法检测，即将1000个细胞接种在培养基中培养10天，然后用通过染色检测培养皿，染色作为骨祖细胞标志的碱性磷酸酶的表达情况确定。与14个样品相关的信息列表如下：
样品号 收集的组织量(克) 处理后细胞的存活率(％) 活的有核细胞总量(×108) CFU-AP总量(×106)
 1  1100  95  1.33  2.1679
 2  800  62.2  1.18  2.36
 3  400  81  2  0.4
 4  650  78.1  1.6  10.4
 5  1300  84.9  1.35  10.8
 6  150  98  0.26  0.52
 7  950  89  1.3  4.849
 8  1200  71  1.1  1.958
 9  700  79  1.02  0.4386
 10  100  91.8  0.37  0.481
 11  750  93.3  1.21  0.605
 12  160  51  0.2  0.24
 13  300  97  0.53  1.06
 14  100  76.5  0.16  0.2656
平均  619  82  0.97  2610000
最小  100  51  0.16  240000
最大  1300  98  2.0  10800000
治疗应用
上述资料证明吸脂术后获得细胞的平均CFU-AP(干细胞)为2600000。即使是收集量最小样品(样品6，10和14)，CFU-AP也超过176000。
如上面方法中所探讨的，收集的样品使用10％DMSO并分成小份低温保存，从4℃至-50℃冷冻速率控制在每分钟降1℃。一旦样品温度达到-50℃，冷冻速率提高至每分钟降10℃，直至达到-90℃。然后将小份样品放置于密封低温保存罐的液氮气相中。
样品低温保存在-196℃平均约30天。
取低温保存的一份一份的细胞融化解冻，检测有核细胞的回收情况，检测多细胞系的分化能力的保留情况。
将细胞容器放置在37℃的水浴中，轻轻搅动解冻细胞，直至容器中的细胞和培养基的粘稠度变的如泥浆状。然后立即从水浴中取出容器，放置在平衡至4℃冰袋上。打开容器，将细胞释放至洗涤溶液中，该溶液中含组织培养基且添加20％血清。4℃，400×g离心洗涤细胞，弃掉无细胞的上清，将细胞重悬于含10％血清的组织培养基中。计数细胞，用台盼兰染色确定细胞的存活率，并用血细胞计数器计数。然后培养细胞确定其增殖、分化能力，并确定解冻后干细胞的含量(CFU-AP检测)。
有证据表明低温保存的细胞解冻后回收率达80.9％，细胞没有丧失分化为脂肪细胞系的能力(冷冻前的103％)，分化为造骨细胞的能力(冷冻前的105％)以及分化为神经元的能力(冷冻前的97％)。由于培养的节结构，所以不可能定量检测软骨形成的分化。虽然如此，低温保存后的细胞也观测不到软骨分化的定性水平的损失。图3是一个低温保存细胞和该细胞解冻回收的实例。
实施例2
引用下列资料是为了证实特定脂肪组织处理方法的实用性。
样品号：SVF 94
捐献者性别：女性
捐献者年龄：68
脂肪组织的收集
收集组织总量：400毫升
收集方法：吸脂术
组织收集容器类型(收集设备)：无菌收集设备，如上所述，如图1，2所示。
收集时间：近2小时
收集时的收集的资料：
吸脂术的日期和时间
医生标示符：
捐献者标示符(与标号标示符相关)
目前使用的药物
绝经期状况
吸烟与否
手术史
吸脂术史
身体情况
组织至处理场所的运输
运输物的包装：收集设备用双重塑料袋密封
运输时间：2.5小时
样品运输过程中的温度(接受点测试)：4℃
组织处理
使用的系统类型：密闭无菌流体通路
组织洗涤溶液：等渗盐水(温度38℃)
使用的洗涤溶液体积：1500毫升
洗涤液收集机制：3升的血浆运输袋(用无菌对接方式连接)
组织消化方法：酶/胶原酶：Blendzyme 1，Roche Diagnostics；使用浓度为20微克/毫升
组织消化时间：60分钟
