CN105324479B - 细胞分离的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以下组分的组合的应用：(i)大分子红细胞沉降增强因子，和，(ii)二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甘氨酸(DMG)和/或缬氨酸；以从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞，和/或事先准备非红细胞的血细胞以在随后的冷冻贮藏步骤中保护它们的完整性。

Description

细胞分离的方法
技术领域
本发明涉及用于分离细胞和/或事先准备细胞的方法和组合物，更具体涉及用于从外周血、骨髓、脐带血和相关的血液组织中分离红细胞的方法和组合物。
背景技术
从血液中分离白细胞用于体外研究或细胞疗法通常包括主要基于构成细胞物质>99％的红细胞大量损耗的血液的初始分离。
红细胞去除技术是基于红细胞的低渗裂解、密度梯度分离、增强的离心沉降，其中增强的离心沉降使用羟乙基淀粉或促使红细胞加速沉降的混合物(其中还包含抗体)。
低渗裂解不仅可用于体外的小体积研究，而且也可应用于为细胞疗法所处理的大体积血液组织。在细胞疗法程序中，通常将进行红细胞的低渗裂解作为最终步骤，以在通过其他方法发生大量损耗之后，去除样品中剩余的污染的红细胞。
密度梯度分离依赖于细胞类型密度的差异，其中细胞类型密度的不同导致细胞被隔离在处于不同水平的具有不同密度的流体介质中。细胞类型之间的密度差异可能较小，而且不同的细胞类型在大小和密度上可能是多种多样的。因此，特定的细胞类型可能在分布整个密度梯度介质中，而不是精确地沉降在密度介质中的独立区域处，因此使得所需细胞的回收降低和/或被不需要的细胞类型污染。
在富集罕见血液细胞类型(诸如造血祖细胞)的程序中，密度梯度沉降可引起所需细胞子集的丢失或产量降低。例如，使用常规的密度梯度方法从脐带血中隔离祖细胞，导致所需的干细胞，例如CD34+造血干细胞(HSC)或VSEL(极小类胚胎样干细胞)的显著丢失(Wagner,J.E.,Am J Ped Hematol Oncol 15:169(1993))。使用常规密度梯度方法隔离淋巴细胞可导致特定的淋巴细胞子集出现选择性丢失(Collins,J Immunol Methods 243:125(2000))。
这些分离方法具有用于细胞疗法的额外的禁忌，因为如果与细胞一起灌输到容器中，分离介质中的化学实体可能是有毒性的。同样，必须进行额外的步骤，以确保在灌输之前将它们完全去除。诸如淘析的仪器方法学还依赖于血液组分通过密度进行差动分离(differential separation)，并且可能受性能上的类似缺陷之苦。
从血液中去除红细胞的另一种方法是利用羟乙基淀粉，它刺激红细胞聚集，然后在离心机中以50×g沉降时发生比白细胞组分更快速地沉降。虽然该方法对受体通常是无毒性的，但是其回收重要细胞类型的性能，包括例如间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)和VSEL是多变的，并且对于例如脐带血，可能导致干细胞的回收不太理想，而且脐带血细胞的植入潜能降低，从而增加了移植失败的风险。
最近报道的方法已经公开(EP 2,117,592；US 7,598,089)，涉及将不凝结的血液与一种组合物混合，该组合物包括：葡聚糖；抗血型糖蛋白A的抗体；除了其他抗体种类之外(例如，抗CD9抗体；抗CD15抗体；和串联抗体，其中已将两种不同的抗体连接在一起以形成单一的实体)。抗体是细胞分离和从血液中回收感兴趣的有核细胞的方法的昂贵的解决方法。
提高罕见细胞类型从供体组织中的回收率会大大改善移植和免疫疗法的结果(例如，骨髓移植、基于干细胞的基因疗法和免疫细胞疗法)，这些疗法的成功与进行治疗应用所引入的细胞的实际数量有关。本发明期望提供一种产生高比例的感兴趣的活细胞的细胞分离方法。
发明内容
本发明涉及以下发现：当与血细胞接触时，特定的化合物(即二甲基亚砜(DMSO)和特定的氨基酸)与大分子红细胞沉降增强因子结合具有惊人的有利效果，这些效果中有一些仅当组织中的血细胞随后进行特定处理时才显现出来。具体地，这些化合物与大分子红细胞沉降增强因子组合能从含血细胞的样品中回收较高数量的非红细胞的血细胞。这些化合物还可与大分子红细胞沉降增强因子组合使用，以事先准备非红细胞的血细胞，从而保护它们在随后的冷冻步骤中的完整性，因此还能在冷冻储藏之后回收较大量的非红细胞的血细胞。因此，本发明人开发了一种处理血液样品的方法，以实现红血细胞和白血细胞的分离。该方法还加速了红血细胞部分和白血细胞部分的分离，并且不依赖于抗体的使用。本发明人还开发了一种为冷冻储藏事先准备细胞部分的方法。
本发明提供了以下组分的组合的应用：
(i)大分子红细胞沉降增强因子，和
(ii)二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甘氨酸(DMG)和/或缬氨酸；
以从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞，和/或事先准备非红细胞的血细胞，以在随后的冷冻贮藏步骤中保护它们的完整性。优选地，所述大分子红细胞沉降增强因子是葡聚糖，并且组分(ii)是DMSO。
与单独使用组分(i)相比，当使用组分(i)和组分(ii)的组合从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞时，组分(ii)能从含血细胞样品中回收更多存活的非红细胞的血细胞。
与诸如葡聚糖和/或DMSO的试剂在例如用作冷冻保护剂时可使用的浓度相比，当按照本发明来使用组分(i)和组分(ii)时，典型地以相对低的浓度使用这些组分。当非红细胞的血细胞与组分(i)和组分(ii)接触时，得到的混合物可包括浓度为0.01％w/v至20％w/v，优选0.05％w/v至10％w/v，例如0.1％w/v至5％w/v(诸如0.5％w/v至2％w/v、1％w/v至1.5％w/v，或1.25％w/v或约1.25％w/v)，或2％w/v至10％w/v(诸如5％w/v至7.5％w/v、6％w/v至6.5％w/v，或6.25％w/v或约6.25％w/v)的组分(i)。优选地，当非红细胞的血细胞与组分(i)和组分(ii)接触时，该混合物可包括浓度为0.01％v/v至20％v/v，优选0.05％v/v至10％v/v，例如0.1％v/v至5％v/v(诸如0.5％v/v至2％v/v、1％v/v至1.5％v/v，或1.25％v/v或约1.25％v/v)，或2％v/v至10％v/v(诸如5％v/v至7.5％v/v、6％v/v至6.5％v/v，或6.25％v/v或约6.25％v/v)的组分(ii)。典型地，组分(i)的％w/v浓度与组分(i)的％v/v浓度近似相同，但是组分(ii)的浓度可能偶尔较高，例如高两倍、三倍、四倍或五倍。
优选地，当使用组分(i)和组分(ii)的组合来事先准备非红细胞的血细胞以在随后的冷冻贮藏中保护它们的完整性时，该准备步骤与为准备好用于直接冷冻贮藏/冻结所可能采取的任何步骤都明显不同。换句话说，在事先准备的非红细胞的血细胞进行冷冻贮藏之前，添加适当量的冷冻保护剂的额外步骤是适当的。在此方面，对用于冷冻贮藏的制剂，使用包括组分(i)或组分(ii)中的至少一种的冷冻保护剂可能是有利的，这将在事先准备步骤呈现出来。这样，不需要从事先准备的组合物中回收细胞，更确切地说，可仅向细胞和事先准备的组合物中添加一种或多种额外的冷冻保护剂。
优选地，当使用组分(i)和组分(ii)的组合来事先准备非红细胞的血细胞以在随后的冷冻贮藏中保护它们的完整性时，所述随后的冷冻贮藏步骤可涉及以下步骤中的一个或多个步骤：(b)向由此获得的非红细胞的血细胞添加冷冻保护剂，(c)冷冻贮藏非红细胞的血细胞，(d)使非红细胞的血细胞解冻，和/或(e)从冷冻贮藏的制剂中回收非红细胞的血细胞。典型地，它涉及步骤(b)，涉及步骤(c)，或涉及步骤(b)和步骤(c)两个步骤，因为在防止如果没有组分(i)和组分(ii)的组合的情况下(即，即使仅存在这些组分中的一种，而另一组分不存在)可能出现的损伤类型中，这些步骤是组分(i)和组分(ii)的组合在帮助保护细胞的完整性中特别有效的步骤。
应理解的是，组分(i)和组分(ii)当然可用于以细胞部分的形式事先准备非红细胞的血细胞，该细胞部分已经经过处理以去除红细胞和/或一种或多种特定的有核细胞，从而获得白血细胞的特别期望的子集。但是，因为本发明的细胞分离方法还用于保护得到的(分离/回收的)细胞免于在随后的冷冻贮藏步骤中受到损伤，因此简单使用本发明的细胞分离方法可更加有效，因为在不需要两步单独的(分离和事先准备)处理步骤的情况下，可获得与本发明的准备方法类似的益处。
因此，本发明提供了一种分离细胞的方法，所述方法包括：
(a)使含血细胞的样品与以下组分接触：
(i)大分子红细胞沉降增强因子，和
(ii)DMSO、DMG和/或缬氨酸；
(b)使所述样品分成沉降相和上清液相；和
(c)从所述沉降相和/或所述上清液相中回收细胞。
与单独使用组分(i)所能获得的存活的非红细胞的血细胞相比，组分(i)和组分(ii)的组合能回收更多存活的非红细胞的血细胞。在(a)分离步骤之后和(b)随后的冷冻贮藏步骤之后体现出了这一优点。
优选地，步骤(a)包括使含血细胞的样品与包括组分(i)和组分(ii)的组合物接触。如下所述，用作组分(i)的优选试剂是葡聚糖。
优选地，组分(ii)是DMSO、DMG或缬氨酸。
优选地，步骤(c)包括从所述沉降相或所述上清液相中回收细胞。
因此，在优选方面，本发明提供了一种分离细胞的方法，所述方法包括：
a)使含血细胞的样品与组合物接触，该组合物包括：
I)葡聚糖；和
II)二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甘氨酸(DMG)或缬氨酸
