JP6615753B2 - 細胞療法のためのバイオマーカー - Google Patents

Description

本発明は、対象における炎症性状態の進行をモニタリングするための方法に関する。特定の実施形態では、患者は炎症性状態の処置を受けており、方法は疾患進行をモニタリングするため、例えば治療レジメンを最適化する臨床医を補助するために1つ又は複数のバイオマーカーのレベルをモニタリングする工程を含む。特定の実施形態では、対象は間葉系幹細胞(MSC)での処置を受けている。特定の実施形態では、本発明は、例えば細胞のさらなる用量を投与するための適切な時期を判定することにおいて臨床医を補助するために、OA等の軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態を有する患者の自己又は同種細胞療法の有効性をモニタリングする方法に関する。本発明は、方法における使用のためのキット及び成分も提供する。

炎症及び炎症性状態は、一般集団において、より一層具体的には、慢性炎症性状態が可動性についての進行性の衰弱及び変性並びに疼痛を示す場合がある加齢集団において、重大な健康問題を示している。炎症は、物理的、化学的又は生物学的薬剤によって生じる損傷又は異常な刺激への応答として現れる場合がある。用語「炎症性」は、障害に関連して使用される場合、不適当である若しくは通常の様式で解決しない炎症によって引き起こされる、そのような炎症から生じる、又はそのような炎症を生じる、病理学的過程を指す。炎症性障害は、全身性又は特定の組織若しくは器官に局在する場合がある。

変形性関節症(OA)は、突発性、不治の慢性及び衰弱性の筋骨格疾患であり、オーストラリアにおいて140万人を超える人々によって報告されている。OA発症は、加齢に最も密接に関連しており、鍵となる所見は軟骨変化及び疼痛である。それは、古典的に非炎症性疾患と称されるが、炎症がOA疾患進行において主要な役割を演じていることが次第に明らかになっている。OAを有する患者は、典型的にはOA症状を緩和し、罹患した関節での疼痛を制御するために非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)及び鎮痛剤で管理される。現在、NSAID及び副腎皮質ステロイド療法ももはや有益でない場合、通常の処置は全関節形成術である。これは、30〜60歳の患者に顕著な問題を有する。多くの整形外科医は、インプラントが彼らの生涯にわたっては持ちこたえないと考えられることから、50歳未満の人々に関節置換を実施することを躊躇する。

近年、医学研究において種々の疾患に対する革新的な再生処置への転換がある。関節炎等の関節疾患では、多数の研究グループが有望な再生医療としての成体間葉系幹細胞(MSC)の使用を探究するためにOAの動物モデルを使用している。急性及び慢性軟骨傷害の動物モデルではMSCでの処置は、半月板及び硝子軟骨再生並びにOA様疾患進行、軟骨減少、骨棘形成及び肋軟骨下肥厚における低減を生じる。これらの細胞は、生理活性因子の分泌を通じて顕著な抗炎症性及び免疫調節性効果を有することも実証された。脂肪組織は、骨髄よりも1グラムあたりで500〜1000倍のMSCを含有することから、治療目的のための細胞の特に魅力的な供給源である。MSCの豊富さと併せて、脂肪組織は、間質性血管画分(SVF)と集合的に称される免疫細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞及び周皮細胞も含む。標準的脂肪吸引技術を通じて多量の脂肪組織を得るための能力、及びSVFを迅速に単離する能力は、臨床での同日細胞療法手順を可能にする。

例えば、国際特許出願第PCT/AU2009/001070号(WO2010/020005)、表題「Therapeutic methods using adipose tissue-derived cell suspensions comprising adipocytes」、及びオーストラリア特許出願第2009201915号は、両方の内容は相互参照により本明細書に組み込まれ、OAを含む筋骨格状態の処置のための自己脂肪由来細胞療法を記載している。

オーストラリア特許出願第2013204930号、表題「Therapeutics using multiple injections of cells」は、自己脂肪組織由来細胞懸濁液が、単一用量と比較して改善された治療結果を提供するための一連の計画された注射としてのその後の投与のために、凍結され、回復されうることが驚くべきことに確認されたと記載している。そこには、驚くべきことに、そのような凍結細胞が凍結保存から回復された後に細胞を培養する必要なく使用できることが記載された。AU2013204930に記載のとおり、これは、本発明者らが、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を対象に与えることによって、変形性関節症、及び疼痛を含む種々の他の状態を処置する改善された方法であって、第1の用量が新鮮調製細胞懸濁液の一部を含み、その後の1つ又は複数の用量が凍結保存された細胞懸濁液の一部を含む方法を開発することを可能にした。

国際特許出願第PCT/AU2009/001070号(WO2010/020005)、表題「Therapeutic methods using adipose tissue-derived cell suspensions comprising adipocytes」 オーストラリア特許出願第2009201915号 オーストラリア特許出願第2013204930号、表題「Therapeutics using multiple injections of cells」 PCT/AU2012/001140 (WO2013/040649)、表題「Therapeutics using adipose cells and cell secretions」 PCT/AU2012/000272 (WO2012/122603)、表題「Cell processing method and device」

Clinical Immunology (Stites & Terr編、第7版1991) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology、volume 37 (Asai編 1993) Alexanderら Exp Neurol. 2012 August; 236(2): 351〜362頁 V.B. Krausら / Osteoarthritis and Cartilage 19 (2011) Blaber SP、Webster RA、Hill CJら. Analysis of in vitro secretion profiles from adipose-derived cell populations. J Transl Med 2012;10:172〜88頁 J Orthop Res. 2013 Jul;31(7):999から1006頁. doi: 10.1002/jor.22324. Epub 2013 Feb 19, Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in knee osteoarthritis: a novel diagnostic and prognostic biomarker

炎症性状態、OA及び関連する障害並びに軟骨傷害又は変性が関与する他の状態を有する患者の処置を補助するための追加的方法に対する必要性が依然として残っている。

本発明者は、患者における炎症性状態の進行を判定することについて治療医を補助する、例えば患者に治療量、例えばMSC又は自己若しくは同種細胞懸濁液であってよい脂肪組織由来細胞懸濁液の用量を、患者に投与する適切な時期についての判断を導くことを補助する方法、具体的には、疼痛スコア又は不快レベルの自己報告等の患者自身の状態の患者の主観的評価とは無関係な方法を有することは、治療医に有益であることを認識した。

本明細書に記載の方法は、炎症性状態の進行を評価し、炎症によって特徴付けられる状態の間葉系細胞に基づく療法のために適切な処置時間を確認することを補助するためのバイオマーカーの使用のために提供される。本発明者は、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)がOA、神経変性疾患及び潰瘍性大腸炎等の炎症性状態に対する間葉系幹細胞処置を受けている患者の血清において検出可能であること、並びに検出可能なMIFのレベルが炎症性状態の安定化又は改善等の処置結果と相関することを確認した。OAの処置において本明細書において例示される特定の例では、検出可能なMIFのレベルは軟骨劣化の低減等の処置結果と相関する。MIFは、損傷された組織の劣化を刺激する炎症性サイトカインである。

本発明者は、CTX-II、II型コラーゲンのC末端テロペプチドが、OAに対する処置を受けている患者の血清において及び尿において検出可能であり、検出可能なCTX-IIのレベルが軟骨劣化と相関することも確認した。MIFの血清レベルは、MSC処置後に観察される組織劣化の低減と相関し、例えばOAにおいて血清MIFの低減は、軟骨劣化のマーカーである尿中CTX IIの低減と相関する。

本発明者は、COMPがOAと良く相関する追加的な軟骨特異的ブレークダウン産生物であることも確認した。それは、疾患の進行の際に(血清において)増加する。CTXと同様に、本明細書の例は、このマーカーの、処置後の安定化又はわずかな減少を実証する。

したがって本発明の一態様では、炎症性状態を有する患者において疾患進行をモニタリングするための方法であって、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を含み、前記第1の生物学的試料と比較した前記第2の生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルにおける変化が疾患進行の指標である、方法が提供される。この用語において、疾患進行は、悪化した、安定化した又は改善した状態であってよい。

一実施形態では、第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルにおける増加は炎症性状態の病理学的進行又は悪化の指標である。一実施形態では第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルにおける減少は炎症性状態の安定化又は改善の指標である。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、前記対象に間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液を投与する工程を含み、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を更に含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を前記対象に与える工程を含み、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を更に含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、方法が、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を前記対象に与える工程を含み、第1の用量が新鮮調製細胞懸濁液の一部を含み、その後の1つ又は複数の用量が凍結保存されていた前記細胞懸濁液の一部を含み、方法が、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を更に含む、方法が提供される。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、方法が、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を前記対象に与える工程を含み、すべての用量が凍結保存されていた細胞懸濁液を含み、方法が、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を更に含む、方法が提供される。

さらなる態様では、本発明は、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程であり、第1の用量は新鮮調製細胞懸濁液の一部を含む、工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程であり、第1の生物学的試料は前記処置の開始前の前記患者からのベースライン試料であり、第2の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者からの試料である、工程と、バイオマーカーMIFのレベルが第1の試料と比較して第2の試料においておよそ同じである場合、自己脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、さらなる用量は処置の開始時に患者に投与された細胞懸濁液の一部を含み、該一部が使用前に凍結保存されている、工程とを含む方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程であり、第1の生物学的試料は前記処置の開始前の前記患者からのベースライン試料であり、第2の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者からの試料である、工程と、バイオマーカーMIFのレベルが第1の試料と比較して第2の試料においておよそ同じである場合、同種脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、細胞懸濁液のすべての用量は使用前に凍結保存されている、工程とを含む方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程であり、第1の用量が新鮮調製細胞懸濁液の一部を含む、工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程であり、第1の及び第2の両方の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者から得られたものである、工程と、第1の試料と比較して第2の試料においてバイオマーカーMIFのレベルにおける増加が判定された場合、自己脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、さらなる用量は処置の開始時に患者に投与された細胞懸濁液の一部を含み、該一部が使用前に凍結保存されている、工程とを含む方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程であり、第1の及び第2の両方の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者からである、工程と、第1の試料と比較して第2の試料においてバイオマーカーMIFのレベルにおける増加が判定された場合、同種脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、細胞懸濁液のすべての用量は使用前に凍結保存されている、工程とを含む方法を提供する。

一実施形態では、MSCは、自己細胞、同種細胞、臍帯血細胞、及び増殖臍帯血細胞、又はこれらの混合物から選択される。

一実施形態では、炎症性状態は、軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる又は関連する状態である。一実施形態では、炎症性状態は変形性関節症、関節リウマチ及び炎症性腸疾患からなる群から選択される。一実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。

一実施形態では、炎症性状態をモニタリングする又は処置する方法は、炎症性状態がOA又は軟骨傷害若しくは変性によって特徴付けられる若しくは関連する状態から選択され、前記1つ又は複数の生物学的試料におけるCTX-II及びCOMPから選択される少なくとも第2のバイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含む。

さらなる態様では、本発明は、軟骨傷害又は変性等の炎症及び組織劣化によって特徴付けられる状態を有する患者における疾患進行をモニタリングするための方法であって、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定する工程を含み、前記第1の生物学的試料と比較した前記第2の生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルにおける変化が疾患進行の指標である、方法を提供する。この用語において、疾患進行は、悪化した、安定化した又は改善した状態であってよい。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液を前記対象に投与する工程を含み、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を前記対象に与える工程を含み、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含む方法が提供される。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、方法が、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を前記対象に与える工程を含み、第1の用量が新鮮調製細胞懸濁液の一部を含み、その後の1つ又は複数の用量が凍結保存されていた前記細胞懸濁液の一部を含み、方法が、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含む、方法が提供される。

本発明のさらなる態様では、処置を必要とする対象における軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態を処置する方法であって、方法が、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置を前記対象に与える工程を含み、すべての用量が凍結保存されていた細胞懸濁液を含み、方法が、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含む方法が提供される。

一実施形態では、第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルにおける増加は、状態の病理学的進行又は悪化の指標である。一実施形態では、第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルにおける減少は、状態の安定化又は改善の指標である。

一実施形態では、細胞懸濁液が同種細胞懸濁液である場合、患者はネコ、イヌ又はウマ等の非ヒト動物である。

一実施形態では、軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態は、慢性状態である。一実施形態では、軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態は、関節炎である。一実施形態では、軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態は、変形性関節症(OA)又は関節リウマチ(RA)である。

一実施形態では、軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態は、軟骨への損傷又は外傷等の急性状態である。

一実施形態では、方法は、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFの2つ以上のレベルを判定する工程を含む。

一実施形態では、方法は、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFのレベルを判定する工程を含む。

第1の及び第2の生物学的試料は、回収の時期で分けられた患者からの任意の2つの試料であってよい。一実施形態では、第1の生物学的試料は、状態の処置の開始前の前記患者からのベースライン試料である。一実施形態では、第2の生物学的試料は、状態の処置の開始後の前記患者からの試料である。一実施形態では、第2の生物学的試料は、状態の処置の開始1週間から12ヵ月後の前記患者からの試料である。一実施形態では、第1の及び第2の両方の生物学的試料は、処置の開始後の患者からの試料である。

一実施形態では、第1の生物学的試料は前記状態の処置の開始前の前記患者からの試料であり、第2の生物学的試料は処置の開始後の前記患者からの試料であり、前記第1の及び前記第2の試料における前記少なくとも1つのバイオマーカーの判定されたレベルがおよそ同じである場合、細胞懸濁液のさらなる用量を投与する。

