JPH0892001A - 細胞集団の保存方法 - Google Patents
細胞集団の保存方法Info
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- JPH0892001A JPH0892001A JP6254192A JP25419294A JPH0892001A JP H0892001 A JPH0892001 A JP H0892001A JP 6254192 A JP6254192 A JP 6254192A JP 25419294 A JP25419294 A JP 25419294A JP H0892001 A JPH0892001 A JP H0892001A
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- cell
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医療現場において安価、簡便かつ安全に用い
ることができる細胞の保存方法を提供する。 【構成】 真に必要な細胞の回収率ａと不要な細胞の回
収率ｂの比がａ／ｂ＞１である滅菌済のフィルターを用
いて細胞集団を処理する工程を含む細胞集団の保存方
法。 【効果】 細胞数の減少による体積減で、冷凍保存スペ
ースの節約ができ、ジメチルスルホキシドの使用量が減
少するので、ジメチルスルホキシドによる副作用の低減
が期待でき、さらに、非常に簡便であると共に、滅菌済
フィルターを用いるので、冷凍保存した細胞を臨床用途
として用いる場合でも、極めて安全に用いることができ
る。
ることができる細胞の保存方法を提供する。 【構成】 真に必要な細胞の回収率ａと不要な細胞の回
収率ｂの比がａ／ｂ＞１である滅菌済のフィルターを用
いて細胞集団を処理する工程を含む細胞集団の保存方
法。 【効果】 細胞数の減少による体積減で、冷凍保存スペ
ースの節約ができ、ジメチルスルホキシドの使用量が減
少するので、ジメチルスルホキシドによる副作用の低減
が期待でき、さらに、非常に簡便であると共に、滅菌済
フィルターを用いるので、冷凍保存した細胞を臨床用途
として用いる場合でも、極めて安全に用いることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、骨髄あるいは末梢血な
ど有用細胞を含む細胞集団を保存する方法に関する。さ
らに詳しくは、細胞を冷凍保存する際の保存スペースを
節約する方法に関する。
ど有用細胞を含む細胞集団を保存する方法に関する。さ
らに詳しくは、細胞を冷凍保存する際の保存スペースを
節約する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】白血病などの造血器腫瘍および固形癌の
化学療法における主たる副作用である造血障害に対して
骨髄移殖療法が広く施行されている。骨髄移殖療法と
は、移殖骨髄による致死的造血障害の回復法であるた
め、患者にとって致死的な大量放射線および／または大
量化学療法の施行が可能となり、白血病や固形癌の治癒
につながる。さらに、近年、骨髄と同様に末梢血中に
も、これらの治療に必要な造血幹細胞および／または造
血前駆細胞が含まれていることが明らかになった。通
常、これらの細胞の末梢血中での含有率はかなり低値で
あり、採取して骨髄移殖の代わりに用いることは困難で
あるが、抗癌剤および／またはＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロ
ニー刺激因子）等のサイトカインを投与することによ
り、その含有率が増大することが明らかにされ、骨髄採
取と比べると、全身麻酔が不要で安全なことから、臨床
応用が盛んに行われている。
化学療法における主たる副作用である造血障害に対して
骨髄移殖療法が広く施行されている。骨髄移殖療法と
は、移殖骨髄による致死的造血障害の回復法であるた
め、患者にとって致死的な大量放射線および／または大
量化学療法の施行が可能となり、白血病や固形癌の治癒
につながる。さらに、近年、骨髄と同様に末梢血中に
も、これらの治療に必要な造血幹細胞および／または造
血前駆細胞が含まれていることが明らかになった。通
常、これらの細胞の末梢血中での含有率はかなり低値で
あり、採取して骨髄移殖の代わりに用いることは困難で
あるが、抗癌剤および／またはＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロ
ニー刺激因子）等のサイトカインを投与することによ
り、その含有率が増大することが明らかにされ、骨髄採
取と比べると、全身麻酔が不要で安全なことから、臨床
応用が盛んに行われている。
【０００３】ここで、細胞を誰から得るかによって、移
殖法は同種移殖と自家移殖に分けられる。前者は健康な
他人（血縁者あるいは非血縁者）の細胞を用いるもの
で、後者は患者本人の細胞を用いるものである。末梢血
を用いる移植法においては、自家移植が用いられること
が多い。同種移植が主に移植当日（大量放射線および／
または大量化学療法後）に細胞が採取され、すぐ移植さ
れることが多いのに対し、自家移植においては、大量放