组织消化体积：600毫升
释放的细胞收集方法：用Sorvall RC3离心机离心，400×g，4℃离心10分钟。
丢弃的液体收集方法：将上清压进600毫升血浆转移袋(CharterMedical)
细胞悬浮培养基：Plasma Lyte A(Baxter Inc)，添加5％人血清白蛋白；总体积52毫升。
冷冻保护剂：Cryoserv DMSO(Edwards Life Science)添加5.75毫升
低温保存工艺
添加冷冻保护剂的机制：用注射器泵以0.25毫升/分钟的流速加入。细胞先预先冷却至4℃。在添加冷冻保护剂的过程中，用Insul-Ice(Polyfoam Packers)预先冷却至4℃维持温度不变。
低温保存容器：干细胞冷冻袋(Pall Medical)(使用两个袋子)放置于铝制外部容器(Pacific Sciences)中。
低温保存机制：MVE KryoSave，一种能够用计算机控制降温速率的低温保存柜，控制程序如下：
起始温度：4℃
冷却速率A：-1℃/分钟
冷却范围A：4℃至-50℃
冷却速率B：-10℃/分钟
冷却范围B：-50℃至-90℃
最终(维持)温度：-90温度
低温保存条件：MVE1841液氮储存罐气相
细胞测试
细胞计数机制：血细胞计数器和手工计数
细胞的最后得率：4.5×107活得有核细胞
细胞存活率：台盼兰染色，80％得活细胞
CFU-AP含量：7.7CFU-AP/1000有核细胞
            总CFU-AP为345375
无菌检测：10毫升培养升上清加10毫升BacT-Alert无菌检测系统至好氧试管，培养14天。无菌结果：未检测到微生物生长
低温保存细胞解冻后的分折
干细胞检测(CFU-AP)
冷冻期：153.5CFU-AP/每接种20000细胞
解冻后：146CFU-AP/每接种20000细胞
解冻后CFU-AP得回收率：95％
开始CFU-AP得率为345375，回收后得率(95％回收率)＝328106
细胞增殖：
在干细胞组织培养基(添加10％小牛血清和抗生素的DMEM培养基)中接种20000个细胞，在潮湿空气的含5％CO2孵箱中，37℃培养14天。胰酶直接消化，用血细胞计数器计数细胞/确定得率。
冷冻前：获得细胞量2.2±0.1×104有核细胞
融化后：获得细胞量2.4±0.4×104有核细胞
总结：增殖能力方面没有明显的统计学差异
检测结果表明：低温保存、解冻的细胞实质上与低温保存前的同一批细胞具有相同的活性
解冻后的细胞保留全部的功能，培养中未见分化为软骨细胞系(软骨)，成骨细胞(骨)，神经元细胞系(神经)和脂肪细胞(脂肪)能力的上丧失。
这些细胞在体内的分化，也通过大鼠动物模型得到证实，即用低温保存的大鼠脂肪组织来源的细胞移植至另一只大鼠心脏(图4)。移植一周后，收获回收的细胞，证实它们在受者心脏中保留了增殖和分化能力。用回收的人脂肪组织来源的细胞，移植至免疫缺陷小鼠的膀胱，结果表明人细胞(图5)能够分化为平滑肌样细胞。以前试图通过低温保存完整的脂肪组织来成功低温保存其中的脂肪组织来源的细胞，结果失败(Lidagoster，MI，Cinelli PB，Levee EM和Sian CS“新鲜的、冷藏的和冷冻的样本的自身脂肪移植的比较：动物模型”，Ann PlastSurg.44，p512-515，(2000))，与之相反，本发明方法取得了成功。
回收基质
基质的回收，取决于所采用的特定的基质存储方法，包括各种各样的选择，如向存储在注射器中的基质加入液相载体溶解作为处理后期的中间产物。图6结果证实了存储的基质应用结果，即将存储的基质物回收并作为体内脂肪组织产生的支架结构。图6结果表明在基质支架结构上产生了成熟的、载脂的脂肪细胞(箭头所指)。
细胞和基质物存储后的检测
为临床应用的细胞和基质，临床应用前应作检测和/或测试。在完成这些检测期间，应当注意保护回收细胞的活力。
