KR20160073382A - 세포 치료를 위한 바이오마커들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대상 내의 염증 상태의 진행을 모니터링하기 위한 방법들에 관한 것이다. 특정 실시예들에 있어서, 환자는 염증 상태의 치료를 받으며, 상기 방법은 질환 진행을 모니터하도록, 예를 들면 임상의가 치료 요법을 최적화하는 것을 보조하도록 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 레벨을 모니터링하는 단계를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대상은 중간엽 줄기 세포(MSC)들로의 치료를 받는다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은, 예를 들면 의사가 세포들의 추가 투여량을 투여하는 적절한 시간을 결정하는 것을 보조하기 위해 OA와 같은 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 갖는 환자의 자가 유래 또는 동종 세포 치료의 효능을 모니터링하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법들에 사용되기 위한 키트들 및 구성 성분들을 제공한다.

Description

세포 치료를 위한 바이오마커들{BIOMARKERS FOR CELL THERAPY}

본 발명은 대상 내의 염증 상태(inflammatory condition)의 진행을 모니터링하기 위한 방법들에 관한 것이다. 특정 실시예들에 있어서, 환자는 염증 상태의 치료를 받으며, 상기 방법은 질환 진행을 모니터하도록, 예를 들면 임상의가 치료 요법을 최적화하는 것을 보조하도록 하나 또는 그 이상의 바이오마커들의 레벨을 모니터링하는 단계를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대상은 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)들로의 치료를 받는다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은, 예를 들면 의사가 세포들의 추가 투여량을 투여하는 적절한 시간을 결정하는 것을 보조하기 위해 OA와 같은 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 갖는 환자의 자가 유래 또는 동종 세포 치료의 효능을 모니터링하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법들에서 사용되기 위한 키트들 및 구성 요소들을 제공한다.

염증 및 염증 상태들은 일반 대중에게, 보다 특별하게는 만성 염증 상태들이 계속 진행되고 있는 쇠약해지고 퇴행하는 운동성 및 통증으로 존재할 수 있는 노령화 인구에게 심각한 건강 문제로 존재한다. 염증은 물리적, 화학적 또는 생물학적 제제에 의해 야기되는 손상이나 비정상적인 자극에 대한 반응으로 일어날 수 있다. "염증성(inflammatory)"이라는 용어는 질병들을 참조하여 사용될 때에 부적절하거나 정상적인 방식으로 해결되지 않는 염증으로부터 야기되어 발생되거나, 이를 야기하는 병리학적 과정을 언급한다. 염증성 질병들은 전신성이거나 조직들 또는 기관들에 국소적일 수 있다.

골관절염(osteoarthritis: OA)은 특발성이고, 불치의 만성 및 쇠약성 근골격계 질환(musculoskeletal disease)이며, 오스트레일리아에서 백 사십 만 명의 사람들 이상에 의해 보고된다. OA 개시는 노령화와 매우 밀접한 관계가 있으며, 주요 관찰 증상들은 연골 변화들과 통증이다. 이는 관행적으로 비염증성 질환으로 언급되지만, OA 질환 진행에서 주요 역할을 하는 점이 점점 더 분명해지고 있다. OA를 앓는 환자들은 통상적으로 OA 증상들을 완화시키고 영향을 받은 관절들 내의 통증을 조절하기 위해 비스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug: NSAID)들 및 진통제들로 관리된다. 현재, NSAID들 및 코르티코스테로이드(corticosteroid) 치료도 더 이상 유익하지 않을 때, 유용한 치료는 전체 관절 성형술(joint arthroplasty)이다. 이는 30-60세의 환자들에게 중요한 문제를 제기한다. 많은 정형외과 의사들이 이식이 이들의 수명을 연장시키지 않을 가능성이 있기 때문에 50세 이하의 환자들에 대해 관절 대체를 수행하는 것에 대해 주저하고 있다.

근래 들어, 다양한 질환들에 대한 혁신적인 재생 치료들을 향해 의학적 연구에서 이동이 있었다. 관절염과 같은 관절 질환들에 있어서, 많은 연구 그룹들이 잠재적인 재생 치료로서 성인 중간엽 줄기 세포(MSC)들의 사용을 탐구하기 위해 OA의 동물 모델들을 이용하고 있다. 급성 및 만성 연골 손상의 동물 모델들에 있어서, MSC들로의 치료는 OA-유사 질환 진행, 연골 손상, 골돌기체(osteophyte) 형성 및 연골하 비후에서 반월상 및 유리질 연골 재생과 교정을 생성한다. 이들 세포들은 또한 생물 활성적 인자들의 분비를 통해 상당한 항염증 및 면역조절 효과들을 가지는 것으로 입증되었다. 지방 조직은 골수에 비해 그램당 500-1000배 많은 MSC들을 함유하기 때문에 치료 목적들을 위한 세포들의 특히 매력적인 소스이다. MSC들의 풍부함과 함께, 지방 조직은 또한 면역 세포들, 혈관 평활근 세포들, 내피 세포들 및 주피 세포들을 포함하며, 이들은 총괄적으로 세포 기질 분획(SVF)으로 언급된다. 표준 지방흡인 기술들을 통해 많은 양의 지방 조직을 얻는 능력 및 상기 SVF를 신속하게 분리하는 능력은 임상적으로 동일한 날의 치료 과정들을 가능하게 한다.

예를 들면, 모두의 개시 사항들이 상호 참조로 여기에 포함되는 국제 특허 출원 PCT/AU2009/001070(WO2010/020005)(발명의 명칭: "지방세포들을 포함하는 지방조직 유래 세포 서스펜션들을 사용하는 치료 방법들(Therapeutic methods using adipose tissue-derived cell suspensions comprising adipocytes)") 및 오스트레일리아 특허 출원 제2009201915호에는 OA를 포함하는 근골격 상태(musculoskeletal condition)들의 치료를 위한 자가 지방 조직 세포(autologous adipose-derived cell) 요법이 기재되어 있다.

오스트레일리아 특허 출원 제2013204930호(발명의 명칭: "세포들의 다중 주사들을 이용한 치료법(Therapeutics using multiple injections of cells)")에는 단일 투여량에 비해 개선된 치료 결과를 제공하도록 계획된 주사들의 과정으로서 놀랍게도 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션(autologous adipose tissue-derived cell suspension)이 후속되는 투여를 위해 냉동될 수 있고 회수될 수 있는 점을 확인하였던 것이 기재되어 있다. 여기서는, 놀랍게도 이와 같은 냉동된 세포들이 동결 저장으로부터 회수된 후에 세포들의 배양을 필요로 하지 않고 사용될 수 있는 점이 기재되어 있다. AU 2013204930에 기재된 바와 같이, 이는 대상에게 시간에 걸쳐 지방 조직 유래 비지방 세포(non-adipocyte cell)들을 포함하는 자가-유래 지방조직 유래 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여함에 의해 발명자들이 골관절염과 통증들을 포함하는 다양한 다른 상태들을 치료하는 개선된 방법을 개발하게 하였으며, 여기서 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 후속되는 투여량이나 투여량들은 냉동되어 저장되는 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함한다.

염증 상태들, OA 및 관련 질환들뿐만 아니라 연골 손상 또는 퇴행이 수반되는 다른 상태들이 있는 환자들의 치료에 보조되는 추가적인 방법들에 대한 필요성이 남아 있다.

본 발명자는 치료하는 의사가 환자 내의 염증 상태(inflammatory condition)의 진행을 결정하는 것을 보조하도록, 예를 들면 환자에 대한 치료적 투여량(therapeutic dose), 예를 들면, MSC들의 투여량 또는 자가유래(autologous) 또는 동종(allogenic) 세포 서스펜션이 될 수 있는 지방 조직 유래 세포 서스펜션(adipose tissue-derived cell suspension)의 투여량을 환자에게 투여하는 적절한 시간에 관한 결정을 안내하는 것을 보조하는 방법, 특히 통증 점수들이나 불편함 레벨들의 자가 보고와 같이 환자들 자신의 주관적인 평가와 독립적인 방법을 사용하는 것이 유리할 수 있는 점을 인지하였다.

여기에 기재되는 바와 같이, 방법들은 염증 상태의 진행을 평가하고, 염증으로 특징지어지는 상태들의 중간엽 세포 기반의 치료(mesenchymal cell-based therapy)를 위한 적절한 치료 시간을 확인하는 것을 보조하도록 바이오마커들(biomarkers)의 사용을 제공한다. 본 발명자는 대식세포 이동 저해 인자(macrophage migration inhibitory factor: MIF)가 OA, 신경변성 질환(neurodegenerative disease) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 같은 염증 상태들에 대한 중간엽 줄기 세포 치료가 진행되는 환자들의 혈청(serum)에서 검출 가능한 점과 검출 가능한 MIF의 레벨들이 상기 염증 상태의 안정화 또는 개선과 같은 치료 결과와 연관성이 있는 점을 확인하였다. 특정 실시예에 있어서, OA의 치료에서 여기에 예시되는 것은, 감소된 연골 퇴행과 같이 치료 결과와 연관성이 있는 검출 가능한 MIF의 레벨들이다. MIF는 손상된 조직의 퇴행을 자극하는 염증성 시토카인(inflammatory cytokine)이다.

본 발명자는 또한 CTX-II, 제2형 콜라겐(type II collagen)의 C-말단 텔로펩티드(telopeptide)가 OA에 대한 치료가 진행되고 있는 환자들의 혈청과 오줌 내에서 검출 가능한 점과 검출 가능한 CTX-II의 레벨들이 연골 퇴행과 연관성이 있는 점을 확인하였다. MIF의 혈청 레벨들은 MSC 치료 후에, 예를 들면 OA에서 관찰되는 감소된 조직 퇴행과 연관성이 있고, 감소된 혈청 MIF는 연골 퇴행의 마커인 감소된 오줌 CTX II와 연관성이 있다.

본 발명자는 또한 COMP가 OA와 잘 관련된 추가적인 연골 치료에 특이적인 분해 생성물인 점을 확인하였다. 이는 질환의 진행 동안에 (혈청 내에서)증가된다. CTX로서와 같이, 여기의 실험예들은 후-치료(post-treatment) 안정화 또는 이러한 마커의 약간의 감소를 입증한다.

이에 따라, 본 발명의 일 측면에 있어서, 염증 상태를 갖는 환자 내의 질환 진행을 모니터링하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플(biological sample) 내의 바이오마커(biomarker) MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 레벨의 변화는 질환 진행을 나타낸다. 이러한 용어들에서, 질환 진행은 상기 상태가 악화되었거나, 안정화되었거나, 개선되었던 것을 나타낼 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 증가는 상기 염증 상태의 병리학적 진행 또는 악화를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 감소는 상기 염증 상태의 안정화 또는 개선을 나타낸다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 시간에 걸쳐 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션의 다중 투여량(dose)들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포(non-adipocyte cell)들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션(autologous adipose tissue-derived cell suspension)의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하고, 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 후속되는 투여량 또는 투여량들은 냉동되어 저장되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 방법은 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션(allogeneic adipose tissue-derived cell suspension)의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 모든 투여량들은 냉동되어 저장되었던 세포 서스펜션을 포함하고, 상기 방법은 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 치료의 개시 이전의 상기 대상으로부터의 기초 샘플(baseline sample)이며, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 제1 투여량 후의 상기 대상으로부터의 샘플이고, 상기 바이오마커 MIF의 레벨이 상기 제1 샘플과 비교해 상기 제2 샘플에서 대략 동일할 경우, 상기 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 대상에 투여되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

본 발명의 다른 측면은 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 이전의 상기 대상으로부터의 기초 샘플이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 제1 투여량 후의 상기 대상으로부터의 샘플이며, 상기 바이오마커 MIF의 레벨이 상기 제1 샘플과 비교해 상기 제2 샘플에서 대략 동일할 경우, 상기 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 세포 서스펜션의 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

본 발명의 다른 측면은 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 제1 투여량 후에 상기 대상으로부터 얻어지며, 상기 제1 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커 MIF의 레벨의 증가가 결정될 경우, 상기 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 대상에 투여되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

본 발명의 다른 측면은 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 제1 투여량 후에 상기 대상으로부터 유래되고, 상기 제1 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커 MIF의 레벨의 증가가 결정될 경우, 상기 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 세포 서스펜션의 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

일 실시예에 있어서, 상기 MSC들은 자가 유래(autologous) 세포들, 동종(allogeneic) 세포들, 제대혈 세포(cord blood cell)들, 증량된 제대혈 세포(expanded cord blood cell)들 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다.