b)使所述样品分成沉降相和上清液相；和
c)从所述沉降相或所述上清液相中回收细胞。
优选地，在本发明的分离细胞的方法中，步骤(a)包括使含血细胞的样品与包括组分(i)和组分(ii)的组合物接触，其中，使该含血细胞的样品和该组合物以10:1至1:10的体积比(除非特别指出，本文提到的组分的比率通常用于指体积比)，优选以5:1至1:5的体积比，更优选以2:1至1:2的体积比混合。典型地，上述体积比为1:1或约1:1的比率。
具体使用的比率取决于组合物中的组分(i)和组分(ii)的浓度。因此，在本发明中使用的一种特别优选的组合物是如下的组合物，该组合物基于PBS，并且通过组合等量(体积)的在PBS中的5％w/v葡聚糖(Dextran)500和在PBS中的5％v/v DMSO来制备(除非特别指出，本文中提到的组分(i)的浓度单位通常指％w/v，而本文中提到的组分(ii)的浓度单位通常指％v/v)。在本文中将该组合物称为“TotiCyte 1X”，含有在PBS中的2.5％w/v葡聚糖500和2.5％v/v DMSO。当使用该组合物时，上述比率是特别优选的。但是，组合物中的组分(i)和组分(ii)的浓度可以改变。例如，在本发明中使用的替代组合物是更加浓缩的制剂，在本文中称为“TotiCyte 5X”，指基于PBS的并且含有7.5％w/v葡聚糖500和7.5％v/v DMSO的TotiCyte组合物。当使用诸如这种TotiCyte 5X的组合物时，可调整上述优选比率，以使组合物的比例减小至例如三分之一、四分之一或五分之一。因此，在该实施方式中，含血细胞的样品和组合物以50:1至1:2的体积比，优选25:1至1:1的体积比，更优选10:1至5:2的体积比混合可能是更优选的。典型地，上述体积比为5:1或约5:1的比率。
因此，通常在本发明的上下文中，含血细胞的样品和组合物以50:1至1:10的体积比，优选25:1至1:5的体积比，更优选10:1至1:2的体积比混合是优选的。
含血细胞的样品与组分(i)和组分(ii)混合的比率还可参照组分(i)和组分(ii)在得到的混合物中的浓度来定义。优选地，使含血细胞的样品与组分(i)组合，以使组分(i)在得到的混合物中的浓度为0.1％w/v至8％w/v，优选0.25％w/v至5％w/v，更优选0.5％w/v至2％w/v，还更优选1％w/v至1.5％w/v，并且典型地为1.25％w/v或约1.25％w/v。优选地，含血细胞的样品与组分(ii)组合，以使组分(ii)在得到的混合物中的浓度为0.1％v/v至8％v/v，优选0.25％v/v至5％v/v，更优选0.5％v/v至2％v/v，还更优选1％v/v至1.5％v/v，并且典型地为1.25％v/v或约1.25％v/v。典型地，组分(i)和组分(ii)的浓度近似相同。因此，在本发明的分离方法的一个优选方面中，一旦含血细胞的样品与组分(i)和组分(ii)接触，则组分(i)的浓度是0.25％w/v至5％w/v，并且组分(ii)的浓度是0.25％v/v至5％v/v。
如果使用更加浓缩的组分(i)和组分(ii)的组合物(诸如TotiCyte 5X)，则在(细胞+组合物)混合物中的目标浓度可能更高。因此，更通常来讲，组分(i)的目标浓度是0.1％w/v至10％w/v，优选0.5％w/v至5％w/v，更优选1％w/v至4％w/v，并且典型地为1.25％w/v或2％w/v，或者约为1.25％w/v或2％w/v；并且，组分(ii)的目标浓度是0.1％v/v至10％v/v，优选0.5％v/v至5％v/v，更优选1％v/v至4％v/v，并且典型地为1.25％v/v或2％v/v，或者约为1.25％v/v或2％v/v。
在本发明的细胞分离方法中，当步骤(a)包括使含血细胞的样品与包括组分(i)和组分(ii)的组合物接触时，该组合物优选包括0.5％w/v～10％w/v(更优选1％w/v～5％w/v，典型为2％w/v～4％w/v)的组分(i)和0.5％v/v～10％v/v(更优选1％v/v～5％v/v，典型为2％v/v～4％v/v)的组分(ii)。
优选地，对其进行本发明的方法的含血细胞样品选自外周血、脐带血和骨髓。
优选地，对其进行本发明的方法的含血细胞样品采集自人类。含血细胞的样品含有抗凝剂也是优选的。抗凝剂的性质不受到特别限制，典型的实例包括肝素、EDTA、CPD和CPDA，其中CPD和CPDA是优选的，并且CPDA是最优选的。
优选地，本发明的分离方法用于从包含红血细胞的含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞。因此，典型地从起始的含血细胞样品中去除存在的基本上所有的红细胞，例如去除至少90％，优选至少95％，更优选至少98％和典型地至少99％的红细胞。
优选地，本发明的分离方法用于制备血细胞比容小于1％(体积)的非红细胞的血细胞样品。因此，在步骤(c)中，从上述沉降相和/或上清液相中回收的细胞优选具有不超过1％并且优选小于1％的血细胞比容。
在一个实施方式中，本发明的分离方法用于制备浓缩的血小板样品。
本发明的方法能回收比例提高的非红细胞的血细胞，典型地是白血细胞。在本发明的分离方法中，相对于起始的全血样品中的量，回收各种或每种所期望的非红细胞的血细胞类型非红细胞的血细胞的水平优选为至少80％，优选至少90％，并且更优选至少95％。通过使用本发明的分离或事先准备方法可获得的解冻后回收水平，优选能获得至少60％，更优选至少80％，并且典型地为至少90％的回收水平(特别是在解冻后可能进行的任何冲洗步骤之前测量的回收水平)。在下面的实施例中，讨论了测量这些期望的细胞类型的浓度的适当方法，诸如总的有核细胞(TNC)、CD34细胞和CD45细胞计数。
在本发明的分离方法中，在步骤(b)中，优选经过10分钟至60分钟使样品分成沉降相和上清液相。
本发明还提供了一种为冷冻贮藏事先准备非红细胞的血细胞部分的方法，所述方法包括使所述细胞部分与以下组分的组合接触：
(i)大分子红细胞沉降增强因子，和
(ii)DMSO、DMG和/或缬氨酸；
其中，当含血细胞的样品与组分(i)和组分(ii)接触时，所述组分(ii)的浓度不超过5％v/v。在此方面，优选地，组分(ii)的浓度不超过4％v/v，更优选不超过3％v/v，仍然更优选不超过2％v/v，并且典型地不超过1.5％v/v。
上述在本发明的分离方法中应用的组分(i)和组分(ii)的优选方面对于本发明的事先准备方法也是优选的。
例如，本发明的事先准备方法优选包括使细胞部分与包括组分(i)和组分(ii)的组合物接触，其中，使所述细胞部分和组合物以10:1至1:10的体积比，优选以5:1至1:5的体积比，更优选以2:1至1:2的体积比混合。典型地，上述体积比为1:1或约1:1的比率。
如上所述，所使用的具体比率取决于组合物中的组分(i)和组分(ii)的浓度。因此，当使用本发明的“TotiCyte 1X”组合物时，上述比率是特别优选的。但是，可以改变组合物中的组分(i)和组分(ii)的浓度。例如，当使用本发明的“TotiCyte 5X”组合物时，可调整优选比率，以使组合物的比例减小至例如三分之一、四分之一或五分之一。因此，在该实施方式中，细胞部分和组合物以50:1至1:2的体积比，优选25:1至1:1的体积比，更优选10:1至5:2的体积比混合是更优选的。典型地，上述体积比为5:1或约5:1的比率。
因此，通常在本发明中，细胞部分和组合物以50:1至1:10的体积比，优选25:1至1:5的体积比，更优选10:1至1:2的体积比混合是优选的。
使细胞部分与组分(i)和组分(ii)混合的比率还可参照组分(i)和组分(ii)在得到的混合物中的浓度来定义。优选地，使细胞部分与组分(i)组合，以使组分(i)在得到的混合物中的浓度为0.1％w/v至8％w/v，优选0.25％w/v至5％w/v，更优选0.5％w/v至2％w/v，还更优选1％w/v至1.5％w/v，并且典型地为1.25％w/v或约1.25％w/v。优选地，使细胞部分与组分(ii)组合，以使组分(ii)在得到的混合物中的浓度为0.1％v/v至8％v/v，优选0.25％v/v至5％v/v，更优选0.5％v/v至2％v/v，还更优选1％v/v至1.5％v/v，并且典型地为1.25％v/v或约1.25％v/v。典型地，组分(i)和组分(ii)的浓度近似相同。因此，在本发明的事先准备方法的一个优选方面中，一旦细胞部分与组分(i)和组分(ii)接触，则组分(i)的浓度是0.25％w/v至5％w/v，并且组分(ii)的浓度是0.25％v/v至5％v/v。
如果使用更加浓缩的组分(i)和组分(ii)的组合物(诸如TotiCyte 5X)，则在(细胞+组合物)混合物中的目标浓度可能更高。因此，更通常来讲，组分(i)的目标浓度是0.1％w/v至10％w/v，优选0.5％w/v至5％w/v，更优选1％w/v至4％w/v，并且典型地为1.25％w/v或2％w/v，或者约为1.25％w/v或2％w/v；并且，组分(ii)的目标浓度是0.1％v/v至10％v/v，优选0.5％v/v至5％v/v，更优选1％v/v至4％v/v，典型地为1.25％v/v或2％v/v，或者约为1.25％v/v或2％v/v，最典型地为1.25％v/v或约1.25％v/v。
本发明的事先准备方法优选包括：使细胞部分与包括组分(i)和组分(ii)的组合物接触，其中，该组合物包括0.1％w/v～10％w/v(更优选0.5％w/v～5％w/v，典型为1％w/v～2％w/v)的组分(i)和0.1％v/v～10％v/v(更优选0.5％v/v～5％v/v，典型为1％v/v～2％v/v)的组分(ii)。
优选地，上述细胞部分包括白血细胞。
优选地，上述细胞部分采集自人类。
