WO2017141831A1 - 脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、脂肪組織由来間質細胞の虚血性疾患に対する優れた治療効果を保持しつつ、治療剤の調製の利便性にも優れる、脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤の製造方法、そのような製造方法により得られる虚血性疾患治療剤を提供することを課題とする。　本発明は、凍結保存および融解を少なくとも２度行った脂肪組織由来間質細胞を含む、虚血性疾患治療剤である。

Description

脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤およびその製造方法

　本発明は、脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤およびその製造方法に関する。

　血栓や塞栓または種々の要因によって、狭窄または閉塞された血管の下流に存在する組織において、血液の供給量が需要量を下回り虚血性疾患が発症する。狭窄または閉塞した血管の部位により、脳梗塞、虚血性視神経症、心筋梗塞、虚血性大腸炎、虚血性骨壊死、下腿潰瘍または間歇性跛行などの病態が生じる。脳梗塞や心筋梗塞等では、血栓溶解療法、薬剤またはカテーテルを用いた血管拡張術、血管迂回術、病発部位切断術などにより閉塞血管の下流へと血液を送る治療が行われている。

　四肢の動脈の狭窄または閉塞による末梢動脈疾患に対して、血管新生を促進させる目的にて、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの血管新生因子の投与（特許文献１または特許文献２）や当該因子を発現するような遺伝子治療、さらには、細胞を移植する治療法が提案されている。このような末梢動脈疾患の治療に用いる細胞として、末梢血中の造血幹細胞や脂肪組織に存在する間質細胞（非特許文献１または特許文献３）が用いられている。

国際公開第２００２／０２２１６３号 国際公開第２０００／００７６１５号 国際公開第２００５／０３４８４３号

Ｐｌａｎａｔ－Ｂｅｎａｒｄ　Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　２００４，　１０９，　ｐｐ．６５６－６６３ Ｆｒａｎｃｏｉｓ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，　２０１２，　１４：　ｐｐ．１４７－１５２ Ｍｏｌｌ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，　２０１４，　３２（９）：　ｐｐ．２４３０－２４４２ Ｑｕｉｍｂｙ　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　Ｔｈｅｒ．，　２０１３，　４：４８

　脂肪組織由来間質細胞を投与直前に培養する場合、医療機関において行う必要が生じる。しかし、このような培養のためには、特殊な培養設備を準備する必要があることから、当該細胞を投与できる医療機関は限定され、結果的にその汎用性は低下する。

　そこで、利便性を高めるため、凍結保存した移植用の脂肪組織由来間質細胞をそのまま投与することが望まれるが、凍結保存した細胞を治療に用いる場合、融解した直後の細胞は、凍結前の細胞または融解後に培養工程を経た細胞と比較して治療効果が減少することや有害事象が増加することが報告されている（非特許文献２から４）。

　従って、凍結融解後の脂肪組織由来間質細胞の虚血性疾患治療への有効性や安全性は、実際に投与し、その結果を確認する必要がある。さらに、凍結融解を繰り返す場合、その効果を推定することはより困難となる。

　本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、脂肪組織由来間質細胞の虚血性疾患に対する優れた治療効果を保持しつつ、治療剤の調製の利便性にも優れる、脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤の製造方法、そのような製造方法により得られる虚血性疾患治療剤を提供することを課題とする。

　すなわち、本発明は、下記に関するものである：
［１］凍結保存および融解を少なくとも２度行った脂肪組織由来間質細胞を含む、虚血性疾患治療剤。
［２］末梢動脈疾患治療用である、［１］記載の虚血性疾患治療剤。
［３］前記脂肪組織由来間質細胞が、被験体に対して同種異系である、［１］または［２］に記載の虚血性疾患治療剤。
［４］前記脂肪組織由来間質細胞が、ヒト脂肪組織由来間質細胞である、［１］から［３］のいずれかに記載の虚血性疾患治療剤。
［５］前記凍結保存および融解を少なくとも２度行うことが、以下の工程を含む、［１］から［４］のいずれかに記載の虚血性疾患治療剤；
（１）脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、
（２）当該融解した細胞を培養する工程、および
（３）当該培養した細胞を凍結保存および融解する工程。
［６］前記工程（３）での融解後、６時間以内に輸液製剤と混合して投与される、［５］に記載の虚血性疾患治療剤。
［７］前記混合が、脂肪組織由来間質細胞を含む凍結保存用の溶液と輸液製剤の混合によって行われる、［６］に記載の虚血性疾患治療剤。
［８］前記脂肪組織由来間質細胞が、４継代以下の脂肪組織由来間質細胞である、［１］から［７］のいずれかに記載の虚血性疾患治療剤。
［９］前記凍結保存が、液体窒素上の気相で行われる、［１］から［８］のいずれかに記載の虚血性疾患治療剤。
［１０］前記凍結保存用の溶液が、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含む溶液である、［７］から［９］のいずれかに記載の虚血性疾患治療剤。
［１１］（ｉ）採取した脂肪組織から分離した間質細胞を培養する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、並びに（ｉｉｉ）融解された脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、を含む、脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤の製造方法。
［１２］前記虚血性疾患が、末梢動脈疾患である、［１１］記載の製造方法。
［１３］前記脂肪組織由来間質細胞が、被験体に対して同種異系である、［１１］または［１２］に記載の製造方法。
［１４］前記脂肪組織由来間質細胞が、ヒト脂肪組織由来間質細胞である、［１１］から［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で融解された脂肪組織由来間質細胞を輸液製剤と混合する工程をさらに含む、［１１］から［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］前記工程（ｉｉｉ）での融解後、６時間以内に前記工程（ｉｖ）を行う、［１５］に記載の製造方法。
［１７］前記凍結保存が、凍結保存液を用いて行われ、工程（ｉｖ）が、融解された脂肪組織由来間質細胞を含む凍結保存液と輸液製剤とを混合する工程である、［１５］または［１６］に記載の製造方法。
［１８］前記工程（ｉ）の培養が、少なくとも１継代行われる、［１１］から［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］前記工程（ｉｉ）において、融解された脂肪組織由来間質細胞を培養する工程をさらに含む、［１１］から［１８］のいずれかに記載の製造方法。
［２０］前記凍結保存が、液体窒素上の気相で行われる、［１１］から［１９］のいずれかに記載の製造方法。
［２１］前記凍結保存液が、ＤＭＳＯを含む溶液である、［１７］から［２０］のいずれかに記載の製造方法。