일 실시예에 있어서, 상기 염증 상태는 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지거나 관련된다. 일 실시예에 있어서, 상기 염증 상태는 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일 실시예에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis)이다.

일 실시예에 있어서, 염증 상태를 모니터링하거나 치료하는 방법에서, 상기 염증 상태는 OA 또는 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지거나 관련되는 상태로부터 선택되며, 상기 생물학적 샘플 또는 샘플들 내의 CTX-II 및 COMP로부터 선택되는 적어도 제2의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 연골 손상 또는 퇴행과 같은 염증 및 조직 퇴화로 특징지어지는 상태를 갖는 환자 내의 질환 진행을 모니터링하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 레벨의 변화가 질환 진행을 나타낸다. 이러한 용어들에서, 질환 진행은 상기 상태가 악화되었거나, 안정화되었거나, 개선되었던 것이 될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 시간에 걸쳐 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하고, 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 후속되는 투여량 또는 투여량들은 냉동되어 저장되었던 상기 세포 서스펜션 의 일부를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포를 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하고, 모든 투여량들은 냉동되어 저장되었던 세포 서스펜션을 포함하며, 상기 방법은 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

일 실시예에 있어서, 제1 생물학적 샘플과 비교해 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 증가는 상기 상태의 병리학적 진행 또는 악화를 나타낸다. 일 실시예에 있어서, 제1 생물학적 샘플과 비교해 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 감소는 상기 상태의 안정화 또는 개선을 나타낸다.

일 실시예에 있어서, 상기 세포 서스펜션은 동종 세포 서스펜션이며, 상기 환자는 고양이, 개 또는 말과 같은 비인간 동물이다.

일 실시예에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 만성 상태이다. 일 실시예에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 관절염(arthritis)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 골관절염(osteoarthritis: OA) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis: RA)이다.

일 실시예에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 연골에 대한 손상 또는 외상과 같은 급성 상태이다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF의 둘 또는 그 이상의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함한다.

상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들은 수집의 시간에서 분리되는 상기 환자로부터의 임의의 두 샘플들이 될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 기초 샘플이다. 일 실시예에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 샘플이다. 일 실시예에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 후의 1주 내지 12개월의 상기 환자로부터의 샘플이다. 일 실시예에 있어서, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 샘플들이다.

일 실시예에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 샘플이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 샘플이며, 상기 제1 및 제2 샘플들 내의 상기 적어도 하나의 바이오마커의 결정된 레벨이 대략 동일할 경우, 상기 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 제3, 제4, 제5 등의 생물학적 샘플과 같은 상기 환자로부터의 추가적인 생물학적 샘플들 내의 상기 바이오마커의 레벨들을 결정하는 단계를 더 포함하며, 각각의 상기 생물학적 샘플들은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전 및/또는 후의 다른 시간들에서 상기 환자로부터 얻어진다. 예를 들면, 제1 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전에 상기 환자로부터의 샘플일 수 있으며. 제2 및 후속하는 생물학적 샘플들은 상기 상태에 대한 치료의 개시 후의 대략 1개월의 간격들에서 상기 환자로부터의 샘플 또는 샘플들일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈청이다. 일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 오줌(urine)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 CTX-II이고, 상기 생물학적 샘플은 오줌 또는 혈청이다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 MIF이고, 상기 생물학적 샘플은 혈청이다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커는 COMP이고, 상기 생물학적 샘플은 혈청이다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료의 방법은 상기 환자에게 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상의 레벨들을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 기초 샘플이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 제1 투여량 후의 상기 환자로부터의 샘플이며, 상기 제1 샘플과 비교해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 적어도 하나의 레벨이 대략 동일할 경우, 상기 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 환자에게 투여되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료의 방법은 상기 환자에게 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상의 레벨들을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 기초 샘플이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 제1 투여량 후의 상기 환자로부터의 샘플이며, 상기 제1 샘플과 비교해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 적어도 하나의 레벨이 대략 동일할 경우, 상기 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 세포 서스펜션의 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것들이다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료의 방법은 상기 환자에게 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상의 레벨들을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 제1 투여량 후에 상기 환자로부터 얻어지고, 상기 제1 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 적어도 하나의 레벨의 증가가 결정되는 경우, 상기 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 환자에게 투여되었던 상기 세포 서스펜션의 일부이고, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료의 방법은 상기 환자에게 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상의 레벨들을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 제1 투여량 후에 상기 환자로부터 유래되고, 상기 제1 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 적어도 하나의 레벨의 증가가 결정되는 경우, 상기 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 세포 서스펜션의 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것들이다.

일 실시예에 있어서, 상기 환자는 인간이며, 본 발명의 방법은 의사(medical practitione)에 의하거나, 의사의 감독 하에서 사람이나 사람들에 의하거나, 이들의 조합에 의해 수행된다.

일 실시예에 있어서, 상기 환자는 인간이며, 상기 방법의 모든 단계들은 상기 방법을 통해 상기 환자의 임상적 관리에 대해 주된 책임이 있는 등록 의사에 의하거나 그의 감독 하에서 수행된다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법의 하나 또는 그 이상의 단계(들)은 상기 의사의 감독 하에서 사람이나 사람들에 의해 실행된다. 일 실시예에 있어서, 상기 방법의 총괄적 단계들은 복수의 개인들에 의해 수행된다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법의 총괄적 단계들은 다중 위치들에서 수행된다. 일 실시예에 있어서, 상기 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계는 투여량을 투여하는 단계, 분석을 위해 생물학적 샘플을 제조하는 단계, 또는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨들 결정하는 단계의 하나 또는 그 이상에 대해 다른 위치에서 수행된다.

앞서 기술한 본 발명의 요약이 본 발이나 다른 특징들을 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 이점들은 다음의 바람직한 실시예들의 상세한 설명뿐만 아니라 특허 청구범위로부터 명백해 질 것이다.

도 1: 시험 전체에 걸친 플라시보(placebo) 및 치료 그룹들에 대한 ICOAP 전체 통증 점수들. 데이터는 평균±평균의 표준 편차(SEM)로 나타낸다.
도 2: 시험 참가자들의 시험 무릎 내의 연골 손상의 기초 큐메트릭스(QMetrics) MRI 평가.
도 3: 시험 참가자들의 오줌 내에서 측정된 크레아티닌(creatinine) 보정된 CTX-II 레벨들. 데이터는 평균±평균의 표준 편차(SEM)로 나타낸다.
도 4: 기초 및 6개월에서의 시험 참가자들의 순환 혈청 MIF 레벨들. 데이터는 평균±log₂형광 값(fluorescence value)의 SEM으로 나타낸다.
도 5: 치료(A) 및 플라시보(B) 그룹들에서 기초 MRI 유래 OA 등급들에 의한 CTX-II 데이터의 계층화. 데이터는 평균±평균의 표준 편차(SEM)로 나타낸다.
도 6: 신경변성 질환이 있는 두 명의 소년들에서 2011년의 제2의 MSC 치료 전의 기초 MIF 레벨들 및 2개월 및 5개월의 후-치료에서 MIF의 레벨들.
도 7: 다양한 신경적 및 물리적 과제들에 대해 기록된 이들의 점수들을 나타내는 MSC들로의 치료 후의 신경변성 질환이 있는 두 명의 소년들의 치료 전문가들에 의한 평가의 결과들.
도 8: 기초 및 4개월의 후-치료에서 하이큐셀(HiQCell) 환자들 내의 순환 혈청 MIF 레벨들. 정규화된 대식세포 이동 저해 인자(MIF). 도표 상의 y-값은 혼합 효과 모델로부터 예측된 log2(Val)이다. 상자 그림들 상부에 도시된 라인은 혼합 모델의 오프셋(offset) -1.388 및 기울기 -0.06848로부터 결정되었다. 통계학적으로, 상기 기울기는 0.001의 p-값으로 0로부터 상당히 다르다. 혼합 선형 모델이 사용되었고, 환자 ID들이 11 레벨들로 무선 효과(random effect) 및 8레벨들로 고정된 인자 시간을 형성하였다. Val은 MIF 측정 판독: log2(Val)~Time＋(1|ID)을 나타낸다.
도 9: 기초 및 4개월의 후-치료에서 크레아티닌 보정된 오줌 CTX 레벨들 하이큐셀 관절 레지스트리 환자들의 상자 그림들. 시간 경향 혼합 모델로부터 정규화된 CTX. 도표 상의 y-값은 혼합 효과 모델로부터 예측된 log2(Val)이다. 상자 그림들 상부에 도시된 라인은 혼합 모델 오프셋 -1.173 및 기울기 0.01265로부터 결정되었다. 통계학적으로, 상기 기울기는 0.983의 p-값으로 0로부터 상당히 다르지 않았다. 혼합 성형 모델이 이용되었고 환자 ID들은 12레벨들로 무선 효과 및 8레벨들로 시간 고정 인자를 형성하였다. Val은 ELISA 흡광 판독: log2(Val)~Time＋(1|ID)을 나타낸다.
도 10: 기초 및 4개월의 후-치료에서 혈청 COMP 레벨들 하이큐셀 관절 레지스트리 환자들의 상자 그림들. 시간 경향 효과 모델로부터 정규화된 COMP. 도표 상의 y-값은 혼합 효과 모델로부터 예측된 log2(Val)이다. 통계학적으로, 기울기는 0.285의 p-값으로 0으로부터 상당히 다르지 않았다. 혼합 선형 모델이 이용되었고, 환자 ID들은 12레벨들로 무선 효과 및 8레벨들로 시간 고정 인자를 형성하였다. Val은 ELISA 흡광 판독:log2(Val)~Time＋(1|ID)을 나타낸다.
도 11: 궤양성 대장염이 있는 두 명의 성인들에서 2014년의 MSC 치료 및 6주 및 12주의 후-치료에서의 MIF의 기초 혈청 MIF 레벨들. 궤양성 대장염이 있는 두 명의 성인들은 배양 증량된 동종 제대혈 유래 MSC들로 2013년에 한 번 치료되었다. 세포들은 정맥으로 투여되었다.

약어들

여기서 사용되는 경우에 SVF는 세포 기질 분획(stromal vascular fraction)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 CTX-II는 제2형 콜라겐(type II collagen)의 C-텔로펩티드(telopeptide)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 MIF는 대식세포 이동 저해 인자(macrophage migration inhibitory factor)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 OA는 골관절염(osteoarthritis)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 RA는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 NSAID들은 비스테로이드성 항염증 약물(non-steroidal anti-inflammatory drug)들에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 ICOAP는 간헐적 및 지속적 골관절통(Intermittent and Continuous Osteoarthritis Pain)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 OSCARS는 골관절염 줄기 세포 선행 조사 연구(Osteoarthritis Stem Cell Advanced Research Study)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 OARSI는 국제 골관절염 연구회(Osteoarthritis Research Society International)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 MSC들은 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)들에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 COMP는 연골 올리고체 기질 단백질(cartilage oligomeric matrix protein)에 대한 약어이다.

여기서 사용되는 경우에 HSC들은 조혈 줄기 세포들(Hematopoeitic Stem Cell)들에 대한 약어이다.

정의들

본 명세서에 있어서, 여기에 사용되는 경우에 "약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable)"이라는 용어는 캐리어(carrier)들, 희석제(diluent)들, 냉동 보존제(cryopreservative)들 등의 본 발명에 관련된 다양한 성분들에 대해 인간 대상에 대한 투여를 위해 적합할 수 있는 이와 같은 성분들뿐만 아니라 비인간 포유동물 대상에 대한 투여를 위해 적할 수 있는 것들을 포괄하도록 의도된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 성분은 비인간 포유동물 대상에 대한 투여를 위해 적합할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 성분은 인간 대상에 대한 투여를 위해 적합할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 성분은 비인간 포유동물 대상에 대해서와 인간 대상에 대한 투여를 위해 적합할 수 있다.

본 문에서 다르게 기재되지 않는 한, 장애(disorder), 상태(condition) 및 질환(disease)이라는 용어들은 대체로 상호 교환적으로 여기에 사용된다.