在优选方面，本发明的分离方法和事先准备方法用于(目的是)提高在随后的冷冻贮藏步骤之后，回收的存活的白血细胞的比例。具体地，与单独使用组分(i)能回收的存活细胞的量相比，引入组分(ii)提高了在冷冻贮藏之后可回收的存活细胞的量。如上所指出的，冷冻贮藏步骤可能指以下步骤中的一个或多个步骤：(b)向由此获得的非红细胞的血细胞添加冷冻保护剂，(c)冷冻贮藏所述非红细胞的血细胞，(d)使所述非红细胞的血细胞解冻，和/或(e)从冷冻贮藏的制剂中回收所述非红细胞的血细胞；但冷冻贮藏步骤典型地指步骤(b)，指步骤(c)，或指步骤(b)和步骤(c)。
对于在本发明的方法和组合物中使用的组分(i)，对可使用的大分子红细胞沉降增强因子的类型没有特别限制。可使用的可能的物质包括聚凝胺、硫酸鱼精蛋白、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和葡聚糖(优选分子量至少约50kDa的葡聚糖)。组分(i)优选为多糖，并且更优选为葡聚糖。对于它的大小，组分(i)(优选为葡聚糖)的分子量优选为至少50kDa，更优选至少70kDa，还更优选至少100kDa或至少200kDa、300kDa或甚至500kDa。对于分子量没有具体的上限，但是典型为1000kDa或更小，更典型为750kDa或更小，还更典型为500kDa或更小。特别优选的葡聚糖是葡聚糖500。在这些优选范围(至少50kDa等)内的分子量在本发明的事先准备方法中是特别优选的。
对在本发明的方法和组合物中使用的组分(ii)，组分(ii)可以是DMSO、DMG和缬氨酸中的两种或全部的混合物，但是典型地仅使用这些试剂中一种。试剂缬氨酸优选是L-缬氨酸。DMSO和缬氨酸(典型地是L-缬氨酸)通常是更优选的，DMSO是最优选的。
优选地，组分(i)是葡聚糖，并且组分(ii)是DMSO。更优选地，组分(i)是葡聚糖500，并且组分(ii)是DMSO。
优选使组分(i)以组合物形式，典型为水性溶液形式与样品或细胞部分接触。上述组合物优选是盐溶液。上述溶液的pH优选为6.8至7.8，例如为7.4或约7.4。使用药学上可接受的缓冲液，将上述溶液典型地缓冲至期望的pH。用于此方面的可能的溶剂包括PBS(磷酸盐缓冲盐)、MOPS和HEPES，其中PBS是优选的。
优选使组分(ii)以组合物形式，典型为水性溶液形式与样品或细胞部分接触。上述组合物优选是盐溶液。上述溶液的pH优选为6.8至7.8，例如为7.4或约7.4。典型地，将上述溶液缓冲至期望的pH。用于此方面的可能的溶剂包括PBS(磷酸盐缓冲盐)、MOPS和HEPES，其中PBS是优选的。
优选地，在与含血细胞的样品或细胞部分接触之前，将组分(i)和组分(ii)组合成单一组合物。典型地，该单一组合物主要由组分(i)和组分(ii)中的每一种与溶剂(优选PBS)组成。
本发明还提供了一种制备用于冷冻贮藏的非红细胞的血细胞的方法，该方法包括：(a)如在本文中定义的本发明的分离或事先准备的方法，和(b)向由此获得的非红细胞的血细胞中添加冷冻保护剂。
本发明还提供了一种冷冻贮藏非红细胞的血细胞的方法，该方法包括：(a)如在本文中定义的本发明的分离或事先准备的方法，(b)向由此获得的非红细胞的血细胞中添加冷冻保护剂，和(c)冷冻贮藏所述非红细胞的血细胞。
本发明还提供了一种冷冻贮藏非红细胞的血细胞并随后回收非红细胞的血细胞的方法，该方法包括：(a)如在本文中定义的本发明的分离或事先准备的方法，(b)向由此获得的非红细胞的血细胞中添加冷冻保护剂，(c)冷冻贮藏所述非红细胞的血细胞，和(d)使所述非红细胞的血细胞解冻。该方法中还存在额外的步骤(e)：从(已解冻的)冷冻储藏制剂中回收所述非红细胞的血细胞。
冷冻保护剂的优选制剂如上面所讨论。冷冻保护剂优选包括DMSO。在一个实施方式中，它可基本由DMSO组成。
冷冻贮藏典型包括将温度降低至零度以下的温度，即低于0℃。典型地，它可包括将温度降低至-50℃或更低，诸如约-80℃(例如-78℃)，但是它可包括将温度降低至-100℃或更低，诸如约-120℃或更低，或甚至-140℃或更低。
本发明还提供了可通过本文中定义的本发明的方法获得的非红细胞的部分。典型地，这样的细胞部分通过特有的高比例的存活非红细胞的血细胞，而与使用其它方法获得的细胞部分区分开。它们还可通过在随后的冷冻贮藏步骤中显现的保护效果的优点，而与经由其它方法获得的细胞部分区分开。在经由本发明的方法制备的细胞部分中，还可存在少量的剩余水平的组分(i)和/或组分(ii)。
本发明还提供了一种包括(i)大分子红细胞沉降增强因子和(ii)DMSO、DMG和/或缬氨酸的组合物，该组合物适用于从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞和/或事先准备非红细胞的血细胞以在随后的冷冻贮藏和解冻步骤中保护它们的完整性，其中，如果组分(ii)是DMSO，则DMSO在所述组合物中的浓度是10％v/v或更低。在此方面，优选地，组分(ii)的浓度不超过8％v/v，更优选不超过6％v/v，仍然更优选不超过4％v/v，并且典型地不超过3％v/v。
组分(i)在组合物中的浓度可有利地是10％w/v或更低，优选8％w/v或更低，更优选6％w/v或更低，仍然更优选4％w/v或更低，典型地是3％w/v或更低。组分(i)在组合物中的浓度优选是0.1％w/v或更高，更优选0.5％w/v或更高，仍然更优选1％w/v或更高，典型地是2％w/v或更高。
组分(ii)在组合物中的浓度优选是8％v/v或更低，更优选6％v/v或更低，仍然更优选4％v/v或更低，典型地是3％v/v或更低。组分(i)在组合物中的浓度优选是0.1％v/v或更高，更优选0.5％v/v或更高，仍然更优选1％v/v或更高，典型地是2％v/v或更高。
在上述组合物的一个优选方面，组分(i)的浓度是1％w/v～5％w/v，并且组分(ii)的浓度是1％v/v～5％v/v。
本发明还提供了一种包括如在本文中定义的组合物(包括组分(i)和组分(ii))的装置，该装置是瓶子、血袋、用于注射到血袋中的预填充的注射器，或一种包括上述组合物和血液收集容器的试剂盒。
组分(i)(例如葡聚糖)和组分(ii)(含二甲基的组分)一起提供了令人惊奇且协同地有效分离和/或事先准备的介质，该介质允许：(i)包括血细胞的样品更好地分成红细胞部分和白细胞部分(和血浆部分)；(ii)在分离之后，细胞回收水平得到改进；和/或(iii)给予非红细胞的血细胞保护效果，以保护它们在随后的冷冻贮藏步骤中的完整性。分离介质促进重力辅助沉降，因此步骤(b)通常仅需要使样品和分离介质的组合静置。因此，在步骤(b)中典型地不需要主动步骤，并且可以简单地依赖于重力，以帮助引起期望的沉降。但是，为了避免疑问，步骤(b)不排除采取主动步骤的可能性，但条件是任何这样的步骤都不妨碍各部分的分开。
在本发明的分离细胞的方法中，步骤a)典型地包括混合步骤。方便地使分离介质(即包括组分(i)和组分(ii)的组合物)和含血细胞的样品以2:1至1:2的比率，优选以1:1的比率或约1:1的比率混合。
在又一方面，本发明提供了一种适用作血细胞分离介质的组合物，该组合物包括组分(i)(例如葡聚糖)和二甲亚砜、二甲基甘氨酸或缬氨酸。上述组合物在血细胞分离方法中的应用构成本发明的又一方面。在本发明的一个方面中，上述组合物典型地包括3％w/v～15％w/v、优选4％w/v～10％w/v的葡聚糖，和1％v/v～10％v/v、优选3％v/v～8％v/v的二甲亚砜、二甲基甘氨酸或缬氨酸。
本发明提供了有效且有成本效率的方法和组合物，以用于从外周血、脐带血和骨髓(例如骨髓穿刺液)中分离和回收具有治疗或诊断价值的细胞；脐带血对按照本发明的方法的处理是特别优选的。具体地，本发明提供了用于特定去除血液中的红细胞组分的方法和组合物。
所公开的组合物和方法可用于例如，制备用于组织培养、免疫表型分型、其它诊断测试、进一步纯化和治疗给药的细胞。具体地，上述方法可用于制备用于长期储存(例如冷冻贮藏)的细胞。因为脐带血内的细胞具有应对生命后期出现的病症的治疗潜力，因此在儿童出生时有储存脐带血的需求。例如，HSC可用于治疗白血病和淋巴瘤；MSC可治疗心脏病、阿尔茨海默氏病或帕金森氏病，并且可用于再生骨骼、软骨、肌肉或结缔组织；VSEL可再生神经细胞、心肌细胞或肌细胞。
多能细胞的治疗潜力正在持续升高，而且自体供应的好处是明显的。但是，存在与长期储存相关的成本问题，这意味着需要对感兴趣的细胞进行富集(即排除红细胞，以减小样品量)。但是，重要的是，通过上述分离不会进一步减少少量的关键细胞(诸如VSEL)。本发明解决了这些需求。
可从沉降相(聚集物)和上清液相中的任一相或两相中回收细胞。根据本发明的方法，即使非常罕见的细胞类型也可以相对高的产量进行回收。沉降相包含来自样品的大部分红细胞，同时上清液相包含有核细胞。有核细胞还被称为“白血细胞”，并且包括淋巴细胞和干细胞。本文中提到的“非红细胞”的细胞可优选指这些细胞中的一种或多种。
公开的组合物和方法可用于隔离和富集多种细胞类型，包括例如T淋巴细胞、辅助型T细胞、抑制型T细胞、杀伤性T细胞、B细胞、NK细胞、造血干细胞、非造血干细胞、VSEL或血液循环系统中的其它细胞。本文中提到的“非红细胞”的细胞可优选指这些细胞中的一种或多种。
本发明公开的方法可应用于任意哺乳动物血液系统中的细胞，该哺乳动物包括人类、非人类的灵长类动物、啮齿动物、猪、牛、狗、猫和马。特别优选的是包含人血细胞的样品。含血细胞的样品可以是全血或组织，或经部分纯化，例如以使红细胞含量粗降的全血或组织。为了避免疑问，本发明的方法用于与体外处理含血细胞样品、非红细胞的细胞和细胞部分相关的应用，即在进行本发明的方法之前，已经从人类(动物)中取出了上述细胞。
根据本发明的分离方法，步骤(b)的分开步骤，优选持续至少10分钟，更优选持续至少15分钟，并且可延续例如长达1小时或2小时(或更长时间)，但典型地需要不超过1小时。因此，分开步骤典型地是10分钟至60分钟，优选15分子～35分钟。优选地，在30分钟内实现充分的分开。“充分的分开”可测量为系统在静置12小时时可实现的最大分开的至少90％或95％。