　本発明によれば、凍結保存および融解された脂肪組織由来間質細胞を用い、虚血性疾患を治療することが可能となる。従って、本発明は凍結保存および融解された脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤を提供する。さらに、本発明は、凍結保存された脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤の製造方法を提供する。

図１は、左肢下肢虚血モデルマウスの右肢に対する左肢の血流量比を示す。グラフは、それぞれ、ＰＢＳのみ（陰性対照）、脂肪組織由来間質細胞３×１０^５細胞および１×１０^６細胞を投与した結果を示す。 図２Ａは、左肢下肢虚血モデルマウスの右肢に対する左肢の血流量比を示す。図中、ｃｏｎｔｒｏｌは、乳酸リンゲルのみ投与の陰性対照を示し、Ｐ３およびＰ２はそれぞれ３継代した細胞および２継代した細胞の投与結果を示す。図２Ｂは、左肢下肢虚血モデルマウスの虚血側肢の状態の平均スコアを示す。 図３Ａは、右肢下肢虚血モデルウサギの左肢に対する右肢の血流量比を示す。基剤のみ（陰性対照）、脂肪組織由来間質細胞１×１０^６細胞および５×１０^６細胞を投与した結果を示す。図３Ｂは、右肢下肢虚血モデルウサギの虚血側肢での１ｍｍ^２あたりのＣＤ３１陽性細胞数を示す。

　本発明において「脂肪組織」とは、脂肪細胞、および微小血管細胞等を含む間質細胞を含有する組織を意味し、例えば、哺乳動物の皮下脂肪を外科的切除または吸引して得られる組織である。脂肪組織は、皮下脂肪より入手され得る。後述する脂肪組織由来間質細胞の投与対象と同種動物から入手されることが好ましく、ヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの皮下脂肪である。皮下脂肪の供給個体は、生存していても死亡していてもよいが、本発明において用いる脂肪組織は、好ましくは、生存個体から採取された組織である。個体から採取する場合、脂肪吸引は、例えば、ＰＡＬ（パワーアシスト）脂肪吸引、エルコーニアレーザー脂肪吸引、または、ボディジェット脂肪吸引などが例示され、細胞の状態を維持するという観点から、超音波を用いないことが好ましい。

　本発明における「間質細胞」は、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間質細胞なる用語は、間葉系幹細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。従って、脂肪組織由来間質細胞とは、脂肪組織に含有される間質細胞を意味し、脂肪組織由来間葉系幹細胞と称しても良い。

　本発明において、脂肪組織由来間質細胞とは、脂肪組織由来間質細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％または９９％が脂肪組織由来間質細胞である。

　当該脂肪組織由来間質細胞は、例えば、米国特許第６，７７７，２３１号に記載の製造方法によって得られて良く、例えば、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、方法で製造することができる：
（ａ）脂肪組織を酵素による消化により細胞懸濁物を得る工程；
（ｂ）細胞を沈降させ、細胞を適切な培地に再懸濁する工程；ならびに
（ｃ）細胞を固体表面で培養し、固体表面への結合を示さない細胞を除去する工程。