본 명세서의 내용에서 "치료하는", "치료", "치료법" 및 유사한 용어들은 증상들 및/또는 염증(inflammation)이나 염증 상태 또는 골관절염과 같은 상태 또는 질환의 선행 원인(underlying cause), 또는 연골 손상이나 퇴행 또는 건 손상(tendon injury)이나 통증과 연관되거나 특징지어지는 상태의 완화를 언급한다. 특정 실시예들에 있어서, 치료는 장애 또는 장애나 손상의 증상들의 진행을 느리게 하거나, 지연시키거나 또는 중단시키거나, 적어도 일시적으로 상기 장애나 손상의 진행을 역행시킬 것이다. 따라서, 본 발명의 내용에서, "치료"라는 단어나 "치료하는"과 같은 그 파생어들은 치료 적용과 관련하여 사용될 때에 치료되는 상태와 관련된 통증의 완화, 치료되는 상태의 경중도(severity)의 완화, 치료되는 상태의 하나 또는 그 이상의 증상들의 개선 등과 같은 치료법의 모든 측면들을 포함한다. "치료"라는 단어 또는 그 파생어들의 사용은 "치료되는" 대상이 전술한 혜택들의 임의의 하나 또는 그 이상을 경험할 수 있는 점을 의미하도록 이해될 것이다.

본 명세서에 걸쳐서, "일" 또는 "하나"의 요소에 대한 언급은, 본 문에서 다르게 판단되지 않는 한, 복수를 배제하는 것은 아니다. 유사하게, "일 실시예"에 대한 언급은, 본 문에서 다르게 판단되지 않는 한, 기재되는 하나 또는 그 이상의 다른 실시예들과 결합되어 적용되는 기술되는 실시예의 특징을 배제하는 것은 아니다.

여기에 사용되는 경우에 "치료적인 유효량(therapeutically effective amount)"이라는 용어는 원하는 치료 효과를 제공하도록 본 발명에 사용되기 위한 화합물이나 조성물의 무독성이지만 그 충분한 양을 의미하는 것을 포함한다. 요구되는 정확한 양은 치료되는 종들, 대상의 연령과 일반 건강, 공존 질환들(co-morbidities), 치료되는 상태의 경중도, 투여되는 특정 약제, 투여의 모드 등등과 같은 인자들에 따라 대상들마다 변할 것이다. 따라서, 임의의 주어진 경우에 대하여, 적절한 "유효량"은 통상적인 방법들만을 사용하여 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서의 내용에 있어서, "포함하는"이라는 용어는 포함하지만, 필수적으로 단독으로 포함하는 것을 의미하지는 않는다. 또한, "포함하다" 및 "포함하여"와 같은 "포함하는"이라는 단어의 변형들은 상응하여 변화되는 의미들을 가진다. 따라서, "포함하는"이라는 용어와 그 변형들은 배타적인 의미보다는 포괄적인 의미로 사용되므로 정수 A를 포함하는 또는 정수 A 및 B를 포함하는 등으로 기재되는 조성물, 방법 등에 추가적인 정수들이나 특징들이 선택적으로 존재할 수 있다.

본 명세서의 내용에 있어서, "약" 및 "대략"이라는 용어들은 해당 기술 분야의 숙련자가 주어진 값들과 관련시킬 수 있는 통상의 오차들을 나타내는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서의 내용에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 하위 범위들을 포함하는 것과 같이 기재된 범위 내의 임의의 하위 범위들을 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값들과 범위를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 하위 범위를 포함하는 것과 같이 기재된 범위 내의 임의의 하위 범위를 포함하며, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값과 범위를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서의 내용에 있어서, "복수" 및 "다중"이라는 용어들은 하나보다 큰 임의의 숫자를 의미한다.

치료 또는 치유에서 본 발명의 방법들 및 조성물들의 사용에 대한 여기서의 언급이 인간 및 수의과 치료의 적용들과 같은 비인간에 적용 가능한 것으로 이해될 것인 점에 유의한다. 따라서, 다르게 기재되는 경우를 제외하면, 환자, 대상 또는 개체에 대한 언급이, 이에 한정되는 것은 아니지만, 양(ovine), 소(bovine), 말(equine), 돼지(porcine), 고양이(feline), 개(canine), 영장류(primates), 설치류(rodents), 특히 양들, 소들, 말들, 돼지들 및 개들과 같이 이들 분류들의 가정이나 농장의 구성원들을 포함하는 분류들의 구성원들을 포함하여 사회적, 경제적, 농업적 또는 조사 중요도의 임의의 종들의 개체와 같은 인간 또는 비인간을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 다양한 실시예들이나 측면들의 예들이 여기에 기재되는 경우, 이들은 대체로 "와(과) 같은"이나 "예를 들면" 또는 "포함하는"을 포함하는 적절한 용어들에 의해 기재될 것이다. 상기 예들이 예시의 목적 또는 본 문에서 다르게 기재되지 않는 한 한정으로 제공되지 않는 이해들을 위한 것과 같이 가능성들을 포함하는 것으로 기재되는 점이 이해될 것이다.

여기에 언급되는 약학 조성물(pharmaceutical composition)은 또한 치료적 용도를 위해 의도된 때와 같이 약제로서 언급된다. 따라서, 본 발명이 의도된 치료적 목적에 대한 약학 조성물의 제조를 위해 기재되는 성분들의 조성물의 사용을 포함하는 것으로 기재되며, 이러한 기재가 본 문에서 다르게 나타내지 않는 한 상기 의도된 치료적 목적에 대한 약제의 제조를 위한 사용과 동일한 의미인 점이 이해될 것이다.

허용되는 정도까지 여기에 언급되는 모든 참조 문헌들은 전체적으로 여기에 참조로 포함된다.

여기서의 문헌들의 임의의 기재 사항 또는 여기서 이들 문헌들로부터 유래되는 서술들은 상기 문헌들 또는 유래된 기재들이 오스트레일리아나 기타 지역에서 관련 기술의 공통적 일반 지식의 일부인 것으로 승인되지는 않는다.

MSC들을 포함하는 자가 유래 또는 동종 세포 서스펜션의 투여에 의해 신경변성 질환(neurodegenerative disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis)을 포함하는 염증성 장 질환, 크론병(Crohn's disease)을 포함하는 자가면역 질환(autoimmune disease) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)뿐만 아니라 다른 만성 염증 상태들과 같은 염증 상태들의 치료를 위한 알려진 방법들에 있어서, 치료하는 의사는 통증, 신경 기능, 운동성, 내시경 검사, 생체 검사의 조직 검사 및 영상과 같은 다양한 인자들에 기초하는 치료적 투여량을 투여하는 적절한 시간을 평가한다. 그러나, 각각의 이들 방법들은 단점들을 가지며, 많은 경우들에서 증상들이 평가 가능한 방식으로 변화하기 전에 상당한 조직 손상이 발생된다. 일부 경우들에 있어서, 상기 평가 도구들은 생체 검사의 내시경 및 조직 검사와 같이 침입성이다. 다른 경우들에 있어서, 상기 환자가 치료하는 의사에게 지침이 되도록 증상들의 정확한 평가를 제공할 수 없다. 바이오마커들(biomarkers)은 분자 레벨에서 손상의 파급을 수량화하여 영상 및 다른 평가 도구들을 위한 매우 효과적인 보조제를 제공할 수 있다. 본 발명자는 바이오마커 분석이 영상 전에 질환 상태의 조기 진단을 가능하게 하며, 다른 평가 기술들이 이를 정확하게 반영할 것으로 예상한다.

OA, RA뿐만 아니라 다른 만성적인 상태들 및 급성 연골 손상들과 같은 연골 손상이나 퇴행에 의하거나, 자가 또는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 투여에 의해 특징지어지는 상태들의 치료를 위한 알려진 방법들에 있어서, 치료하는 의사는 통증과 운동성 및 영상과 같은 다양한 인자들에 기초하는 치료적 투여량을 투여하는 적절한 시간을 평가한다. 그러나, 각각의 이들 방법들은 단점들을 가진다. 예를 들면, 자기 공명 영상(MRI)에 의한 영상에 의하는 것과 같이 영향을 받은 관절의 물리적 상태에 기초하는 평가는 비용이 비싸고, 충분한 전문지식과 사회 기반시설이 용이하게 이용될 수 없는 상황에서는 시간이 소요된다. 상기 평가가 통증 점수(pain score)들 또는 운동성의 자가 보고와 같은 주관적인 측정들에 기초할 경우, 난제들이 야기될 수 있다. 예를 들면, 자가 보고된 통증과 생활 점수들의 질이 항상 급성 조직 손상과 밀접하게 연관되지는 않는다. 즉, OA에서, 이들은 연골 손상의 범위와 밀접하게 연관되지 않을 수 있다. X-선 및 MRI를 포함하여 관절들을 영상화하는 많은 방식들이 있지만, 이들 각각은 조직 손상의 범위의 매우 상세한 영상을 제공하는 측면에서 불완전하다. 바이오마커들은 분자 레벨에서 손상의 범위를 수량화하여 영상과 통증 점수들에 매우 효과적인 보조제를 제공할 수 있다. 본 발명자는 바이오마커 분석이 영상 전에 질환 상태의 조기 진단을 가능하게 하며, 기술들이 이를 정확하게 반영할 것으로 예상한다.

또한, 통증 및 운동성에 관한 문제들의 하나는 환자가 이들 시스템들을 보고하는 시간까지는 질환이 진행되었고 관절 내의 다른 손상이 발생되었다는 점이다. 증상들의 시작 이전에 치료함으로써, 상기 질환의 진행이 중단될 수 있거나 느려질 수 있다. 동일한 점은 다른 염증 상태들에 대해서도 사실로 된다.

평가의 후자의 형태의 의미는 추가 투여량을 투여하는 결정이 이루어졌기 전에 환자들의 상태가 악화될 것이거나, 적어도 이들의 불쾌감 레벨들이 증가될 것이거나 및/또는 이들의 운동성이 악화될 것인 점이다. 개개의 환자에 대해 특이적인 임의의 형태의 평가에 대한 선택으로서, 치료의 과정은 예를 들면, 3개월 후, 또는 6개월 후의 이전의 투여량 이래로 경과되었던 특정 기간 후에 투여되는 추가 투여량과 같이 주기적 투여에 근거할 수 있다. 단순한 시간 기반의 평가의 단점은 퇴행이나 염증의 레벨이 체중, 운동 레벨 및 운동의 유형과 같은 많은 것들에 의존할 것인 점을 포함하여 개체들의 특별한 상황들과의 특별한 관련성을 가질 수 없다는 것이다.

본 발명자는 MIF가 염증 상태를 갖는 환자들로부터의 혈청 내에서 검출 가능한 점 및 상기 검출 가능한 레벨들이 상기 염증이나 상태의 임상적 진행에 대한 마커로서 기능하는 점을 확인하였다. 따라서, 상기 염증 상태가 악화됨에 따라 상기 MIF 증가의 검출 가능한 레벨들이 증가하는 반면, 상기 상태가 개선됨에 따라 상기 검출 가능한 레벨들이 감소된다. 그 결과, 염증 상태가 있는 환자 내의 질환 진행을 모니터링하기 위한 방법이 여기에 기재되며, 상기 방법은 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 상기 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제1 생물학적 샘플과 비교하여 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 레벨의 변화는 질환 진행을 나타낸다.

질환 진행을 모니터하는 능력은 임상의가 염증 상태를 갖는 환자를 위한 치료 요법을 개선하거나 최적화하도록 보조하는 데서 유용성이 찾아진다. 예를 들면, 본 발명은 치료를 요구하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상에 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 방법은 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 상기 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함한다.

본 발명자는 또한 OA 및 다른 근골격 상태(musculoskeletal condition)들에 대해 치료되는 환자로부터의 연골 특이적 콜라겐 조각(fragment)(제2형 콜라겐의 C-텔로펩티드; CTX-II)이 오줌(urine) 내에서 검출 가능하고, COMP가 혈청(serum) 내에서 검출 가능하며, 대식세포 이동 저해 인자(MIF)가 혈청 내에서 검출 가능한 점을 확인할 수 있었다. 특히, 여기에 기재되는 바와 같이, CTX-II 레벨들은 상기 치료 그룹 내에서 감소되었지만, 기초(baseline)(즉, 치료 이전) 및 6개월 사이의 플라시보(placebo) 그룹 내에서 상당히 증가되었다. 상기 MIF의 혈청 레벨인, 연골 퇴행 경로에서 수반되는 키 시토카인(key cytokine)의 상당한 감소가 상기 치료 그룹 내에서 관찰되었다. 본 발명자는 이에 따라 여기서 상기 환자로부터의 생물학적 샘플들 내의 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상의 검출이 치료하는 의사에게 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 투여량을 투여하는 적절하거나 최적의 시간을 결정하는 것을 돕도록 사용될 수 있는 점을 설명한다. 이들 바이오마커들이 본 발명자에 의해 치료되는 연골의 병태의 변화를 나타내도록 상정되기 때문에, 여기에 개시되는 방법들은 또한 RA뿐만 아니라 다른 만성 상태들 및 급성 연골 손상들과 같은 연골 손상이나 퇴행으로 특징지어지는 다른 상태들의 치료에 적용된다.