一実施形態では、方法は、前記患者からの第3の、第4の、第5の等の生物学的試料等の追加的生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含み、前記生物学的試料のそれぞれは、状態の処置の開始前及び又は後の異なる時期に前記患者から得られたものである。例えば、第1の生物学的試料は状態の処置の開始前の前記患者からの試料であってよく、第2及びその後の生物学的試料は状態の処置の開始後およそ1ヵ月間隔での前記患者からの1つ又は複数の試料であってよい。

一実施形態では、生物学的試料は血清である。一実施形態では、生物学的試料は尿である。一実施形態では、バイオマーカーはCTX-IIであり、生物学的試料は尿又は血清である。一実施形態では、バイオマーカーはMIFであり、生物学的試料は血清である。一実施形態では、バイオマーカーはCOMPであり、生物学的試料は血清である。

一実施形態では、処置の方法は、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程であり、第1の用量は新鮮調製細胞懸濁液の一部を含む、工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数のレベルを判定する工程であり、第1の生物学的試料は前記処置の開始前の前記患者からのベースライン試料であり、第2の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者からの試料である、工程と、バイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの少なくとも1つのレベルが第1の試料と比較して第2の試料においておよそ同じである場合、自己脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、さらなる用量は処置の開始時に患者に投与された細胞懸濁液の一部を含み、該一部は使用前に凍結保存されている、工程とを含む。

一実施形態では、処置の方法は、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数のレベルを判定する工程であり、第1の生物学的試料は前記処置の開始前の前記患者からのベースライン試料であり、第2の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者からの試料である、工程と、バイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの少なくとも1つのレベルが第1の試料と比較して第2の試料においておよそ同じである場合、同種脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、細胞懸濁液のすべての用量は使用前に凍結保存されている、工程とを含む。

一実施形態では、処置の方法は、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程であり、第1の用量は新鮮調製細胞懸濁液の一部を含む、工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数のレベルを判定する工程であり、第1の及び第2の両方の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者から得られる、工程と、バイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの少なくとも1つのレベルにおける増加が第1の試料と比較して第2の試料において判定される場合、自己脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、さらなる用量は処置の開始時に患者に投与された細胞懸濁液の一部を含み、該一部は使用前に凍結保存されている、工程とを含む。

一実施形態では、処置の方法は、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量を前記患者に投与する工程と、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数のレベルを判定する工程であり、第1の及び第2の両方の生物学的試料は前記第1の用量後の前記患者由来である、工程と、バイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの少なくとも1つのレベルにおける増加が第1の試料と比較して第2の試料において判定される場合、同種脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与する工程であり、細胞懸濁液のすべての用量は使用前に凍結保存されている、工程とを含む。

一実施形態では、患者はヒトでである場合、本発明の方法は、医師によって、又は医師の監督の下で一名若しくは複数名によって、又はその組合せによって実施される。

一実施形態では、患者がヒトである場合、方法のすべての工程は、前記方法全体を通じて前記対象の臨床診療に主な責任を有する登録医師によって又はその監督の下で実施される。

一実施形態では、方法の1つ又は複数の工程は、前記医師の監督の下で一名若しくは複数名によって行われる。一実施形態では、方法の集団的工程は、複数の個人によって実施される。

一実施形態では、方法の集団的工程は、複数の場所で実施される。一実施形態では、前記対象から生物学的試料を得る工程は、用量を投与する1つ又は複数の工程、アッセイのために生物学的試料を調製する工程、又は少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定する工程とは異なる場所で行われる。

以上に記載の本発明の概要は限定的なものではなく、本発明の他の特性及び利点は、好ましい実施形態についての以下の詳細な記載から、及び特許請求の範囲から明らかである。

治験全体を通じたプラセボ及び処置群についてのICOAP総疼痛スコアを示すグラフである。データは、平均±平均値の標準誤差(SEM)として表される。 治験参加者の検査膝での軟骨傷害のベースラインQMetrics MRI評価を示すグラフである。 治験参加者の尿において測定したクレアチニン補正CTX-IIレベルを示すグラフである。データは、平均±平均値の標準誤差(SEM)として表される。 ベースライン及び6ヵ月時での治験参加者における循環血清MIFレベルを示すグラフである。データは、log₂蛍光値の平均±SEMとして表される。 処置(A)及びプラセボ(B)群におけるベースラインMRI由来OA等級によるCTX-IIデータの層別化を示すグラフである。データは、平均±平均値の標準誤差(SEM)として表される。 神経変性疾患を有する2名の少年での2011年の第2のMSC処置前のベースラインMIFレベル並びに、処置後2ヵ月及び5ヵ月でのMIFを示すグラフである。 神経変性疾患を有する2名の少年のMSCでの処置後の治療専門家による評価の結果を示すグラフであり、種々の神経学的及び身体的作業について記録された彼らのスコアを示している。 ベースライン及び処置後4ヵ月までのHiQCell患者での循環血清MIFレベルを示すグラフである。規格化したマクロファージ遊走阻止因子(MIF)。プロットでのy値は、混合効果モデルからの予測log2(Val)である。ボックスプロット上に描いた線は、混合モデルのオフセット-1.388及びスロープ-0.06848から判定された。統計的にスロープは、p値0.001を有して0から有意に異なっている。混合直鎖状モデルが使用され、ここでは、患者IDがレベル11で変量効果を、時間がレベル8で固定効果を形成した。Valは、MIFアッセイ読み値:log2(Val)〜Time+(1|ID)を表している。 ベースライン及び処置後4ヵ月までのHiQCell共同レジストリ参加者のクレアチニン補正尿中CTXレベルのボックスプロットを示すグラフである。経時的傾向混合モデルから規格化したCTX。プロットでのy値は、混合効果モデルからの予測log2(Val)である。ボックスプロット上に描いた線は、混合モデルのオフセット-1.173及びスロープ0.01265から判定された。統計的に、スロープは、p値0.983を有して0から有意に異なっていない。混合直鎖状モデルが使用され、ここでは、患者IDがレベル12で変量効果を、時間がレベル8で固定係数を形成した。Valは、ELISA吸光度読み値:log2(Val)〜Time+(1|ID)を表している。 ベースライン及び処置後4ヵ月までのHiQCell共同レジストリ参加者の血清COMPレベルのボックスプロットを示すグラフである。経時的傾向混合モデルから規格化したCOMP。プロットでのy値は、混合効果モデルからの予測log2(Val)である。統計的に、スロープは、p値0.285を有して0から有意に異なっていない。混合直鎖状モデルが使用され、ここでは、患者IDがレベル12で変量効果を、レベル8で固定係数を形成した。Valは、ELISA吸光度読み値:log2(Val)〜Time+(1|ID)を表している。 潰瘍性大腸炎を有する2名の成人での2014年のMSC処置前のベースライン血清MIFレベル並びに、治療後6週間及び12週間でのMIFを示すグラフである。潰瘍性大腸炎を有する2名の成人は、2013年に培養増殖同種臍帯血由来MSCで一度処置された。細胞は、静脈内に投与された。

略称
本明細書において使用されるSVFは、間質性血管画分(stromal vascular fraction)に対する略称である。

本明細書において使用されるCTX-IIは、II型コラーゲンのC-テロペプチドに対する略称である。

本明細書において使用されるMIFは、マクロファージ遊走阻止因子(macrophage migration inhibitory factor)に対する略称である。

本明細書において使用されるOAは、変形性関節症(osteoarthritis)に対する略称である。

本明細書において使用されるRAは、関節リウマチ(rheumatoid arthritis)に対する略称である。

本明細書において使用されるNSAIDは、非ステロイド性抗炎症薬物(non-steroidal anti-inflammatory drugs)に対する略称である。

本明細書において使用されるICOAPは、間欠的及び継続的変形性関節症疼痛(Intermittent and Continuous Osteoarthritis Pain)に対する略称である。

本明細書において使用されるOSCARSは、変形性関節症幹細胞先進調査研究(Osteoarthritis Stem Cell Advanced Research Study)に対する略称である。

本明細書において使用されるOARSIは、国際変形性関節症研究学会(Osteoarthritis Research Society International)に対する略称である。

本明細書において使用されるMSCは、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)に対する略称である。

本明細書において使用されるCOMPは、軟骨オリゴマー基質タンパク質(cartilage oligomeric matrix protein)に対する略称である。

本明細書において使用されるHSCは、造血幹細胞(Hematopoeitic Stem Cell)に対する略称である。

定義
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、凍結保存剤等の本発明に関連する種々の成分の文脈では、ヒト対象への投与に好適である成分だけでなく、非ヒト哺乳動物対象への投与に好適であるものも包含することが意図される。特定の実施形態では、薬学的に許容される成分は、非ヒト哺乳動物対象への投与のために好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される成分は、ヒト対象への投与のために好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容される成分は、非ヒト哺乳動物対象へ及びヒト対象への投与のために好適である。

文脈がそうでないとを示す場合を除いて、用語障害、状態及び疾患は、本明細書において一般に互換的に使用される。

用語「処置する」、「処置」、「療法」等は、本明細書の文脈では、炎症若しくは炎症性状態、又は変形性関節症、又は軟骨傷害若しくは変性に関連する若しくは特徴付けられる状態、又は腱損傷若しくは疼痛等の、状態又は疾患の症状及び/又は根本原因の緩和を指す。ある特定の実施形態では、処置は、障害の進行又は障害若しくは損傷の症状を遅らせる、遅延させる又は停止する、或いは障害又は損傷の進行を少なくとも一時的に逆戻りさせる。それにより本発明の文脈では、単語「処置」又は「処置する」等のその派生語は、療法への適用に関連して使用される場合、処置される状態に伴う疼痛の緩和、処置される状態の重症度の緩和、処置される状態の1つ又は複数の症状における改善等の療法のすべての態様を含む。単語「処置」又はその派生語の使用は、「処置される」対象が前述の利益の任意の1つ又は複数を経験する場合があることを意味することが理解される。

本明細書全体を通じて、「1つ(a)」又は「1つ(one)」の要素への言及は、文脈が他を定める場合を除いて複数を排除しない。同様に「実施形態(an embodiment)」への言及は、文脈が他を定める場合を除いて、記載される1つ又は複数の他の実施形態との組合せで適用される記載の実施形態の特徴を排除しない。

本明細書で使用される用語「治療有効量」は、その意味に無毒性だが、望ましい治療効果を提供するための本発明における使用のための化合物又は組成物の十分な量を含む。必要とされる正確な量は、処置される種、対象の年齢及び全身状態、併存症、処置される状態の重症度、投与される特定の薬剤及び投与の様式その他等の要因に応じて対象によって変化する。したがって、いかなる場合であっても、適切な「有効量」は、ルーティン法のみを使用して当業者によって決定されうる。

本明細書の文脈では用語「含んでいる(comprising)」は、含んでいることを意味するが、それだけを含んでいる必要はない。更に、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等の単語「含んでいる(comprising)」の変化形は、それに対応して変化した意味を有する。したがって用語「含んでいる(comprising)」及びその変化形は、整数Aを含んでいる又は整数A及びBを含んでいる等として記載されている組成物、方法等に追加的な整数又は特性が任意選択で存在する場合があるように排他的よりむしろ包括的意味で使用される。

本明細書の文脈では用語「約(about)」及び「およそ(approximately)」は、当業者が所与の値に関連付ける通常の許容度を示すとして理解される。

本明細書の文脈では、パラメーターについて範囲が述べられる場合、パラメーターは述べられた範囲の終点を含む述べられた範囲内のすべての値を含むと理解される。例えば範囲「5から10」は、5.5、6.5、7.5、5.5から8.5及び6.5から9等の述べられた範囲の文脈で合理的である整数間の任意の値及び範囲を含んで、値5、6、7、8、9及び10、並びに、6から10、7から10、6から9、7から9等の部分的な範囲を含む等の述べられた範囲内のいかなる部分的な範囲も含むと理解される。例えば「10%から30%」の範囲は、10.5%、15.5%、25.5%等の述べられた範囲の文脈で合理的である整数間の任意の値及び範囲を含んで、値10%、11%、12%、13%、及び30%を含むそれまでのすべての整数、並びに10%から15%、12%から18%、20%から30%等の部分的な範囲を含む等の述べられた範囲内のいかなる部分的な範囲も含むと理解される。

本明細書の文脈では用語「複数の(plurality)」及び「多重の(multiple)」は、1を超える任意の数を意味する。

処置又は療法における本発明の方法及び組成物の使用の本明細書での言及が、ヒト及び、獣医学的等の非ヒトでの適用に適用可能であると理解されることに留意されたい。そのため、そうでないことが示される場合を除いて、患者、対象又は個体への言及が、ヒト、又は、これらだけに限らないが、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類、げっ歯類に分類されるメンバー、特にヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ及びイヌ等に分類される飼い慣らされた又は飼育されたメンバーを含む社会的、経済的、農業的又は研究用に重要な任意の種の個体等の非ヒトを意味することが理解される。

本発明の種々の実施形態又は態様の例が本明細書に記載される場合、それらは概して「等(such as)」又は「例えば(for example)」又は「含む(including)」を含む適切な用語を前置きされる。例が、例えば例示又は理解の目的のために、文脈がそうではないことを示す場合を除いて、限定として提供されることなく包括的な可能性として記載されることが理解される。

本明細書で言及する医薬組成物は、治療的使用を目的とする場合等、医薬品とも称される場合がある。そのため意図する治療目的のための医薬組成物の調製のために記載の成分の組成物の使用を含むとして本発明が記載される場合、文脈がそうでないことを示す場合を除いて、記載が意図する治療目的のための医薬品の調製のための使用を同等に意味することが理解される。

許容される程度まで、本明細書に引用するすべての参考文献はその全体が参照により組み込まれる。

本明細書における文献の任意の記載又はそれらの文献に由来する若しくは基づく本明細書の記述は、文献又はそれに由来する記述が、オーストラリア又は他所における関連技術分野の一般的知識の一部であることを承認するものではない。