　工程（ａ）において用いる脂肪組織は、洗浄されたものを用いることが好ましい。洗浄は、生理学的に適合する生理食塩水溶液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））を用いて、激しく攪拌して沈降させることによって行い得る。これは、脂肪組織に含まれる夾雑物（デブリとも言い、例えば損傷組織、血液、赤血球など）を組織から除去するためである。したがって、洗浄および沈降は一般に、上清からデブリが総体的に除去されるまで繰り返される。残存する細胞は、さまざまなサイズの塊として存在するので、細胞そのものの損傷を最小限に抑えながら解離させるため、洗浄後の細胞塊を、細胞間結合を弱めるか、または破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼまたはトリプシンなど）で処理することが好ましい。このような酵素の量および処理期間は、使用される条件に依存して変わるが、当技術分野で既知である。このような酵素処理に代えて、または併用して、細胞塊を、機械的な攪拌、超音波エネルギー、熱エネルギーなどの他の処理法で分解することができるが、細胞の損傷を最小限に抑えるため、酵素処理のみで行うことが好ましい。酵素を用いた場合、細胞に対する有害な作用を最小限に抑えるために、適切な期間をおいた後に培地等を用いて酵素を失活させることが望ましい。

　工程（ａ）により得られる細胞懸濁物は、凝集状の細胞のスラリーまたは懸濁物、ならびに各種夾雑細胞、例えば赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞を含む。従って、続いて凝集状態の細胞とこれらの夾雑細胞を分離、除去してもよいが、後述する工程（ｃ）での接着および洗浄により、除去可能であることから、当該分離、除去は割愛しても良い。夾雑細胞を分離、除去する場合、細胞を上清と沈殿に強制的に分ける遠心分離によって達成しえる。得られた夾雑細胞を含む沈殿は、生理学的に適合する溶媒に懸濁させる。懸濁状の細胞には、赤血球を含む恐れがあるが、後述する個体表面への接着による選択により、赤血球は除外されるため、溶解する工程は必ずしも必要ではない。赤血球を選択的に溶解する方法として、例えば、塩化アンモニウムによる溶解による高張培地または低張培地中でのインキュベーションなど、当技術分野で周知の方法を使用することができる。溶解後、例えば濾過、遠心沈降、または密度分画によって溶解物を所望の細胞から分離してもよい。

　工程（ｂ）において、懸濁状の細胞において、間質細胞の純度を高めるために、１回もしくは連続して複数回洗浄し、遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。この他にも、細胞を、細胞表面マーカープロファイルを基に、または細胞のサイズおよび顆粒性を基に分離しても良い。

　再懸濁において用いる培地は、間質細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、このような培地は、基礎培地に、血清を添加する、および／または、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。これらの培地は、必要に応じて、さらに脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの物質を添加しても良い。基礎培地は、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地およびこれらの混合培地などが挙げられる。血清は、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清などがあるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加しても良い。脂肪酸は、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸等が例示されるが、これらに限定されない。脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン等が例示されるが、これらに限定されない。アミノ酸は、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシンなどを含むがこれらに限定されない。タンパク質は、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチンおよびβ２－ミクログロブリン等が例示されるが、これらに限定されない。多糖は、グリコサミノグリカンが例示され、グリコサミノグリカンのうち特に、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等が例示されるが、これらに限定されない。増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が例示されるが、これらに限定されない。本発明において得られる脂肪由来間質細胞を細胞移植に用いるという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地を用いることが好ましい。このような培地は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社およびＲｏｈｔｏ社などから間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている。

　続いて、工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた細胞懸濁液中の細胞を分化させずに固体表面上で、上述の適切な細胞培地を使用して、適切な細胞密度および培養条件で培養する。本発明において、「固体表面」とは、本発明の脂肪組織由来間質細胞の結合を可能とする任意の材料を意味する。特定の態様では、このような材料は、その表面への哺乳類細胞の結合を促すように処理されたプラスチック材料である。固体表面を有する培養容器の形状は特に限定されないが、シャーレやフラスコなどが好適に用いられる。非結合状態の細胞および細胞の破片を除去するために、インキュベーション後に細胞を洗浄する。

　本発明では、最終的に固体表面に結合した状態で留まる細胞を、脂肪組織由来間質細胞の細胞集団として選択することができる。

　選択された細胞について、本発明の脂肪組織由来間質細胞であることを確認するために、表面抗原についてフローサイトメトリー等を用いて従来の方法で解析しても良い。さらに、各細胞系列に分化する能力について検査してもよく、このような分化は、従来の方法で行うことができる。

　本発明の脂肪組織由来間質細胞は、上述の通り製造することができるが、次の特性を持つ細胞として定義してもよい；
（ａ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す、
（ｂ）表面抗原ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲが陰性であり、および
（ｃ）培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能。

　本発明の脂肪組織由来間質細胞は、虚血性疾患治療剤として用いるために、適宜、凍結保存および融解を繰り返しても良く、好ましくは、凍結保存および融解を少なくとも２度行うことである。凍結保存および融解を少なくとも２度行うとは、脂肪組織由来間質細胞を凍結保存して任意の期間の後に融解する操作を、少なくとも２度行うことである。また、少なくとも２度行うとは、例えば、２度以上、３度以上、４度以上、５度以上行うこと、１０度以下、９度以下、８度以下、７度以下、６度以下行うことが挙げられる。さらに好ましくは、凍結保存および融解を２度行うことである。

　脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤を調製する過程において実施される評価試験により不適合が確認された場合、当該細胞を廃棄する必要が生じる。しかし、評価試験の結果を得るまでに時間が経過する場合、当該試験中においても細胞の培養を継続する必要がある。そこで、評価試験以前に凍結保存を行うことで結果的に廃棄することになる細胞を培養する工程等の実施を避けることができる。このような無駄な工程を省くことで、全体として製造コストを抑制することができる。また、虚血性疾患治療剤を製造する作業を中断することで、当該治療剤の製造スケジュールを人為的に制御することができる。本発明の脂肪組織由来間質細胞は、このように凍結保存および融解を２度以上行っても、本発明の虚血性疾患治療剤としての優れた治療効果を保持していることが、実施例にて確認されている。

　凍結保存および融解を少なくとも２度行う場合、例えば、（１）脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、（２）当該融解した細胞を培養する工程、および（３）当該培養した細胞を凍結保存および融解する工程を含む方法を用いることができる。なお、最後の融解する工程は、医療機関で行うことが好ましい。ドナーから採取した脂肪組織を入手した場合、（ｉ）採取した脂肪組織から分離した間質細胞を培養する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、（ｉｉｉ）融解された脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で融解された脂肪組織由来間質細胞を輸液製剤と混合する工程を含む方法が挙げられ、好ましくは、前記工程（ｉｉ）の後、融解された脂肪組織由来間質細胞を培養する工程をさらに含む。必要に応じて、工程（ｉｉｉ）を繰り返すことができる。工程（ｉｉｉ）を繰り返す場合、融解された脂肪組織由来間質細胞を培養する工程をさらに含んでもよい。

　本発明において、凍結保存は、当業者に周知の凍結保存液へ脂肪組織由来間質細胞を懸濁し、冷却することによって行い得る。懸濁は、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、凍結保存容器に移し、適宜、処理した後、凍結保存液を加えることによって行い得る。

　凍結保存液は、凍害防御剤として、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含有していても良いが、ＤＭＳＯは、細胞毒性に加えて、間質細胞を分化誘導する特性を有することから、ＤＭＳＯ含有量を減らすことが好ましい。ＤＭＳＯの代替物として、グリセロール、プロピレングリコールまたは多糖類が例示される。ＤＭＳＯを用いる場合、５％～２０％の濃度、好ましくは５％～１０％の濃度、より好ましくは１０％の濃度を含有する。この他にも、ＷＯ２００７／０５８３０８に記載の添加剤を含んでも良い。このような凍結保存液として、例えば、バイオベルデ社、日本ジェネティクス株式会社、リプロセル社、ゼノアック社、コスモ・バイオ社、コージンバイオ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社などから提供されている凍結保存液を用いても良い。

　上述の懸濁した細胞を凍結保存する場合、－８０℃～－１００℃の間の温度（例えば、－８０℃）で保管することで良く、当該温度に達成しえる任意のフリーザーを用いて行い得る。特に限定されないが、急激な温度変化を回避するため、プログラムフリーザーを用いて、冷却速度を適宜制御しても良い。冷却速度は、凍結保存液の成分によって適宜選択しても良く、凍結保存液の製造者指示に従って行われ得る。

　保存期間は、上記条件で凍結保存した細胞が融解した後、凍結前と同等の性質を保持している限り、特に上限は限定されないが、例えば、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、１年以上、またはそれ以上が挙げられる。より低い温度で保存することで細胞障害を抑制することができるため、液体窒素上の気相（約－１５０℃以下から－１８０℃以下）へ移して保存しても良い。液体窒素上の気相で保存する場合、当業者に周知の保存容器を用いて行うことができる。特に限定されないが、例えば、２週間以上保存する場合、液体窒素上の気相で保存することが好ましい。

　融解した脂肪組織由来間質細胞は、次の凍結保存までに適宜、培養しても良い。脂肪組織由来間質細胞の培養は、上述した間質細胞を培養できる培地を用いて行われ、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃の培養温度で、ＣＯ_２含有空気の雰囲気下で行われても良い。ＣＯ_２濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。培養において、培養容器に対して適切なコンフルエンシー（例えば、培養容器に対して、５０％から８０％を細胞が占有することが挙げられる）に達した後に、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、別途用意した培養容器に適切な細胞密度で播種して培養を継続しても良い。細胞を播種する際において、典型的な細胞密度として、約１００細胞／ｃｍ^２～約１００，０００細胞／ｃｍ^２、約５００細胞／ｃｍ^２～約５０，０００細胞／ｃｍ^２、約１，０００～１０，０００細胞／ｃｍ^２、約２，０００～１０，０００細胞／ｃｍ^２などが例示される。特定の態様では、細胞密度は２，０００～１０，０００細胞／ｃｍ^２である。適切なコンフルエンシーに達するまでの期間が、３日間から７日間となるように調整することが好ましい。培養中、必要に応じて、適宜、培地を交換しても良い。