根据本发明的事先准备方法，该事先准备处理典型地涉及使细胞部分与组分(i)和组分(ii)接触至少10分钟，优选至少20分钟。所述事先准备可延续，例如长达1小时或2小时(或更长时间)，但是典型地需要不超过1小时，例如优选约30分钟至50分钟。
葡聚糖是由主要以α(1-6)形式连接的葡萄糖单位组成的多糖。葡聚糖可引起红细胞的堆积(即缗钱状形成)，从而促进从溶液中去除红系细胞。典型地，组分(i)(例如葡聚糖)在细胞分离组合物中的浓度是10g/L至40g/L(例如约20g/L)。所使用的组分(i)(例如葡聚糖)的浓度偶尔高于20g/L(例如为25g/L或甚至更高)。缗线状的细胞聚集要耗费很长的时间段，这样单独使用组分(i)(例如葡聚糖)不是可商业化的分离技术。
在本发明的一个方面，当与样品或细胞部分混合时，组分(i)(例如葡聚糖)的终浓度典型地是1％w/v～20％w/v，优选是1.5％w/v至10％w/v，更优选是2.5％w/v～10％w/v。
提及葡聚糖时，包括葡聚糖盐，例如葡聚糖硫酸钠盐。葡聚糖产品的分子量变化很大；在本发明中使用的葡聚糖的分子量优选大于50千道尔顿、更优选为50千道尔顿～1,000千道尔顿，特别优选的分子量是200千道尔顿～750千道尔顿，例如约500千道尔顿。
与单独使用组分(i)相比，当DMSO、DMG或缬氨酸与组分(i)(例如葡聚糖)组合，并且与含血细胞的样品接触时，可回收更大比例的白血细胞。另外，如果这些细胞随后进行冷冻贮藏的话，由此获得的细胞取得一些有助于保护它们的完整性的形式的保护。进一步地，红细胞群体例如使用TotiCyte 1X进行的沉降可比单独使用葡聚糖快很多，优选在15至30分钟内发生。
在一个实施方式中，DMSO、DMG或缬氨酸典型地以0.25％w/v至10％w/v、优选0.5％w/v～5％w/v、更优选2％～3％，例如约2.5％的终浓度(当与样品混合时)存在。
在一个实施方式中，组分(i)(例如葡聚糖)与组分(ii)(二甲基化合物)的比率典型为1:1至1:5，更典型为1:1至1:2，优选的比率是约1:1。
本发明的细胞分离组合物典型地包括在适当的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)中，并且可含有二价阳离子(例如Ca+2和Mg+2)。二价阳离子可通过例如平衡的盐溶液(例如汉克平衡盐溶液)来提供，这些二价阳离子是选择素介导和整合素介导的细胞与细胞粘附的辅助因子。
与现有技术的一些方法相比，本发明的优点之一是，它能对于期望的白血细胞部分以优异的回收水平从含血细胞的样品中分离/去除红细胞，且不需要抗体。因此，在一个优选方面，本发明的分离方法不包括使用任何抗体，例如包括组分(i)和组分(ii)的组合物不含有任何抗体。对于在本发明的事先准备方法中使用的组合物来说，这(任选)也是真实的。尽管如此，作为实际情况，在对本发明的益处没有偏见的情况下，可以引入抗体。因此，本发明的分离组合物或介质可(但典型地是不)额外包含适当的抗体、抗体片段、串联抗体或能特异性识别蛋白序列或构象的另一分子。上述分离组合物可包括对细胞表面抗原适当的抗体或其片段，例如以刺激它们与红细胞发生共沉降。所包括的抗体或抗体片段可缀合至本领域已知的多种功能基团(例如链霉亲和素)，在引入结合伴侣(例如生物素)时，可利用该功能基团刺激靶细胞群的沉降。
在沉降步骤之后，可通过多种手段，诸如对得到的上清液部分进行离心，从溶液相中(即上清液)中回收未沉降的细胞。还可从沉降相中回收细胞。通过例如将细胞转移到含有二价阳离子螯合剂，诸如EDTA或EGTA的缓冲液中，来离解沉降的细胞。
可例如通过使用针对细胞表面抗原的抗体，进一步分离、隔离或纯化从沉降或未沉降部分中回收的细胞。
本发明的分离方法可用于从多种含血细胞的样品中分离细胞，所述含血细胞的样品包括外周血(例如通过静脉穿刺获得)、脐带血(例如在产后获得)和骨髓(例如来自穿刺液)。
脐带血优选在出生的一周内，典型地在48小时、优选24小时内、更优选在12小时内，进行本发明的方法。在标准程序中，对脐带血进行清洁，将血袋针插入脐静脉和动脉中，以使血进入血袋中，之后夹紧血袋并且进行密封。快递服务可用于将样品运输到进行细胞分离方法的场所，或者细胞分离方法可在婴儿分娩地点进行。
由本发明的细胞分离方法生成的细胞群可用在异体和自体移植的情形中。在异体移植的情况中，可从细胞移植物中去除T淋巴细胞，以降低T淋巴细胞相关的GvHD。在自体移植的情况中，可在移植之前，首先去除不需要的细胞，例如来自患者血液或骨髓中的转移性癌细胞。然后，可将没有或基本没有肿瘤细胞的期望细胞(例如造血干细胞)返回到患者体内。
根据本发明的方法回收的细胞群，特别是有核细胞，优选包含良好比例的存活细胞。实施例尤其记载了评估细胞存活力的方法，并且作为替代方法，可使用Guava个人细胞分析仪(Psersonal Cell Analyser，PCA)基础系统来测量感兴趣的细胞群的存活力。使用这些技术测量的存活细胞的比例优选高于50％，更优选高于55％或60％。
本发明的分离方法典型地主要用于排除红细胞，并且保留在起始样品部分内的有核细胞，就这一点而论，本发明的分离方法可看作部分细胞纯化的方法。但是，得到的部分很有可能包含MSC、HSC和VESL，因此，可能需要随后的处理步骤或对本文中记载的基础方法进行改变来隔离感兴趣的靶群。如果将样品进行冷冻贮藏，可在样品从冷冻贮藏状态中恢复时进行上述的随后步骤。
可将在根据本发明的应用中使用的组合物的组分，即包括组分(i)和组分(ii)的组合物(在本文中还被称为细胞分离组合物)进行单独包装，或彼此混合在一起进行包装。在又一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括本发明的细胞分离组合物(可为混合物或在单独的容器中)和血液收集容器(例如血袋或真空管)。在一些实施方式中，细胞分离组合物可被容纳在无菌袋中。进一步地，无菌袋可操作地(例如经由无菌管道)与加工袋相连，该加工袋可操作地(例如经由无菌管道)与储存袋或储存容器相连，以辅助分离的细胞的加工和无菌转移。单个无菌袋还可起到加工袋的作用。储存袋或容器可包括额外的冷冻保护剂，诸如二甲亚砜，足以提供终浓度典型是溶液终体积的1％至10％的冷冻保护剂(DMSO)。冷冻贮藏能长期保存这些细胞，以用于治疗或研究。试剂盒中包括的包装材料典型包含说明书或标签，其中记载了细胞分离组合物如何用于刺激特定细胞类型的分开。上述试剂盒还可包含用于收集血液的针，该针与血液收集容器一体化或与其连接。
在其它实施方式中，通过例如提供分离和冷冻贮藏功能的DMSO(存在的DMSO的终浓度可约为2％)，可使用单个袋子来进行细胞分离和冷冻贮藏。在袋子中进行了分离步骤之后，在冷冻贮藏之前，可使用在袋子底部的阀或管子去除红细胞。上述袋子可设计为能在分离步骤中悬挂起来，同时袋子的开孔朝下，以便仅需要一个开口来填充袋子或去除红细胞。
在本文的实施例和通常与上述方法相关的实施例中所讨论的分离组合物/介质的优选特征是组合物/介质自身，以及包括该组合物/介质的试剂盒的优选特征。
附图说明
参照附图，在下面的非限制性实施例中进一步描述本发明。在附图中：
图1示出红细胞(试管的底部)与血液样品中的有核细胞(试管的顶部)的清晰的分离，该血液样品在室温下，暴露于终浓度为2.5％w/v的葡聚糖500和终浓度为2％v/v(左图)或2.5％v/v(右图)的DMSO，持续30分钟。
图2示出红细胞与血液样品中的有核细胞的清晰的分离，该血液样品暴露于终浓度为2.5％w/v的葡聚糖500和终浓度在1％v/v至5％v/v范围内的DMSO。从左至右，分析以下终浓度的DMSO(％v/v)：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。将样品在室温下暴露于上述溶液15分钟(图2a)或在室温下暴露于上述溶液30分钟(图2b)。
图3示出在细胞分离之后，有核细胞部分的红细胞体积分数(血细胞比容)。血液样品以1:1的比率与以下物质混合：(i)仅PBS(对照，左)；(ii)含有在PBS中的浓度为5％w/v的500Mw葡聚糖的溶液(葡聚糖的终浓度为2.5％w/v)(中间)；或(iii)包含在PBS中浓度为5％w/v的500Mw葡聚糖和浓度为5％v/v的DMSO的溶液(葡聚糖的终浓度为2.5％w/v并且DMSO的终浓度为2.5％v/v)(右)。使样品静置，以在室温下分离30分钟。然后将有核细胞部分(100μl)转移至微量移液管，并且在1500rpm离心2分钟。
图4示出7-氨基放线菌素D(7-AAD)荧光水平(x-轴)对侧向散射(y-轴)的点阵图。血液样品以1:1的比率与以下溶液混合，该溶液包含在PBS中浓度为5％w/v的500Mw葡聚糖和浓度为5％v/v的DMSO的溶液(葡聚糖的终浓度为2.5％w/v并且DMSO的终浓度为2.5％v/v)。然后，在使用获自Becton,Dickinson and Company的“干细胞枚举试剂盒(Stem CellEnumeration Kit)”进行分析之前，使样品在室温静置30分钟。
图5示出使用恒定的2.5％w/v的葡聚糖70和其它物质进行的全血的分离。第1排＝β-丙氨酸；第2排＝L-脯氨酸；第3排＝L-缬氨酸；第4排＝DMSO；和第5排＝DMG。左栏示出15分钟时的各分离情况，右栏示出30分钟之后的各分离情况。
图6示出，当DMSO处于恒定浓度时，不同的葡聚糖进行30分钟分离之后的对比(参见实施例5)。左上方＝葡聚糖6和对照；右上方＝葡聚糖40；左下方＝葡聚糖70；右下方＝葡聚糖500。
图7示出在30分钟之后，葡聚糖500与葡聚糖硫酸钠盐的分离的对比。
图8示出葡聚糖500和葡聚糖500硫酸钠盐分离的特写。这些特写在30分钟标志时拍摄，以证明葡聚糖硫酸钠盐分离是额外浑浊的。
图9示出在进行全血分离和离心之后的血细胞比容水平。在转移至微量移液管之前，使每一种混合物静置30分钟以发生分离：对照具有与PBS以1:1混合的血液(左)，下一管具有与血液混合的一半葡聚糖一半PBS(中间)，另一管具有TotiCyte(右)。然后，将每一种混合物转移至微量移液管，并且离心。