可能的检测包括但不限于，细胞计数和用台盼兰染色排除法或类似技术检测活力，通过DNA指纹图谱或类似方法确定供体细胞的一致性。优选方案中，密封在无菌的与储存袋相连的管子中的低温保存的部分物资，在不妨碍、不融化以及不将袋中的物质暴露在环境的前提下，从袋子中剪出。在解冻袋子中的全部物质前，可先解冻检测密封在一定长度的管子中的细胞。通过这种方法，在回收细胞的主体前，完成测试并确证供体与细胞的一致性。
另外，在处理程序的最后，也可以作上面所列出的任何或全部检测和测试(比如免疫表形或克隆培养)。
在临床应用前对存储后的细胞和物质的操作
脂肪组织内的干细胞和祖细胞的特性，决定了它们具有包括组织工程和基因医学等的多方面的应用价值。在这些领域中特定应用，需要在输入受者体内或研究前，对这些细胞进行操作。
实例包括但并不限于，细胞培养以增加细胞数量和/或纯化细胞，富集或纯化细胞亚群，向细胞中导入基因，或细胞培养后细胞群体分化来促进获得目的表型或功能。
对细胞和基质库应用质控系统
完整的质控系统是本发明的一个可选择的部分。该系统将会覆盖本发明的每个方面，确保处理程序的可控性以及将出错机率降至最小。
虽然认为是可选择性的，但在无质控系统控制的情形下，本发明实施最终可能会出现质量降低，样品一致性以及其它问题。
如美国组织库协会和美国血库协会等专业机构，对应用其特定领域的质控系统有详细的要求，这些要求对本发明内容有相当重要的意义。同样，由国际标准机构制定的ISO9000系列标准，尽管是必要的原则性的，同样适用于本发明。由美国食品药品管理局颁布的包括安全组织准则的规则，包含了样品管理规则。
能够应用于本发明实践的质控系统的部分成分，包括但不限于，如下：
·组织处理程序的各种处理对照(从捐献者与项目的接触至组织收集，处理场所的接受、处理、测试、存储和释放)
·标记全部生产过程的细胞群/基质产物，
·项目的组织、管理和监督，包括指派专人负责质控系统的开发和执行
·职员的选择、培训和教育
·供应品的选择、购置、检测和使用
·仪器的选择、购置、检测、维护和使用
·供应品的评价
·项目专产或为项目生产的产品的设计和制造。
·文献、记录、修改和对照
·设备
·处理方法的改进
·错误/差错检查
·证书和对客户投诉的反应
·产品和工艺标准的开发
·安全性
·项目内部的开发和执行，评价质控系统的适应性。
本发明的实施可能没有上述的可选择性部分，也可能有部分或全部上述部分。
本发明的脂肪组织干细胞和祖细胞群以及基质，有多方面潜在的治疗，结构和美容应用价值。这些应用方面所用的细胞和/或基质，可以来自应用者自身(自体应用)，或来自相关的或不相关的个体(异源应用)。本发明优选的方案是将细胞和/或基质用于自体应用，即将从某个体脂肪组织获得的细胞或基质再返用于他自己。这种方法避免了使用抗排斥药物，降低了组织排斥危险以及传染病的引入。在干细胞和祖细胞以及基质保存完好的情况下，也就是说干细胞和祖细胞以及基质并非根本性的原因时，这种方法是可行的。比如，自体干细胞和祖细胞可应用促进心肌组织的或软骨损伤的修复。然而，未进行基因转化，来源于脂肪组织的自体干细胞或祖细胞将不适用于对患成骨不全——一种骨产生遗传疾病的骨损伤的治疗。在这种情况下，优选从相关或不相关的供体来源的异源干细胞和祖细胞。
在未背离本发明宗旨和范围的前提下，可以改造和变更本发明。本文提供的明确实施例和方案仅仅是举例，本发明仅限于附加的权利要求。
比如，优选的收集程序使用了带可渗透膜的收集设备，将目的组分从欲弃组分中分离出来，然而也可以在单一收集容器中收集从患者体内获得的全部吸出物，并在低温保存前将收集物全部运至分离、提取干细胞、祖细胞、基质和任何其它的目的组分的场所。
更进一步地，本发明也包括收集、转运以及低温保存全部的吸脂术吸出物。然后在将来用前面所述方法，将吸出物加热到适当的处理温度，如在4℃或高于4℃但优选低于体温的温度下，回收、分离干细胞、祖细胞、基质以及任何其它的目的组分。
权利要求书
(按照条约第19条的修改)第1页
1.一种从脂肪组织中回收和保存干细胞、祖细胞以及基质用于治疗的方法，包括：