実施形態の説明
神経変性疾患、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、クローン病及び多発性硬化症を含む自己免疫疾患並びに他の慢性炎症性状態等の炎症性状態の、MSCを含む自己又は同種細胞懸濁液の投与による処置のための公知の方法では、治療医は、疼痛、神経学的機能、可動性、内視鏡検査、生検の組織学的検査及び画像等の種々の要因に基づいて治療量を投与する適切な時期の評価を行う。しかし、これらの方法のそれぞれは、欠点を有し、多くの場合、目に見えるほどの症状の変化の前に顕著な組織傷害が生じる。いくつかの場合では、内視鏡及び生検の組織学的検査等の評価ツールは、侵襲性である。他の場合では、患者は、治療医を導くような症状の的確な評価を提供できない場合がある。バイオマーカーは、傷害の程度を分子レベルで定量することによって、画像化及び他の評価ツールに強力な補助を提供できる。本発明者は、画像化及び他の評価技術がそれを的確に反映できるようになる前にバイオマーカー分析が疾患状況の初期段階診断を可能にすることを期待している。

OA、RA並びに他の慢性状態及び急性軟骨損傷等の軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態の、自己又は同種脂肪組織由来細胞懸濁液の投与による処置のための公知の方法では、治療医は、疼痛及び可動性及び画像等の種々の要因に基づいて治療量を投与する適切な時期の評価を行う。しかし、これらの方法のそれぞれは、欠点を有する。例えば磁気共鳴画像法(MRI)による画像化による等の罹患した関節の物理的状態に基づく評価は、高価であり、十分な専門知識及び又はインフラが容易には利用できない場合に時間がかかる可能性がある。疼痛スコア又は可動性の自己報告等、評価が主観的尺度に基づく場合、困難が生じる場合がある。例えば、自己報告された疼痛及び生活の質スコアは、実際の組織傷害と必ずしも十分に相関しない、すなわちOAではそれらは軟骨傷害の程度と十分に相関しない場合がある。X線及びMRIを含む、関節を画像化する多くの方法があるが、これらそれぞれは組織傷害の程度の非常に詳細な像を提供することにおいては不完全である。バイオマーカーは、傷害の程度を分子レベルで定量することによって、画像化及び疼痛スコアに強力な補助を提供できる。本発明者らは、画像化技術がそれを的確に反映できるようになる前にバイオマーカー分析が疾患状況の初期段階診断を可能にすることを期待している。

更に、疼痛及び可動性に伴う課題の1つは、患者がこれらの系を報告するまでに、疾患が進行し、関節におけるさらなる傷害が生じることである。症状の発症の前に処置することによって、疾患の進行は停止又は遅くされうる。他の炎症性状態についても同じである。

後者の評価形態に潜在しているのは、さらなる用量を投与する決定が行われる前に、患者の状態が悪化している又は少なくとも彼らの不快レベルが増加している又は彼らの可動性が、更に悪化していることである。個々の患者に特異的な任意の評価形態への代替として、一連の処置は、前回の用量から一定期間が経過した後、例えば3ヵ月後又は6ヵ月後にさらなる用量が投与される等の定期的な投与に基づくものであってよい。単純な時間に基づく評価の欠点は、劣化又は炎症のレベルが体重、運動レベル及び運動の種類等の多くの事柄に依存することを含む、個々の特定の環境に特異的な関連を有さない場合があることである。

本発明者は、MIFが炎症性状態を有する患者からの血清において検出可能であり、検出可能なレベルが炎症又は状態の臨床的進行に対するマーカーとして作用できることを確認した。したがって、炎症性状態が悪化するとMIFの検出可能なレベルは増加し、一方、状態が改善すると検出可能なレベルは低下する。結果として、炎症性状態を有する患者において疾患進行をモニタリングするための方法であって、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を含み、前記第1の生物学的試料と比較した前記第2の生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルにおける変化が疾患進行の指標である、方法が、本明細書に記載される。

疾患進行をモニタリングするためのこの能力は、炎症性状態を有する患者のための治療レジメンを改善する又は最適化するために臨床医を補助することにおいても有用性を見出す。例えば本発明は、前記処置を必要とする対象における炎症性状態を処置する方法であって、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液を前記対象に投与する工程を含み、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を更に含む方法を提供する。

本発明者は、OA及び他の筋骨格状態について処置されている患者から軟骨特異的コラーゲン断片(II型コラーゲンのC-テロペプチド;CTX-II)が尿中、血清中で検出可能であること、COMPが血清中で検出可能であること、及びマクロファージ遊走阻止因子(MIF)が血清中で検出可能であることも確認した。特に、本明細書に記載のとおり、ベースライン(すなわち処置前)と6ヵ月の間でCTX-IIレベルは処置群で減少していたが、プラセボ群では有意に増加していた。MIF、軟骨劣化経路に関与する鍵となるサイトカイン、の血清レベルでの有意な低減が処置群において観察された。したがって本発明者は、患者からの生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数の検出が、自己脂肪組織由来細胞懸濁液の用量を投与するために適切な又は最適な時期を判定することにおいて治療医を補助するために使用されうることを本明細書に記載する。これらのバイオマーカーが、処置される軟骨の病態における変化の指標であると本発明者らによって仮定されていることから、本明細書で開示の方法は、RA等の軟骨傷害又は変性並びに他の慢性状態及び急性軟骨損傷によって特徴付けられる他の状態の処置への適用も有する。

本明細書の実施例は本発明の方法が、培養増殖同種臍帯血由来MSC由来等の間葉系幹細胞、又は自己細胞懸濁液が治療剤である場合に適切であることを実証しているが、その内容が参照により本明細書に組み込まれるPCT/AU2009/001070(WO2010/020005)、表題「Therapeutic methods using adipose tissue derived cell suspension comprising adipocytes」は、同種細胞懸濁液がそのような状態を処置するためにも使用されることを実証している。したがって本明細書において本発明の方法は、同種脂肪組織由来細胞懸濁液を使用する患者の適切な処置を補助することにも適用を有する。

第1の及び第2の生物学的試料は、回収の時期で分けられた患者からの任意の2つの試料であってよい。「第1の」及び「第2の」への言及は、それらが患者から回収された経時的に第1の及び第2の試料であることを意図せず、それらは「第2の」が「第1の」試料の後に得られた、異なる時期に患者から得られた単に2つの試料である。したがって追加的試料はバイオマーカーのレベルが判定される「第1の」及び「第2の」試料と称される試料の前、後又は間の任意の時期に患者から得られていてよいことが理解される。任意の又はすべての追加的試料もバイオマーカーレベルについて分析されてよい。

例えば第1の生物学的試料におけるバイオマーカーのレベルを判定することへの言及は、例えばバイオマーカーの1つが血清中で判定される必要がある又は望ましく、同じ時点の試料で判定される他の生物学的マーカーが尿試料中で判定される必要がある又は望ましい場合、同じ時点で取られた2つの試料におけるレベルを判定することを意味する場合があることも理解される。文脈を更に例示するために、方法はMIF及びCTX-IIのレベルを、例えば第1の生物学的試料において判定することを含んでよい。MIFのレベルが血清試料を使用して判定され、CTX-IIのレベルが尿試料を使用して判定される場合、血清及び尿試料は同じ時点で得られ、そのためこの文脈ではそれらは、集合的に第1の生物学的試料を表す。そのため生物学的試料は、同じ時点で患者から得られた種類の異なる2つの試料(例えば1つは尿及び1つは血清)からなる場合がある。第1の生物学的試料に関して例示及び説明されるが、同じことが任意の他の数字の試料に等しく適用される。

第1の生物学的試料は、処置の開始前に患者から得られた試料であってよい。そのような試料は、ベースライン試料とも称される場合がある。実際に、この試料は、処置の開始と同じ日に得られてよく、実際に、バイオマーカーの検出可能なレベルが処置の第1の用量の投与によってすぐには影響されないと予期されることから処置の第1の用量の投与後すぐに得られてもよい。それにより、処置用量から約24時間以内に検出可能な処置前レベルから変化しないことが公知であるバイオマーカーについて、処置の開始「前」に患者から得られた第1の又はベースライン生物学的試料への言及が、処置の初回用量の投与後約24時間以内に前記患者から得られた生物学的試料も包含することが理解される。

第1の生物学的試料は、炎症性状態の処置の開始後の患者からの試料であってよい。例示的な実施形態では、例えば、第1の生物学的試料は処置の開始後およそ1ヵ月の患者からの試料であってよく、第2の生物学的試料は処置の開始後およそ3、4、5又は6ヵ月の患者からの試料であってよい。このシナリオでは、治療量の結果としての患者の状態における改善は、処置前又はベースラインレベルと比較した第1の処置後試料におけるMIFのレベルの減少に反映される場合があり、第1の処置後試料と比較したMIFの第2の処置後レベルにおける増加は、根底にある状態の悪化を示している場合がある。このように医師は、例えば状態の初期の改善又は安定化後に炎症性状態の退行又は悪化をモニタリングするために本発明の方法を用いることができる。結果として、治療医は、MSC、又は脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液、又は脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与することが適切であると判定できる。典型的には、さらなる用量は、処置の開始時に患者に投与された脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の一部であり、該一部は使用まで凍結保存されていたものである。

このように方法は、個々の患者における炎症性状態の進行を特徴付ける客観的尺度を医師に提供する。方法は、患者若しくは罹患した関節の可動性の増加若しくは減少、患者によって報告された疼痛スコアの増加若しくは減少、又は超音波若しくはMRIによる分析、患者の認知能力における変化、又は患者の腹部不快感における変化等の、MSC又は細胞懸濁液の第2の若しくはその後の用量を投与する適切な時期を判定するために患者の炎症性状態の状況を評価するための医師に利用可能な他の尺度と併せて使用されてよい。具体的な追加的基準は、炎症性状態の根底にある性質に依存する場合がある。

例示的な実施形態では、例えば第1の生物学的試料は処置の開始後およそ1ヵ月の患者からの試料であってよく、第2の生物学的試料は処置の開始後およそ3、4、5又は6ヵ月の患者からの試料であってよい。このシナリオでは、投薬の結果としての患者の状態における改善は、処置前又はベースラインレベルと比較した第1の処置後試料におけるバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数のレベルの減少に反映される場合があり、第1の処置後試料と比較したバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの1つ又は複数の第2の処置後レベルの増加は、根底にある状態の悪化を示している場合がある。このように医師は、例えば状態の初期の改善又は安定化後に状態の退行又は悪化をモニタリングするために本発明の方法を用いることができる。結果として、治療医は、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液のさらなる用量を投与することが適切であると判定できる。典型的には、さらなる用量は、処置の開始時に患者に投与された脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の一部であり、該一部は使用まで凍結保存されていたものである。

このように方法は、OA、RA又は軟骨損傷等の個々の患者における状態の進行を特徴付ける客観的尺度を医師に提供する。方法は、患者若しくは罹患した関節の可動性の増加若しくは減少、患者によって報告された疼痛スコアの増加若しくは減少、又は超音波若しくはMRIによる分析等の、細胞懸濁液の第2の若しくはその後の用量を投与する適切な時期を評価するために医師に利用可能な他の尺度と併せて使用されてよい。

1つ又は複数のバイオマーカーのレベルをモニタリングすることによって医師は、例えば罹患した関節における悪化を、患者が関節についての不快若しくは疼痛スコアの増加を経験する若しくは報告する前に、又は彼らが罹患した関節の可動性の減少を経験若しくは報告する前に確認できる場合がある。第2の又はその後の用量を本明細書に記載の方法に基づいて投与することによって、医師は、そうでなければ患者によって経験される疼痛における顕著な増加又は患者によって経験される可動性における顕著な減少を低減すること等によって、そのような悪化の影響又は持続を低減できる場合がある。

1つ又は複数のバイオマーカーのレベルのモニタリングは、患者からの試料中のCOMP、CTX-II及びMIFの少なくとも1つのレベルの患者特異的タイムラインの経時的蓄積を含んでよい。例えば医師は、処置の開始前の患者からの1つ又は複数の試料を含む「ベースライン」評価を有してよく、処置の開始後の患者からの任意の数の試料を有してよい。試料は、毎月、若しくは3ヵ月ごと若しくは6ヵ月ごと等の定期的に得られてよく、又はそれらは1週間から6若しくは12ヵ月間離れた任意の期間で等の不定期に得られてもよい。根底にある状態における又は1つ若しくは複数のバイオマーカーのレベルにおける比較的急速な変化が予期される場合、試料間の時間間隔は関連する変化について医師が患者を密接にモニターできるようにするために典型的には短い。根底にある状態における又は1つ若しくは複数のバイオマーカーのレベルにおける比較的遅い変化が予測される場合、試料は典型的には低頻度で得られる。

1つ又は複数の生物学的試料中のCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定することは、第1の、第2の及び存在する場合は追加的試料がすべて同時に判定されうるように、同時に行われてよい。代替的に、1つ又は複数の試料は、1つ又は複数のバイオマーカーについて他の1つ又は複数の試料とは異なる時期に評価されてよい。例えば各試料は、回収後すぐにバイオマーカーのレベルについて評価されてよい。