射線および／または大量化学療法前に、患者自身の細胞
を採取して単核球に分離して冷凍保存し、その後、大量
放射線および／または大量化学療法を行い、冷凍保存し
ておいた細胞を解凍後、移植するすることが通常行われ
る。
殖法は同種移殖と自家移殖に分けられる。前者は健康な
他人（血縁者あるいは非血縁者）の細胞を用いるもの
で、後者は患者本人の細胞を用いるものである。末梢血
を用いる移植法においては、自家移植が用いられること
が多い。同種移植が主に移植当日（大量放射線および／
または大量化学療法後）に細胞が採取され、すぐ移植さ
れることが多いのに対し、自家移植においては、大量放
射線および／または大量化学療法前に、患者自身の細胞
を採取して単核球に分離して冷凍保存し、その後、大量
放射線および／または大量化学療法を行い、冷凍保存し
ておいた細胞を解凍後、移植するすることが通常行われ
る。
【０００４】この際、冷凍保存は液体窒素中または電気
冷凍庫中で行うのであるが、冷凍に際しては、移植時の
細胞凝集を防止するために細胞濃度を１〜５×１０7 ／
ｍｌ程度に希釈しなければならず、最近、施行例が急増
していることから、その保管スペース増大の問題が指摘
されはじめている（例えば、大坪正道，他：日本輸血学
会誌，第４０巻，第２号，３６３ページ）。さらに、冷
凍保存に際しては、凍害防止のため、ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）を通常、１０〜２０％添加しなければ
ならないが、ＤＭＳＯは毒性を持つことが知られており
（岡本康裕，他：臨床血液，第３３巻，第３号，３１７
ページ）、添加ＤＭＳＯは可及的少量にすることが望ま
しい。
冷凍庫中で行うのであるが、冷凍に際しては、移植時の
細胞凝集を防止するために細胞濃度を１〜５×１０7 ／
ｍｌ程度に希釈しなければならず、最近、施行例が急増
していることから、その保管スペース増大の問題が指摘
されはじめている（例えば、大坪正道，他：日本輸血学
会誌，第４０巻，第２号，３６３ページ）。さらに、冷
凍保存に際しては、凍害防止のため、ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）を通常、１０〜２０％添加しなければ
ならないが、ＤＭＳＯは毒性を持つことが知られており
（岡本康裕，他：臨床血液，第３３巻，第３号，３１７
ページ）、添加ＤＭＳＯは可及的少量にすることが望ま
しい。
【０００５】一方、本移植法においては真に必要な細胞
は、単核球中に約０．５〜１０％程度含まれる造血幹細
胞および／または造血前駆細胞であるので、これらの細
胞の表面抗原に対するモノクローナル抗体と磁気ビーズ
などの器具を組み合わせて利用し、濃縮してから冷凍保
存することで、細胞数の減少による体積減で冷凍保存ス
ペースの節約になり、さらには、輸注するＤＭＳＯ量が
減少するので、ＤＭＳＯの副作用軽減は可能ではある
が、この方法は、高価な試薬および器具を用いなければ
ならず、また、操作も非常に煩雑であり、かつ、滅菌が
困難であるという欠点があった。
は、単核球中に約０．５〜１０％程度含まれる造血幹細
胞および／または造血前駆細胞であるので、これらの細
胞の表面抗原に対するモノクローナル抗体と磁気ビーズ
などの器具を組み合わせて利用し、濃縮してから冷凍保
存することで、細胞数の減少による体積減で冷凍保存ス
ペースの節約になり、さらには、輸注するＤＭＳＯ量が
減少するので、ＤＭＳＯの副作用軽減は可能ではある
が、この方法は、高価な試薬および器具を用いなければ
ならず、また、操作も非常に煩雑であり、かつ、滅菌が
困難であるという欠点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上述べてきたよう
に、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の自家移植
においては、採取細胞の保管スペースの増大およびＤＭ
ＳＯによる副作用が問題となってきているが、モノクロ
ーナル抗体を用いる方法はコスト高、煩雑であり、日常
の臨床として用いるには甚だ不適当な方法であった。ま
た、滅菌が困難であるという、臨床用途としては安全面
における致命的欠陥を持っていた。そこで、本発明の目
的は、医療現場において安価、簡便かつ安全に用いるこ
とができる細胞の保存方法を提供することにある。
に、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の自家移植
においては、採取細胞の保管スペースの増大およびＤＭ
ＳＯによる副作用が問題となってきているが、モノクロ
ーナル抗体を用いる方法はコスト高、煩雑であり、日常
の臨床として用いるには甚だ不適当な方法であった。ま
た、滅菌が困難であるという、臨床用途としては安全面
における致命的欠陥を持っていた。そこで、本発明の目
的は、医療現場において安価、簡便かつ安全に用いるこ
とができる細胞の保存方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、真に必要な細
胞の回収率ａと不要な細胞の回収率ｂの比がａ／ｂ＞１