비록 여기서의 실험예들은 본 발명의 방법들이 배양 증량된(culture expanded) 동종 제대혈(allogeneic umbilical cord blood) 유래 MSC들로부터와 같은 중간엽 줄기 세포들일 때, 또는 자가 유래 세포 서스펜션들이 치료제일 때에 적절한 점을 입증하지만, 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 PCT/AU2009/001070(WO2010/020005)(발명의 명칭: "지방 세포들을 포함하는 지방조직 유래 세포 서스펜션을 사용하는 치료 방법들(Therapeutic methods using adipose tissue derived cell suspension comprising adipocytes)")는 동종 세포 서스펜션들 또한 이와 같은 상태들을 치료하는 데 사용되는 점을 증명하고 있다. 이에 따라, 여기서의 본 발명의 방법들은 또한 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션을 사용하는 환자들의 적절한 치료를 보조하는 적용을 가진다.

상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들은 수집의 시간에서 분리되는 상기 환자로부터의 임의의 두 샘플들일 수 있다. "제1" 및 "제2"에 대한 언급은 이들이 연대순으로 상기 환자로부터 수집된 제1 및 제2 샘플들이고; 이들이 단순히 다른 시간들에서 상기 환자로부터 얻어졌던 두 샘플들이며, 상기 "제2"는 상기 "제1" 샘플 후에 얻어졌던 점을 나타내도록 의도된다. 이에 따라 추가적인 샘플들이 상기 바이오마커의 레벨들이 결정되는 상기 "제1" 및 "제2" 샘플들로서 언급되는 샘플들 전, 후 또는 사이의 임의의 시간에서 상기 환자로부터 얻어질 수 있었던 점이 이해될 것이다. 임의의 또는 모든 추가적인 샘플들 또한 바이오마커 레벨들에 대해 분석될 수 있다.

또한, 예를 들면, 제1 생물학적 샘플 내의 바이오마커의 레벨을 결정하는 것에 대한 언급이, 예를 들면 상기 바이오마커들의 하나가 혈청 내에서 결정되도록 요구되거나 요구하며, 다른 생물학적 마커가 샘플이 오줌 샘플 내에서 결장되도록 요구되거나 요구하는 동일한 시간에서 결정되는 경우에 동일한 시간에서 취해지는 두 샘플들 내의 레벨을 결정하는 것을 의미할 수 있다. 내용을 더 예시하기 위해, 상기 방법은, 예를 들면, 제1 생물학적 샘플 내의 MIF 및 of CTX-II의 레벨을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 MIF의 레벨이 혈청 샘플을 사용하여 결정되고, 상기 CTX-II의 레벨이 오줌 샘플을 사용하여 결정될 경우, 상기 혈청 및 상기 오줌 샘플들은 동일한 시간에서 얻어지며, 이에 따라, 본 문에서, 이들은 총괄적으로 제1 생물학적 샘플을 나타낸다. 따라서, 생물학적 샘플은 동일한 시간에서 환자로부터 얻어진 다른 유형의 두 샘플들(예를 들면, 하나는 오줌, 하나는 혈청)로 구성될 수 있다. 비록 제1 생물학적 샘플에 관하여 예시하고 설명하지만, 동일한 사항이 임의의 다른 숫자의 샘플에 동등하게 적용된다.

상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터 얻어지는 샘플이 될 수 있다. 이와 같은 샘플은 또한 기초 샘플(baseline sample)로도 언급될 수 있다. 실제로, 이러한 샘플은 상기 치료의 개시와 같은 날에 얻어질 수 있고, 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨들이 상기 치료의 제1 투여량의 투여에 의해 즉시 영향을 받지 않을 것으로 예상될 수 있기 때문에 실제로 치료의 제1 투여량(dose)의 투여 후에 곧 얻어질 수 있다. 따라서, 상기 치료의 개시 "이전에" 상기 환자로부터 얻어지는 제1 또는 기초 생물학적 샘플에 대한 언급은 치료 투여량으로부터 약 24시간 이내의 검출 가능한 후-치료(pre-treatment) 레벨들로부터 변화되지 않는 것으로 알려진 바이오마커에 대하여 상기 치료의 초기 투여량의 투여 후의 약 24시간 이내에 상기 환자로부터 얻어지는 생물학적 샘플도 포괄하는 것으로 이해될 것이다.

상기 제1 생물학적 샘플은 상기 염증 상태의 치료의 개시 후의 삼기 환자로부터의 샘플일 수 있다. 예시적인 실시예에 있어서, 예를 들면, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 후의 대략 1개월 후에 상기 환자로부터 얻어지는 샘플일 수 있고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 후의 대략 3, 4, 5 또는 6개월 후에 상기 환자로부터 얻어지는 샘플일 수 있다. 이러한 시나리오에 있어서, 치료적 투여량의 결과로서 환자의 상태의 개선은 상기 후-치료 또는 기초 레벨들과 비교하여 상기 제1 후-치료 샘플 내의 감소된 MIF의 레벨에 반영될 수 있고, 상기 제1 후-치료 샘플과 비교한 MIF의 제2의 후-처리 레벨의 증가는 상기 기초 상태에서의 악화를 나타낼 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 의사는, 예를 들면 상기 상태의 초기 개선이나 안정화 후에 상기 염증 상태의 퇴행이나 악화를 모니터하기 위해 본 발명의 방법들을 채용할 수 있다. 그 결과, 상기 치료하는 의사는 상기 MSC들의 추가 투여량, 또는 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션, 또는 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션을 투여하는 것이 적절한 지를 결정할 수 있다. 통상적으로, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 환자에게 투여되었던 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 일부가 될 수 있으며, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었다.

이러한 방식으로, 상기 방법은 의사에게 개개의 환자 내의 염증 상태의 진행으로 특징지어지는 객관적인 측정을 제공한다. 상기 방법은 상기 환자 또는 영향을 받은 관절의 운동성의 증가나 감소, 상기 환자에 의해 보고되는 통증 점수들의 증가나 감소, 또는 초음파 또는 MRI에 의한 분석, 상기환자의 인지 능력의 변화들, 또는 상기 환자의 복부 불편의 변화들과 같은 상기 MSC들 또는 세포 서스펜션의 제2 또는 후속되는 투여량을 투여하는 적절한 시간을 결정하도록 상기 환자의 염증 상태의 상황을 평가하기 위해 상기 의사가 사용할 수 있는 다른 측정들과 함께 사용될 수 있다. 특정한 추가적인 기준은 상기 염증 상태의 기초적 성질에 의존할 수 있다.

예시적인 실시예에 있어서, 예를 들면, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 후의 대략 1개월에 상기 환자로부터의 샘플이 될 수 있고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 후의 대략 3, 4, 5 또는 6개월 후의 상기 환자로부터의 샘플이 될 수 있다. 이러한 시나리오에 있어서, 투여량의 결과로서 환자의 상태의 개선은 상기 후-치료 또는 기초 레벨들과 비교하여 상기 제1 후-치료 샘플 내의 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상 의 감소된 레벨로 반영될 수 있으며, 상기 제1 후-치료 샘플과 비교하여 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 하나 또는 그 이상의 제2 후-치료 레벨들의 감소는 상기 기초 상태의 악화를 나타낼 수 있다. 이러한 방식으로, 의사는, 예를 들면 상기 상태의 초기 개선이나 안정 후에 상기 상태의 퇴행 또는 악화에 대해 모니터하도록 본 발명의 방법들을 채용할 수 있다. 그 결과, 치료하는 의사는 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 것이 적절한 지를 결정할 수 있다. 통상적으로, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 환자에게 투여되었던 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 일부가 될 수 있고, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것이다.

이러한 방식으로, 상기 방법은 의사에게 OA, RA 또는 연골 손상과 같은 개개의 환자 내의 상태의 진행으로 특징지어지는 객관적인 측정을 제공한다. 상기 방법은 상기 환자 또는 영향을 받은 관절의 운동성의 증가나 감소, 상기 환자에 의해 보고되는 통증 점수들의 증가나 감소, 또는 초음파 또는 MRI에 의한 분석과 같이 상기 세포 서스펜션의 제2 또는 후속되는 투여량을 투여하는 적절한 시간을 평가하기 위해 상기 의사에게 이용될 수 있는 다른 측정들과 함께 사용될 수 있다.

상기 바이오마커들의 하나 또는 그 이상의 레벨들을 모니터링함에 의해, 의사는, 예를 들면, 환자들이 관절에 대한 불편감이나 통증 점수들을 경험하거나 보고하기 전에, 또는 환자들이 상기 영향을 받은 관절의 운동성의 감소를 경험하거나 보고하기 전에 상기 영향을 받은 관절의 악화를 확인할 수 있다. 여기에 기재되는 방법들에 기초하여 제2 또는 후속되는 투여량을 투여함에 의해, 의사는 또한 그렇지 않으면 상기 환자에 의해 경험되는 통증의 상당한 증가 또는 상기 환자에 의해 경험되는 운동성의 상당한 감소를 가졌던 것을 감소시키는 것과 같이 이와 같은 악화의 효과나 지속성을 감소시킬 수 있다.

상기 바이오마커들 의 하나 또는 그 이상의 레벨을 모니터링하는 것은 환자로부터의 샘플들 내의 COMP, CTX-II 및 MIF의 적어도 하나의 레벨들의 환자 특이적 연표의 시간에 걸친 축적을 포함할 수 있다. 예를 들면, 의사는 상기 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 하나 또는 그 이상의 샘플을 포함하는 "기초(baseline)" 측정을 가질 수 있고, 상기 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 임의의 숫자의 샘플들을 가질 수 있다. 상기 샘플들은 1개월마다, 또는 3개월마다 또는 6개월마다와 같은 규칙적인 간격으로 얻어질 수 있거나, 1주로부터 6개월 또는 12개월로 구분되는 임의의 기간과 같이 불규칙한 간격으로 얻어질 수 있다. 상기 기초 상태 또는 상기 바이오마커들의 하나 또는 그 이상의 레벨에서 상대적으로 빠른 변화들이 예상되는 경우, 샘플들 사이의 시간 간격은 상기 의사가 관련된 변화들에 대해 상기 환자를 밀접하게 모니터하게 하기 위하여 통상적으로 짧을 수 있다. 상기 기초 상태 또는 상기 바이오마커들의 하나 또는 그 이상의 레벨들의 상대적으로 느린 변화들이 예상되는 경우, 샘플들은 통상적으로 덜 자주 얻어질 수 있다.

상기 생물학적 샘플 또는 샘플들 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 것은 동시에 이루어질 수 있으므로, 상기 제1, 제2 및 존재할 경우에 추가적인 샘플들이 모두 동시에 결정될 수 있다. 선택적으로는, 상기 샘플(들)의 하나 또는 그 이상이 다른 샘플 또는 샘플들과 다른 시간에서 상기 바이오마커 또는 바이오마커들에 대해 평가될 수 있다. 예를 들면, 각 샘플은 수집 후에 곧 상기 바이오마커의 레벨에 대해 평가될 수 있다.

여기서의 예들에 대한 도면들을 참조하여, 본 발명의 실시예들이 다음과 같이 예시된다.

여기에 나타낸 바와 같이, 상기 바이오마커들 COMP, CTX II 및 MIF는 재치료의 지표들로 이용될 수 있다. 환자들 사이에 자연적인 생물학적 변화들이 있을 것이지만, 성공적인 지방조직 유래 세포 서스펜션(cell suspension) 치료는 MIF를 감소시킬 것이고, CTX II를 안정화시키거나 감소시킬 것이며, COMP를 안정화시키거나 감소시킬 것이다. 후-치료 모니터링은 중요 포인트들이 되는 COMP, CTX II 및 MIF의 후-치료 기초 레벨들로서 상기 연골 퇴행 과정이 문제가 있는 레벨들에 도달되었을 때를 나타낼 것이다. COMP, CTX 및 MIF의 후-치료 레벨들이, 예를 들면 후-치료 레벨들로 다시 또는 부근으로 증가할 때, 의사는 연골 퇴행이 활성인 강한 지표를 얻을 수 있다. 치료되는 상태가 염증 상태일 경우, 바람직한 바이오마커는 MIF이다.