本明細書の例の図面、本発明の実施形態は、次のとおり例示されうる。

本明細書に示すとおり、バイオマーカーCOMP、CTX II及びMIFは、再処置の指標として使用されうる。患者間に天然の生物学的多様性があるが、良好な脂肪組織由来細胞懸濁液処置は、MIFを減少させ、CTX IIを安定化又は減少させ、COMPを安定化又は減少させる。処置後モニタリングは、COMP、CTX II及びMIFの処置前ベースラインレベルが鍵となる点になって、いつ軟骨劣化過程が問題となるレベルに達するかを示す。例えば処置前レベルに近づく又は戻るのいずれかで、COMP、CTX及びMIFの処置後レベルが増加する場合、医師は、軟骨劣化が活性である強い指標を有する。処置される状態が炎症性状態である場合、好ましいバイオマーカーはMIFである。

したがって本発明は、組合せで使用される場合、軟骨劣化並びにOA、RA及び軟骨損傷等の軟骨劣化によって特徴付けられる状態の状況に関する指標を提供する多重バイオマーカーの使用を含む。本発明に更に含まれるのは、自己又は同種脂肪組織由来細胞懸濁液を用いる処置を含む間葉系幹細胞での処置の前又は最中に、炎症性状態の状況の指標を提供するための個々のバイオマーカー、好ましくはMIFの使用である。

変形性関節症及び本明細書で言及される他の状態を処置する方法
その内容が参照により本明細書に組み込まれる同時係属オーストラリア特許出願第2013204930号、表題「Therapeutics using multiple injections of cells」に記載のとおり、対象にある期間にわたって投与される脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の多重投与を使用する変形性関節症の一連の処置は、以前から公知の処置と比較して、対象に結果の改善を提供できる。このように、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液は、典型的には患者からの単一の脂肪組織抽出物から調製され、有用なポーション又はアリコートに分割され、第1の用量は、細胞懸濁液の調製後すぐに投与され、他のポーションは第2の、及び適切な場合は第3の、第4の、第5の用量等のために必要とされるまで適切な条件下で保存され、その時点で必要とされる用量は保存から回復され、対象に投与されるものである。

その内容が参照により本明細書に組み込まれる、例えばPCT/AU2009/001070(WO2010/020005)表題「Therapeutic methods using adipose tissue derived cell suspension comprising adipocytes」に示されるとおり、同種細胞懸濁液はそのような状態の処置のためにも使用でき、それにより本明細書に記載の方法は同種脂肪組織由来細胞懸濁液を利用する処置にも適用される。

その内容が参照により本明細書に組み込まれる、例えばPCT/AU2012/001140(WO2013/040649)表題「Therapeutics using adipose cells and cell secretions」に示されるとおり、脂肪組織由来非脂肪細胞の、及び細胞分泌物のもの等のMSCの組合せを含む組成物は、本明細書に記載のそのような状態の処置のためにも使用でき、それにより本明細書に記載の方法はそのような組合せを使用する処置にも適用される。

本発明は、変形性関節症及び、軟骨変性、傷害又は外傷を含む他の状態を処置する方法へのさらなる改善を、OA又は状態を有する患者において臨床的進行をモニタリングするための方法を提供することによって提供し、方法はOA若しくは状態の処置のための方法とは無関係に使用できる、又は好ましくはそのような処置のための方法と併せて使用できる。本明細書の方法は炎症性状態の処置にも適用される。

特に、本発明の方法は、患者が脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置で処置される組合せ法を利用することによって等、患者のための全体的な処置計画に組み込まれた場合に治療医又は患者に利益を提供でき、ここで、第1の用量は新鮮調製細胞懸濁液の一部を含み、その後の1つ又は複数の用量は凍結保存されていた細胞懸濁液の一部を含み、方法は前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルを判定することも含む。この処置過程では、1つ又は複数のその後の用量の投与の時期は、例えば少なくとも1つのバイオマーカーのレベルが第1の生物学的試料と比較して第2において大きい場合、少なくとも1つのバイオマーカーのレベルに基づいて判定される。

好ましい実施形態では、少なくともバイオマーカーMIFのレベルが、単独で又は追加的にCOMP及びCTX-IIの1つ又は複数と共に判定される。

炎症性障害
本明細書に記載の方法は、対象における炎症性障害の処置に、及び/又は炎症性障害に伴う疼痛の緩和のために適用される。炎症性障害及び炎症性状態という用語は、文脈がそうでないことを示す場合を除いて、本明細書において互換的に使用されうることが理解される。

炎症は、損傷、又は物理的に、化学的に若しくは生物学的薬剤によって引き起こされる異常な刺激への応答として生じる場合がある。炎症反応は、局所反応及び生じた形態学的変化、破壊又は有害な物質の除去、並びに修復及び治癒を導く応答を含む場合がある。用語「炎症性」は、障害に関して使用される場合、適切でない又は通常の様式で解決されない炎症によって引き起こされる、そのような炎症から生じる、又はそのような炎症を生じる病理学的過程を指す。炎症性障害は、全身性又は特定の組織若しくは器官に局在性であってよい。

炎症は、これらだけに限らないが:全身性炎症性応答(SIRS);アルツハイマー病(並びに:慢性神経炎症、グリア活性化;ミクログリアの増加;老人斑形成;及び療法への応答を含む関連する状態及び症状);筋萎縮性側索硬化症(ALS)、関節炎(並びにこれらだけに限らないが:急性関節炎症、抗原誘導関節炎、慢性リンパ球性甲状腺炎に関連する関節炎、コラーゲン誘導関節炎、若年性関節炎;関節リウマチ、変形性関節症、予後及び連鎖球菌誘導関節炎、脊椎関節症、痛風性関節炎を含む関連する状態及び症状)、喘息(並びに:気管支喘息;慢性閉塞性気道疾患;慢性閉塞性肺疾患、若年性喘息及び職業性喘息を含む関連する状態及び症状);心血管疾患(並びに粥状動脈硬化;自己免疫性心筋炎、慢性心臓低酸素症、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、心筋症を含む関連する状態及び症状、並びに:大動脈平滑筋細胞活性化;心臓細胞アポトーシスを含む心臓細胞機能障害;並びに心臓細胞機能の免疫調節;糖尿病及び自己免疫性糖尿病、インスリン依存性(1型)糖尿病、糖尿病性歯周炎、糖尿病性網膜症及び糖尿病性腎症を含む関連する状態);胃腸管炎症(並びにセリアック病、関連する骨減少症、慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患及び潰瘍性大腸炎を含む関連する状態及び症状);胃潰瘍;ウイルス性及び他の種類の肝炎等の肝臓炎症、コレステロール胆石及び肝線維症、HIV感染並びに変性応答、神経変性応答及びHIV関連ホジキン病を含む関連する状態、川崎症候群並びに粘膜皮膚リンパ節症候群、頸部リンパ節腫脹、冠動脈病変、浮腫、発熱、白血球増加、軽度貧血、皮膚剥離、皮疹(rash)、結膜発赤、血小板増加症を含む関連する疾患及び状態;アトピー性皮膚炎等の皮膚炎及び関連する状態を含む皮膚の炎症性障害;多発性硬化症、腎症並びに糖尿病性腎症、末期腎臓疾患、急性及び慢性糸球体腎炎、急性及び慢性間質性腎炎、ループス腎炎、グットパスチャー症候群、血液透析生存及び腎臓虚血再灌流損傷を含む関連する疾患及び状態、神経変性疾患並びに急性神経変性、加齢及び神経変性疾患におけるIL-Iの誘導、視床下部ニューロンのIL-I誘導可塑性及び慢性ストレス応答性亢進を含む関連する疾患及び状態、眼疾患並びに糖尿病性網膜症、グレーブス眼症及びぶどう膜炎を含む関連する疾患及び状態、骨粗鬆症並びに歯槽、大腿、橈骨、椎骨若し
くは手根骨の喪失又は骨折発症、閉経後骨量減少、腫瘤(mass)、骨折発症又は骨量減少の割合を含む関連する疾患及び状態、中耳炎(成人又は小児)、膵炎若しくは膵臓細葉炎、歯周疾患並びに成人、早発性及び糖尿病性を含む関連する疾患及び状態;慢性肺疾患、慢性副鼻腔炎、ヒアリン膜症、SIDSにおける低酸素症及び肺疾患を含む肺疾患;冠状動脈又は他の血管移植片の再狭窄;関節リウマチ、リウマチ性アショフ体、リウマチ性疾患及びリウマチ性心筋炎を含むリウマチ;慢性リンパ球性甲状腺炎を含む甲状腺炎;慢性前立腺炎、慢性骨盤痛症候群並びに尿路結石症を含む尿路感染、自己免疫疾患、円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、グレーブス疾患、グレーブス眼疾患、硬化性苔癬、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症等を含む免疫学的障害、甲状腺疾患(例えば甲状腺腫(goitre)及びリンパ性甲状腺腫(struma lymphomatosa)(橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫(lymphadenoid goitre))、睡眠障害及び慢性疲労症候群及び肥満(非糖尿病性又は糖尿病に伴う)、細菌、ウイルス(例えばサイトメガロウイルス、脳炎、エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr Virus)、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス)又は原虫(例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、トリパノソーマ)によって引き起こされるリーシュマニア症、ハンセン病、ライム疾患、ライム心炎、マラリア、脳性マラリア、髄膜炎、尿細管間質性腎炎(マラリアに伴う)等の感染性疾患への抵抗性、脳外傷(脳卒中及び虚血、脳炎、脳症、てんかん、周産期脳損傷、遷延性熱性痙攣、SIDS及びくも膜下出血を含む)を含む外傷への応答、低出生体重(例えば脳性麻痺)、肺損傷(急性出血性肺損傷、グットパスチャー症候群、急性虚血性再灌流)、心筋機能障害、職業性及び環境汚染物質によって引き起こされるもの(例えば有毒油症候群、珪肺症への易罹患性)、放射線外傷、並びに創傷治癒応答の効率(例えば熱傷又は熱性創傷、慢性創傷、外科的創傷及び脊髄損傷)、敗血症、甲状腺機能低下症、酸素依存症、頭蓋異常、早発閉経、移植片への対象の応答(拒絶又は許容)、急性期応答(例えば熱性応答)、一般的炎症性応答、急性呼吸促迫応答、急性全身性炎症性応答、創傷治癒、癒着、免疫炎症性応答、神経内分泌応答、発熱発症及び耐性、急性期応答、ストレス応答、疾患易罹患性、反復運動ストレス、テニス肘、靱帯及び腱の問題、並びに疼痛管理及び応答を含む多くの障害において生じることが公知である。

特定の実施形態では、炎症性障害は、関節炎等の関節関連炎症性障害である。

本発明の方法及び組成物は、靱帯損傷及び腱損傷の処置のため又はそのような損傷に伴う疼痛の緩和のために使用されうる。靱帯損傷及び腱損傷は、いくつかの形態では、炎症性障害として分類される場合がある。いくつかの靱帯損傷及び腱損傷は、炎症性障害とは考えられない場合がある。誤解を避けるために、本発明において検討される靱帯損傷及び腱損傷は、炎症性障害であるもの又はそれに関連するもの及び炎症性障害とは考えられない場合があるものであってよい。

次の段落は、脂肪組織由来細胞懸濁液の供給源及び調製、MSCを含む細胞懸濁液、並びにそのような一連の処置が患者に与えられてもよい方法を記載する。

脂肪組織
本発明の処置方法において使用される細胞懸濁液は、自己脂肪組織由来細胞懸濁液又は同種脂肪組織由来細胞懸濁液である。脂肪組織は、処置の対象に応じて及び自己又は同種細胞懸濁液のどちらが使用されるかに応じて、ヒト脂肪組織又は哺乳動物脂肪組織であってよい。脂肪組織は、「白色」脂肪組織又は「褐色」脂肪組織を含んでよい。

脂肪組織は、対象の身体、又は同種材料の場合は入手可能なドナーの身体の、いずれの供給源に由来してもよい。例えば皮下脂肪は、表面的創傷だけで、又は「鍵穴手術」技術を使用することによって容易に入手されうる。例えば脂肪組織は、脂肪吸引技術を使用して回収した組織、又はオス若しくはメス動物を去勢(de-sexing)する場合に生殖組織とともに除去される脂肪組織であってよい。脂肪組織は、目的の処置の対象に実施された美容目的の手順の際に回収されてもよい。脂肪組織は、示された状態についての対象の目的の処置の一部として特異的に回収されてよい。脂肪組織は、付着した血液細胞を除去するために組織培養培地又は緩衝等張溶液でリンスされてよく、脂肪組織由来細胞懸濁液を生成する前に大きな血管又は結合組織要素を除去するために整えられ又は粗加工されてよい。

脂肪組織は、成熟動物に又は若年動物に由来してよい。

特定の実施形態で、対象又は患者は、飼いイヌ又は飼いネコ等のコンパニオン動物、又は使役動物である。他の特定の実施形態では、対象又は患者は、ウマ、ロバ(donkey)、ロバ(ass)、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ、ラクダ又はブタから選択される飼育動物又は競争用動物である。他の特定の実施形態では、対象又は患者は、ヒトである。典型的には患者がヒトである場合、脂肪組織は自己である。

脂肪組織由来細胞懸濁液
本明細書で使用される用語「脂肪組織由来細胞懸濁液」は、脂肪組織から単離された細胞又は脂肪組織の小さな凝集体若しくは小片、又は、単離された細胞、脂肪組織の小さな凝集体及び小片の2種以上の混合物を包含する。脂肪組織由来細胞懸濁液は、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む。細胞懸濁液は、当技術分野において容易に入手可能である技術を使用して脂肪組織を機械的に分離することによって得ることができる。脂肪組織の機械的分離のための任意の好適な方法、例えば、ブレードで若しくはハサミで脂肪組織をミンチにすることによる、又は組織を単離された細胞又は脂肪組織の小片に壊すために十分なポアサイズを有するふるい又は網に脂肪組織を通すことによる、又はこれらの技術の組合せを使用することができる。脂肪組織の小さな凝集体は、分離された脂肪由来細胞が、例えば培地中でより大きな会合物に再会合する場合に形成しうる。脂肪組織の小片又は凝集体は、直径10ミリメートル未満、直径5ミリメートル未満、直径1ミリメートル未満、直径500μm未満又は直径250μm未満である場合がある。