图10示出(在左侧)使用与2.5％v/v DMSO混合的，浓度为1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、2.5％w/v、3％w/v、3.5％w/v、4％w/v、4.5％w/v和5％w/v(从左至右)的葡聚糖500进行5分钟之后的分离情况。在右侧是与上述相同、但其中使用葡聚糖70的分离情况。图11和图12分别示出在15分钟和30分钟之后的分离情况。
图13示出使用2.5％w/v的葡聚糖500与浓度为1％v/v、1.5％v/v、2％v/v、2.5％v/v、3％v/v、3.5％v/v、4％v/v、4.5％v/v和5％v/v的DMSO以1:1的体积组合进行的分离。左侧图片示出15分钟之后的分离情况，在该时间点分离良好。右侧图片示出在30分钟之后的分离情况，其中所有浓度都工作良好，并且已经全部产生了清晰的白细胞部分。
图14示出使用1.5％w/v的葡聚糖70与浓度为1％v/v、1.5％v/v、2％v/v、2.5％v/v、3％v/v、3.5％v/v、4％v/v、4.5％v/v和5％v/v的DMSO以1:1的体积组合进行的分离。上面的两张图示出恒定为1.5％的葡聚糖，左侧是在15分钟时的分离情况，右侧是在30分钟时的分离情况。可以清楚看出，实际上，这并不比血液自身分开更快地分离血液。下面的两张图对应于其中使用3％w/v的葡聚糖70溶液的样品。
图15示出使用如下物质进行的对比分离测试：(1)仅溶剂(PBS)(作为对照)，(2)DMSO(即没有组分(ii))，(3)DMSO+HES，和(4)DMSO+葡聚糖500。
具体实施方式
实施例
在实施例中使用的术语和设备
“TotiCyte”指葡聚糖500和DMSO的组合。
“TotiCyte 1X”指基于PBS的，并且包含2.5％w/v葡聚糖500和2.5％v/v DMSO的TotiCyte组合物。
“TotiCyte 5X”指基于PBS的，并且包含7.5％w/v葡聚糖500和7.5％v/v DMSO的TotiCyte组合物。
除非另有说明，使用已经与作为抗凝剂的CPDA混合的血液进行所有实验。另外，除非另有说明，添加到含血细胞的样品中的组合物是基于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的。
使用FACS(荧光激活细胞分选)仪(FACSCalibur 4CA，编号E4378)，测量白血细胞部分中的CD34细胞和/或CD45细胞的量。
使用Guave easyCyte 5仪，测量白血细胞部分中的TNC(总的有核细胞的计数)的量。
对于细胞分离的方法，采用三种不同的方法，即马克普乐斯(Macopress)法、群体(Syngen)法和人工法。按如下步骤进行这些方法。
Macopress
1、打开Macopress。重要的是在步骤11之前进行这一步骤，因为如果血袋已经悬挂在仪器上了，则不能对Macopress进行适当校正。
2、计算血袋中有多少血液+CPDA。
3、使血袋与Macopress加工试剂盒(沿白色突出物)进行无菌相接。
4、切断距血沉棕黄色层袋(有伸出两个管子的袋，与如血浆袋的一个袋子相对)最近的夹具，并且关闭其它所有夹具。
5、使用收集袋管线上的端口，加入等体积的1X TotiCyte。
6、在添加TotiCyte的同时和完成之后，摇动袋子。
7、使用之前用来添加TotiCyte的注射器以从袋子中去除尽可能多的空气(Macopress血沉棕黄色层袋仅有200ml，以确保它在完成压缩之前不会充满空气)。
8、将Macopress加工袋悬挂到Macopress上，并且分离30分钟。
9、使用箭头，选择程序4。
10、遵照屏幕上给出的指令——将管子插入到亮起来的夹具中(1、3和欧皮特(OPTI))。确保管线中没有扭结。打破袋子顶部的破坏文泰尔(breakventile)，确保血沉棕黄色层管线上的夹具是打开的，并且在加工套件的其它部件上的那些夹具是关闭的。
11、按下回车键(Enter)，以启动Macopress。
12、一旦Macopress结束，就按下Escape键，以确保仪器不密封夹具1处的管线。
13、从Macopress上取下袋子和管道。
14、撕开两个袋子之间的密封件。切开血沉棕黄色层袋的管子，以使管线的内容物排入。在进行下一步骤之前，对该管子进行热封。
15、将套件紧靠地放置到离心筒中，以确保血沉棕黄色层袋在离心步骤中不会出现褶皱，并且确保所有夹具都是关闭的。
16、确保对离心机进行适当地平衡，然后在500g离心15分钟。
17、从离心机中小心地取出加工套件，以不会破坏沉淀块。
18、将袋子放回到Macopress上，此时将管道仅放置到夹具1和夹具3中。
19、选择程序3(10ml终体积)，打破血沉棕黄色层袋顶部的breakventile，并且在按下Enter之前确保在额外管道上的所有夹具都是关闭的。
20、从Macopress上取下加工套件，并且撕开两个袋子之间的密封件。这将留下血浆袋和包含10ml的血沉棕黄色层袋。
21、轻轻地摩擦血沉棕黄色层袋，以从脊状突起移除所有的沉淀快，然后使用20ml注射器从袋子中取出血沉棕黄色层。
22、精确地测量存在多少血沉棕黄色层(用于算出回收率)。
23、然后，可在Guava easyCyte仪上测试TNC和存活力，并且在FACS仪上测试CD34细胞和CD45细胞和它们的存活力。
Syngen
1、使用50ml注射器(或者，如果需要则使用多于一个注射器)，从Fenwal血袋中取出血液。记录取出的体积。
2、保留少量的上述全血，以在稍后用于算出TNC回收率。
3、将血液放回到血袋中。
4、量出等体积的1X TotiCyte。
5、将等体积的1X TotiCyte添加到血袋中，并且混合均匀。
6、从离心筒(cartrage)底部去除销，并且从蓝色过滤器去除盖子。
7、使血袋与Syngen筒的中央管线无菌连接。
8、使血液/TotiCyte混合，以流入筒中。
9、在尽可能靠近筒的顶部处，密封管线。
10、反转筒以进一步混合样品，确保避免任何液体流入筒侧的两个管子中(进入其它腔体的管子)或流入蓝色过滤器中。
11、使样品静置，以分离30分钟。
12、将筒附接至Syngen加工模块，并且使其启动。
13、用装了水的Syngen筒附接至加工模块的，使离心机平衡。
14、使用程序1使筒旋转——这将经历4个旋转周期，每一个旋转周期都有不同的长度和速度。
15、从离心机中取出筒，将筒转移至Syngen工作站，并且将加工模块转移至转接站(docking station)(现在，该模块将显示P，指示需要对数据进行处理)。
16、从模块中下载信息，输入所需的信息(所使用的离心机编号、样品名称、筒的批号和加工模块批号)。
17、血沉棕黄色层腔室应包含20ml：取出，并且精确测量存在多少血沉棕黄色层，因为可能略有变化。
18、将血沉棕黄色层混合均匀，然后从其中提取样品，以进行存活力分析。
19、然后，可在Guava easyCyte仪上测试TNC和存活力，并且在FACS仪上测试CD34细胞和CD45细胞和它们的存活力。
人工法
1、计算血液+CPDA的体积。
2、保留少量的上述全血，以稍后用于计算TNC回收率。
3、将其转移至附接在铁支架的分液漏斗中。确保底部的旋塞是关闭的。
4、添加等体积的1X TotiCyte。移除盖子，以除去所有过剩空气，并且静置以分离30分钟。
5、将法尔孔(falcon)管或培养皿放置在漏斗下。转动旋塞，以仅略打开喷嘴并且使红色部分流出漏斗。
6、密切注视剩余红色的量：不移除所有的红色，因为如果完全移除红色，会丧失界面。
7、一旦足够接近界面，就关闭旋塞。在从下方移走管并将其替换成新管之前，使尽可能多的红色从喷嘴滴下。
8、再次打开旋塞，以抽出白细胞部分。
9、使白细胞部分在500g旋降10分钟，并且重悬在10ml上清液中。
10、然后，可在Guava easyCyte仪上测试TNC和存活力，并且在FACS仪上测试CD34细胞和CD45细胞和它们的存活力。
实施例1-通用的细胞分离方法
将脐带血收集在标准的含有35ml柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖-腺嘌呤(CPDA)抗凝剂溶液的百特(Baxter)250ml(标明的)血袋中。
制备在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液，该溶液含有葡聚糖和选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甘氨酸(DMG)、L-缬氨酸、L-脯氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甘氨酸的额外成分。将该溶液以1:1的比率添加到血液样品中，然后完全混合。在15分钟或30分钟的时间段内，在室温进行红细胞部分和有核细胞部分的分离。
肉眼可观察到各细胞部分的分离。图1示出红细胞(试管底部)与有核细胞(试管顶部)的清晰分离。暴露于终浓度为2.5％w/v的葡聚糖(500分子量(Mw))和终浓度为2％v/v(左图)或2.5％v/v(右图)的DMSO，在30分钟后获得该图像。
将葡聚糖500Mw替换成终浓度在3％w/v至5％w/v之间的70Mw较低分子量的葡聚糖时，看到如上所述的类似的细胞分离(数据未示出)。将葡聚糖500Mw替换成终浓度在2.5％w/v至5％w/v之间的葡聚糖500硫酸钠时，也看到类似的细胞分离(数据未示出)。
暴露于终浓度为2.5％的葡聚糖70Mw和终浓度为2.5％w/v的DMG或L-缬氨酸的血液样品，在30分钟之后也示出红细胞和有核细胞的清晰分离(数据未示出)。相比之下，暴露于终浓度为2.5％的葡聚糖70Mw和终浓度为2.5％w/v的L-脯氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或甘氨酸的血液样品，在30分钟之后示出即使有也很少的红细胞和有核细胞的分离(数据未在本文中示出)。