a.真空吸取脂肪组织至容器的细胞收集部分，该部分由可渗透的膜将其与围绕细胞分离部分的容器分隔开，其中可渗透的膜将脂肪组织中的目的组分保留在细胞收集部分中，并将可丢弃的组分透过该膜而除去；
b.分离收集部分中保留的物质，洗涤所述分离的物质以除去任何可丢弃组分，并从中分离基质和无脂肪细胞的细胞群中至少一种；
c.低温保存和存储无脂肪细胞的细胞群与细胞基质中至少一种中的一种或多种目的组分。
2.权利要求1中的方法，其中目的组分包括细胞群和基质，所述细胞群包括干细胞、祖细胞，可丢弃的组分包含肿胀溶液、盐水、血液、血栓、游离脂类和成熟的脂肪细胞。
3.权利要求1中的方法，其中可渗透的膜是一种具有确定孔隙度的滤膜材料。
4.权利要求1中的方法，其中分离和洗涤方法包括：分离留在收集部分中的物质，分解所述分离的物质并将分解的物质置于等渗缓冲溶液中，由此从游离的脂类和脂肪细胞中分离出干细胞和祖细胞，并除去游离的脂类和脂肪细胞。
5.权利要求4的方法，其中分解是通过将收集部分中的物质暴露于蛋白水解酶中、机械分解或是这些方法联用而完成的。
6.权利要求5的方法，其中分解是通过将收集部分中的物质暴露于胶原酶、胰酶、木瓜蛋白酶、DNase或脂酶中，或者绞碎或剪切，或者这些方法联用而完成的。
7.权利要求5的方法，其中从可丢弃的组分中分离干细胞和祖细胞的方法是离心或浮力密度浮选。
8.权利要求1的方法，其中无脂肪细胞的细胞群，可以通过离心，纺丝膜分离、差异粘附、洗脱至固相结构、荧光激活细胞筛选或这些方法的联用而从其他物质浓缩。
9.权利要求8的方法，其中固相结构是抗体包被的珠子。
10.权利要求8中的方法，进一步包括将无脂肪细胞的细胞群分成干细胞富集相或祖细胞富集相。
11.适于输给同种哺乳动物的治疗用哺乳动物细胞，包括从脂肪组织分离的活的干细胞，所述干细胞在低温保存后处于解冻状态。
12.权利要求1的方法，其中低温保存包括将无脂肪细胞的细胞群与一种或多种冷冻保护剂混合，以恒定的约-1℃至-3℃的降温速率将混合物冷却，直至混合物降至-50℃，将冷却的混合物储存在含液氮的容器中。
13.权利要求12的方法，其中冷冻保护剂选自渗透性、非渗透性冷冻保护剂以及它们的组合。
14.权利要求13的方法，其中渗透性冷冻保护剂是二甲基亚砜、甘油、1，2丙二醇或它们的组合，而非渗透性冷冻保护剂是自体血浆、人血清、羟乙基淀粉、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮或它们的组合。
15.权利要求1的方法，其中
a.无脂肪细胞的细胞群被制成5％人血清白蛋白溶液中的细胞悬液，
b.悬液冷却至4℃
c.慢慢将二甲基亚砜加入冷却的悬液中，同时维持悬液温度在4℃，使DMSO终浓度按体积比约为5～20％
d.细胞悬液以每分钟约-1℃的速率，降至温度为-50℃。
e.细胞悬液以每分钟约-10℃的速率，降至温度为-90℃
f.将细胞悬液置于液氮储存容器的汽相中。
16.权利要求1的方法，其中无脂肪细胞的细胞群在低温保存前被进一步分成多于一个部分。
17.权利要求15的方法，其中DMSO的终浓度按体积比为10％。
18.权利要求1的方法，进一步包括回收低温保存的无脂肪细胞的细胞群，包括慢慢将其温度升高至约4℃。
19.权利要求1的方法，其中基质分离自任何其它回收物，将其冻干至残余水份含量按体积比约为0.5～5.0％，并存储在约25℃或低于约25℃。
20.一种治疗组合物，包含用于输给患者的处于载体溶液中的活的干细胞，所述干细胞是从脂肪组织回收的，与脂肪组织中的其它细胞物质相分离，在低温保存后处于解冻状态，所述干细胞具有治疗或美容活性。
21.权利要求20中的治疗组合物，进一步包含从脂肪组织回收的祖细胞，对其进行与干细胞相同的处理。
22.一种低温保存的治疗组合物，包含来源于一个捐献者的脂肪组织的活的干细胞，其含量足以在低温保存后能够保留适当水平的所述干细胞的活力，所述干细胞的含量使得它在解冻并去除冷冻保护剂后足以分化成各种细胞类型并增殖。