脂肪組織由来細胞懸濁液は、網又はふるいポアサイズより大きい細胞凝集体又は組織小片を除去するために網又はふるいを通してろ過されてよい。

タンパク質分解酵素は、脂肪組織の脂肪組織由来細胞懸濁液への分離を促進するために使用されてよい。そのような使用のために好適である酵素は、当技術分野において周知であり、これらだけに限らないが、トリプシン及びコラーゲナーゼを含む。脂肪組織由来細胞抽出物を使用する前にタンパク質分解酵素を除去する及び/又は他に不活性化することは、これらの酵素が細胞の望ましいin vivo使用と適合性でない場合があることから一般的である。タンパク質分解酵素は、脂肪組織由来細胞懸濁液を生成するための脂肪組織の機械的分離のための技術との組合せで使用されてよい。

機械的分離技術は、1つ又は複数のタンパク質分解酵素を使用することなく使用されうる。このように使用される技術は、脂肪組織由来細胞懸濁液を迅速に生成するために使用されてよい。

細胞懸濁液は、液体中に懸濁されてよい。液体は、脂肪組織の分離の前、最中又は後に脂肪組織に添加されてよい。液体は、適切な培養条件下で脂肪組織細胞生存を少なくとも24時間維持できる培地を含んでよい。液体は、脂肪組織細胞生存を少なくとも1時間維持できるリン酸又はHEPES緩衝生理食塩水等の等張緩衝液を含んでよい。液体は、組織培養培地を含んでよい。液体は、細胞懸濁液中の脂肪組織細胞生存を支持又は延長する血清又は血清成分を含んでよい。血清又は血清成分は、自己血清又は血清成分であってよい。

いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、液体を添加されない場合があり、その代わり細胞は組織の分離の際に形成される液体中に懸濁される。

脂肪組織由来細胞懸濁液の調製は、遠心分離工程を含む場合がある。培地等の液体中に懸濁された単離された細胞又は脂肪組織の小さな凝集体若しくは小片の遠心分離は、およそ500g、10分間又は脂肪由来非脂肪細胞を含む細胞沈殿を生成するために十分な時間及び十分なg力においてであり、その上は培地の層であり、その上に浮いているのは生存脂肪細胞を含む層であり、最上部に浮いているのは破裂した脂肪細胞に由来する脂質の層である。遠心分離に続いてある特定の実施形態では、脂質層及び培地層は廃棄され、保持された細胞は混合され、生存脂肪細胞及び脂肪由来非脂肪細胞を含む脂肪組織由来細胞懸濁液を残した。他の実施形態では、生存脂肪細胞を含む層だけが保持される。

他の実施形態では、脂肪細胞を含む層は、除去されてよく、それにより脂肪組織由来細胞懸濁液には含まれない。これは、典型的には脂肪細胞を実質的に含まない脂肪組織由来細胞懸濁液を調製する場合に生じる。本明細書において、脂肪細胞を実質的に含まないとして言及する細胞懸濁液は、遠心分離後の脂肪細胞画分の除去によって等、出発材料と比較して細胞懸濁液が脂肪細胞を顕著に枯渇させられていることを意味する。細胞懸濁液に関連して使用される場合に脂肪細胞を実質的に含まないことは、脂肪細胞の完全な不在を含み、材料中の脂肪細胞のごきわずかな保持が生じている状況も含むことが理解される。

他の実施形態では、脂肪組織の脂肪細胞含有量の一部だけが、脂肪組織由来細胞懸濁液の調製において除去されうる。この場合、生じた細胞懸濁液は、脂肪細胞を含むが、出発材料での割合と比較して、幹細胞等の他の保持された成分と比較して低減した割合でである。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、少なくとも10体積%の脂肪細胞を含む。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、10体積%から30体積%の間の脂肪細胞を含む。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、数で少なくとも10%の脂肪細胞を含む(すなわち、細胞懸濁液中の細胞の総数の少なくとも10%が脂肪細胞である)。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、数で少なくとも20%の脂肪細胞を含む。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、数で少なくとも30%の脂肪細胞を含む。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、数で10%から30%の間の脂肪細胞を含む。

1つの遠心分離工程又は多重遠心分離工程が、例えば追加的細胞分離工程を提供するために使用される場合がある。他の実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液の調製は遠心分離工程を含まない。

脂肪組織由来細胞懸濁液は、生存脂肪細胞を含んでも含まなくてもよい。存在する場合、脂肪細胞は検出可能な量の脂質をそれらの細胞質中に保持でき、脂質によって与えられる異なる密度に基づいて、脂肪由来非脂肪細胞から分離されうる。脂質は、位相差顕微鏡を含む光学顕微鏡技術を使用して、又はOil Red O等の親油性色素で細胞の試料を染色することによって検出可能でありうる。細胞質中に脂質を保持している脂肪細胞は、他の脂肪由来細胞よりも相当に脆弱であり、したがって生存脂肪細胞が望ましい場合、脂肪細胞の大部分を傷害する又は殺す、組織を分離するための技術は、回避されるべきである。脂肪組織の超音波分離又は、例えば脂肪組織が激しく振とうされる技術は、多数の生存脂肪細胞を含有する細胞懸濁液を提供するためには見込みがない。脂肪細胞の生存率はLIVE/DEAD cell viability assays (Life Technologies社)等の容易に利用可能な技術を使用して容易に判定されうる。

脂肪組織由来細胞懸濁液は、脂肪細胞及び脂肪由来非脂肪細胞の両方を含みうる。脂肪由来非脂肪細胞は、間葉系幹細胞を含む間質性血管画分の細胞を典型的には含む。間質性血管画分の細胞は、脂肪組織由来細胞懸濁液の本明細書に記載の遠心分離条件で典型的には沈殿する。

脂肪細胞及び脂肪由来非脂肪細胞の両方を含む実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、脂肪細胞層及び沈殿した脂肪由来非脂肪細胞の両方が回収される本明細書に記載の遠心分離工程を含む方法によって便利に調製されうる。代替的にこれらの実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、遠心分離工程を含まずに本明細書に記載の脂肪組織を分離することによって調製されうる。

任意選択で脂肪細胞を含む脂肪組織由来細胞懸濁液又はその一部は、適切な条件下で保存されてよい。保存条件は、典型的には50%を超える、60%を超える、70%を超える、80%を超える、90%を超える又は95%を超える等の細胞懸濁液中のいくらかの又はすべての細胞の細胞生存率の保持を可能にする。

脂肪組織由来細胞懸濁液又はその一部が凍結保存される場合、細胞の凍結のために適切な任意の担体液体中であってよい。例示としてだが限定的例ではなく、凍結前に細胞はDMEM、RPMI、最小必須培地等の血清含有若しくは血清不含有であってよい培養培地中に又は血清中に懸濁されてよい。

脂肪組織由来細胞懸濁液は、調製される細胞懸濁液において望ましくない成分から細胞沈殿が分離される場合等、細胞懸濁液の調製の際に又は調製の後期に添加される場合がある自己血清又は血漿も典型的には含む。

脂肪組織由来細胞懸濁液が凍結保存される場合、細胞懸濁液は、細胞分泌物を含む組成物と組合せられてよい。細胞分泌物を含む組成物は、例えば脂肪組織由来細胞懸濁液の培養物からの澄ませた培地を含んでよく、又は脂肪組織由来細胞懸濁液の培養物からの濃縮培地を含んでよい。細胞、細胞懸濁液及び特に脂肪組織由来細胞懸濁液の保存のためのそのような方法は、PCT/AU2012/001140(WO2013/040649)表題「Therapeutics using adipose cells and cell secretions」に開示されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

脂肪組織由来細胞懸濁液が凍結保存される場合、それは典型的には凍結保存剤も含む。経時的に細胞生存率の顕著な損失を伴わない、細胞懸濁液を保存するための任意の添加物及び方法が使用されうることが理解される。例えば間葉系幹細胞の保存のための方法は、当技術分野において公知である。例として細胞懸濁液は、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はグリセロールを5%から10%等の適切な濃度で含んでよい。さらなる例として細胞懸濁液は、トレハロース、デキストラン、ブドウ糖、ショ糖等の1つ又は複数の凍結保存用糖を適切な濃度で含んでよい。例えば凍結保存用糖は、1%w/vから30%w/vの範囲の濃度で含まれてよい。さらなる例では、凍結保存用糖は、5%w/vから10%w/vの範囲の濃度で含まれてよい。

液体培地及び凍結保存剤等の細胞懸濁液の構成物は、典型的には使用される濃度で薬学的に許容される。これは、脂肪組織由来細胞懸濁液が最小の解凍後処理で解凍後に対象に投与されうる利点を有する。

細胞懸濁液は、対象を苦しめる状態についての一連の処置の一部として意図される。自己細胞懸濁液が使用されるそのような様式では、一連の処置は、脂肪組織が得られ且つ細胞懸濁液が調製される対象への、ある期間にわたる細胞懸濁液の多重用量を含む。処置の時間経過は、典型的には数週間、数ヵ月及び一年以上にわたる可能性がある。簡単に使用するために、脂肪組織由来細胞懸濁液は、典型的には調製後すぐに有用なポーション又はアリコートに分割され、第2の及び適切な場合は第3の、第4の、第5の等の用量のために使用される材料は、次いで適切な時期での回復のために凍結保存される。典型的には、保存された材料は単一用量を含むポーション又はアリコート中である。

典型的には、処置が自己細胞懸濁液を利用する場合、一連の処置の第1の用量として投与するための細胞懸濁液の少なくとも1つのアリコート又はポーションは、凍結保存剤又は細胞懸濁液の保存における補助を目的とした他の成分の添加前に、調製細胞懸濁液から得られる。

細胞懸濁液は、それが典型的には1つ又は複数の薬学的に許容される担体希釈剤、賦形剤又はアジュバントも含むことから、医薬組成物と称される場合がある。

細胞懸濁液は、細胞傷害を最少化するために制御された条件下で、例えばプログラム可能な凍結デバイス又は-70℃から-90℃の冷凍庫内の断熱容器中に置くことによって等、遅い凍結によって、典型的には約1℃/分の速度で、典型的には凍結される。保存のために凍結細胞は、典型的には次いで液体窒素保存に移される。

一連の処置が同種脂肪組織由来細胞懸濁液を利用する場合、すべての用量は使用前に凍結保存されてよい。そのような一連の処置では、1つ又は複数の用量は、異なるドナーに由来してよい。

脂肪組織由来細胞懸濁液の調製のために使用されうる細胞処理方法及びデバイスは、同時係属出願PCT/AU2012/000272(WO2012/122603)表題「Cell processing method and device」に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

MSCの単離
間葉系幹細胞(MSC)は、本発明のいずれかの方法において使用されうる。MSCは、身体における任意の組織から得ることができる。供給源は、骨髄、脂肪組織及び臍帯血を含む。骨髄(BM)は、MSC及び造血幹細胞(HSC)の両方を含有する。BMでは、MSCはHSCよりも少ない数、BM細胞百万個あたりそれぞれ細胞10個及び100個で存在する。BMは、jamshidi等の吸入針を使用して採取される。容量10mLのBMは、有核細胞およそ6x10⁷個を含有し、その600から6000個は幹細胞である。有核細胞を赤血球から分離するために、Ficoll-paque等の密度勾配遠心分離手順が実施される。生理食塩水中での穏やかな遠心分離による洗浄後、細胞は直ちに投与されうる又は組織培養若しくは免疫学的分離方法によって更に精製若しくは濃縮されうる。実施形態では、MSCは、同種であってよく又は自己であってよい。実施形態では、MSCは、培養増殖MSCであってよい。

MSCは、骨髄よりも脂肪において高いレベルで存在する。この発見について最も考えられる説明は、他の有核細胞型と共にMSCが、脂肪組織を覆っている密な毛細血管床の巨大なネットワークに関連していることである。脂肪組織は、外科的切除によって又は脂肪吸引によって採取でき、脂肪組織からMSCを含む懸濁液を含む非脂肪細胞懸濁液を調製するための方法は、本明細書に記載されている。

本発明者らの実験では、脂肪組織から回収されたMSCの数は、1グラムあたり50,000から500万個の範囲である。

臍帯血は、誕生時に臍帯及び胎盤の血管に残っている血液である。この血液は、造血幹細胞に富んでおり、少数のMSCも含有している。多数のMSCが臍静脈及び臍帯血管の周辺組織であるウォートンゼリー中に存在する。

MSCは、末梢血液、滑膜、筋肉、骨膜、歯髄、胎盤等の他の供給源からも単離されうる。

処置方法
本発明の方法の実施形態では、脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の第1の用量が細胞懸濁液の調製後すぐに対象に投与される、変形性関節症、関節リウマチ又は軟骨損傷等の軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態を有する対象に一連の処置が提供される。この文脈では、第1の用量は、新鮮調製細胞懸濁液として対象に投与されるとして記載されてよい。この文脈では、新鮮調製という用語及び本明細書において使用される類似語は、そのように投与される細胞懸濁液は、それが調製された同日に、対象に投与されることを意味する。本明細書に記載の脂肪組織由来細胞懸濁液は、一連の過程が与られる対象から得られた脂肪組織から調製され、それにより生じた細胞懸濁液は、自己細胞懸濁液である。典型的には、対象からの脂肪組織の単離から、調製された細胞懸濁液の投与の準備ができるまでにかかる時間は、約2から3時間までである。新たに調製された試料は、したがって対象からの脂肪組織の除去の約2から3時間以内に対象への投与のための準備するものである。