である滅菌済のフィルターで細胞集団を処理してから冷
凍保存を行うと、細胞数の減少による体積減で、冷凍保
存スペースの節約が可能となること、ＤＭＳＯの使用量
が低減することを見出し、本発明を完成するにいたっ
た。
的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、真に必要な細
胞の回収率ａと不要な細胞の回収率ｂの比がａ／ｂ＞１
である滅菌済のフィルターで細胞集団を処理してから冷
凍保存を行うと、細胞数の減少による体積減で、冷凍保
存スペースの節約が可能となること、ＤＭＳＯの使用量
が低減することを見出し、本発明を完成するにいたっ
た。
【０００８】すなわち、本発明は、細胞集団を冷凍保存
する方法であって、真に必要な細胞の回収率ａと不要な
細胞の回収率ｂの比がａ／ｂ＞１である滅菌済のフィル
ターで細胞集団を処理する工程を含むことを特徴とする
細胞集団の保存方法である。本発明によれば、高価なモ
ノクローナル抗体等の試薬および器具を用いることがな
く、また、非常に簡便であると共に、滅菌済みフィルタ
ーを用いているので、冷凍保存した細胞を臨床用途とし
て用いる場合でも、極めて安全性が高い。
する方法であって、真に必要な細胞の回収率ａと不要な
細胞の回収率ｂの比がａ／ｂ＞１である滅菌済のフィル
ターで細胞集団を処理する工程を含むことを特徴とする
細胞集団の保存方法である。本発明によれば、高価なモ
ノクローナル抗体等の試薬および器具を用いることがな
く、また、非常に簡便であると共に、滅菌済みフィルタ
ーを用いているので、冷凍保存した細胞を臨床用途とし
て用いる場合でも、極めて安全性が高い。
【０００９】本発明においては、真に必要な細胞の回収
率ａと不要な細胞の回収率ｂの比がａ／ｂ＞１である滅
菌済のフィルターを用いるのであるが、真に必要な細胞
の回収率ａと不要な細胞の回収率ｂは、以下のように算
出される。フィルター通過前の総細胞数をＴ0 （血球計
で測定）、必要細胞含有率をｘ0 （フローサイトメトリ
ーで測定）とすると、 不要細胞含有率は１００−ｘ0 必要細胞数は Ｔ0 ｘ0 ／１００ 不要細胞数は Ｔ0 （１００−ｘ0 ）／１００とな
る。
率ａと不要な細胞の回収率ｂの比がａ／ｂ＞１である滅
菌済のフィルターを用いるのであるが、真に必要な細胞
の回収率ａと不要な細胞の回収率ｂは、以下のように算
出される。フィルター通過前の総細胞数をＴ0 （血球計
で測定）、必要細胞含有率をｘ0 （フローサイトメトリ
ーで測定）とすると、 不要細胞含有率は１００−ｘ0 必要細胞数は Ｔ0 ｘ0 ／１００ 不要細胞数は Ｔ0 （１００−ｘ0 ）／１００とな
る。
【００１０】同様に、フィルター通過後の総細胞数をＴ
1 （血球計で測定）、必要細胞含有率をｘ1 （フローサ
イトメトリーで測定）とすると、 不要細胞含有率は１００−ｘ1 必要細胞数は Ｔ1 ｘ1 ／１００ 不要細胞数は Ｔ1 （１００−ｘ1 ）／１００とな
る。
1 （血球計で測定）、必要細胞含有率をｘ1 （フローサ
イトメトリーで測定）とすると、 不要細胞含有率は１００−ｘ1 必要細胞数は Ｔ1 ｘ1 ／１００ 不要細胞数は Ｔ1 （１００−ｘ1 ）／１００とな
る。
【００１１】細胞の回収率は、１００×フィルター通過
後細胞数／フィルター通過前細胞数で算出されるから、 ａ＝１００×Ｔ1 ｘ1 ／Ｔ0 ｘ0 ｂ＝１００×Ｔ1 （１００−ｘ1 ）／Ｔ0 （１００−ｘ
0 ）
後細胞数／フィルター通過前細胞数で算出されるから、 ａ＝１００×Ｔ1 ｘ1 ／Ｔ0 ｘ0 ｂ＝１００×Ｔ1 （１００−ｘ1 ）／Ｔ0 （１００−ｘ
0 ）
【００１２】本発明に用いる滅菌済フィルターは、上記
の条件を満足するものであれば特に限定されず、滅菌可
能な容器に滅菌可能な吸着材を充填したものであればよ
い。容器としては、市販のディスポーザブルシリンジ、
血液バッグなどがあげられる。吸着材としては、無機物
質ではハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム
系化合物、二酸化ケイ素などがあげられ、有機高分子物
質ではナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、セルロ
ースなどがあげられる。
の条件を満足するものであれば特に限定されず、滅菌可
能な容器に滅菌可能な吸着材を充填したものであればよ
い。容器としては、市販のディスポーザブルシリンジ、
血液バッグなどがあげられる。吸着材としては、無機物
質ではハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム
系化合物、二酸化ケイ素などがあげられ、有機高分子物
質ではナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、セルロ
ースなどがあげられる。
【００１３】これらの吸着材の形状は特に限定されない
が、吸着表面積を大きくしてフィルター自体を小型にす
る目的から、ビーズ、繊維塊などにすることが望まし
い。また、高価な吸着材を用いる場合は、安価な担体に
コーティングして用いることが好ましい。ビーズとして