　凍結保存した細胞の融解は、当業者に周知の方法によって行い得る。例えば、３７℃の恒温槽内または湯浴中にて静置または振とうすることによって行う方法が例示される。融解した細胞は、再度凍結保存する前に、培養してもよく、後述する治療剤として調製されても良い。融解後、再度培養する場合は、別途用意した培養容器に上述の通り適切な細胞密度で播種することによって行い得る。

　脂肪組織由来間質細胞は、培養方法によって、虚血性疾患への治療効果を失うことなく数回継代し、その数を増やすことができるが、継代回数はより少ないことが好ましいが、培養によって虚血性疾患治療に必要な細胞数を確保するため、継代を行うことが好ましい。本発明の治療に用いる脂肪組織由来間質細胞は、例えば、８回以下、７回以下、６回以下、５回以下、４回以下、または３回以下の継代を経た細胞であることが好ましい。より好ましくは、４回以下の継代を経た細胞である。本発明では、培養後の細胞を剥離し回収する工程を１回の継代として計数する。剥離後の細胞は、再播種または凍結保存等に供する。このような脂肪組織由来間質細胞を得る一つの態様として、（１）脂肪組織から分離された間質細胞を少なくとも１回細胞剥離し再播種することを伴い培養する工程、（２）細胞を剥離し凍結保存する工程、（３）融解する工程、（４）培養する工程、（５）細胞を剥離し凍結保存する工程、および（６）融解する工程が例示される。当該工程（４）では、さらに、細胞剥離し播種することを伴い培養する工程を含み得る。

　上記で調製した脂肪組織由来間質細胞は虚血性疾患の治療剤として利用が可能である。本発明において、虚血性疾患とは、動脈が血栓や塞栓、または種々の要因によって狭窄または閉塞された血管の下流に存在する組織において、血液の供給の減少により、細胞死が進行する疾患であり、例えば、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞、末梢動脈疾患等が挙げられる。本発明において、虚血性疾患の治療とは、血液の供給の減少した組織において血流改善を促すことを意味し、当該血流改善は、血管再生、すなわち新規血管構築（側副血行の発達）を促進することによって成しえることを含む。従って、虚血部位での組織細胞の増殖を見込める病態に適用することが好ましく、このような病態として、末梢動脈疾患が例示される。本発明において、末梢動脈疾患とは、糖尿病、バージャー病、閉塞性血栓血管炎、閉塞性動脈硬化症等を原因とする末梢での血行不良の病態を意味し、これらのすべてが虚血性疾患に含有される。すなわち、本発明において、末梢動脈疾患の治療とは、虚血の原因となる末梢動脈の下流の組織、特に、四肢末梢において、血管再生、すなわち新規血管構築を促進することを意味する。

　虚血性疾患の治療剤として用いるため、脂肪組織由来間質細胞は、ヒト由来の脂肪組織から分離された間質細胞であることが望ましく、凍結保存した脂肪組織由来間質細胞を用いるという観点から、虚血性疾患を罹患した投与対象ではない、他の対象から脂肪組織を採取することが望ましい。すなわち、脂肪組織由来間質細胞は、被験体に対して同種異系であることが好ましい。

　本発明によれば、上記した脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤または脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療用キットが提供される。さらに本発明によれば、細胞移植治療のために使用される、上記した脂肪組織由来間質細胞が提供される。更に本発明によれば、虚血性疾患に罹患した被験者に、上記の脂肪組織由来間質細胞の治療有効量を投与する工程を含む、被験者に細胞を移植する方法、並びに被験者の疾患の治療方法が提供される。なお、本発明における虚血性疾患治療剤としては、上記した脂肪組織由来間質細胞を含む医薬であれば特にその形態は限定されない。即ち、上記した脂肪組織由来間質細胞が凍結保存されている状態のもの、脂肪組織由来間質細胞が投与用又は保存用の輸液等に懸濁された状態のもの等、種々の形態のものが本発明の虚血性疾患治療剤に含まれる。

　上記の方法により得られた凍結保存された脂肪組織由来間質細胞は、融解後、輸液製剤と混合することで、脂肪組織由来間質細胞物を含む虚血性疾患治療剤を製造することができる。混合にあっては、融解後の細胞が懸濁された凍結保存液を輸液製剤と混合しても良く、遠心分離等により細胞を溶媒と分離した後、細胞のみを輸液製剤と混合しても良い。手技の煩雑さを回避するため、融解後、培養する工程を含まないこと、または融解後の細胞が懸濁された凍結保存液を直接輸液製剤と混合することが好ましい。本発明では、脂肪組織由来間質細胞は、融解後３時間以内、２時間以内、または１時間以内に輸液製剤と混合することが好ましく、さらに好ましくは、輸液製剤と混合後、３時間以内、２時間以内、または１時間以内に被験体へ投与することが望ましい。すなわち、脂肪組織由来間質細胞を融解後６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内に被験体へ投与することが望ましい。