본 발명은 이에 따라 연골 퇴행의 상태에 대한 지표들을 제공하고, 이에 따라 OA, RA 등과 같은 연골 퇴행 및 연골 손상들로 특징지어지는 상태들의 지표들을 제공하는 이후에 결합되어 사용되는 다중 바이오마커들의 사용을 포함한다. 본 발명은 또한 자가 또는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션들로의 치료를 포함하는 중간엽 줄기 세포들의 치료 이전에 및 그 동안에 염증 질환의 상태의 지표를 제공하도록 개별적인 바이오마커들, 바람직하게는 MIF의 사용을 포함한다.

골관절염 및 여기에 언급되는 다른 상태들을 치료하는 방법들

개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 함께 계류 중인 오스트레일리아 특허 출원 제2013204930호(발명의 명칭: "세포들의 다중 주입들을 이용한 치료법(Therapeutics using multiple injections of cells)")에 기재된 바와 같이, 상기 대상에 기간에 걸쳐 투여되는 지방조직 유래 비지방 세포(non-adipocyte cell)들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 다중 투여를 이용하는 골관절염의 치료의 과정은 이전에 알려진 치료들에 비해 상기 대상에 개선된 결과들을 제공할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션은 통상적으로 상기 환자로부터의 단일의 지방조직 추출로부터 제조되었고, 유용한 부분들이나 부분 표본들로 분리되었던 것들이며, 제1 투여량은 상기 세포 서스펜션의 제조 후에 투여되고, 다른 부분들은 제2 및, 적절한 경우, 요구되는 투여량이 저장으로부터 회수되고 상기 대상에 투여되는 시간인 제3, 제4, 제5 등의 투여량들이 요구될 때까지 적절한 조건들 하에서 저장된다.

예를 들면, 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 PCT/AU2009/001070(WO2010/020005)(발명의 명칭: "지방 세포들을 포함하는 지방조직 유래 세포 서스펜션을 사용하는 치료 방법들(Therapeutic methods using adipose tissue derived cell suspension comprising adipocytes)")에 나타난 바와 같이, 동종 세포 서스펜션들도 이러한 상태들의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 여기에 기재되는 방법들 또한 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션을 활용하는 치료들에 적용된다.

예를 들면, 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 PCT/AU2012/001140(WO2013/040649)(발명의 명칭: "지방 세포들 및 세포 분비물들을 이용한 치료법(Therapeutics using adipose cells and cell secretions)")에 나타난 바와 같이, 지방조직 유래 비지방 세포들 및 세포 분비물들의 MSC들과 같은 MSC들의 결합을 포함하는 조성물들도 여기서 언급되는 이러한 상태들의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 여기에 기재되는 방법들 또한 이와 같은 결합들을 사용하는 치료들에 적용된다.

본 발명은 OA 또는 상기 상태를 갖는 환자 내의 임상적인 진행을 모니터링하기 위한 방법들을 제공함에 의해 골관절염 및 연골 퇴행, 손상 또는 외상(trauma)을 수반하는 다른 상태들을 치료하는 방법들에 대한 추가적인 개선점들을 제공하며, 상기 방법들은 OA 또는 상기 상태의 치료를 위한 방법들과 독립적으로 이용될 수 있거나, 바람직하게는 이와 같은 치료를 위한 방법들과 함께 사용될 수 있다. 여기서의 방법들은 또한 염증 상태들의 치료에 적용된다.

특히, 환자가 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 시간에 대한 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정으로 치료되는 결합된 방법을 활용하는 것과 같이 상기 환자에 대한 전체적인 치료 계획으로 통합될 때에, 본 발명의 방법들은 치료하는 의사 또는 환자에게 이점을 제공할 수 있으며, 여기서 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 후속되는 투여량이나 투여량들은 동결되어 저장되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 방법은 또한 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨들을 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 치료 과정에 있어서, 상기 후속되는 투여량들의 하나 또는 그 이상의 투여의 타이밍은, 예를 들면 상기 적어도 하나의 바이오마커의 레벨이 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플에서 클 경우에 상기 적어도 하나의 바이오마커의 레벨에 기초하여 결정된다.

바람직한 실시예들에 있어서, 적어도 상기 바이오마커 MIF의 레벨은 단독으로 또는 COMP 및 CTX-II의 하나 또는 그 이상과 함께 추가적으로 결정된다.

염증성 질환들(inflammatory disorders)

여기에 기재되는 방법들은 대상 내의 염증성 질환의 치료에 대해 및/또는 염증성 질환과 관련된 통증을 완화시키기 위해 적용될 수 있다. 염증성 질환 및 염증 상태라는 용어들이 본 문에서 다르게 기재되지 않는 한 여기서는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 점이 이해될 것이다.

염증은 물리적, 화학적 또는 생물학적 제제들에 의해 야기되는 손상이나 비정상 자극에 대한 반응으로서 유발될 수 있다. 염증 반응은 국소 반응들과 결과적인 형태적 변화들, 파괴 또는 손상을 입히는 물질의 제거 및 복구와 치유를 가져오는 반응들을 포함할 수 있다. "염증성(inflammatory)"이라는 용어는 장애를 참조하여 사용되는 때에 적절하지 않거나 정상적인 방식으로 해결되지 않는 염증으로부터 야기되거나 염증을 야기하는 병리학적 과정을 언급한다. 염증성 질환들은 전신성이 될 수 있거나, 특정한 조직들 또는 기관들에 대해 국소적이 될 수 있다

염증은, 이에 한정되는 것은 아니지만: 전신성 염증 반응(Systemic Inflammatory Response: SIRS); 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)(그리고 만성 신경세포염증(chronic neuroinflammation), 신경 교세포 활성화(glial activation); 상승된 미세아교세포(microglia); 신경반 형성(neuritic plaque formation) 및 치료에 대한 반응을 포함하는 관련 상태들과 증상들); 근위축성 측삭 경화증(Amyotropic Lateral Sclerosis: ALS), 관절염(그리고, 이에 한정되는 것은 아니지만: 급성 관절 염증, 항원 유도 관절염(antigen-induced arthritis), 만성 림프구성 갑상선염(chronic lymphocytic thyroiditis)과 관련된 관절염, 콜라겐 유발 관절염(collagen-induced arthritis), 연소성 관절염(juvenile arthritis); 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 예후 및 연쇄상구균 유도 관절염(streptococcus-induced arthritis), 척추관절증들(spondyloarthopathies), gouty arthritis)을 포함하는 관련 상태들과 증상들), 천식(그리고 기관지 천식(bronchial asthma); 만성 폐쇄성 기도 질환(chronic obstructive airway disease); 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease), 연소성 천식(juvenile asthma) 및 직업성 천식(occupational asthma)을 포함하는 연관 상태들과 증상들); 심혈관계 질환들(그리고 죽상동맥액경화증(atherosclerosis)을 포함하는 관련된 상태들과 증상들; 자가면역성 심근염(autoimmune myocarditis), 만성 심장 저산소증(chronic cardiac hypoxia), 울혈성 심부전(congestive heart failure), 관상 동맥 질환(coronary artery disease), 대동맥 평활근 세포 활성화(aortic smooth muscle cell activation); 심장 세포 사멸(cardiac cell apoptosis); 및 심장 세포 기능의 면역 조절(immunomodulation)을 포함하는 심근증(cardiomyopathy) 및 심장 세포 손실(cardiac cell dysfunction); 자가면역성 당뇨병, 인슐린 의존형(제1형) 당뇨병, 당뇨 치주염(diabetic periodontitis), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy) 및 당뇨 신장병증(diabetic nephropathy)을 포함하는 당뇨병 및 관련된 상태들); 위장 염증들(gastrointestinal inflammations)(셀리악병(celiac disease), 관련 골감소증(osteopenia), 만성 대장염, 크론병, 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염); 위궤양들(gastric ulcers)을 포함하는 관련 상태들과 증상들); 바이러스성 및 다른 유형들의 간염(hepatitis)과 같은 간염증들, 콜레스테롤 담석증(cholesterol gallstones) 및 간섬유증(hepatic fibrosis), 퇴행성 반응들(degenerative responses), 신경변성 반응들(neurodegenerative responses) 및 HIV 관련 호지킨병(Hodgkin's Disease)을 포함하는 HIV 감염 및 관련 상태들, 급성 열성 피부점막 림프절 증후군(mucocutaneous lymph node syndrome), 경부 림프절비대(cervical lymphadenopathy), 관상 동맥 병변들(coronary artery lesions), 부종(edema), 발열(fever), 상승된 백혈구들(leukocytes), 경증 빈혈(mild anemia), 피부 벗겨짐(peeling), 발진(rash), 결막 발적(conjunctiva redness), 혈소판 증가증(thrombocytosis)을 포함하는 카와사키 증후군(Kawasaki's Syndrome) 및 관련 질환들과 상태들; 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 및 관련 상태들과 같은 피부염(dermatitis)을 포함하는 피부의 염증성 질환들; 다발성 경화증(multiple sclerosis), 당뇨성 신장 질환(diabetic nephropathy), 말기 신장 질환(endstage renal disease), 급성 및 만성 사구체 신염(glomerulonephritis), 급성 및 만성 간질성 신염(interstitial nephritis), 루푸스 신염(lupus nephritis), 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 혈액투석 생존(hemodialysis survival) 및 신장의 허헐 재관류 손상(renal ischemic reperfusion injury)을 포함하는 신장병증들 및 관련 질환들과 상태들, 급성 신경퇴화(neurodegeneration), 노화에서의 IL-I의 유도 및 신경변성 질환, 시상하부 신경세포들(hypothalamic neurons)의 IL-I 유도 형성성(plasticity) 및 만성 스트레스 기도과민증(chronic stress hyperresponsiveness)을 포함하는 신경변성 질환들 및 관련 질환들과 상태들, 당뇨 망막병증, 그레이브스 안병증(Graves' ophthalmopathy) 및 포도막염(uveitis)을 포함하는 안병증들(ophthalmopathies) 및 관련 질환들과 상태들, 폐포(alveolar), 대퇴(femoral), 요골(radial), 척추 또는 손목뼈 손실이나 골절 사건, 폐경기후 골 손실(postmenopausal bone loss), 골량, 골절 사건 또는 골 손실률을 포함하는 골다공증(osteoporosis) 및 관련 질환들과 상태들, 중이염(otitis media)(성인 또는 소아), 췌장염(pancreatitis)이나 췌장 소포염(pancreatic acinitis), 성인, 조기 발명 및 당뇨성을 포함하는 치주 질환(periodontal disease) 및 관련 질환들과 상태들; 만성 폐 질환, 만성 부비동염(chronic sinusitis), 하알린 막증(hyaline membrane disease), SIDS에서의 저산소증과 폐질환 등을 포함하는 폐 질환들; 관상동맥 또는 다른 혈관 이식편들(vascular grafts)의 재협착증(restenosis); 류마티스 관절염, 류머티스 아숍 소체들(rheumatic Aschoff bodies), 류마티스성 질환들 및 류마티스성 심근염(rheumatic myocarditis)을 포함하는 류머티즘(rheumatism); 만성 림프구성 갑상선염(chronic lymphocytic thyroiditis)을 포함하는 갑상선염; 만성 전립선염(chronic prostatitis), 만성 골반 통증 증후군(chronic pelvic pain syndrome) 및 요로 결석증(urolithiasis)을 포함하는 요로 감염증들(urinary tract infections), 원형 탈모증(alopecia aerata)과 같은 자가면역성 질환들을 포한하는 면역계 질환들, 자가면역성 심근염, 그레이브스병(Graves' disease), 그레이브스 안병증, 경화성 태선(lichen sclerosis), 다발성 경화증, 건선(psoriasis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 경피증(systemic sclerosis), 갑상선(thyroid) 질환들(예를 들면, 갑상선종(goitre) 및 갑상샘종(struma) 갑상선종(lymphomatosa)(하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 림프종성 갑상선종(lymphadenoid goitre)), 수면 장애들 및 만성 피로 증후군과 비만(비당노성 또는 당뇨병과 관련된), 라슈마니아종(Leishmaniasis)과 같은 감염증에 대한 저항, 한센병(Leprosy), 라임병(Lyme Disease), 라임 심장염(Lyme Carditis), 말라리아(malaria), 뇌 말라리아, 뇌수막염(meningitis), 말라리아와 관련된 세뇨관간질성 신염(tubulointerstitial nephritis), 박테리아, 바이러스들 등에 기인하는 경우들(예를 들면, 거대세포바이러스(cytomegalovirus), 뇌염(encephalitis), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus), 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus), 인플루엔자 바이러스) 또는 원생몽둘들(protozoans)(예를 들면, 열대말라리아원충(Plasmodium falciparum), 파동 편모충들(trypanosomes)), 뇌 외상(cerebral trauma)(뇌졸중들과 허혈들(ischemias), 뇌염, 뇌병증들(encephalopathies), 뇌전증(epilepsy), 주산기 뇌손상(perinatal brain injury), 지속성 열성 발작(prolonged febrile seizures), SIDS 및 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage)을 포함하는)을 포함하는 외상에 대한 반응, 저체중아(low birth weight)(예를 들면, 뇌성마비(cerebral palsy)), 폐 손상(급성 출혈성 폐 손상(acute hemorrhagic lung injury), 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 급성 허혈성 뇌졸중(acute ischemic reperfusion)), 심근 기능장애(myocardial dysfunction), 직업성 및 환경적 오염원들에 의해 야기되는 경우들(예를 들면, 독성 오일 증후군 규폐증에 대한 민감성), 방사선 외상(radiation trauma) 및 상처 치유 반응의 효능(예를 들면, 화상이나 열적 상처들, 만성 창상들, 수술 창상들 및 척수 손상들(spinal cord injuries)), 패혈증(septicemia), 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism), 산소 의존성(oxygen dependence), 두개골 이상(cranial abnormality), 이른 갱년기(early onset menopause), 이식에 대한 대상의 반응(거부 또는 수용), 급성기 반응(예들 들면, 열 반응(febrile response)), 일반적인 염증 반응, 급성 호흡 곤란 반응(respiratory distress response), 급성 전신성 염증 반응(acute systemic inflammatory response), 상처 치유(wound healing), 유착(adhesion), 면역염증성 반응(immunoinflammatory response), 신경 내분비 반응(neuroendocrine response), 발열 진행 및 저항, 급성기 반응(acute-phase response), 스트레스 반응, 이병성(disease susceptibility), 반복 운동 스트레스(repetitive motion stress), 테니스 엘보우(tennis elbow), 인대 및 근 문제들, 그리고 통증 관리 및 반응을 포함하는 많은 질환들에서 일어나는 것으로 알려져 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염(arthritis)과 같은 관절-관련 염증성 질환이다.