は、平均粒径２５μｍないし２５００μｍのものが好ま
しく、さらに好ましくは４０μｍないし１０００μｍの
ものである。平均粒径が２５００μｍを超えると吸着量
が低下し、平均粒径が２５μｍ未満では圧力損失が大き
くなりすぎて好ましくない。また、繊維塊を用いる場合
は、その平均繊維径は３μｍないし３００μｍが好まし
く、１０μｍないし１００μｍがより好ましい。
が、吸着表面積を大きくしてフィルター自体を小型にす
る目的から、ビーズ、繊維塊などにすることが望まし
い。また、高価な吸着材を用いる場合は、安価な担体に
コーティングして用いることが好ましい。ビーズとして
は、平均粒径２５μｍないし２５００μｍのものが好ま
しく、さらに好ましくは４０μｍないし１０００μｍの
ものである。平均粒径が２５００μｍを超えると吸着量
が低下し、平均粒径が２５μｍ未満では圧力損失が大き
くなりすぎて好ましくない。また、繊維塊を用いる場合
は、その平均繊維径は３μｍないし３００μｍが好まし
く、１０μｍないし１００μｍがより好ましい。
【００１４】本発明に用いる細胞集団としては、血液由
来、すなわち、末梢血（全血）、末梢血（全血）を遠心
分離した単核球画分、また、近年注目を集めている臍帯
血などがあげられる。また、骨髄由来としては骨髄、骨
髄を遠心分離器で分離した単核球画分などがあげられ
る。これらの細胞集団中における真に必要な細胞として
は、造血機能回復に直接的に寄与する造血幹細胞および
／または造血前駆細胞があげられる。また、不要な細胞
としては、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球など
があげられる。
来、すなわち、末梢血（全血）、末梢血（全血）を遠心
分離した単核球画分、また、近年注目を集めている臍帯
血などがあげられる。また、骨髄由来としては骨髄、骨
髄を遠心分離器で分離した単核球画分などがあげられ
る。これらの細胞集団中における真に必要な細胞として
は、造血機能回復に直接的に寄与する造血幹細胞および
／または造血前駆細胞があげられる。また、不要な細胞
としては、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球など
があげられる。
【００１５】前述のフィルターで処理して体積が減縮さ
れた細胞集団は、冷凍保存可能な容器（コニカルチュー
ブ、プラスチックバッグなど）に充填され、凍害防止剤
などを添加して冷凍保存される。冷凍方法としては、プ
ログラムフリーザーを用いて−８０℃まで徐冷してか
ら、液体窒素または電気冷凍庫に保存する方法と、直接
−８０℃の冷凍庫中に静置させて冷凍する、いわゆる簡
易法があるが、どちらでもかまわない。本発明により保
存された細胞集団は、大量放射線および／または大量化
学療法後の患者のベッドサイドで解凍し、静脈より輸注
され、患者の造血機能回復に寄与する。
れた細胞集団は、冷凍保存可能な容器（コニカルチュー
ブ、プラスチックバッグなど）に充填され、凍害防止剤
などを添加して冷凍保存される。冷凍方法としては、プ
ログラムフリーザーを用いて−８０℃まで徐冷してか
ら、液体窒素または電気冷凍庫に保存する方法と、直接
−８０℃の冷凍庫中に静置させて冷凍する、いわゆる簡
易法があるが、どちらでもかまわない。本発明により保
存された細胞集団は、大量放射線および／または大量化
学療法後の患者のベッドサイドで解凍し、静脈より輸注
され、患者の造血機能回復に寄与する。
【００１６】
【実施例】以下に実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明は、これらにより限定されるものではない。 （実施例１） フィルターの作製 テルモ社製滅菌済ディスポーザブルシリンジ（２５ｍ
ｌ）に高圧蒸気滅菌を行った和光純薬製ナイロンウール
１ｇを無菌下で均一に詰め、滅菌済フィルターとした。
が、本発明は、これらにより限定されるものではない。 （実施例１） フィルターの作製 テルモ社製滅菌済ディスポーザブルシリンジ（２５ｍ
ｌ）に高圧蒸気滅菌を行った和光純薬製ナイロンウール
１ｇを無菌下で均一に詰め、滅菌済フィルターとした。
【００１７】実験用検体 担癌患者からＣＯＢＥ社製成分採血器ＣＯＢＥ−Ｓｐｅ
ｃｔｒａを用い、常法によりバフィーコートを採取した
後、公知のＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法にて
単核球分画に分離して、実験用検体とした。なお、本検
体の総白血球数、造血幹細胞および／または造血前駆細
胞（ＣＤ３４陽性細胞）含有率、不要細胞含有率は以下
のとおりであった。 総白血球数 ２．０６×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ２．６％ 不要細胞含有率 ９７．４％ ここで、総白血球数は血球計にて、ＣＤ３４陽性細胞含
有率はフローサイトメトリーにより測定し、（１００−
ＣＤ３４陽性細胞含有率）％を不要細胞含有率とした
（以下、同じ）。
ｃｔｒａを用い、常法によりバフィーコートを採取した
後、公知のＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法にて