　本発明における「輸液製剤」としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、たとえば、生理食塩水、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、１号液、２号液、３号液、４号液等が挙げられる。

　本発明の虚血性疾患治療剤には、凍結した脂肪組織由来間質細胞と輸液製剤とを組み合わせたキットも含まれる。

　細胞を混合した輸液製剤は、さらに、薬学的に許容される担体を添加しても良い。本発明において、担体とは、治療薬を投与するための懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、媒体、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤などをいい、これらを適切に添加することができる。

　懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステルなどを挙げることができる。安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウム等を挙げることができる。等張化剤としては、例えば、Ｄ－マンニトール、ソルビトール等を挙げることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。吸着防止剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキシドプロピレンオキシド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。含硫還元剤としては、例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオキト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１～７のチオアルカン酸などのスルホヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルまたはエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなどのキレート剤等を挙げることができる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩、グルコースなどの糖類など通常的に添加される成分を適宜添加していてもよい。

　細胞を混合した輸液製剤は、局所投与のために、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマー及びその化学的誘導体と混合しても良い。

　本発明の虚血性疾患治療剤の投与方法は、虚血部位に直接注射によって投与することが好ましく、特に限定されないが、例えば、脳内投与、筋肉内投与（心筋内投与および骨格筋内投与等を含む）、皮下投与等が例示される。投与の手技は、虚血部位に細胞を搬入することのできるものであれば特に限定されないが、例えば、針またはカテーテルを用いて行われ得る。

　本発明の虚血性疾患治療剤の投与量は、被験者に投与した場合に、投与していない被験者と比較して疾患に対して治療効果を得ることができる細胞量である。具体的な投与量は、被験者の年齢、体重、虚血の範囲、症状等によって適宜決定することができるが、一例としては、脂肪組織由来間質細胞数で、ヒト（例えば成人）の１回の投与当たり１ｘ１０^５～１ｘ１０^９個／ｋｇ体重が好ましく、１ｘ１０^５～１ｘ１０^８個／ｋｇ体重がより好ましく、１ｘ１０^５～１ｘ１０^７個／ｋｇ体重がさらに好ましい。

　本発明の虚血性疾患治療剤の投与回数としては、上記投与量を１回または複数回に分けて虚血部全体に投与しても良い。複数回投与する場合、投与箇所を適宜変更することが好ましく、その投与箇所は、虚血組織の大さに依存するが、例えば、１０ヵ所以上、２０ヵ所以上、３０ヵ所以上、４０ヵ所以上、５０ヵ所以上、６０ヵ所以上、７０ヵ所以上またはそれ以上に投与することが挙げられる。１ヵ所の注入量は１ｍＬ以下、０．９ｍＬ以下、０．８ｍＬ以下、０．７ｍＬ以下、０．６ｍＬ以下、０．５ｍＬ以下であることが好ましい。従って、適宜、細胞濃度を調整して、虚血性疾患治療剤を製造することが好ましい。

　本発明の虚血性疾患治療剤は、他の治療薬と併用して用いても良く、単剤として用いても良い。

　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］本発明の虚血性疾患治療剤の調製
脂肪組織由来間質細胞の樹立
　ヒトドナーから同意を得た後、脂肪吸引法で得た皮下脂肪組織を生理食塩液で洗浄した。細胞外基質の破壊、および細胞の単離を達成するために、コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）（溶媒は生理食塩液）を添加し、３７℃で９０分間振倒し、分散した。続いて、この上記懸濁液を８００ｇで５分間、遠心分離して間質血管細胞群の沈殿を得た。

　上記細胞の沈殿に間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を加え、当該細胞懸濁液を４００ｇで５分間遠心分離し、上清除去後に間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）に再懸濁し、フラスコに細胞を播種した。

　細胞を３７℃で数日間、５％ＣＯ_２中で培養した。数日後に培養物をＰＢＳで洗浄して、培養液中に含まれていた血球や脂肪組織の残存等を除去し、プラスチック容器に接着している間質細胞を得た。

　トリプシンを加え、細胞を剥離し、細胞を希釈したうえ、フラスコに播種し、間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を加え培養した。

脂肪組織由来間質細胞の凍結保存
　得られた脂肪組織由来間質細胞をトリプシンを用いて剥離し、遠沈管に移し、４００ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、細胞凍結保存液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（ゼノアック社））を適量加え懸濁した。当該細胞懸濁溶液を、クライオチューブに分注した後、フリーザー内で－８０度にて保存後、液体窒素上の気相に移し、保存を継続した。