본 발명의 방법들 및 조성물들은 인대(ligament) 손상들 및 건(tendon) 손상들의 치료를 위해서나, 이와 같은 손상들과 관련된 통증의 완화를 위해 사용될 수 있다. 인대 손상들 및 건 손상들은, 일부 형태들에서, 염증성 질환들로 분류될 수 있다. 일부 인대 손상들 및 건 손상들은 염증성 질환들로 간주되지 않을 수 있다. 혼동의 여지를 방지하기 위해, 본 발명에서 고려되는 인대 손상들 및 건 손상들은 염증성 질환들이거나 이와 관련되는 경우들 및 고려되는 염증성 질환들이 아닌 경우들이 될 수 있다.

다음 설명들은 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션들의 공급원과 제조, MSC들을 포함하는 세포 서스펜션들, 그리고 환자에게 투여될 수 있는 이와 같은 치료의 과정에 의한 방법들을 기술한다.

지방조직

본 발명의 치료 방법들에 사용되는 세포 서스펜션들은 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션들 또는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션들이다. 지방조직은 치료의 대상에 따라서와 자가 유래 또는 동종 세포 서스펜션이 사용되는 지에 따라서 인간 지방조직 또는 포유동물의 동물 지방조직이 될 수 있다. 상기 지방조직은 "백색" 지방조직 또는 "갈색" 지방조직을 포함할 수 있다.

상기 지방조직은 상기 대상의 신체 또는 동종 물질의 경우에는 접근 가능한 공여자의 신체 내의 임의의 소스로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 피하 지방은 표피상의 상처만으로, 또는 "키홀 수술(keyhole surgery)" 기술들에 의해 쉽게 접근 가능하다. 예를 들면, 지방조직은 지방 흡인 기술(liposuction technique)들을 이용하여 수집된 조직, 또는 수컷 또는 암컷 동물의 성별을 제거할 때에 생식 조직과 함께 제거되는 지방조직이 될 수 있다. 상기 지방 조직은 의도되는 치료의 대상에 수행되는 미용 시술 동안에 수집될 수 있다. 상기 지방 조직은 나타난 상태를 위해 상기 대상의 의도되는 치료의 일부로서 특별히 수집될 수 있다. 상기 지방 조직은 부착된 혈액 세포들을 제거하기 위해 조직 배지(culture medium) 또는 완충 등장 용액으로 세정될 수 있으며, 지방조직 유래 세포 서스펜션을 생성하기 이전에 큰 혈관들이나 결합 조직 요소들을 제거하기 위해 다듬어지거나 거칠게 처리될 수 있다.

상기 지방조직은 성숙한 동물로부터 또는 어린 동물로부터 유래될 수 있다.

특정 실시예들에 있어서, 상기 대상 또는 환자는 개과 또는 고양이과 가축과 같은 애완동물이나 일하는 동물이다. 다른 특정한 실시예들에 있어서, 상기 대상 또는 환자는 말, 당나귀, 나귀, 소, 버펄로, 양, 염소, 낙타 또는 돼지로부터 선택되는 농장 동물이나 경주용 동물이다. 다른 특정 실시예들에 있어서, 상기 대상 또는 환자는 인간이다. 통상적으로, 상기 환자가 인간일 경우, 상기 지방조직은 자가 유래성이다.

지방조직 유래 세포 서스펜션

여기서 사용되는 경우에 "지방조직 유래 세포 서스펜션(adipose tissue-derived cell suspension)"이라는 용어는 지방조직 또는 지방조직의 작은 응집체들이나 조각들, 또는 분리된 세포들 및 지방조직의 작은 응집체들이나 조각들의 둘 또는 그 이상의 혼합물로부터 분리된 세포들을 포괄한다. 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함한다. 상기 세포 서스펜션은 해당 기술 분야에서 용이하게 이용할 수 있는 기술들을 이용하여 지방조직을 기계적으로 해리시켜 얻어질 수 있다. 지방조직의 기계적인 해리를 위한 임의의 적합한 방법은, 예를 들면 칼날들이나 가위로 지방조직을 다지거나, 상기 조직을 지방조직의 분리된 세포 또는 작은 조각들로 파쇄하기에 충분한 구멍 크기를 갖는 스크린들이나 메시들을 통과시키거나, 이들 기술들의 조합에 의해 이용될 수 있다. 지방조직의 작은 응집체들은 해리된 지방-유래 세포들이, 예를 들면 배지 내에 대기하면서 보다 큰 응집체들로 재응집될 때에 형성될 수 있다. 지방조직의 작은 조각들이나 응집체들은 십 밀리미터 보다 작은 직경, 오 밀리미터 보다 작은 직경, 일 밀리미터 보다 작은 직경, 500㎛ 보다 작은 직경, 또는 250㎛ 보다 작은 직경이 될 수 있다.

상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 메시나 스크린의 구멍 크기보다 큰 세포 응집체들 또는 조직 조각들을 제거하기 위해 메시나 스크린을 통해 여과될 수 있다.

단백질 분해요소(proteolytic enzyme)들이 지방조직 유래 세포 서스펜션 내로 지방조직의 해리를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 용도를 위해 적합한 효소들은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 트립신(trypsin) 및 콜라게나아제(collagenase)를 포함한다. 이들 효소들이 세포들의 원하는 체내 사용과 양립되지 않을 수 있기 때문에, 상기 지방조직 유래 세포 추출물을 사용하기 전에 상기 단백질 분해효소들을 제거 및/또는 비활성화시키는 것이 통상적이다. 상기 단백질 분해효소들은 지방조직 유래 세포 서스펜션을 생성하도록 지방조직의 기계적인 해리를 위한 기술들과 결합되어 사용될 수 있다.

기계적인 해리 기술은 하나 또는 그 이상의 단백질 분해효소들을 사용하지 않고 이용될 수 있다. 이러한 방식으로 이용되는 기술은 지방조직 유래 세포 서스펜션을 신속하게 생성하도록 이용될 수 있다.

상기 세포 서스펜션은 액체 내에 현탁될 수 있다. 상기 액체는 상기 지방조직의 해리 전에, 그 동안에 또는 후에 상기 지방조직에 첨가될 수 있다. 상기 액체는 적절한 배양 조건들 하에서 적어도 24시간 동안 지방조직 세포 생존을 유지할 수 있는 배지를 포함할 수 있다. 상기 액체는 적어도 한 시간 동안 지방조직 세포 생존을 유지할 수 있는 인산염(phosphate) 또는 HEPES 완충 식염수와 같은 등장 완충액을 포함할 수 있다. 상기 액체는 조직 배지를 포함할 수 있다. 상기 액체는 상기 세포 서스펜션 내에서 지방조직 세포 생존을 유지하거나 연장시키는 혈청 또는 혈청 성분들을 포함할 수 있다. 상기 혈청 또는 혈청 구성 성분들은 자가 유래 혈청 또는 혈청 성분들이 될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 세포 서스펜션은 첨가된 액체를 포함하지 않을 수 있으며, 대신에 상기 세포들이 상기 조직의 해리 동안에 형성되는 액체 내에 현탁된다.

상기 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제조는 원심 분리 단계를 포함할 수 있다. 배지와 같은 액체 내에 현탁된 지방조직의 분리된 세포들 또는 작은 응집체들이나 조각들의 원심 분리는 배지의 층상에 결국 생존 가능한 지방세포들을 포함하는 층이 부유하고, 상부에 파열된 지방세포들로부터 유래되는 지질의 층이 부유하는 지방-유래 비지방 세포들을 포함하는 세포 펠릿(cell pellet)을 생성하도록 10분 동안 대략 500g 또는 충분한 중력(g-force)에서 충분한 시간 동안 수행된다. 원심 분리 후에, 특정 실시예들에서, 지방층 및 배지층은 버려질 것이며, 생존 가능한 지방세포들 및 지방-유래 비지방 세포들을 포함하는 지방조직 유래 세포 서스펜션을 남기면서 유지된 세포들이 혼합된다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 생존 가능한 지방세포들을 포함하는 층만이 유지될 것이다.

다른 실시예들에 있어서, 지방세포들을 포함하는 층은 제거될 수 있으며, 이에 따라 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션 내에 포함되지 않을 수 있다. 이는 통상적으로 지방세포들이 실질적으로 없는 지방조직 유래 세포 서스펜션을 제조할 때에 발생될 것이다. 여기서 지방세포들이 실질적으로 없는 것으로 언급되는 세포 서스펜션은 상기 세포 서스펜션이 원심 분리 후의 지방세포 부분의 제거와 같이 상기 출발 물질에 비해 현저하게 고갈된 지방세포들을 가졌던 것을 의미한다. 세포 서스펜션에 대하여 사용될 때에 지방세포들이 실질적으로 없는 것이 지방세포들의 완전한 부존재를 포함하며, 또한 상기 물질 내의 지방세포들의 최소한의 유지가 일어났던 상황을 포함하는 점이 이해될 것이다.

다른 실시예들에 있어서, 상기 지방조직의 지방세포 함량의 일부만이 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제조에서 제거될 수 있다. 이 경우, 결과적인 세포 서스펜션은 지방세포들을 포함할 것이지만, 출발 물질 내의 비율에 비하여 줄기 세포들과 같은 다른 유지된 성분들에 대해 감소된 비율을 가질 것이다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 적어도 10체적%의 지방세포들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 10체적% 내지 30체적%의 지방세포들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 적어도 10수량%의 지방세포들을 포함한다(즉, 상기 세포 서스펜션 내의 세포들의 전체 숫자의 적어도 10%가 지방세포들이다). 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 적어도 20수량%의 지방세포들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 적어도 30수량%의 지방세포들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 10수량% 내지 30수량%의 지방세포들을 포함한다.

하나의 원심 분리 단계 또는 다중 원심 분리 단계들이, 예를 들면 추가적인 세포 분리 단계들을 제공하도록 이용될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제조는 원심 분리 단계를 포함하지 않는다.