単核球分画に分離して、実験用検体とした。なお、本検
体の総白血球数、造血幹細胞および／または造血前駆細
胞（ＣＤ３４陽性細胞）含有率、不要細胞含有率は以下
のとおりであった。 総白血球数 ２．０６×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ２．６％ 不要細胞含有率 ９７．４％ ここで、総白血球数は血球計にて、ＣＤ３４陽性細胞含
有率はフローサイトメトリーにより測定し、（１００−
ＣＤ３４陽性細胞含有率）％を不要細胞含有率とした
（以下、同じ）。
【００１８】フィルターによる処理 で調製した実験用検体をのフィルターに注入、３７
℃で３０分間インキュベーションを行った。その後、
０．５％ヒトアルブミン添加ＲＰＭＩ−１６４０（以
下、ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）にて溶出させた。溶出液は６０
０ｍｌの血液バッグに回収した。本操作により、総白血
球数、造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３
４陽性細胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりと
なった。 総白血球数 ０．７７×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ４．８％ 不要細胞含有率 ９５．２％ なお、ここでのＣＤ３４+ 細胞回収率（ａ）と不要細胞
回収率（ｂ）の比を計算すると１．８９となった。
℃で３０分間インキュベーションを行った。その後、
０．５％ヒトアルブミン添加ＲＰＭＩ−１６４０（以
下、ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）にて溶出させた。溶出液は６０
０ｍｌの血液バッグに回収した。本操作により、総白血
球数、造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３
４陽性細胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりと
なった。 総白血球数 ０．７７×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ４．８％ 不要細胞含有率 ９５．２％ なお、ここでのＣＤ３４+ 細胞回収率（ａ）と不要細胞
回収率（ｂ）の比を計算すると１．８９となった。
【００１９】冷凍保存 常法により１×１０7 ／ｍｌとなるように調製した細胞
浮遊液（６０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ、２０％患者
血清、２０％ＤＭＳＯを含む）を５ｍｌのポリスチレン
クライオチューブに分注し、プログラムフリーザーを用
い（−１℃／分）、液体窒素中に保存した。チューブの
必要個数は１６本であり、約８０ｃｍ3を占めた。ま
た、ＤＭＳＯの使用量は１６ｍｌであった。
浮遊液（６０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ、２０％患者
血清、２０％ＤＭＳＯを含む）を５ｍｌのポリスチレン
クライオチューブに分注し、プログラムフリーザーを用
い（−１℃／分）、液体窒素中に保存した。チューブの
必要個数は１６本であり、約８０ｃｍ3を占めた。ま
た、ＤＭＳＯの使用量は１６ｍｌであった。
【００２０】（比較例１）フィルターで処理をする以外
は、実施例１と同様の操作を行ったところ、チューブの
必要本数は４２本となったため、占有体積は約２２０ｃ
ｍ3 となり、実施例１の３倍近かった。さらに、ＤＭＳ
Ｏの使用量は、実施例１の約３倍の４２ｍｌとなった。
は、実施例１と同様の操作を行ったところ、チューブの
必要本数は４２本となったため、占有体積は約２２０ｃ
ｍ3 となり、実施例１の３倍近かった。さらに、ＤＭＳ
Ｏの使用量は、実施例１の約３倍の４２ｍｌとなった。
【００２１】（実施例２） フィルターの作製 川澄化学製６００ｍｌ血液バッグの底部から約２ｃｍを
水平に切断し、和光純薬製ナイロンウール１０ｇを均一
に詰め、切断部を熱融着により密閉後、滅菌バッグに入
れて高圧蒸気滅菌を行い、滅菌済フィルターとした。
水平に切断し、和光純薬製ナイロンウール１０ｇを均一
に詰め、切断部を熱融着により密閉後、滅菌バッグに入
れて高圧蒸気滅菌を行い、滅菌済フィルターとした。
【００２２】実験用検体 担癌患者からＣＯＢＥ社製成分採血器ＣＯＢＥ−Ｓｐｅ
ｃｔｒａを用い、常法によりバフィーコートを採取した
後、ＣＯＢＥ社製血球洗浄器ＣＯＢＥ−２９９１を用い
る比重遠心法にて単核球分画に分離して、実験用検体と
した。なお、本検体の総白血球数、造血幹細胞および／
または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）含有率、不要
細胞含有率は以下のとおりであった。 総白血球数 ０．６×１０10 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ２．４％ 不要細胞含有率 ９７．６％