脂肪組織由来間質細胞の融解
　３７℃の恒温槽で、凍結保存したクライオチューブを溶解させ遠沈管に移し、間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）で希釈した後、４００ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）に懸濁し、フラスコに播種した。数日後にトリプシンを加え、細胞を剥離し、継代培養を継続し、凍結保存した。疾患個体に対して投与する際には、後述の実施例で示す通りこの凍結細胞を融解し、適切な懸濁液に懸濁したものを本発明の虚血性疾患治療剤として用いた。

　すなわち、以下の実施例２～４では、処理した皮下脂肪組織を播種してから、２度目の凍結保存を行うまでに、計２継代、計３継代、または計４継代を伴う拡大培養を行って得られた脂肪組織由来間質細胞を使用した。

［実施例２］
投与細胞の調製
　実施例１において計４継代を伴う拡大培養をして保存した脂肪組織由来間質細胞を、ウォーターバス（３７℃）を用いて融解し、１０ｍＬのＤＭＥＭを入れた遠心管に移した。４００ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）に懸濁し、フラスコへ移し、６日間培養した。培地を除去し、ＳｔｅｍＰｒｏ　Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、５分間インキュベートし、細胞を剥離させ、遠心管に移した。遠心後、上清を除去し、ＤＭＥＭを添加後、細胞濃度を計数し、上清を除去後、ＰＢＳを添加し１．６７×１０^６細胞／ｍＬおよび５．５６×１０^６細胞／ｍＬに調整した。

モデルマウスの作製および治療効果
　ＢＡＬＢ／ｃマウスを２％イソフルラン吸入麻酔し、左鼠径部を切開し、左大腿動脈を露出させた。大腿動脈起因部を結紮し、さらに、膝窩動脈と伏在動脈の分岐部直前を結紮した。結紮後、大腿動脈を切除した。カナマイシン液を術部に添加後、切開した鼠径部を縫合し、下肢虚血モデルマウスを作製した。手術翌日に３か所（腓腹筋、薄筋、大腿四頭筋）へＰＢＳのみ（陰性対照）、３×１０^５細胞／１８０μＬまたは１×１０^６細胞／１８０μＬを各３匹のモデルマウスの虚血部位近傍にて筋肉内投与した。

　手術後７日目および１４日目の血流量を血流画像化装置ｍｏｏｒＦＬＰＩ（Ｍｏｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて後肢の血流量を測定した。血流の評価は、右肢に対する左肢の血流量の比で行った。その結果、用量依存的に血流量の改善が確認された（図１）。

［実施例３］
投与細胞の調製
　実施例１において計２継代または３継代を伴う拡大培養をして保存した脂肪組織由来間質細胞を、ウォーターバス（３７℃）を用いて融解し、遠心管に移し、間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を加えて全量を１３ｍＬとした。３８０ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、１２ｍＬ間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）に懸濁し、３ｍＬずつ４本のフラスコへ移し、４日間培養した。培地を除去し、ＳｔｅｍＰｒｏ　Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、５分間インキュベートし、細胞を剥離させ、遠心管に移した。遠心後、上清を除去し、間質細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を添加後、細胞濃度を計数し、上清を除去後、乳酸リンゲル液を添加し５．５６×１０^６細胞／ｍＬに調整した。

モデルマウスの作製および治療効果
　ＢＡＬＢ／ｃマウスを２％イソフルラン吸入麻酔し、左鼠径部を切開し、左大腿動脈を露出させた。大腿動脈起因部を結紮し、さらに、膝窩動脈と伏在動脈の分岐部直前を結紮した。結紮後、大腿動脈を切除した。カナマイシン液を術部に添加後、切開した鼠径部を縫合し、下肢虚血モデルマウスを作製した。手術翌日に３か所（腓腹筋、薄筋、大腿四頭筋）へ乳酸リンゲル液のみ（陰性対照）、１×１０^６細胞／１８０μＬを各５匹のモデルマウスの虚血部位近傍にて筋肉内投与した。

　手術後７日目および１４日目の血流量を血流画像化装置ｍｏｏｒＦＬＰＩを用いて後肢の血流超を測定した。血流の評価は、右肢に対する左肢の血流量の比で行った。その結果、継代数にかかわらず血流量の改善が確認された（図２Ａ）。さらに、手術後７日目および１４日目に虚血側肢の状態を観察し、次の基準でスコア化した。
　０：正常な外観
　１：爪の色の変化
　２：足趾の損傷
　３：足趾の脱落初期
　４：足趾以遠の脱落初期または下肢の損傷
　５：足首以遠の脱落または下肢損傷の拡大
その結果、細胞投与群ではスコアの悪化が抑制されることが確認された（図２Ｂ）。