本明細書に記載するように、患者の根底にある状態をモニタリングすることを補助するためにバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFを利用する本発明の方法は、同種脂肪組織由来細胞懸濁液を使用する処置にも適用可能である。

本明細書に記載のどの処置方法も、間葉系幹細胞の細胞懸濁液を使用する場合がある。本明細書に示す非限定的例では、神経変性及び潰瘍性大腸炎のための臍MSC処置は、同種ヒト処置であった。同種培養増殖MSCは、例えばヒト処置のために本明細書に記載されている。

本発明の方法の文脈では、用量は、用量が単回適用で又は1回より多い適用で投与されるかにかかわらず、所与の時期での対象への細胞懸濁液の投与を意味することが理解される。例示的な例として、用量は、対象の身体上の標的化部位への単回注射等単回投与からなってよい。さらなる例示的な例として、用量は、対象の身体上の1つ又は複数の標的化部位への多重注射等の多重投与からなってよい。第1の及び又は第2の、第3の、第4の、第5の用量等のいずれかのその後の用量のいずれかは、したがって単回適用として又は多重適用として投与されてよい。

方法は、医師が患者に適切であると考える第1の用量及び第2の用量、又は第1の用量、第2の用量及び第3の用量、又は第1の用量、第2の用量、第3の用量及び第4の用量、又は第1の用量、第2の用量、第3の用量、第4の用量及び第5の用量又は任意の他の数の用量を含む一連の処置を含んでよい。

一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、細胞の凝集体を含む及び又は脂肪組織の小片を含む。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、脂肪細胞を更に含む。一実施形態では、細胞懸濁液は、脂肪細胞を実質的に含まない。一実施形態では、脂肪組織由来細胞懸濁液は、脂肪組織由来細胞懸濁液の調製の際に(i)脂肪細胞含有量の一部又は(ii)脂肪細胞含有量の実質的にすべての除去を含む方法によって調製される。

一実施形態では、一連の処置は、非脂肪細胞及び脂肪細胞を含む細胞懸濁液の第1の用量を含み、並びに1つ又は複数のその後の用量の1つ又は複数の細胞懸濁液は実質的に脂肪細胞を含まない。一実施形態では、一連の処置は、非脂肪細胞及び脂肪細胞を含む細胞懸濁液の第1の用量を含み、1つ又は複数のその後の用量の1つ又は複数の細胞懸濁液は非脂肪細胞及び脂肪細胞を含む。

一実施形態では、一連の処置は、3ヵ月から12ヵ月の間の処置期間全体にわたって投与される多重用量を含む。一実施形態では、一連の処置は、約3ヵ月から、1年、2年、3年又はそれ以上の数年の間の処置期間全体にわたって投与される多重用量を含む。一実施形態では、一連の処置は、6ヵ月から12ヵ月の間の処置期間全体にわたって投与される多重用量を含む。一実施形態では、一連の処置は、3ヵ月から9ヵ月の間の処置期間全体にわたって投与される多重用量を含む。一実施形態では、一連の処置は、6ヵ月から9ヵ月の間の処置期間全体にわたって投与される多重用量を含む。

一実施形態では、1つ又は複数のその後の用量は、解凍後約10分間以内、又は解凍後約20分間以内、又は解凍後約30分間以内又は解凍の約1時間以内又は解凍の約2時間以内等の解凍後すぐに対象に投与される。

本発明の方法では、用量の少なくとも1回、典型的には第2の又はその後の用量は、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルの判定後に患者に投与される。一実施形態では、バイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFの少なくとも2つのレベルが患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料において判定される。一実施形態では、3つのバイオマーカーCOMP、CTX-II及びMIFのレベルが患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料において判定される。一実施形態では、実質的にすべての用量が、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFから選択される少なくとも1つのバイオマーカーのレベルの判定後に患者に投与される。一実施形態では、そのように判定されたバイオマーカーのレベルは、患者の状態における悪化を示し、それにより患者にさらなる用量を投与するための指示を治療医に提供する。

第1の用量とその後の各用量との間の適切な時間間隔は、異なる患者間及び所与の患者についてでさえ異なっている場合があり、用量間の間隔は変化する場合がある。本発明の方法を使用することは、治療医が疾患進行に関連するバイオマーカーにおける客観的尺度に基づいて細胞懸濁液の用量を患者に投与することを可能にする。これは、細胞懸濁液の用量の投与のための適切な時期を判定する追加的な改善された根拠を医師に提供する。本発明以前は、投薬の時期は、3ヵ月ごと等の単純な定期的適用に基づいている場合があり、その場合、患者は必要を超える投薬を受ける場合があり、又は投薬の時期が患者によって経験された疼痛の増加若しくは患者によって経験された可動性の減少に基づく場合があり、望ましくない。このように、対象が、その期間中の個体における同じ状態を処置する期間にわたって細胞懸濁液の多重用量を投与されることは、本発明の方法における目的とする一連の処置である。

一実施形態では、一連の処置は、その後の各投薬が前の投薬から1週間から10週間の間で時間的に分けられている多重用量を含む。一実施形態では、一連の処置は、その後の各投薬が前の投薬から時間的に2週間から8週間の間で分けられている多重用量を含む。一実施形態では、一連の処置は、その後の各投薬が前の投薬から時間的に2週間から6週間の間で分けられている多重用量を含む。任意の所与の一連の処置について、各投薬間の時間間隔は一定期間であってもなくてもよい。例示的な例として、第1のと第2の用量との間の時間間隔は、第2のと第3の用量との間の時間間隔と同じであってもなくてもよい。

医薬組成物は、患っている領域から遠隔性の部位で対象患者に投与されてよい。この文脈において、「遠隔性の」は、投与が処置される炎症又は他の損傷若しくは疾患の部位への細胞懸濁液の直接適用ではないことを、そのような部位が同定可能である場合に意味する。例示として、関節炎の関節の処置の場合、当技術分野において以前記載された投与は、患っている関節への直接の脂肪組織由来細胞懸濁液の注射を含んだ。そのような投与は、適切な正確さを確実にするために治療医又は臨床医の側に高度な技術を必要とする。そのような投与において必要とされる罹患した肢又は関節の取り扱いもヒト又は非ヒトである患者によって経験される困難を増加させる。脂肪組織由来懸濁液の遠隔性の投与を提供することによって、本発明は、そのような疾患の処置のための方法、使用及び組成物の改善を提供する。例えば遠隔性の投与は、処置される動物(例えばネコ又はイヌ)の首筋等への皮下注射によって又は筋肉内注射によってであってよい。さらなる例として、筋肉内注射によるイヌへの投与は、イヌの大腿部へであってよい。さらなる例として、筋肉内注射によるウシへの投与は、尾のひだへであってよい。

生物学的試料
生物学的試料は、所望のバイオマーカーが検出されうる任意の好適な試料であってよい。典型的には試料は、血液又は血漿若しくは血清等のその画分である。方法は、対象からの血液の回収について及び検査目的のための血液の所望の画分の分離について当技術分野において公知である。一実施形態では、生物学的試料は滑液である。一実施形態では、生物学的試料は尿である。一実施形態では、バイオマーカーCTX-IIは尿試料中で判定される。一実施形態では、バイオマーカーCTX-IIは血清試料中で判定される。一実施形態では、バイオマーカーMIFは血清試料中で判定される。一実施形態では、バイオマーカーMIFは血液又は滑液等の液中で判定される。一実施形態では、バイオマーカーCOMPは血清試料中で判定される。一実施形態では、バイオマーカーCOMPは尿試料中で判定される。

患者から生物学的試料を得る工程は、本発明の方法の一部として行われてよい、又は別の工程として行われてよい。個体から血液試料を得る工程は、本発明の方法の実施における連続する一連の工程の一部として行われてよい。個体から血液試料を得る工程は、本発明の方法の1つ又は複数の残りの工程とは別の、例えば時期、場所又は操作者が別の、別個の1つ又は複数の工程として行われうる。したがって本発明の方法の実施において、血液試料を得ることは、前記個体からの血液の抽出を含んでも含まなくてもよい。本発明の方法の実施は、例えば容器中の血液試料、本発明の方法の実施とは別に練習として個体から予め抽出された血液を受けることを含んでよい。さらなる例として、血液試料を得ることは、本発明の方法の実施とは別に練習として個体から抽出された血液試料を一時保存から回復することを含んでよい。本発明の方法の実施は、したがって全体的にex vivoで行われてよいことが理解される。

試料は、回収及び、所望により処理後すぐにバイオマーカーの存在若しくはレベルを判定するために検査されてよく又は試料若しくはその処理された画分は、検査まで適切な条件下で保存されてよい。例えば生物学的試料は、血液又はその画分(好ましくは血清又は血漿)であってよい。例えば生物学的試料がその尿である場合、デブリ及び細胞を除去するために最初に遠心分離されてよく、次いで検査のための使用まで保存されてよい。これらの試料は、理想的には1又は2時間冷蔵保存され、より好ましくは凍結保存される。

典型的には患者がヒトである場合、生物学的試料は、例えば、医師又は健康管理専門職によって、医師の臨床診療の下で対象から回収されてよい。医師は、医学を独立して実行するために法の下で登録された、公認された又は認定された任意の者であってよい。健康管理専門職は、対象から生物学的試料を回収することを独立して又は医師の監督の下でのいずれかで許可された、公認された、登録された又は認定された任意の者であってよい。例えば健康管理専門職は、登録された又は記載された看護師、又は医師の補助者又は臨床補助員であってよい。生物学的試料が、例えば医師の臨床診療の下にある患者に通常実行される通例の外来患者手順の際に回収されてよいことが理解される。

生物学的試料が尿である場合、試料は患者の全体的臨床診療と共に医師の直接又は間接での監督の下で回収されうるが、物理的には患者自身によって回収されうる。

特定の実施形態では、本発明の方法は、医師によって、又は医師の監督下にある1名若しくは複数名の者によって、又はその組合せによって実施される。医師の監督下にある者は、例えば、健康管理専門職、薬剤師、臨床、医学若しくは病理学の検査技師、又は科学者であってよい。本発明の方法が、医師によって、又は医師の監督下にある1名若しくは複数名の者によって、又はその組合せによって任意の研究室において実施されてよいことが理解される。例えば、生物学的試料の回収、調製及び又は検査は、治療量が患者に投与される場所とは異なる場所において実施されてよい。同様に、脂肪組織の回収、脂肪組織由来細胞懸濁液の調製及び投与は、異なる個体によって実施されてよく、異なる場所で実施されてよい。そのような場合、典型的にはすべての工程は、前記方法全体について前記患者の臨床診療に主要な責任を有する登録された医師によって又はその監督の下で実施される。

生物学的試料の検査
本明細書で述べたもの等のバイオマーカーの存在について生物学的試料を検査するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、目的のバイオマーカーを含む可能性がある試料は、バイオマーカーポリペプチド又はその断片に特異的に結合する抗体に接触されうる。任意選択で抗体は、複合体の洗浄及びその後の単離を促進するために、抗体を試料に接触させるより前に固体支持体に固定されてよい。固体支持体の例は、例えば、マイクロタイタープレート、ビーズ、チック又はマイクロビーズを含む。抗体は、当技術分野において公知のタンパク質チップアレイ又はプローブ基質に付着されてもよい。

抗体マーカー複合体の存在を検出する又は量を測定するために有用なアッセイは、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、側方流動アッセイ、放射免疫アッセイ(RIA)又はウエスタンブロットアッセイを含む。そのような方法は、例えばClinical Immunology (Stites & Terr編、第7版1991); Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology、volume 37 (Asai編 1993);及びHarlow & Lane、上記に記載されている。

方法は、全タンパク質、ペプチド又はその断片の検出を含んでよい。それにより、本明細書においてバイオマーカーのレベルを判定することへの言及又はそれと同様の表現は、文脈がそうでないと示す場合を除いて、バイオマーカーがその全体で検出される状況及びペプチド断片等のバイオマーカーの断片が検出される状況を包含することが意図されることが理解される。しかし、バイオマーカーそれ自体が完全なタンパク質のブレークダウン産生物である場合、逆は適用しない。それゆえ、明確化のために、バイオマーカーがコラーゲンの断片であるCTX-IIである場合、CTX-IIのレベルを判定することへの言及は、コラーゲンのレベルを判定することを包含するとは意図されない。方法は、方法の補正又は一貫した実施のため等に、対照の含有も更に含んでよい。

例えばCTX-IIの場合、CTX-IIはクレアチニン濃度を使用して補正され、患者において観察されたng/mmolでのクレアチニンレベルとして表されてよい。本明細書の実施例に寄与する対象では、観察されたレベルは約100から約1500ng/mmolであった。

COMP及びMIFの定量は、Urine Pre-clinical Cartilaps(登録商標)(CTX-II) ELISA(Immunodiagnosticsystems社、UK)アッセイを製造者の説明書に従って使用するR&D Systems社(CTX-II)からのELISAアッセイを使用して実施された。CTX-IIレベルは、Creatinine Parameter Assay (R&D systems社、USA)を使用してクレアチニン(Cr)について補正された。MIF ELISAは、説明書(http://www.rndsystems.com/Products/SMF00B)及びAlexanderら Exp Neurol. 2012 August; 236(2): 351〜362頁に記載のとおり実行された。COMP及びCTX-II ELISAアッセイは、説明書(http://www.rndsystems.com/Products/DCMP0)及びV.B. Krausら / Osteoarthritis and Cartilage 19 (2011)に記載のとおり実行された。特に表IIは、COMP及びCTX-IIのためのELISAアッセイを記載している多数の参考論文を含んでおり、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。