还观察到，暴露于终浓度为2.5％w/v的葡聚糖500Mw和终浓度为1％v/v至5％v/v的DMSO的血液样品，在15分钟和30分钟之后示出红细胞和有核细胞的清晰分离(图2)。
对于上面的实验，常常在暴露15分钟之后看到实质性分离，但是在暴露15分钟至30分钟之间的时间之后会看到进一步的分离。例如，这在图2a的样品与图2b的样品进行对比时是明显的。
实施例2-红细胞体积分数(血细胞比容)的研究
在本实施例中，测定在细胞分离之后，在有核细胞部分中残留的红细胞体积分数的水平。准备以下三管来进行分离：(i)血液样品以1:1的比率仅与PBS混合(对照)，(ii)血液样品以1:1的比率与含有在PBS中的浓度为5％w/v的500Mw葡聚糖的溶液混合(葡聚糖的终浓度为2.5％w/v)，(iii)血液样品以1:1的比率与含有在PBS中的浓度为5％w/v的500Mw葡聚糖和浓度为5％v/v的DMSO的溶液混合(葡聚糖的终浓度为2.5％w/v并且DMSO的终浓度为2.5％v/v)。使样品静置，以在室温下分离30分钟。
观察到样品(iii)中的各细胞部分的分离速度比样品(ii)快，并且在30分钟之后，样品(iii)已经显现出比样品(ii)更致密的红细胞部分(数据未示出)。
将有核细胞部分(100μl)转移至微量移液管，并且使用粘胶封闭住端部。然后，将微量移液管在1500rpm离心2分钟。
图3示出了离心之后的微量移液管。对照(图3中左边的移液管)示出在白细胞部分内的高度压实的红细胞体积。相比之下，样品(ii)(中间的移液管)和样品(iii)(右边的移液管)示出约1％的大大减少的压实的红细胞体积。
实施例3-使用流式细胞仪对细胞存活力和造血干细胞(HSC)的存在进行评定
血液样品以1:1的比率与以下溶液混合，该溶液包含在PBS中浓度为5％w/v的500Mw葡聚糖和浓度为5％v/v的DMSO(葡聚糖的终浓度为2.5％w/v并且DMSO的终浓度为2.5％v/v)。使样品静置，以在室温下分离30分钟。
然后，使用流式细胞仪分析得到的有核细胞部分的样品。具体地，使用来自Becton,Dickinson and Company的“干细胞枚举试剂盒(Stem Cell Enumeration Kit)”进行分析。按照试剂盒的应用指南进行分析，并且所使用的模板基于临床和实验室标准化研究所H42-A2认可准则(Clinical and Laboratory Standards Institute H42-A2approved guideline)(通过流式细胞仪定义的细胞群的免疫学技术；认可准则-第二版，维恩PA：临床和实验室标准化研究所2007，CLSI文件H42-A2(Enumeration ofImmunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry；ApprovedGuideline-Second EditionWayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute；2007.CLSIdocument H42-A2)中描述的方法。
图4示出7-氨基放线菌素D(7-AAD)荧光水平(x-轴)针对侧向散射(y-轴)的点阵图。7-AAD是用于评定细胞存活力的荧光化合物。它仅透过非存活细胞的细胞膜，因此低水平的荧光(如由点状图上的矩形门(rectangular gate)所示)代表存活细胞。该点状图示出总细胞群中的大部分是存活的。
流式细胞检测分析还示出，上述细胞分离方法是从血液样品中隔离HSC群的有效方式(数据未示出)。
实施例4-葡聚糖70与DMSO或氨基酸
将全血样品与PBS组合物1:1混合，该PBS组合物包括2.5％的葡聚糖加DMSO、L-缬氨酸、L-脯氨酸、β-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和DMG。测试在PBS组合物中每一种氨基酸和DMSO的浓度水平为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％下进行。在混合之后，将每个样品都在室温静置30分钟。图5示出在15分钟和30分钟之后的样品的图像。
β-丙氨酸即使在30分钟之后的效果也很小。L-脯氨酸在30分钟之后的效果也很小。在L-缬氨酸的实验中，具有1％浓度的试管与2％试管的分离速率类似。在此方面，值得注意的是，一些较高浓度的氨基酸溶液的结果可能受到氨基酸溶解性的限制。L-缬氨酸的性能比DMG好：使用L-缬氨酸，在30分钟之后得到的白细胞部分清晰得多。异亮氨酸、亮氨酸和甘氨酸似乎都不诱导任何沉降。图5示出在分离中所描述的每一种物质，除了没有示出甘氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之外，因为它们几乎都是没有活性的，它们分离血液的速率都不比与PBS以1:1混合的血液快。下面是各种物质的分离效果从最佳至最差的顺序的列表。
DMSO>L-缬氨酸>DMG>L-脯氨酸>β-丙氨酸>亮氨酸/异亮氨酸/甘氨酸
实施例5-葡聚糖的大小和类型
测试了不同分子量的葡聚糖。具体地，对比了葡聚糖6、葡聚糖40、葡聚糖70和葡聚糖500。建立各分子量的葡聚糖的2％w/v～10％w/v(2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％)的储备物，以与血液样品以1:1的体积比组合后得到1％～5％的浓度。储备物都包含相同浓度的DMSO，即2.5％v/v。
如在图6中可看到的，实际上，葡聚糖6和葡聚糖40在15分钟或完整的30分钟之后没有真正分离开。葡聚糖70开始相当好地分离开，具有清晰的梯度——与较低浓度相比，5％的浓度下分离快很多且好很多。30分钟之后，葡聚糖70仍然具有该清晰的梯度，较高浓度分离在试管的下半部。葡聚糖500的分离明显是最好的。通过15分的标记(minute mark)，3％的试管具有几乎完全致密的红细胞部分，并且在30分钟之后，1％浓度的所有试管条形块都得到极好的紧实：所有试管从2.5％向上看基本上都是相同的(一些试管具有稍微更浑浊的白细胞部分)。
图6示出在30分钟之后的样品的图像。葡聚糖6和葡聚糖40分离的不比对照(使用PBS稀释的血液)快。葡聚糖70具有清晰的梯度，但浓度较低时，实际上不能分离开。葡聚糖500很好地分离血液，并且得到清晰的白细胞部分。
实施例6-葡聚糖500与葡聚糖硫酸钠盐
葡聚糖500(2.5％w/v)与2.5％v/v的DMSO混合；葡聚糖硫酸钠盐同样也与2.5％v/v的DMSO混合。将1ml每种组合物放置在试管中，并且每一试管都已经添加了1ml血液，然后静置分离30分钟，与大部分其它实验相同。
葡聚糖500硫酸钠盐相当好地分离血液，但不如葡聚糖500/DMSO组合分离的那么好，如在图7中所示。致密性非常类似，但是白细胞部分在葡聚糖盐中浑浊很多，很多红细胞可见地漂浮在红细胞部分的上方，如在下面图4中所示。因此，虽然两种都有效，但是葡聚糖500提供了稍微更清晰的白细胞部分。
图8示出了按照本实施例中上面所述的方案，葡聚糖500和葡聚糖500硫酸钠盐的分离的特写。这些特写是在30分钟标记时采集的，以证明葡聚糖硫酸钠盐分离是额外浑浊的。
在此点，值得注意的是，认为本发明的所有方面都提供了比现有技术更大的优点，而且葡聚糖500/DMSO组合，尤其通过以(i)在PBS中的2.5％w/v葡聚糖500与(ii)在PBS中的2.5％v/v的DMSO等体积混合获得的组合物的形式使用时，在本实施例和前述实施例中讨论的实验中是特别有利的。
实施例7-血细胞比容实验
研究在白细胞部分中剩余的血细胞比容的水平。制备三种试管来进行分离，各试管都包含基于血液:PBS的1:1混合物的组合物(第一组合物是仅PBS，作为对照；第二组合物具有与PBS 1:1混合的5％w/v的葡聚糖500(以得到2.5％w/v)；第三组合物是TotiCyte1X)，并且在室温静置30分钟，以确保最大分离。与仅具有葡聚糖的样品相比，具有TotiCyte1X的样品分离稍微更快。直至分离30分钟之后，两种样品都保持相对浑浊，此时，TotiCyte已经显现出更致密的红细胞部分。将100ul白细胞部分转移至微量移液管，并且使用粘胶封闭住端部。然后，将微量移液管在1500rpm离心2分钟。仅葡聚糖的样品和TotiCyte样品具有约1％的血细胞比容，并且似乎比对照致密得多。对于肉眼来说，在仅葡聚糖的试管和TotiCyte试管中，血细胞比容的量没有差别，如可在图9中看到的。
此外，使用Macopress仪器和人工法，测试样品的血细胞比容水平。Macopress产生相当一致的结果，当将仪器设置为仅收集特定水平的血细胞比容(当给定水平的红细胞通过传感器时，Macopress终止按压动作，这样理论上离开的量总是相同的)。高于1％剩余的血细胞比容的值仅出现在传感器的敏感性被改变了的运行中。使用人工法更难以得到恒定水平的血细胞比容，因为在某种程度上，在没有影响界面的情况下取出多少红细胞是主观的。
实施例8-葡聚糖70和葡聚糖500的不同浓度
以确定DMSO和葡聚糖的最佳浓度为目标，将不同浓度的葡聚糖70和葡聚糖500(1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、2.5％w/v、3％w/v、3.5％w/v、4％w/v、4.5％w/v和5％w/v)与2.5％v/v的DMSO和血液(照例，组合等体积的葡聚糖和DMSO溶液，然后添加对应于组合的葡聚糖和DMSO溶液的体积的血液)混合，静置分离30分钟。即使在5分钟之后，来自2.5％～4.5％的葡聚糖500组分的样品也开始分离的相当好。5分钟之后，葡聚糖70还没有显现出变化。图10示出在5分钟之后的样品的图像。