상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 생존 가능한 지방세포들을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 존재할 때, 상기 지방세포들은 이들의 세포질(cytoplasm) 내에 지질의 검출 가능한 양을 유지할 수 있고, 상기 지질에 의해 제공되는 다른 밀도에 기초하여 지방-유래 비지방 세포들로부터 분리될 수 있다. 지질은 위상 대비 현미경 관찰(phase contrast microscopy)을 포함하는 광학 현미경 관찰 기술들을 이용하거나, 오일 레드 오(Oil Red O)와 같은 친유성 염료(lipophilic dye)로 세포들의 샘플을 착색하여 검출될 수 있다.이들의 세포질 내에 지질을 보유하는 지방세포들은 다른 지방-유래 세포들보다 상당히 파괴되기 쉬우며, 이에 따라 생존 가능한 지방세포들을 원하는 경우에, 지방세포들의 보다 큰 비율을 손상시키거나 죽이는 조직을 해리시키기 위한 기술들은 회피되어야 한다. 지방조직의 초음파 해리 또는 지방조직이 힘차게 흔들리는 기술들은, 예를 들면, 보다 많은 숫자의 생존 가능한 지방세포들을 함유하는 세포 서스펜션을 제공할 가능성이 낮다. 지방세포들의 생존 가능성은 LIVE/DEAD 세포 생존 가능성 분석(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))와 같이 쉽게 이용할 수 있는 기술들을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.

상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 지방세포들 및 지방-유래 비지방 세포들 모두를 포함할 수 있다. 상기 지방 유래 비지장 세포들은 통상적으로 중간엽 줄기 세포들을 포함하는 세포 기질 분획(stromal vascular fraction)의 세포들을 포함한다. 상기 세포 기질 분획의 세포들은 통상적으로 지방조직 유래 세포 서스펜션의 여기에 기재되는 원심 분리 조건들에 따라 펠릿으로 된다.

지방세포들 및 지방-유래 비지방 세포들 모두를 포함하는 실시예들에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 상기 지방세포 층들 및 상기 펠릿으로 된 지방-유래 비지방 세포들 모두가 수집되는 여기에 기재되는 바와 같이 원심 분리 단계를 포함하는 방법들에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 선택적으로는, 이들 실시예들에서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 원심 분리 단계 없이 여기에 기재되는 바와 같이 지방조직을 해리시켜 제조될 수 있다.

선택적으로 지방세포들을 포함하는 지방조직 유래 세포 서스펜션 또는 그 부분은 적절한 조건들 하에서 저장될 수 있다. 상기 저장 조건들은 통상적으로 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상과 같이 상기 세포 서스펜션 내에 일부 또는 모든 세포들의 세포 생존 가능성의 유지를 허용한다.

상기 지방조직 유래 세포 서스펜션 또는 그 일부가 냉동되어 저장되는 경우, 세포들의 냉동을 위해 적절한 임의의 캐리어 액체 내에 존재할 수 있다. 예시적이지만 한정적이지는 않은 예로서, 상기 세포들은 냉동 이전에 DMEM, RPMI, 최소 필수 배지 등과 같이 혈청을 포함할 수 있거나 혈청이 없을 수 있는 배지 또는 혈청 내에 현탁될 수 있다.

상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 또한 통상적으로 자가 유래 혈청 또는 혈장을 포함하며, 이는 상기 세포 서스펜션의 제조 동안, 또는 세포 펠릿이 제조되는 세포 서스펜션 내의 원하지 않는 성분들로부터 분리될 때와 같이 제조의 마지막 단계에서 첨가될 수 있다.

상기 저장되는 지방조직 유래 세포 서스펜션이 냉동되는 경우, 상기 세포 서스펜션은 세포 분비물들을 포함하는 조성물과 결합될 수 있다. 상기 세포 분비물들을 포함하는 조성물은, 예를 들면 지방조직 유래 세포 서스펜션의 배양으로부터의 분류된 매체들을 포함할 수 있거나, 지방조직 유래 세포 서스펜션의 배양으로부터의 농축된 매체들을 포함할 수 있다. 세포들, 세포 서스펜션 및 특정한 지방조직 유래 세포 서스펜션들의 저장을 위한 이와 같은 방법들은 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 PCT/AU2012/001140(WO2013/040649)(발명의 명칭: "지방 세포들 및 세포 분비물들을 이용한 치료법(Therapeutics using adipose cells and cell secretions)")에 개시되어 있다.

상기 저장되는 지방조직 유래 세포 서스펜션이 냉동되는 경우, 통상적으로 냉동보존제(cryopreservative)도 포함한다. 시간에 대해 세포 생존 가능성의 중대한 손실 없이 상기 세포 서스펜션을 저장하기 위한 임의의 첨가제들과 방법이 사용될 수 있는 점이 이해될 것이다. 예를 들면, 중간엽 줄기 세포들의 저장을 위한 방법들이 해당 기술 분야에 알려져 있다. 일 예로서, 상기 세포 서스펜션은 5% 내지 10%와 같이 적절한 농도로 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide: DMSO) 또는 글리세롤(glycerol)을 포함할 수 있다. 다른 예들로서, 상기 세포 서스펜션은 트레할로오스(trehalose), 덱스트란(dextran), 덱스트로오스(dextrose), 수크로오스(sucrose) 등과 같은 하나 또는 그 이상의 냉동보존 당(cryopreservative sugar)들을 적절한 농도로 포함할 수 있다. 예를 들면, 냉동보존 당은 1%(w/v) 내지 30%(w/v)의 범위의 농도로 포함될 수 있다. 또 다른 예에서, 냉동보존 당은 5%(w/v) 내지 10%(w/v)의 범위 내의 농도로 포함될 수 있다.

상기 액체 매체 및 냉동보존제와 같은 상기 세포 서스펜션의 구성 요소들은 사용되는 농도들에서 통상적으로 약학적으로 허용 가능하다. 이는 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션이 최소한의 후-해동(post-thaw) 과정으로 해동 후에 상기 대상에 투여될 수 있는 이점을 가진다.

상기 세포 서스펜션은 상기 대상을 괴롭히는 상태에 대한 치료의 과정의 일부로서 의도된다. 자가 유래 세포 서스펜션이 사용되는 방식에 있어서, 상기 과정은 상기 지방조직이 얻어졌고 상기 세포 서스펜션이 제조되었던 상기 대상에 대해 기간에 걸친 상기 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함한다. 시기적절한 치료의 과정은 통상적으로 몇 주에서 몇 개월에 걸칠 것이며, 일 년 또는 그 이상이 될 가능성도 있다. 사용의 용이성을 위하여, 지방조직 유래 세포 서스펜션은 통상적으로 제조 후에 곧 유용한 부분들이나 부분 표본(aliquot)들 내로 분할되며, 제2, 적절할 경우에는 제3, 제4, 제5 등의 투여량들을 위해 사용되는 물질이 이후에 적절한 시간에서 인출을 위해 냉동되어 저장된다. 통상적으로, 상기 저장된 물질은 단일 투여량을 포함하는 부분들이나 부분 표본들 내에 있을 것이다.

통상적으로, 상기 치료가 자가 유래 세포 서스펜션을 활용하는 경우, 상기 치료의 과정의 제1 투여량으로서 투여를 위한 상기 세포 서스펜션의 적어도 하나의 부분 표본이나 부분은 상기 냉동보존제 또는 상기 세포 서스펜션의 저장을 보조하도록 의도되는 다른 성분들의 첨가 이전에 제조된 세포 서스펜션으로부터 얻어질 것이다.

상기 세포 서스펜션은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 희석제, 부형제 또는 보조제(adjuvant)의 하나 또는 그 이상도 포함하기 때문에 약학 조성물로 언급될 수 있다.

상기 세포 서스펜션은 통상적으로, 예를 들면 프로그램 가능한 동결 장치 내에 또는 -70℃ 내지 -90℃의 냉동실 내의 단열된 용기 내에 배치하는 것과 같이 통상적으로 약 1℃/분의 속도로 서서히 냉동시켜 세포 손상을 최소화하는 조절된 조건들 하에서 냉동된다. 저장을 위하여, 냉동된 세포들은 통상적으로 이후에 액체 질소 저장소로 이송된다.

상기 치료의 과정이 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션을 활용하는 경우, 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장될 수 있다. 이와 같은 치료의 과정에 있어서, 하나 또는 그 이상의 투여량들이 다른 공여자들로부터 유래될 수 있다.

지방조직 유래 세포 서스펜션들의 제조를 위해 이용될 수 있는 세포 처리 방법 및 장치는 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 함께 계류 중인 PCT/AU2012/000272(WO2012/122603)(발명의 명칭: "세포 처리 방법 및 장치(Cell processing method and device)")에 기재되어 있다.

MSC들의 분리

중간엽 줄기 세포(MSC)들은 본 발명의 방법들 중에서 임의의 것에 사용될 수 있다. MSC들은 신체 내의 임의의 조직으로부터 얻어질 수 있다. 소스들은 골수(bone marrow), 지방조직 및 제대혈(umbilical cord blood)을 포함한다. 골수(BM)는 MSC들 및 조혈 줄기 세포(Hematopoeitc Stem Cell: HSC)들 모두를 함유한다. BM에 있어서, MSC들은 백만의 BM 세포들마다 내의 10 및 100의 세포들에서 각기 HSC들보다 낮은 숫자로 존재한다. BM은 잠쉬디(jamshidi)와 같은 흡인 바늘(aspiration needle)을 사용하여 수확된다. 10mL 부피의 BM은 대략 6×10⁷의 유핵 세포들을 함유할 것이고, 이들 중에서 600 내지 6000이 줄기 세포들이다. 적혈구 세포들로부터 상기 유핵 세포들을 분리하기 위해, 피콜-파케(Ficoll-paque)와 같은 밀도 구배 원심 분리(density gradient centrifugation) 과정이 수행된다. 식염수 내에서 부드러운 원심 분리로 세척한 후, 세포들은 즉시 투여될 수 있거나, 더 정제될 수 있거나, 조직 배양이나 면역 분리(immunological separation) 방법들에 의해 농후화될 수 있다. 실시예들에 있어서, 상기 MSC들은 동종일 수 있거나, 자가 유래일 수 있다. 실시예들에 있어서, 상기 MSC들은 배양 증량된 MSC들일 수 있다.

MSC들은 지방 내에 골수보다 높은 레벨들로 존재한다. 이러한 발견에 대한 가장 가능성이 있는 설명은 다른 유핵 세포 형태들과 함께 MSC들이 지방조직을 받치는 치밀한 모세혈관계의 방대한 네트워크와 관련되는 것이다. 지방조직은 절제술에 의하거나, 지방 흡인술에 의해 수확될 수 있으며, 지방조직으로부터 MSC들을 포함하는 서스펜션들을 포함하여 비지방 세포 서스펜션들을 제조하기 위한 방법들은 여기에 기재된다.

경험에 의하면, 지방조직으로부터 회수되는 MSC들의 숫자는 그램 당 50,000 내지 5백만의 범위이다.

제대혈은 출생 시에 탯줄과 태반의 정맥 내에 남아 있는 혈액이다. 이러한 혈액은 조혈 줄기 세포들이 풍부하며, 또한 적은 숫자의 MSC들을 함유한다. 많은 숫자의 MSC들은 탯줄 내의 제정맥과 혈관들을 둘러싸는 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 내에 존재한다.

MSC들은 또한 말초 혈액, 윤활막(synovium), 근육, 골막(periosteum), 치수(dental pulp), 태반(placenta) 등과 같은 다른 소스들로부터 분리될 수 있다.

치료의 방법들

본 발명의 방법들의 실시예들에 있어서, 치료의 과정이 상기 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량이 상기 세포 서스펜션의 제조 후에 곧 대상에 투여되는, 골관절염, 류마티스 관절염 또는 연골 손상과 같은 연골 손상이나 퇴행으로 특징지어지는 상태를 갖는 대상에 제공된다. 본 문에 있어서, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션으로 상기 대상에 투여되는 것으로 설명될 수 있다. 본 문에 있어서, 여기서 사용되는 상기 새롭게 제조된과 같은 용어 및 유사한 용어들은 이렇게 투여되는 세포 서스펜션이 제조되는 일자와 같은 날에 상기 대상에 투여되는 것을 의미한다. 여기에 기재되는 바와 같이, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 상기 치료의 과정이 투여되는 상기 대상으로부터 얻어진 지방조직으로부터 제조되며, 이에 따라 결과적인 세포 서스펜션은 자가 유래 세포 서스펜션이다. 통상적으로, 상기 대상으로부터의 지방조직의 분리에서 투여를 위해 준비되는 제조된 세포 서스펜션까지 걸리는 시간은 약 2시간 내지 3시간까지이다. 새롭게 제조된 샘플은 이에 따라 상기 대상으로부터 지방조직의 제거 후의 약 2시간 내지 3시간 이내에 상기 대상에 대한 투여를 위해 준비되는 것이다.