血液回収。所望の時点で、血液8〜36mLは18ゲージ針を使用して患者からEDTAを含有するBD vacutainers(Becton Dickinson社、USA)に回収されてよい。血液成分は、フィコール密度勾配分離を使用して分離されうる。完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社、Switzerland)を血漿に1:50希釈で添加し、試料は氷上で研究所に輸送される。血漿は、いかなる細胞性物質も除去するために16000xgで5分間遠心分離され、アリコートされ、-80℃で保存された。

Bio-Plex分析。Bio-Plex suspension array system (Bio-Rad社、USA)は、単一のウエル中の100個までの分析物の同時定量を可能にするために、固有の蛍光で着色されたビーズを使用する。標的分析物は、Bio-Plex dual-laser flow-based microplate reader systemを使用して、一次抗体にコンジュゲートされた固有のビーズ及び対応するレポーター複合体の検出によって定量される。試料は、Bio-Inert(登録商標) Membrane(Pall Scientific社、USA)を有する0.2μm Nanosep MF Centrifugal Devicesを5分間、9000xgで通してろ過される。各ろ過試料50μLは所望のBio-Plexアッセイ(Bio-Rad社、USA)を製造者の説明書に従って使用して分析される。Bio-Plex Pro II magnetic wash stationが洗浄工程のために使用されてよく、データはBio-Plex 200 systemをバージョン5.0ソフトウェア(Bio-Rad社、USA)で使用して取得されてよい。

以下、本発明を、例示のためのみの次の実施例によって、より詳細に説明する。実施例は、本発明を例示することに役立つことを目的とし、本明細書全体の記載の開示の一般性を限定するものとして解釈されるべきではない。

キット及び組成物
本発明は、本発明の方法の実施において有用な1つ又は複数の成分を含むキットも提供する。例えばMSCを含む等の医薬組成物又は脂肪組織由来細胞懸濁液は、例えば書面による説明書等の目的の処置において有用な追加的成分を含むキットの一部として提供されてよく、又は単一のバイアル若しくは組成物のアリコート等の単一物品として提供されてよい。

キットは、生物学的試料の回収若しくは調製のため、又は特定のバイオマーカーの検出のための1つ又は複数の薬剤を含んでよい。例えばキットは、MIF、CTX-II及びCOMPからなる群から選択される1つ又は複数のバイオマーカーに結合及び又は検出できる、好ましくは特異的に結合及び又は検出できる1つ又は複数の薬剤を含んでよい。キットは、生物学的試料における任意の1つ又は複数のMIF、CTX-II及びCOMP等のバイオマーカーのレベルを定量することにおける使用のための1つ又は複数の薬剤を含んでよい。

キットは、その用語が試薬が別々の容器に含有され、小さなガラス容器、プラスチック容器又はプラスチック若しくは紙のストリップを含む場合がある任意のキットを含む区画化されたキットであってよい。そのような容器は、試料と試薬との相互汚染を回避しながら1つのコンパートメントから別のコンパートメントへの試薬の効率的な移行、及び各容器の薬剤又は溶液の1つのコンパートメントから別への添加を定量的様式で可能にできる。そのようなキットは、検査試料を受け入れる容器、アッセイで使用される抗体を含有する容器、洗浄試薬(リン酸緩衝生理食塩水、Tris緩衝液等)を含有する容器及び検出試薬を含有する容器も含みうる。キットのさまざまな成分は、異なる温度で存在、保存又は輸送されてよい。

(実施例1)
変形性関節症幹細胞先進調査研究
変形性関節症幹細胞先進調査研究(OSCARS)は、OA処置のための自己脂肪由来細胞療法の安全性及び有効性を評価するための無作為化、二重盲検、プラセボ対照治験である。患者合計40名を、彼らの検査膝に自己脂肪由来細胞又はプラセボの単回の関節内注射を受けるように無作為化(20:20)した。参加者らは、自己報告疼痛質問票(間欠的及び継続的変形性関節症疼痛[ICOAP]指標)を完了させた。軟骨劣化の程度は、MRI T2マッピングを使用してベースライン及び処置後6ヵ月で評価し、軟骨劣化は、尿中の軟骨特異的コラーゲン断片(CTX-II)及び血清中の48個のサイトカインのパネルを使用して測定した。

すべての患者は、彼らの総疼痛スコアにおいて大きく有意な低減を、治験を通じて維持されて経験した。MRI T2マッピングは、自己脂肪由来細胞療法が、重度の軟骨傷害を有する対象においてさえ軟骨劣化を遅くすることによって疾患修飾効果を有しうることを実証した。この発見と一致して、CTX-IIレベルは処置群において減少したが、プラセボ群においてはベースラインと6ヵ月との間で有意(p=0.04)に増加した。マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、軟骨劣化経路に関与する鍵となるサイトカインの血清レベルにおける有意な低減が処置群において観察された。

OSCARは、OA罹患者における膝疼痛を低減するための自己脂肪由来細胞療法の効果を評価するために設計された世界初の治験である。この中間報告での結果は、短期から中期の症状修飾は、プラセボ及び処置群の両方において同様であったことを実証している。軟骨劣化の客観的マーカーは、処置群において低減しており、これは自己脂肪由来細胞療法がOAの進行を遅くし、長期間での結果の改善を生じうることを示すMRI T2マッピングによって支持された。

研究が行われた様式の更に詳細な説明並びに研究の結果及び波及効果を下に示す。

治験設計
OSCARは、Royal North Shore Hospital、シドニー、オーストラリアで実施された倫理的に承認された第II相、二重盲検、プラセボ対照治験であった。患者年齢>40歳は、彼らが内側若しくは外側のいずれかのコンパートメントについて国際変形性関節症研究学会(OARSI)等級1又は2のX線検査関節腔狭窄として等級付けられて、又は関節腔狭窄を伴わない内側若しくは外側のコンパートメントについて骨棘等級2若しくは3と等級付けられて診断された膝変形性関節症、及び数値評価スケール(NRS)で少なくとも4の症候性膝変形性関節症疼痛を有する場合に治験に参加することに適格であった。患者合計40名を彼らの検査膝への自己脂肪由来細胞又はプラセボの単回の関節内注射を受けることに無作為に割り当てた(1:1)。

研究目的は、膝変形性関節症の診断を有する患者において、自己非増殖脂肪由来幹細胞の注射が疼痛を改善し、疾患進行を変えたかどうかを判定することであった。最初の目的は、膝変形性関節症における疼痛症状を低減するために自己幹細胞を使用することの効率を判定することであった。第2の目的は:(a)膝変形性関節症の処置に自己幹細胞を使用することの中期安全性を判定すること;(b)疾患進行のバイオマーカーへの自己幹細胞の注射の影響を評価すること;(c)生活の質への自己幹細胞を使用することの影響を判定することであった。

方法論
すべての参加者は、脂肪組織およそ200gを採取するために通例の脂肪吸引手順を受けた。組織を以前記載のとおり処理した(Blaber SP、Webster RA、Hill CJら Analysis of in vitro secretion profiles from adipose-derived cell populations. J Transl Med 2012;10:172〜88頁;その内容は参照により本明細書に組み込まれる)。簡潔には脂肪組織をコラーゲナーゼで消化し、沈殿細胞(SVF)及び脂肪細胞を得るために遠心分離した。SVF及び脂肪細胞懸濁液を生理食塩水で2回洗浄した。得られた混合細胞集団を生理食塩水中最終容量5mLに再懸濁した。処置群は、彼らの検査膝にこの細胞懸濁液の関節内注射を独立した放射線科医によって受け、一方プラセボ群は生理食塩水の関節内注射を受けた。参加者及び調査者は、治験全体を通じて処置割り当てについて盲検のままであった。患者を研究全体を通じて有害事象(AE)及び併用薬物療法についてモニターした。

参加者らは、自己報告疼痛質問票(間欠的及び継続的変形性関節症疼痛[ICOAP]指標)を1ヵ月、3ヵ月、6ヵ月及び12ヵ月時に完了させた。軟骨の質は、MRI T2マッピングを使用してベースライン及び処置後6ヵ月で評価した。二次結果測定は、ベースライン、処置後1ヵ月及び6ヵ月での尿及び血清バイオマーカーの評価を含んだ。CTX-IIを尿中で、Royal North Shore HospitalにおいてELISAキットを使用して測定した。尿中クレアチニンレベルもELISAによって測定し、示すすべてのCTX-IIデータをクレアチニン補正する。血清をBio-Rad Bio-Plexキットを使用して48個のサイトカインのパネルについてMacquarie UniversityのAustralian Proteome Analysis Facility (APAF)で分析した。データを、治療意図に基づく解析を使用して分析した。

結果及び考察
この研究は、自己脂肪由来細胞処置が安全で臨床的に可能であることを実証した。処置は、患者によって十分許容され、主要な中期の安全への懸念及び関節感染は無かった。

プラセボ及び自己脂肪由来細胞処置群の両方は、ICOAPによって測定された彼らの総疼痛スコアにおいてベースラインからの大きく統計的に有意な減少を経験し、それは12ヵ月の最終追跡時点まで維持された(図1)。自己報告結果、特に疼痛の観点からプラセボがOA罹患者において処置効果を有することが確立されていたことから、プラセボ群における有意な効果は、予想外ではなかった。

MRIによる軟骨劣化の評価。患者を両膝の放射線画像によってこの治験への組み入れについてスクリーニングした。すべての患者を内側若しくは外側のいずれかのコンパートメントについて国際変形性関節症研究学会(OARSI)等級1又は2関節腔狭窄として、又は関節腔狭窄を伴わない内側若しくは外側のコンパートメントについて骨棘等級2若しくは3と等級付け、プラセボ又は処置群に無作為化した。関節の放射線画像は、関節腔狭窄によって関節軟骨質の間接測定を提供するが、軟組織情報は提供しない。MRIは、軟骨形態及び生理学の評価を可能にする強力で高感度の画像化技術である。MRI T2マッピングは、軟骨の分子含有量及び構造の定量的評価を可能にする。特にT2マッピングは、コラーゲン束配向性及びプロテオグリカン-コラーゲンマトリクスの完全性、並びに水含有量を通じた軟骨傷害の程度を評価する。

MRI T2マッピングをすべての参加者らの検査膝についてベースライン及び処置後6ヵ月で実施した。分析はQmetrics Technologies社、MRI画像化に特化した独立した開発業務受託機関によって実施された。T2マッピングは、軟骨の喪失が処置後6ヵ月の時点では予測より遅かったことを明らかにした。両群が進行している対象よりも安定のままである対象のより大きな割合を示したことが見出された。すべての参加者がOARSI関節腔狭窄等級1又は2を有したが、ベースラインでの軟骨傷害の詳細な評価は組み入れ基準の一部ではなかった。

MRI分析は、ベースラインで自己脂肪由来細胞処置群には進行した軟骨傷害を有する有意に多い参加者がいたことを示し、これはプラセボ群よりも有意に(p 0.03)多い等級4 OA患者が処置群にいたことになる。図2は、MRIによるベースラインでの軟骨傷害の、OA等級によって等級付けられるQMetrics評価を示す。これは、自己脂肪由来細胞処置群をOAの加速した進行になるようにする傾向があり、それにより群間に有意な差異が観察されにくくするが、しかしこのことは観察されなかった。この結果は、自己脂肪由来細胞療法が軟骨劣化を遅くすることによる疾患修飾効果を有する可能性があることを示唆している。

OAバイオマーカーの評価による疾患進行の分析。自己脂肪由来細胞療法の効果を分子レベルで調査するために、OAバイオマーカーを参加者の尿及び血清においてベースライン、処置後1ヵ月及び6ヵ月で測定した。CTX-IIは、II型コラーゲンのC末端テロペプチドであり、尿中で測定される軟骨傷害の非侵襲性マーカーである。この治験では、尿中CTX-IIの31%増加がプラセボ群においてベースラインと6ヵ月の間において観察された(p=0.04;図3)。平均CTX-IIレベルは、自己脂肪由来細胞処置群において治験の過程にわたって減少した。この結果は、所与のMRI分析は、この群が進行した軟骨傷害を有する有意に多い対象をベースラインで含むことから予想外であった。この結果は、自己脂肪由来細胞が進行した軟骨傷害を有する対象においてさえ軟骨劣化を遅くすることを示しているQmetrics T2マッピングMRI結果と相関する。

変形性関節症は歴史的に非炎症性疾患と称されるが、低度炎症がOA疾患進行において主要な役割を演じていることが、今やますます明らかになっている。OAは、劣化及び修復機構の間の不均衡を含み、関節構造全体に影響を与える。炎症への自己脂肪由来細胞療法の効果を調査するために、48個のサイトカイン、ケモカイン及び増殖因子のパネルを参加者らの血清においてAPAF(Macquarie University)で測定及び分析した。

分析は、自己脂肪由来細胞処置がプラセボ群と比較して1及び6ヵ月の両方で炎症を低減させたことを示した。鍵となるサイトカインは、自己脂肪由来細胞処置群において6ヵ月で有意に低減していたマクロファージ遊走阻止因子(MIF)であった(p=0.00;図4)。MIFは、T細胞及び滑膜線維芽細胞を含む多数の細胞によって産生される。MIFは、健常対照よりも膝OAを有する患者の血清及び滑液においてより高いレベルで検出される。MIFは、滑膜線維芽細胞においてマトリクスメタロプロテイナーゼMMP-1及びMMP-3の上方制御を、濃度及び時間依存的様式で誘導する。MMPは、軟骨の破壊において主な役割を有する。したがって、自己脂肪由来細胞処置群における循環MIFレベルの低減は、酵素レベルの減少を介した軟骨劣化の低減を有しやすい。