23.权利要求22的低温保存的治疗组合物，进一步包含活的祖细胞。
24.一种治疗哺乳动物受试者的方法，该受试者被诊断患可以通过输给干细胞和/或祖细胞而治疗的疾病，所述方法包括输给该受试者先前低温保存的干细胞、祖细胞或它们的组合，其中低温保存的干细胞和祖细胞是先前从该受试者的脂肪组织中收集的。
25.权利要求24的方法，其中低温保存的干细胞和祖细胞是通过以下方法从哺乳动物受试者的脂肪组织中回收和保存的：
a.将脂肪组织真空吸取至容器的细胞收集部分中，其中的细胞收集部分由渗透性膜将其与容器周围的部分分开，细胞收集部分的该渗透性膜能够保留脂肪组织中目的组分，并能够将需丢弃的组分通过该膜而丢弃；
b.分离保留在收集部分中的物质，洗涤所述分离的物质以去除任何可丢弃的组分，并从中分离出无脂肪细胞的细胞群；低温保存和低温储藏无脂肪细胞的细胞群，从存储器中取出，加热至至少约4℃，在给个体输送低温保存的无脂肪细胞的细胞群前，去除其中的基本上所有的冷冻保护剂。
26.一种从脂肪组织中回收和保存干细胞、祖细胞和基质用于治疗的方法，包括：
a.从患者身上取出脂肪组织；
b.从脂肪组织中分离出无脂肪细胞的细胞群和基质中的至少一种；
c.低温保存无脂肪细胞的细胞群和基质中的至少一种。
27.权利要求26的方法，进一步包括解冻低温保存的无脂肪细胞的细胞群的步骤。
28.权利要求27的方法，其中解冻步骤包括加热无脂肪细胞的细胞群至约37℃。
29.权利要求26的方法，其中从患者身上取出脂肪组织包括从患者身上吸取脂肪组织。
30.权利要求28的方法，其中从患者身上取出脂肪组织包括将脂肪组织吸取到容器中，其中脂肪组织可在该容器中与干细胞和祖细胞分离。
31.权利要求26的方法，其中与基本上一致但无分离步骤的方法相比，进行分离能够有效地提供数量增加的活细胞。
32.权利要求26的方法，其中分离步骤包括从脂肪组织中分离多能干细胞。
33.权利要求26的方法，其中的低温保存方法包括将无脂肪细胞的细胞群与冷冻保护剂混合。
34.权利要求26的方法，其中取出组织、分离和低温保存是依次进行的。
35.权利要求26的方法，其中分离步骤包括离心、纺丝膜分离、差异粘附、洗脱至固相结构，以及荧光激活细胞筛选中的至少一种。
36.权利要求26的方法，进一步包括低温保存的基质的解冻步骤。
37.权利要求36的方法，其中解冻步骤包括将基质加热至约37℃。
38.权利要求37的方法，其中取出组织包括将脂肪组织吸取到容器中，其中基质可在该容器中与其他组织分离。
39.权利要求26的方法，其中低温保存包括将基质与冷冻保护剂混合。

Claims (25)

1.一种从脂肪组织中回收和保存干细胞、祖细胞以及基质用于治疗的方法，包括：
a.真空吸取脂肪组织至容器的细胞收集部分，该部分由可渗透的膜将其与围绕细胞分离部分的容器分隔开，其中可渗透的膜将脂肪组织中的目的组分保留在细胞收集部分中，并将可丢弃的组分透过该膜而除去；
b.分离收集部分中保留的物质，洗涤所述分离的物质以除去任何可丢弃的组分，并从中分离基质和无脂肪细胞的细胞群；
c.低温保存和存储无脂肪细胞的细胞群中的一种或多种目的组分与细胞基质。
2.权利要求1中的方法，其中目的组分包括细胞群和基质，所述细胞群包括干细胞、祖细胞，可丢弃的组分包含肿胀溶液、盐水、血液、血栓、游离脂类和成熟的脂肪细胞。
3.权利要求1中的方法，其中可渗透的膜是一种具有确定孔隙度的滤膜材料。
4.权利要求1中的方法，其中分离和洗涤方法包括：分离留在收集部分中的物质，分解所述分离的物质并将分解的物质置于等渗缓冲溶液中，由此从游离的脂类和脂肪细胞中分离出干细胞和祖细胞，并除去游离的脂类和脂肪细胞。
5.权利要求4的方法，其中分解是通过将收集部分中的物质暴露于蛋白水解酶中、机械分解或是这些方法联用而完成的。