ｃｔｒａを用い、常法によりバフィーコートを採取した
後、ＣＯＢＥ社製血球洗浄器ＣＯＢＥ−２９９１を用い
る比重遠心法にて単核球分画に分離して、実験用検体と
した。なお、本検体の総白血球数、造血幹細胞および／
または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）含有率、不要
細胞含有率は以下のとおりであった。 総白血球数 ０．６×１０10 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ２．４％ 不要細胞含有率 ９７．６％
【００２３】フィルターによる処理 で調製した実験用検体をのフィルターに注入し、３
７℃で３０分間インキュベーションを行った。その後、
０．５％ヒトアルブミン添加ＲＰＭＩ−１６４０（以
下、ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）にて溶出させた。溶出液は６０
０ｍｌの血液バッグに回収した。本操作により、総白血
球数、造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３
４陽性細胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりと
なった。 総白血球数 ０．２×１０10 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ４．８％ 不要細胞含有率 ９５．２％ なお、ここでのＣＤ３４+ 細胞回収率（ａ）と不要細胞
回収率（ｂ）の比を計算すると２．０５となった。
７℃で３０分間インキュベーションを行った。その後、
０．５％ヒトアルブミン添加ＲＰＭＩ−１６４０（以
下、ＨＳＡ／ＲＰＭＩ）にて溶出させた。溶出液は６０
０ｍｌの血液バッグに回収した。本操作により、総白血
球数、造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３
４陽性細胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりと
なった。 総白血球数 ０．２×１０10 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ４．８％ 不要細胞含有率 ９５．２％ なお、ここでのＣＤ３４+ 細胞回収率（ａ）と不要細胞
回収率（ｂ）の比を計算すると２．０５となった。
【００２４】冷凍保存 常法により１×１０7 ／ｍｌとなるように調製した細胞
浮遊液（６０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ、２０％患者
血清、２０％ＤＭＳＯを含む）を１００ｍｌの凍結バッ
グに分注し、プログラムフリーザーを用い（−１℃／
分）、液体窒素中に保存した。バッグの必要個数は２個
であり、約２００ｃｍ3 を占めた。また、ＤＭＳＯの使
用量は４０ｍｌであった。
浮遊液（６０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ、２０％患者
血清、２０％ＤＭＳＯを含む）を１００ｍｌの凍結バッ
グに分注し、プログラムフリーザーを用い（−１℃／
分）、液体窒素中に保存した。バッグの必要個数は２個
であり、約２００ｃｍ3 を占めた。また、ＤＭＳＯの使
用量は４０ｍｌであった。
【００２５】（比較例２）フィルターで処理をする以外
は、実施例２と同様の操作を行ったところ、バッグの必
要個数は６個となったため、占有体積は約７００ｃｍ3
となり、実施例２の約３．５倍となった。さらに、ＤＭ
ＳＯの使用量は、実施例２の３倍の１２０ｍｌとなっ
た。
は、実施例２と同様の操作を行ったところ、バッグの必
要個数は６個となったため、占有体積は約７００ｃｍ3
となり、実施例２の約３．５倍となった。さらに、ＤＭ
ＳＯの使用量は、実施例２の３倍の１２０ｍｌとなっ
た。
【００２６】（実施例３） フィルターの作製 リン酸水溶液と水酸化カルシウム懸濁液を用いる公知の
湿式法で合成したハイドロキシアパタイトスラリーを吸
引濾過後、乾燥、粉砕してハイドロキシアパタイト顆粒
を作成した。本顆粒を１２００℃で４時間焼成後、ステ
ンレス製篩で分級し、約１００μｍに揃えた。本顆粒２
５ｇをテルモ社製５０ｍｌディスポーザブルシリンジに
充填し、高圧蒸気滅菌を行い、滅菌済フィルターとし
た。
湿式法で合成したハイドロキシアパタイトスラリーを吸
引濾過後、乾燥、粉砕してハイドロキシアパタイト顆粒
を作成した。本顆粒を１２００℃で４時間焼成後、ステ
ンレス製篩で分級し、約１００μｍに揃えた。本顆粒２
５ｇをテルモ社製５０ｍｌディスポーザブルシリンジに
充填し、高圧蒸気滅菌を行い、滅菌済フィルターとし
た。
【００２７】実験用検体 卵巣癌患者の末梢血をＣＯＢＥ社製Ｓｐｅｃｔｒａ成分
採血器を用い、常法により採取した後、公知のＦｉｃｏ
ｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法にて単核球分画に分離し
て実験用検体とした。なお、本検体の総白血球数、造血
幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性細
胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりであった。 総白血球数 ２×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ２．６％ 不要細胞含有率 ９７．４％
採血器を用い、常法により採取した後、公知のＦｉｃｏ
ｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法にて単核球分画に分離し
て実験用検体とした。なお、本検体の総白血球数、造血
幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性細
胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりであった。 総白血球数 ２×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ２．６％ 不要細胞含有率 ９７．４％
【００２８】フィルターによる処理 ５％ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝液
（以下、Ｄ−ＰＢＳ）でフィルターをプライミング後、
の細胞浮遊液（１ｍｌ）をフィルターに通して５ｍｌ
のＤ−ＰＢＳで洗浄した。溶出液は１０ｍｌのプラスチ
ックチューブに回収した。本操作により、総白血球数、
造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性
細胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりとなっ
た。 総白血球数 １．１×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ４．８％ 不要細胞含有率 ９５．２％ なお、ここでのＣＤ３４+ 細胞回収率（ａ）と不要細胞
回収率（ｂ）の比を計算すると１．８９となった。
（以下、Ｄ−ＰＢＳ）でフィルターをプライミング後、
の細胞浮遊液（１ｍｌ）をフィルターに通して５ｍｌ
のＤ−ＰＢＳで洗浄した。溶出液は１０ｍｌのプラスチ
ックチューブに回収した。本操作により、総白血球数、
造血幹細胞および／または造血前駆細胞（ＣＤ３４陽性
細胞）含有率、不要細胞含有率は以下のとおりとなっ
た。 総白血球数 １．１×１０9 ＣＤ３４+ 細胞含有率 ４．８％ 不要細胞含有率 ９５．２％ なお、ここでのＣＤ３４+ 細胞回収率（ａ）と不要細胞
回収率（ｂ）の比を計算すると１．８９となった。
【００２９】冷凍保存 常法により１×１０7 ／ｍｌとなるように調製した細胞
浮遊液（６０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ、２０％患者
血清、２０％ＤＭＳＯを含む）を、５ｍｌのポリスチレ
ンクライオチューブに分注し、プログラムフリーザーを
用い（−１℃／分）、液体窒素中に保存した。チューブ
の必要本数は２２本であり、約１００ｃｍ3 を占めた。
また、ＤＭＳＯの使用量は２２ｍｌであった。
浮遊液（６０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ、２０％患者
血清、２０％ＤＭＳＯを含む）を、５ｍｌのポリスチレ
ンクライオチューブに分注し、プログラムフリーザーを
用い（−１℃／分）、液体窒素中に保存した。チューブ
の必要本数は２２本であり、約１００ｃｍ3 を占めた。
また、ＤＭＳＯの使用量は２２ｍｌであった。
【００３０】（比較例３）フィルターで処理をする以外
は、実施例３と同様の操作を行ったところ、チューブの
必要本数は４０本となったため、占有体積は約２００ｃ
ｍ3 となり、実施例３の約２倍となった。さらに、ＤＭ
ＳＯの使用量は、実施例３の約２倍の４０ｍｌとなっ
た。
は、実施例３と同様の操作を行ったところ、チューブの
必要本数は４０本となったため、占有体積は約２００ｃ
ｍ3 となり、実施例３の約２倍となった。さらに、ＤＭ
ＳＯの使用量は、実施例３の約２倍の４０ｍｌとなっ
た。
【００３１】
【発明の効果】以上示したように、本発明による細胞の
保存方法は、細胞数の減少による体積減で、冷凍保存ス
ペースの節約が可能となり、また、ＤＭＳＯの使用量が
減少するので、ＤＭＳＯによる副作用の低減が期待でき
る。本方法は、高価なモノクローナル抗体などの試薬お
よび器具を用いることがなく、また、非常に簡便である
と共に、滅菌済フィルターを用いているので、冷凍保存
した細胞を臨床用途として用いる場合でも、極めて安全
に用いることができる。
保存方法は、細胞数の減少による体積減で、冷凍保存ス
ペースの節約が可能となり、また、ＤＭＳＯの使用量が
減少するので、ＤＭＳＯによる副作用の低減が期待でき
る。本方法は、高価なモノクローナル抗体などの試薬お
よび器具を用いることがなく、また、非常に簡便である
と共に、滅菌済フィルターを用いているので、冷凍保存
した細胞を臨床用途として用いる場合でも、極めて安全