［実施例４］
投与細胞の調製
　実施例１において計４継代を伴う拡大培養をして保存した脂肪組織由来間質細胞を、ウォーターバス（３７℃）を用いて融解し、遠心管に移し、ＰＢＳを加えて全量を１４ｍＬとした。４００ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を少し残して除去した後、細胞密度を計数し、８．３３×１０^５細胞／ｍＬまたは４．１７×１０^６細胞／ｍＬとなるようにＰＢＳを加え、投与液を調製した。

モデルウサギの作製および治療効果
　ＪＷウサギを３％イソフルラン吸入麻酔し、腹部を切開し、腹部大動脈から総腸骨動脈を露出させた。右総腸骨動脈を２ヶ所結紮し、その間の右総腸骨動脈を切除した。カナマイシン液を術部に添加後、切開した部分を縫合し、下肢虚血モデルウサギを作製した。手術翌日にＰＢＳのみ（陰性対照）、１×１０^６細胞／１２００μＬまたは５×１０^６細胞／１２００μＬを各３匹のモデルウサギの虚血側の大腿筋膜張筋付近の６箇所に筋肉内投与した。細胞は融解後、投与液の調製を行い３時間以内に投与した。

　手術後４日目、７日目および１４日目の血流量を、血流画像化装置ｍｏｏｒＦＬＰＩを用いて後肢の血流超を測定した。血流の評価は、左肢に対する右肢の血流量の比で行った。その結果、１４日目においていずれの投与量においても血流量の改善が確認された（図３Ａ）。さらに、１４日目の血流量を測定した後、放血致死させ、虚血側肢の骨格筋（大腿筋膜張筋および内転筋）を採取し、常法に従って切片を作製し、ＣＤ３１抗体を用いて免疫染色を行った。１ｍｍ^２当たりのＣＤ３１陽性細胞数を算出し、血管新生の評価を行ったところ、いずれの投与量においても内転筋においてＣＤ３１陽性細胞数が増加傾向を示した。（図３Ｂ）。

Claims (21)

1. 　凍結保存および融解を少なくとも２度行った脂肪組織由来間質細胞を含む、虚血性疾患治療剤。
2. 　末梢動脈疾患治療用である、請求項１に記載の虚血性疾患治療剤。
3. 　前記脂肪組織由来間質細胞が、被験体に対して同種異系である、請求項１または２に記載の虚血性疾患治療剤。
4. 　前記脂肪組織由来間質細胞が、ヒト脂肪組織由来間質細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
5. 　前記凍結保存および融解を少なくとも２度行うことが、以下の工程を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤；
   （１）脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、
   （２）当該融解した細胞を培養する工程、および
   （３）当該培養した細胞を凍結保存および融解する工程。
6. 　前記工程（３）での融解後、６時間以内に輸液製剤と混合して投与される、請求項５に記載の虚血性疾患治療剤。
7. 　前記混合が、脂肪組織由来間質細胞を含む凍結保存用の溶液と輸液製剤の混合によって行われる、請求項６に記載の虚血性疾患治療剤。
8. 　前記脂肪組織由来間質細胞が、４継代以下の脂肪組織由来間質細胞である、請求項１から７のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
9. 　前記凍結保存が、液体窒素上の気相で行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
10. 　前記凍結保存用の溶液が、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含む溶液である、請求項７から９のいずれか１項に記載の虚血性疾患治療剤。
11. 　（ｉ）採取した脂肪組織から分離した間質細胞を培養する工程、
    （ｉｉ）工程（ｉ）で得られた脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、並びに
    （ｉｉｉ）融解された脂肪組織由来間質細胞を凍結保存および融解する工程、
    を含む、脂肪組織由来間質細胞を含む虚血性疾患治療剤の製造方法。
12. 　前記虚血性疾患が、末梢動脈疾患である、請求項１１に記載の製造方法。
13. 　前記脂肪組織由来間質細胞が、被験体に対して同種異系である、請求項１１または１２に記載の製造方法。
14. 　前記脂肪組織由来間質細胞が、ヒト脂肪組織由来間質細胞である、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の製造方法。
15. （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で融解された脂肪組織由来間質細胞を輸液製剤と混合する工程をさらに含む、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の製造方法。
16. 　前記工程（ｉｉｉ）での融解後、６時間以内に前記工程（ｉｖ）を行う、請求項１５に記載の製造方法。
17. 　前記凍結保存が、凍結保存液を用いて行われ、工程（ｉｖ）が、融解された脂肪組織由来間質細胞を含む凍結保存液と輸液製剤とを混合する工程である、請求項１５または１６に記載の製造方法。
18. 　前記工程（ｉ）の培養が、少なくとも１継代行われる、請求項１１から１７のいずれか１項に記載の製造方法。
19. 　前記工程（ｉｉ）において、融解された脂肪組織由来間質細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１１から１８のいずれか１項に記載の製造方法。
20. 　前記凍結保存が、液体窒素上の気相で行われる、請求項１１から１９のいずれか１項に記載の製造方法。
21. 　前記凍結保存液が、ＤＭＳＯを含む溶液である、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の製造方法。

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