15分钟之后，具有葡聚糖500的所有样品(除了1％之外)都已经完成了大部分的分离，尽管在30分钟之后，各部分确实变得更加致密且更加清晰。尽管浓度为5％的葡聚糖70的试管已经在致密性上开始取得一些进展，但是葡聚糖70在15分钟之后还不是太有效。图11示出了15分钟之后的样品的图像。但是，在30分钟之后，存在非常清晰的梯度：前4个试管(1％、1.5％、2％和2.5％)还没有实际分离开，3％～5％的试管尽管还没有与具有对应浓度的葡聚糖500的样品一样致密或清晰的白细胞部分，但是已经分离地很好了。图12示出了在30分钟之后的样品的图像。
本实验的后一半涉及改变DMSO的浓度，同时使葡聚糖浓度保持恒定。为了此目的，将2.5％w/v的葡聚糖500与不同浓度的DMSO溶液(1％v/v、1.5％v/v、2％v/v、2.5％v/v、3％v/v、3.5％v/v、4％v/v、4.5％v/v和5％v/v)混合。为了进对比，还使用1.5％w/v的葡聚糖70溶液和3％w/v的葡聚糖70溶液(代替葡聚糖500)进行等效测试。在15分钟之后，葡聚糖500/DMSO试管已经全部使红细胞部分相当好地压实下来，至试管的约1/3。在此阶段，5％的试管是仅有的没有很好压实的试管。但是，在30分钟之后，所有试管甚至进一步压实，并且具有清晰更多的白细胞部分。来自1.5％的葡聚糖70溶液的样品没有显示比与PBS混合的血液(对照)快的效果，其中与PBS混合的血液已经静置以进行分离。甚至在30分钟之后，各葡聚糖70浓度的清晰度和致密性有很少/没有变化。图13和图14示出了样品的图像。图14中的两张底部图像是来自3％的葡聚糖70溶液的样品的图像。这使得分离存在更大差异，并且在30分钟时，明确的白细胞部分和红细胞部分已经显现出来。虽然红细胞部分不如使用葡聚糖500的那么致密，但是它比来自1.5％的葡聚糖70溶液的样品清晰很多。
实施例9-在白细胞部分中回收的细胞的实际数量
CD34和CD45计数
对两个不同的血液样品进行分离。对于每一个样品，使用(a)TotiCyte 1X和(b)2.5％w/v的葡聚糖500溶液进行分离。2.5％w/v的葡聚糖500溶液与1ml血液混合，以便葡聚糖在样品中的终浓度与TotiCyte重复实验(其中DMSO和葡聚糖500组分分别具有1.25％v/v和1.25％w/v的终浓度)中的相同。在30分钟之后或这样在室温下，一旦分离已经进行了它能进行的最大程度，则移除白细胞部分并将其转移至另一试管。将100ul的该白细胞部分在FACS仪上运行，以测试CD34细胞和CD45细胞。引入DMSO(在TotiCyte样品中)对回收细胞的数量的效果如下：
·平均来说，使用TotiCyte的分离回收29％的比仅使用葡聚糖溶液更多的CD34细胞
·平均来说，使用TotiCyte的分离回收7％的比仅使用葡聚糖溶液更多的CD45细胞
在细胞存活力％方面，与仅使用葡聚糖溶液相比，使用TotiCyte组合物回收的存活细胞的比例略低，但是这通常高于被使用TotiCyte组合物时回收的更多数量的细胞所抵消的量(意味着，使用TotiCyte组合物回收显著更多的存活细胞)。
进一步测试TNC(总有核细胞)计数&C34计数
还进行了对应测试，以证实TotiCyte 1X在较大样品大小中的有效性。此外，还进行了对应测试，以证实使用TotiCyte 5X的存活力。结果总结在下面的表中。
Figure BDA0000875283500000211
*在Macopress法的情况中为9个样品的平均值，在Syngen法的情况中为2个样品的平均值
测试示出TotiCyte 1X能得到一致高的TNC的回收率，而不管所选择的方法(即使用人工方法、Syngen系统或Macopress)。CD34细胞的回收也很高。尽管Toticyte 1X组合物通常提供最高的回收率，但使用更浓的TotiCyte 5X的存活力也得到了证实。
解冻后的分析
进行了进一步的测试，以在下游添加DMSO至已知的防冷冻水平、冷冻、然后解冻之后，对比所提出的分离方法的效果。在每种情况中，按照下面实施例11中所述的途径，在冷冻之前添加DMSO，并且使用相同的冷冻解冻过程。当在冷冻之前添加DMSO时，在4℃添加，并且缓慢添加，以不会使细胞震动；将样品冷冻在经验证的被动冷冻盒中，该经验证的被动冷冻盒在顶部具有填充流体的血袋(盒子如何验证)；通过旋动和轻轻地反转管子，使样品在37℃快速解冻，然后混合物一旦变成半冻结状态就移动到湿冰中；在完全解冻之后对血液进行快速取样，以确保最大程度地保留存活力。结果总结在下面的表中，同时示出全血样品的对应结果。对于冲洗步骤，将解冻的细胞悬浮液在500g离心10分钟；丢弃上清液，并且将细胞沉淀块轻轻地重悬在冷的PBS中；再次将细胞悬浮液在500g离心10分钟，并且将沉淀块重悬在冷的PBS中，至期望体积。
Figure BDA0000875283500000212
使用TotiCyte 1X和TotiCyte 5X处理的样品都提供了良好的解冻后的回收水平，其中TotiCyte 1X提供的特别有效。在各全血及其对应的TotiCyte 1X和TotiCyte 5X重复样品的存活力之间存在显著差异。对于绝大部分来说，在这些实验过程中发现，全血不总是在解冻过程中存活的特别好。因此，尽管在不同的血液样品之间不可避免地存在变动，但是发现，虽然通常从全血细胞样品中回收更多的细胞，但是如果考虑存活力，则回收数字通常与TotiCyte1X重复样品相当。实际上，使用TotiCyte 1X处理且进行冲洗的样品的平均TNC计数(66％)甚至高于全血的对应的平均TNC计数(58％)。类似的，使用TotiCyte 5X处理且不经过冲洗的样品的平均CD34计数(91％)甚至高于全血的对应的CD34计数(86％)。(值得注意的是，与上面的结果相关，虽然>100％的回收水平当然是不可能的，但是>100％的水平记录在测试中，这是因为例如血清样品内存在变化)。
实施例10-不同的抗凝剂
使用TotiCyte 1X，但是使用一半含有CPD和另一半含有CPDA，来处理血液样品。两组样品在分离漏斗中进行人工处理，其中首先虹吸出红细胞部分，然后收集白细胞部分。在FACS仪和Guava easyCyte上分别测试两种样品的CD34/CD45细胞和TNC。结果如下。
Figure BDA0000875283500000221
两种抗凝剂之间的TNC回收是类似的。CD45的回收％的测试示出，与使用CPD的组回收70％的CD45相比，使用CPDA的组回收87％(数据未示出)。两种抗凝剂都适于根据本发明的应用，但是CPDA的情况可能是优选的。
实施例11-为冷冻事先准备细胞部分，以提高解冻后的回收
按照下面的方法，测试在细胞部分与冷冻保护剂接触并且冷冻，然后解冻之前，进行本发明的事先准备方法对解冻后的细胞回收的效果。
1、使用胰蛋白酶，从培养瓶中移出细胞。
2、将细胞旋降下来，以去除胰蛋白酶。
3、然后将细胞重悬在10ml DMEM中。
4、测量TNC细胞和CD45/CD34细胞的计数(以确定解冻后的细胞回收)。
5、以0.5ml等分在8个2ml冷冻管中。
6、向前两个管中分别添加额外的0.5ml DMEM，向接着的两个管中分别添加0.5ml的TotiCyte 1X，向接着的两个管中分别添加0.1ml的TotiCyte 5X，并且向最后的两个管中分别添加0.5ml的2.5％w/v葡聚糖500。然后将样品混合均匀。
7、然后将样品在室温下静置45分钟。
8、向每对管中的一个中添加DMSO(即四种类型的每一种中的一个)，至7.5％。对于其它四个管，添加DMSO和FCS(胎牛血清)的组合。
9、将细胞样品转移至Mr Frosty冷冻容器中。
10、底部腔室填充有甲醇，并且将整个容器放置在-80℃冰箱中至少一夜。
11、从冰箱中移出容器，并且快速解冻。
12、将一部分细胞部分移出至另一管子中，以在没有冲洗的情况下进行再测验。
13、对于在移出该少量等分之后剩余的细胞，逐滴添加一半体积的温暖的DMEM，同时始终轻柔地旋转管子。
14、然后，将样品在500g离心10分钟。
15、移除上清液，并且重悬在0.5mlDMEM中。
16、然后，重新测验样品的细胞回收。
按照上述方案，包括在解冻前，将样品留在冰箱中2/3天。下面给出了TNC回收(在Guava PCA测量)结果。
所使用的组合物 冷冻保护剂 冷冻前的存活力％ 解冻后的存活力％
DMEM DMSO 90.2 77.67
DMEM DMSO/FCS 90.2 69.75
TotiCyte 1X DMSO 90.2 87.13
TotiCyte 1X DMSO/FCS 90.2 91.03
TotiCyte 5X DMSO 90.2 73.9
TotiCyte 5X DMSO/FCS 90.2 76.1
仅葡聚糖 DMSO 90.2 82.9
仅葡聚糖 DMSO/FCS 90.2 81.6
葡聚糖和DMSO都对细胞有事先准备的效果，因为TotiCyte和葡聚糖的细胞回收都显著好于对照。在冲洗步骤之后，TotiCyte 1X对于解冻后保持TNC显示出是最好的，并且保留85％+存活力，其次是仅葡聚糖，然后是5X TotiCyte。
实施例12–进一步的对比测试
使用以下组合物进行进一步的血液分离：
·血液+等体积的PBS作为对照(测试1)
·血液+等体积的含有2.5％v/v DMSO的PBS，以便DMSO在与血液样品混合之后的浓度是1.25％v/v(测试2)
·血液+等体积的含有2.5％w/v HES(羟乙基淀粉)和2.5％v/v DMSO的PBS(测试3)
·血液+等体积的TotiCyte 1X，即具有2.5％w/v葡聚糖500和2.5％v/vDMSO的PBS(测试4)。
在这些测试中获得的分离的图像显示在图15中。明显看出，在测试2中仅使用DMSO的组合物几乎与对照(测试1)一样，在测试过程(60分钟)中都没有实现任何的分离。在测试3和测试4中看到类似的分离，从而证实HES是葡聚糖的实际可行的替代物。