6.权利要求5的方法，其中分解是通过将收集部分中的物质暴露于胶原酶、胰酶、木瓜蛋白酶、DNase或脂酶中，或者绞碎或剪切，或者这些方法联用而完成的。
7.权利要求5的方法，其中从可丢弃的组分中分离干细胞和祖细胞的方法是离心或浮力密度浮选。
8.权利要求1的方法，其中无脂肪细胞的细胞群，可以通过离心，纺丝膜分离、差异粘附、洗脱至固相结构、荧光激活细胞筛选或这些方法的联用而从其他物质浓缩。
9.权利要求8的方法，其中固相结构是抗体包被的珠子。
10.权利要求8中的方法，进一步包括将无脂肪细胞的细胞群分成干细胞富集相或祖细胞富集相。
11.适于输给同种哺乳动物的治疗用的哺乳动物细胞，包括从脂肪组织分离的干细胞，所述干细胞在用前被低温保存和解冻。
12.权利要求1的方法，其中低温保存包括将无脂肪细胞的细胞群与一种或多种冷冻保护剂混合，以恒定的约-1℃至-3℃的降温速率将混合物冷却，直至混合物降至-50℃，将冷却的混合物储存在含液氮的容器中。
13.权利要求12的方法，其中冷冻保护剂选自渗透性、非渗透性冷冻保护剂以及它们的组合。
14.权利要求13的方法，其中渗透性冷冻保护剂是二甲基亚砜、甘油、1，2丙二醇或它们的组合，而非渗透性冷冻保护剂是自体血浆、人血清、羟乙基淀粉、白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮或它们的组合。
15.权利要求1的方法，其中
a.无脂肪细胞的细胞群被制成5％人血清白蛋白溶液中的细胞悬液，
b.悬液冷却至4℃，
c.慢慢将二甲基亚砜加入冷却的悬液中，同时维持悬液温度在4℃，使DMSO终浓度按体积比约为5～20％，
d.细胞悬液以每分钟约-1℃的速率，降至温度为-50℃，
e.细胞悬液以每分钟约-10℃的速率，降至温度为-90℃，
f.将细胞悬液置于液氮储存容器的汽相中。
16.权利要求1的方法，其中无脂肪细胞的细胞群在低温保存前被进一步分成多于一个部分。
17.权利要求15的方法，其中DMSO的终浓度按体积比为10％。
18.权利要求1的方法，进一步包括回收低温保存的无脂肪细胞的细胞群，包括慢慢将其温度升高至约4℃。
19.权利要求1的方法，其中基质分离自任何其它回收物，将其冻干至残余水份含量按体积比约为0.5～5.0％，并存储在约25℃或低于约25℃。
20.一种治疗组合物，包含用于输给患者的处于载体溶液中的干细胞，所述干细胞是从脂肪组织回收的，与其它细胞物质相分离，低温保存后解冻，所述干细胞具有治疗或美容活性。
21.权利要求20中的治疗组合物，进一步包含从脂肪组织回收的祖细胞，对其进行与干细胞相同的处理。
22.一种低温保存的治疗组合物，包含来源于一个捐献者的脂肪组织的活的干细胞，其含量足以在低温保存后能够保留适当水平的所述干细胞的活力，所述干细胞的含量使得它在解冻并去除冷冻保护剂后足以分化成各种细胞类型并增殖。
23.权利要求22的低温保存的治疗组合物，进一步包含活的祖细胞。
24.一种治疗哺乳动物受试者的方法，该受试者被诊断患可以通过输给干细胞和/或祖细胞而治疗的疾病，所述方法包括输给该受试者先前低温保存的干细胞、祖细胞或它们的组合，其中低温保存的干细胞和祖细胞是先前从该受试者的脂肪组织中收集的。
25.权利要求24的方法，其中低温保存的干细胞和祖细胞是通过以下方法从哺乳动物受试者的脂肪组织中回收和保存的：
a.将脂肪组织真空吸取至容器的细胞收集部分中，其中的细胞收集部分由渗透性膜将其与容器周围的部分分开，细胞收集部分的该渗透性膜能够保留脂肪组织中目的组分，并能够将需丢弃的组分通过该膜而丢弃；
b.分离保留在收集部分中的物质，洗涤所述分离的物质以去除任何可丢弃的组分，并从中分离出无脂肪细胞的细胞群；低温保存和低温储藏无脂肪细胞的细胞群，从存储器中取出，加热至至少约4℃，在给个体输送低温保存的无脂肪细胞的细胞群前，去除其中的基本上所有的冷冻保护剂。
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