に用いることができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 細胞集団を冷凍保存する方法であって、
真に必要な細胞の回収率ａと不要な細胞の回収率ｂの比
がａ／ｂ＞１である滅菌済のフィルターで細胞集団を処
理する工程を含むことを特徴とする細胞集団の保存方
法。 - 【請求項２】 真に必要な細胞が造血幹細胞および／ま
たは造血前駆細胞である請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6254192A JPH0892001A (ja) | 1994-09-26 | 1994-09-26 | 細胞集団の保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6254192A JPH0892001A (ja) | 1994-09-26 | 1994-09-26 | 細胞集団の保存方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0892001A true JPH0892001A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=17261528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6254192A Pending JPH0892001A (ja) | 1994-09-26 | 1994-09-26 | 細胞集団の保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0892001A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998032840A1 (fr) * | 1997-01-24 | 1998-07-30 | Asahi Medical Co., Ltd. | Procede de separation des cellules |
| JP2002534393A (ja) * | 1998-12-30 | 2002-10-15 | アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 多能性造血幹細胞の動員を刺激するためのヒト成長ホルモン |
| JP2009269930A (ja) * | 2001-09-14 | 2009-11-19 | Cytori Therapeutics Inc | 非造血組織由来の非胚性細胞の保存 |
| JP2013034436A (ja) * | 2011-08-09 | 2013-02-21 | Kaneka Corp | 細胞懸濁液の濃縮方法 |
| JP2015232000A (ja) * | 2008-08-20 | 2015-12-24 | アンスロジェネシス コーポレーション | 改良型細胞組成物およびその作製方法 |
-
1994
- 1994-09-26 JP JP6254192A patent/JPH0892001A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998032840A1 (fr) * | 1997-01-24 | 1998-07-30 | Asahi Medical Co., Ltd. | Procede de separation des cellules |
| US6268119B1 (en) | 1997-01-24 | 2001-07-31 | Asahi Medical Co., Ltd. | Method for separating cells |
| CN1330752C (zh) * | 1997-01-24 | 2007-08-08 | 旭化成医疗株式会社 | 细胞分离方法 |
| JP2002534393A (ja) * | 1998-12-30 | 2002-10-15 | アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 多能性造血幹細胞の動員を刺激するためのヒト成長ホルモン |
| JP4808316B2 (ja) * | 1998-12-30 | 2011-11-02 | メルク・セローノ・ソシエテ・アノニム | 多能性造血幹細胞の動員を刺激するためのヒト成長ホルモン |
| JP2009269930A (ja) * | 2001-09-14 | 2009-11-19 | Cytori Therapeutics Inc | 非造血組織由来の非胚性細胞の保存 |
| JP2015232000A (ja) * | 2008-08-20 | 2015-12-24 | アンスロジェネシス コーポレーション | 改良型細胞組成物およびその作製方法 |
| JP2013034436A (ja) * | 2011-08-09 | 2013-02-21 | Kaneka Corp | 細胞懸濁液の濃縮方法 |
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