Claims (39)

1.一种组合的应用，所述组合为：（i）分子量至少为50 kDa的大分子红细胞沉降增强因子，和（ii）二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甘氨酸（DMG）和/或缬氨酸；以从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞，和/或事先准备非红细胞的血细胞，以在随后的冷冻贮藏步骤中保护它们的完整性；其中，当所述非红细胞的血细胞与组分（i）和组分（ii）接触时，所产生的混合物包括0.05% w/v ~10% w/v浓度的组分（i）和0.05% v/v ~10% v/v浓度的组分（ii）。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述大分子红细胞沉降增强因子是葡聚糖，并且组分（ii）是DMSO。
3.一种分离细胞的方法，所述方法包括：（a）使含血细胞的样品与以下组分接触：（i）分子量至少为50 kDa的大分子红细胞沉降增强因子，和（ii）DMSO、DMG和/或缬氨酸； （b）使所述样品分成沉降相和上清液相；和（c）从所述沉降相和/或所述上清液相中回收细胞；其中，当所述样品与组分（i）和组分（ii）接触时，所产生的混合物包括0.05% w/v ~10% w/v浓度的组分（i）和0.05% v/v ~10% v/v浓度的组分（ii）。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括：(a) 使含血细胞的样品与组合物接触，该组合物包括：（i）葡聚糖，和（ii）DMSO、DMG和/或缬氨酸；（b）使所述样品分成沉降相和上清液相；和（c）从所述沉降相或所述上清液相中回收细胞。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，步骤（a）包括使含血细胞的样品与包括组分（i）和组分（ii）的组合物接触，并且使该含血细胞的样品和该组合物以10:1至1:10的比率混合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，使该含血细胞的样品和该组合物以5:1至1:5的比率混合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，使该含血细胞的样品和该组合物以2:1至1:2的比率混合。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中，步骤（a）包括使含血细胞的样品与包括组分（i）和组分（ii）的组合物接触，并且该组合物包括0.5% w/v ~10% w/v的组分（i）和0.5% v/v ~10% v/v的组分（ii）。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中，所述含血细胞的样品选自外周血、脐带血和骨髓。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中，从人类采集所述含血细胞的样品。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中，所述方法用于从包含红血细胞的含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中，在步骤（b）中，持续10分钟至60分钟，使所述样品分成沉降相和上清液相。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中，一旦所述含血细胞的样品与组分（i）和组分（ii）接触，则组分（i）的浓度是0.25% w/v至5 % w/v，并且组分（ii）的浓度是0.25% v/v至5 % v/v。
14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其中，组分（i）是葡聚糖，并且组分（ii）是DMSO。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的方法，其中，组分（i）是分子量至少为50 kDa的葡聚糖。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法，其中，组分（i）是葡聚糖500，并且组分（ii）是DMSO。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的方法，其中，在步骤（c）中，从所述沉降相和/或所述上清液相中回收的细胞具有小于1%的血细胞比容。
18.一种为冷冻贮藏事先准备非红细胞的血细胞部分的方法，所述方法包括使所述细胞部分与以下组分的组合接触：（i）分子量至少为50 kDa的大分子红细胞沉降增强因子，和（ii）DMSO、DMG和/或缬氨酸；其中，当所述细胞部分与组分（i）和组分（ii）接触时，所产生的混合物包括0.1% w/v ~8% w/v浓度的组分（i）和0.1% v/v~5% v/v浓度的组分（ii）。
19.根据权利要求18所述的方法，包括使所述细胞部分与包括组分（i）和组分（ii）的组合物接触，其中，使该细胞部分和该组合物以10:1至1:10的比率混合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，使该细胞部分和该组合物以5:1至1:5的比率混合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，使该细胞部分和该组合物以2:1至1:2的比率混合。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，包括使所述细胞部分与包括组分（i）和组分（ii）的组合物接触，其中，该组合物包括0.1% w/v ~10% w/v的组分（i）和0.1% v/v ~10% v/v的组分（ii）。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中，所述细胞部分包括白血细胞。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其中，从人类采集所述细胞部分。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中，一旦所述细胞部分与组分（i）和组分（ii）接触，则组分（i）的浓度是0.25 % w/v至5 % w/v，并且组分（ii）的浓度是0.25%v/v至5 % v/v。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，其中，组分（i）是葡聚糖，并且组分（ii）是DMSO。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中，组分（i）是分子量为至少50 kDa的葡聚糖。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的方法，其中，组分（i）是葡聚糖500，并且组分（ii）是DMSO。
29.根据权利要求3至28中任一项所述的方法，其中，所述方法用于增加在随后的冷冻贮藏之后，回收的存活的白血细胞的比例。
30.一种制备用于冷冻贮藏的非红细胞的血细胞的方法，该方法包括：（a）如在权利要求3至29中任一项定义的方法，和（b）向由此获得的非红细胞的血细胞中添加冷冻保护剂。
31.一种冷冻贮藏非红细胞的血细胞的方法，该方法包括：（a）如在权利要求3至29中任一项定义的方法，（b）向由此获得的非红细胞的血细胞中添加冷冻保护剂，和（c）冷冻贮藏所述非红细胞的血细胞。
32.一种冷冻贮藏并且随后回收非红细胞的血细胞的方法，该方法包括：（a）如在权利要求3至29中任一项定义的方法，（b）向由此获得的非红细胞的血细胞中添加冷冻保护剂，（c）冷冻贮藏所述非红细胞的血细胞，和（d）使所述非红细胞的血细胞解冻。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中，所述冷冻保护剂包括DMSO。
34.一种组合物，包括（i）分子量至少为50 kDa的大分子红细胞沉降增强因子，和（ii）DMSO、DMG和/或缬氨酸，该组合物适用于从含血细胞的样品中回收非红细胞的血细胞，和/或事先准备非红细胞的血细胞以在随后的冷冻贮藏步骤和解冻步骤中保护它们的完整性，其中，所述组合物中组分（ii）的浓度大于等于0.1%v/v且小于等于10% v/v，并且其中所述组合物中组分（i）的浓度大于等于0.1%w/v且小于等于10%w/v。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中，组分（i）是葡聚糖，并且组分（ii）是DMSO。
36.根据权利要求34或35所述的组合物，其中，组分（i）是葡聚糖。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的组合物，其中，组分（i）是葡聚糖500，并且组分（ii）是DMSO。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的组合物，其中，组分（i）的浓度是1% w/v ~5%w/v，并且组分（ii）的浓度是1% v/v ~5% v/v。
39.一种包括如在权利要求34至38中任一项定义的组合物的装置，其中所述装置是瓶子、血袋、用于注射到血袋中的预填充的注射器；或一种包括如在权利要求34至38中任一项定义的组合物和血液收集容器的试剂盒。
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