MRI由来OA等級によるCTX-II結果の層別化。変形性関節症は、一般に人々の膝の両側に発症するが、身体における他の関節にも影響を与える場合がある。OSCAR治験は、自己脂肪由来細胞療法又は生理食塩水のプラセボ注射で片側の膝OAを処置するように設計された。しかしベースラインX線検査スクリーニングは、参加者の大部分が彼らの未処置膝にもOAの徴候を有することを例示した。いくつかの場合では彼らの未処置膝は、彼らの検査膝よりも更に進行した関節腔狭窄及び骨棘スコアを有した。この研究で調査したOAバイオマーカーが治験参加者の血清及び尿において測定されたことから、未処置膝及び他の関節炎の関節における傷害の程度がこれらの結果に寄与する。CTX-IIのレベルが進行した軟骨劣化を有する対象において増加するかどうかを判定するために、結果をMRIによって評価したOA等級によって層別化した。図5A及び図5Bは、MRI由来OA等級によって層別化したプラセボ及び自己脂肪由来細胞処置群についてのCTX-II値を示している。

自己脂肪由来細胞処置群では、15名の等級4のOA患者はベースラインで491ng/mmolの平均CTX-IIレベルを有し、これは6ヵ月で477ng/mmolに低減した。9名のプラセボ等級4のOA患者は、CTX-IIレベルは、ベースラインでの平均490ng/mmolから6ヵ月での702ng/mmolに増加した、43%の増加(p=0.037片側t検定を使用する;p=0.074両側t検定を使用する)。検査及びプラセボからの等級4 OA患者を処置後6ヵ月で比較し、15名の検査患者は、平均477ng/mmolを及び9名のプラセボ患者は702ng/mmolを有する(p値=0.066片側t検定を使用する)。この結果は、進行した軟骨傷害を有するプラセボ群における軟骨劣化が治験の経過にわたって増加したことを示している。対照的に軟骨劣化は、同程度の軟骨傷害を有する自己脂肪由来細胞処置群での参加者のコホートにおいて遅くなっていた。併せてこれらの結果は、自己脂肪由来細胞処置がOAの処置について疾患修飾効果を有しうることを支持している。

OSCARは、OA罹患者における膝疼痛を低減するための自己脂肪由来細胞療法の効果を評価するために設計された世界初の治験である。処置過程は、十分許容され、主要な中期の安全への懸念は無かった。結果は、短期から中期の症状修飾は、プラセボ及び処置群の両方において同様であったことを実証している。軟骨劣化の客観的マーカーは、処置群において低減しており、これは自己脂肪由来細胞療法がOAの進行を遅くし、長期間での結果の改善を生じうることを示すMRI T2マッピングによって支持された。

(実施例2)
MSCでの神経変性疾患の処置
神経変性疾患(モノカルボン酸輸送体8[MCT8]欠損)を有する2名の4歳児を2010年に一度及び2011年に一度培養増殖同種臍帯血由来MSCで処置した。細胞は静脈内に投与した。

図6は、2011年の第2のMSC処置の前のベースラインMIFレベル及び処置後2ヵ月及び5ヵ月でのMIFを示している。MIFでの減少は、少年らが受けた神経学的及び身体的検査での改善と相関している。

少年らは、治療専門家によって常に評価され、彼らのスコアを種々の神経学的及び身体的作業について記録した(図7)。彼らは、各MSC処置後に予想外の増進を示した。音声及び作業療法は、初回MSC処置後に劇的な改善を示した。身体的作業を試みる彼らの能力は、2回目のMSC処置後に著しい改善を示した。

(実施例3)
自己脂肪由来細胞での筋骨格状態の処置
本実施例で言及するデータセットは、HiQCell Joint Registryからの変形性関節症患者を含む。登録プロトコールはBellberry Human Research Ethics Committeeによって認可され、オーストラリア及びニュージーランド臨床試験登録で登録された。HiQCell Treating Practitioners (TMP)は、研究の共同研究者であり、筋骨格状態の診断及び処置について訓練された整形外科医及びスポーツ医を含む。これは、無制限の患者募集での観察的レジストリである。無作為化、対照臨床治験とは異なり、組み入れ又は排除基準はなく、それによりRegeneus公認のTMPでHiQCell処置を受けているすべての患者は、組み入れの対象であり、不均一な集団を生じる。血清及び尿試料は、HiQCell Joint Registry以外のHiQCell患者からも回収した。

方法論
すべての参加者は、脂肪組織およそ100〜200gを採取するために通例の脂肪吸引手順を受けた。組織を以前記載のとおり処理した(Blaber SP、Webster RA、Hill CJら Analysis of in vitro secretion profiles from adipose-derived cell populations. J Transl Med 2012;10:172〜88頁;その内容は参照により本明細書に組み込まれる)。簡潔には脂肪組織をコラーゲナーゼで消化し、沈殿細胞(SVF)及び脂肪細胞を得るために遠心分離した。SVF及び脂肪細胞懸濁液を生理食塩水で2回洗浄した。得られた混合細胞集団を注射される関節の数に応じて生理食塩水中最終容量5mL〜10mLの間に再懸濁した。混合細胞集団の一部を罹患した関節それぞれ注射した。

15名の患者のサブセットでは、結果測定は、ベースライン及び処置後毎月時点での尿及び血清バイオマーカーの評価を含んだ。CTX-IIを尿中でMacquarie UniversityのAustralian Proteome Analysis Facility (APAF)でELISAキットを使用して測定した。尿中クレアチニンレベルもELISAによって測定し、示されたすべてのCTX-IIデータをクレアチニン補正した。血清を軟骨オリゴマー基質タンパク質(COMP)及びMIFについて分析した。COMPは、OA患者において血清レベルの顕著な上昇を有する、変形性関節症及び関連する軟骨劣化の認められたバイオマーカーである(J Orthop Res. 2013 Jul;31(7):999〜1006頁. doi: 10.1002/jor.22324. Epub 2013 Feb 19, Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in knee osteoarthritis: a novel diagnostic and prognostic biomarker)。

結果
2014年7月に、HiQCellで処置した患者総数494名の78%を表す患者合計386名をJoint Registryに含めた。処置したすべての関節についての平均疼痛スコアは、すべての処置後時点で低減した:処置後2週間で24%、6ヵ月で46%、1年で49%及び2年で51%。

図8は、処置前から処置後4ヵ月の血清MIFレベルのボックスプロットを示す。傾向分析は、処置後4ヵ月にわたるMIFレベルにおける有意な(p 0.001)減少を示している。図9及び図10は、処置前から処置後4ヵ月のCTXII及びCOMPについてのボックスプロット及びトレンドラインを示す。傾向は、OSCARS研究(実施例1)において観察されたものと同様であり、軟骨劣化がHiQCell共同レジストリから分析された参加者15名において遅くなったことを示している。併せてこれらの結果は、自己脂肪由来細胞処置がOAの処置に疾患修飾効果を有しうることを支持している。

(実施例4)
MSCでの潰瘍性大腸炎の処置
潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患(IBD)の形態を有する成人2名を、臍帯MSCで処置した。潰瘍性大腸炎は炎症及び大腸の多重潰瘍によって特徴付けられる。個体は、それぞれ2013年に静脈内に投与された培養増殖同種臍帯血由来MSCの単一用量で処置された。図11は、処置後6週間及び12週間で評価した際の測定可能なMIFにおける低減を示している。細胞療法は、炎症を低減すること(血清中の検出可能なMIFによって測定される)及び疾患の症状を低減することに有効であった。

本明細書の実施例において実証したとおり、状態を有する患者からの生物学的試料において判定された客観的バイオマーカーのレベルの相関は、患者における状態の状況を評価する、例えば治療量を患者に投与する適切な時期を判定するために治療医を補助する方法に根拠を提供する。

Claims (13)

1. 炎症性状態に対する間葉系幹細胞療法を有する患者における疾患進行をモニタリングするための方法であって、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料においてバイオマーカーMIFのレベルを判定する工程を含み、前記第1の生物学的試料と比較した前記第2の生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルの変化が疾患進行の指標であり、a)前記第1の生物学的試料が、前記状態に対する療法の開始前に、前記患者から得たベースライン試料であり、前記第2の生物学的試料が、前記状態に対する療法の開始後に、前記患者から得た試料であり、またはb)前記第1の生物学的試料が、前記状態に対する療法の開始後に、前記患者から得た試料であり、前記第2の生物学的試料が、前記第1の生物学的試料の後に、前記患者から得た試料であり、(i)第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルの増加が炎症性状態の病理学的進行又は悪化の指標であり、または(ii)第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルの減少が炎症性状態の安定化又は改善の指標であり、前記療法が、(i)間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置、または(ii)脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置であって、最初の用量が新鮮調製細胞懸濁液の一部を含み、その後の1つ又は複数の用量が凍結保存されていた前記細胞懸濁液の一部を含む処置、または(iii)脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置であって、すべての用量が凍結保存されていた細胞懸濁液を含む処置を含む、方法。
2. (i)第1の生物学的試料は前記療法の開始前の前記患者からのベースライン試料であり、第2の生物学的試料は最初の用量の間葉系幹細胞後の前記患者からの試料であり、バイオマーカーMIFのレベルが第1の試料と比較して第2の試料においておよそ同じである場合、間葉系幹細胞のさらなる用量を投与し、または(ii)第1の及び第2の両方の生物学的試料は最初の用量の間葉系幹細胞後の前記患者からであり、第1の試料と比較して第2の試料においてバイオマーカーMIFのレベルの増加が判定された場合、間葉系幹細胞のさらなる用量を投与する、請求項１に記載の方法。
3. MSCが、自己細胞、同種細胞、臍帯血細胞、及び増殖臍帯血細胞、又はこれらの混合物から選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. (i)炎症性状態が、軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる又は関連する状態である、または(ii)炎症性状態が、変形性関節症、関節リウマチ及び潰瘍性大腸炎といった炎症性腸疾患からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 炎症性状態が、OA又は軟骨傷害若しくは変性によって特徴付けられる若しくは関連する状態から選択され、1つ又は複数の前記生物学的試料におけるCTX-II及びCOMPから選択される少なくとも第2のバイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 軟骨傷害又は変性といった炎症及び組織劣化によって特徴付けられる状態に対する間葉系幹細胞療法を有する患者における疾患進行をモニタリングするための方法であって、前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料における、i)バイオマーカーMIF、またはii) バイオマーカーMIF並びにCOMP及びCTX-IIから選択される少なくとも1つの追加のバイオマーカーのレベルを判定する工程を含み、前記第1の生物学的試料と比較した前記第2の生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルの変化が疾患進行の指標であり、a)前記第1の生物学的試料が、前記状態に対する療法の開始前に、前記患者から得たベースライン試料であり、前記第2の生物学的試料が、前記状態に対する療法の開始後に、前記患者から得た試料であり、またはb)前記第1の生物学的試料が、前記状態に対する療法の開始後に、前記患者から得た試料であり、前記第2の生物学的試料が、前記第1の生物学的試料の後に、前記患者から得た試料であり、前記療法が、(i)間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置、または(ii)脂肪組織由来非脂肪細胞を含む自己脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置であって、最初の用量が新鮮調製細胞懸濁液の一部を含み、その後の1つ又は複数の用量が凍結保存されていた前記細胞懸濁液の一部を含む処置、または(iii)脂肪組織由来非脂肪細胞を含む同種脂肪組織由来細胞懸濁液の経時的多重用量を含む一連の処置であって、すべての用量が凍結保存されていた細胞懸濁液を含む処置を含み、(i)第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルの増加が炎症性状態の病理学的進行又は悪化の指標であり、または(ii)第1の生物学的試料と比較した第2の生物学的試料における前記バイオマーカーの検出可能なレベルの減少が炎症性状態の安定化又は改善の指標である、方法。
7. (i)軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態が、慢性状態である、または(ii)軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態が、変形性関節症(OA)又は関節リウマチ(RA)といった関節炎である、または(iii)軟骨傷害又は変性によって特徴付けられる状態が、軟骨への損傷又は外傷といった急性状態である、請求項６に記載の方法。
8. (i)前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFの2つ以上のレベルを判定する工程を含む、または(ii)前記患者からの少なくとも第1の及び第2の生物学的試料におけるCOMP、CTX-II及びMIFのレベルを判定する工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 第1の生物学的試料が、前記療法の開始前の前記患者からのベースライン試料である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. (i)第2の生物学的試料が、状態の処置の開始後の前記患者からの試料である、または(ii)第2の生物学的試料が、状態の処置の開始1週間から12ヵ月後の前記患者からの試料である、または(iii)第2の生物学的試料が、MSC投与の少なくとも1ヵ月後の前記患者からの試料である、または(iv)第2の生物学的試料が、MSC投与の少なくとも3ヵ月後の前記患者からの試料である、または(v)第1の及び第2の両方の生物学的試料が、前記療法の開始後の患者からの試料である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 第1の生物学的試料が、前記状態の処置の開始前の前記患者からの試料であり、第2の生物学的試料が、処置の開始後の前記患者からの試料であり、前記第1の及び前記第2の試料における前記少なくとも1つのバイオマーカーの判定されたレベルがおよそ同じである場合、間葉系幹細胞のさらなる用量を投与する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記患者からの第3の、第4の、第5のといった生物学的試料といった追加的生物学的試料における前記バイオマーカーのレベルを判定する工程を更に含み、前記生物学的試料のそれぞれが、状態の療法の開始前及び又は後の異なる時期に前記患者から得られたものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 生物学的試料が、循環血液試料又はその画分である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。