여기에 언급되는 바와 같이, 환자의 기초 상태의 모니터링에 보조하는 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF를 활용하는 본 발명의 방법들은 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션을 사용하는 치료에도 적용될 수 있다.

여기에 기재되는 바와 같이, 치료의 방법들의 임의의 것이 중간엽 줄기 세포들의 세포 서스펜션을 사용할 수 있다. 여기서 나타내는 제한적이지 않은 예에서, 신경퇴화 및 궤양성 대장염을 위한 제대 MSC 치료들은 동종 인간 치료였다. 동종의 배양 증량된(culture expanded) MSC들이, 예를 들면 인간 치료를 위해 여기에 기재된다.

본 발명의 방법들의 내용에서, 투여량은 정해진 시간에서 상기 대상에 대한 상기 세포 서스펜션의 투여가 상기 투여량이 단일의 적용으로 또는 하나 이상의 적용으로 투여되는 것인지를 의미하는 점이 이해될 것이다. 예시적인 예로서, 투여량은 상기 대상의 신체의 표적으로 하는 부위 내로의 단일 주사와 같은 단일 투여로 구성될 수 있다. 다른 예시적인 예로서, 투여량은 다중 주사들과 같이 상기 대상의 신체의 표적으로 하는 하나 또는 그 이상의 표적이 되는 부위들에 대한 다중 투여들로 구성될 수 있다. 이에 따라 제2, 제3, 제4, 제5 등의 투여량들의 임의의 것과 같이 제1 및/또는 후속되는 투여량들의 임의의 것이 단일 적용 또는 다중 적용들로서 투여될 수 있다.

상기 방법은 제1 투여량 및 제2 투여량, 또는 제1 투여량, 제2 투여량 및 제3 투여량, 또는 제1 투여량, 제2 투여량, 제3 투여량 및 제4 투여량, 또는 제1 투여량, 제2 투여량, 제3 투여량, 제4 투여량 및 제5 투여량, 또는 의사가 환자에 대해 적절한 것으로 간주하는 임의의 다른 횟수의 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 세포들의 응집체들을 포함하거나 및/또는 지방조직의 조각들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 지방세포들을 더 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션에는 지방세포들이 실질적으로 없다. 일 실시예에 있어서, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션은 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제조 동안에 (i) 상기 지방세포 함량의 일부 또는 (ii) 실질적으로 모든 지방세포의 제거를 포함하는 방법에 의해 제조된다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 비지방 세포들 및 지방세포들을 포함하는 세포 서스펜션의 제1 투여량을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 후속되는 투여 또는 투여량들의 하나 또는 그 이상의 세포 서스펜션에는 지방세포들이 실질적으로 없다. 일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 비지방 세포들 및 지방세포들을 포함하는 세포 서스펜션의 제1 투여량을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 후속되는 투여 또는 투여량들의 하나 또는 그 이상의 세포 서스펜션은 비지방 세포들 및 지방세포들을 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 3개월 내지 12개월 사이의 전체 치료 기간에 걸쳐 투여되는 다중 투여량들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 약 3개월 내지 일 년, 이 년, 삼 년 또는 그 이상과 같은 몇 년 사이의 전체 치료 기간에 걸쳐 투여되는 다중 투여량들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 6개월 내이 12개월 사이의 전체 치료 기간에 걸쳐 투여되는 다중 투여량들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 3개월 내지 9개월 사이의 전체 치료 기간에 걸쳐 투여되는 다중 투여량들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 치료의 과정은 6개월 내지 9개월 사이의 전체 치료 기간에 걸쳐 투여되는 다중 투여량들을 포함한다.

일 실시예에 있어서, 상기 후속되는 투여량 또는 투여량들은 해동(thawing) 후 약 10분 이내, 또는 해동 후 약 20분 이내, 또는 해동 후 약 30분 이내, 또는 해동 후 약 1시간 이내, 또는 해동 후 약 2시간 이내와 같이 해동 후에 곧 상기 대상에 투여된다.

본 발명의 방법들에 있어서, 상기 투여량들의 적어도 하나, 통상적으로 제2 또는 후속되는 투여량이 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨의 결정 후에 상기 환자에 투여된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 적어도 둘의 레벨이 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 세 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 레벨이 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨의 결정 후에 상기 환자에 투여되는 실질적으로 모든 투여량들이 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 세 바이오마커들 COMP, CTX-II 및 MIF의 레벨이 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨의 결정 후에 상기 환자에 투여되는 실질적으로 모든 투여량들이 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 바이오마커들의 이렇게 결정된 레벨은 상기 환자의 상태의 악화를 나타내며, 이에 따라 치료하는 의사에게 상기 환자에 대한 추가 투여량을 투여하기 위한 지표가 제공된다.

제1 및 각 후속하는 투여량 사이의 적절한 시간 간격은 다른 환자들 사이에 상이할 수 있고, 정해진 환자에 대해서도 상기 투여량들 사이의 간격들이 변화될 수 있다. 본 발명의 방법들을 사용하는 것은 치료하는 의사가 질환 진행과 관련되는 바이오마커 내의 객관적인 측정에 기초하여 상기 환자에게 세포 서스펜션의 투여량을 투여하게 한다. 이는 상기 의사에게 상기 세포 서스펜션의 투여량의 투여를 위한 적절한 시간을 결정하기 위한 추가적이고 개선된 근거를 제공한다. 본 발명 이전에, 투여량들의 타이밍은 3개월마다와 같이 단순한 주기적인 적용에 기초할 수 있고, 이 경우에 상기 환자는 필요한 것 보다 많은 투여량을 받을 수 있거나, 투여량들의 타이밍이 바람직하지 않은 환자가 경험하는 증가된 통증 또는 환자가 경험하는 감소된 운동성에 기초할 수 있다. 이러한 방식에서, 본 발명의 방법들에서 치료의 의도된 과정은 대상에게 시간에 걸친 개체 내의 동일한 상태의 치료를 위한 시간 간격에 대한 상기 세포 서스펜션의 다중 투여량이 투여되는 것이다.

일 실시예에 있어서, 치료의 과정은 각 후속되는 투여량이 1주 내지 10주로 이전의 투여량과 시간적으로 분리되는 다중 투여량들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 치료의 과정은 각 후속되는 투여량이 2주 내지 8주로 이전의 투여량과 시간적으로 분리되는 다중 투여량들을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 치료의 과정은 각 후속되는 투여량이 2주 내지 6주로 이전의 투여량과 시간적으로 분리되는 다중 투여량들을 포함한다. 임의의 정해진 치료의 과정 동안, 각 투여량 사이의 시간 간격은 일정한 기간이 될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 예시적인 예로서, 상기 제1 및 제2 투여량 사이의 시간 간격은 제2 및 제3 투여량 사이의 시간 간격과 동일할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.

상기 약학 조성물은 통증이 있는 영역으로부터 멀리 떨어진 부위에서 대상 환자에게 투여될 수 있다. 본 문에 있어서, "원격(remote)"은 상기 투여가 염증이나 다른 손상의 부위 또는 이와 같은 부위가 식별 가능한 치료되는 질환에 대해 상기 세포 서스펜션의 직접적인 적용이 아닌 것을 의미한다. 예시된 바와 같이, 관절염에 걸린 관절(arthritic joint)의 치료의 경우에서, 종래 기술 분야에서 앞서 기재한 바와 같이 투여는 지방조직 유래 세포 서스펜션들 directly into 통증이 있는 관절 내로의 직접적인 지방조직 유래 세포 서스펜션들의 주사를 수반하였다. 이와 같은 투여는 적절한 정밀성을 확보하도록 치료하는 의사나 임상의가 수행하는 고도의 기술을 요구한다. 이와 같은 투여가 요구되는 영향을 받은 사지(limb)나 관절을 다루는 것도 이들이 인간 또는 비인간인 환자가 경험하거는 고통을 증가시킨다. 상기 지방조직 유래 서스펜션의 원격 투여를 제공함에 의해, 본 발명은 이와 같은 질환들의 치료를 위한 개선된 방법들, 용도들 및 조성물들을 제공한다. 예를 들면, 상기 원격 투여는 치료되는 동물(예를 들면, 고양이 또는 개)의 목의 목덜미 내와 같은 피하 주사에 의할 수 있거나, 근육내 주사에 의할 수 있다. 또 다른 예로서, 근육내 주사에 의한 개에 대한 투여는 개의 넓적다리 내로가 될 수 있다. 또 다른 예로서, 근육내 주사에 의한 소에 대한 투여는 꼬리쪽 주름(caudal fold) 내가 될 수 있다.

생물학적 샘플

생물학적 샘플은 원하는 바이오마커가 검출될 수 있는 임의의 적합한 샘플이다. 통상적으로, 상기 샘플은 혈액이나 혈장 또는 혈청과 같은 그 부분이다. 대상으로부터 혈액의 수집을 수집하고, 시험 목적들을 위해 혈액의 원하는 부분들의 분리를 위한 방법들은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 윤활액(synovial fluid)이다. 일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 오줌이다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커 CTX-II는 오줌 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커 CTX-II는 혈청 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커 MIF는 혈청 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커 MIF는 혈액 또는 윤활액과 같은 유체 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커 COMP는 혈청 샘플 내에서 결정된다. 일 실시예에 있어서, 상기 바이오마커 COMP는 오줌 샘플 내에서 결정된다.

환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계는 본 발명의 방법들의 일부로 수행될 수 있거나, 별도의 단계로 수행될 수 있다. 개체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계는 본 발명의 방법의 수행의 연속적인 일련의 단계들의 일부로 수행될 수 있다. 상기 개체로부터 혈액 샘플을 얻는 단계는 본 발명의 방법의 하나 또는 그 이상의 나머지 단계들과 구분되는, 예를 들면 시간, 위치 또는 작업자가 구분되는 별도의 단계나 단계들로 수행될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 방법의 수행에서, 상기 혈액 샘플을 얻는 단계는 상기 개체로부터 혈액의 추출을 수반하거나 수반하지 않을 수 있다. 본 발명의 방법의 수행은, 예를 들면, 용기(container) 내에 혈액 샘플을 수용하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 혈액은 본 발명의 방법의 수행과 분리되는 활동으로서 상기 개체로부터 이전에 추출되었다. 또 다른 예로서, 혈액 샘플을 얻는 단계는 본 발명의 방법의 수행과 분리되는 활동으로서 상기 개체로부터 추출된 혈액 샘플의 일시적인 저장으로부터 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 수행이 이에 따라 전체적으로 생체 외(exvivo)로 수행될 수 있는 점이 이해될 것이다.

상기 샘플은 수집 후에 곧 바이오마커의 존재 또는 레벨을 결정하기 위해 테스트될 수 있고, 원할 경우, 처리된 샘플 또는 이의 처리된 부분(fraction)은 시험까지 적절한 조건들 하에서 저장될 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 샘플은 혈액 또는 그 부분(바람직하게는 혈청 또는 혈장)이 될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플이 그 오줌일 경우, 부스러기들과 세포들을 제거하기 위해 처음에 원심 분리될 수 있고, 이후에 시험을 위해 사용되기 이전에 저장될 수 있다. 이들 샘플들은 이상적으로는 1시간 또는 2시간 동안 냉동되어 저장되고, 보다 바람직하게는 동결되어 저장된다.

통상적으로, 상기 환자가 인간일 경우, 상기 생물학적 샘플은 의사의 임상적 관리 하에서, 예를 들면, 의사 또는 보건 의료 전문가에 의해 대상으로부터 수집될 수 있다. 의사는 독립적으로 의료를 수행하도록 법률에 의해 등록되거나, 공인되거나 면허가 있는 임의의 사람이 될 수 있다. 보건 의료 전문가는 독립적으로 또는 의사의 감독 하에서 대상으로부터 생물학적 샘플을 수집하도록 승인되거나, 공인되거나, 등록되거나 면허가 있는 임의의 사람이 될 수 있다. 예를 들면, 상기 보건 의료 전문가는 공인되거나 등록된 간호사, 의사의 보조자 또는 임상 보조자가 될 수 있다. 상기 생물학적 샘플이, 예를 들면, 의사의 임상적 관리 하에 있는 환자에게 통상적으로 수행될 수 있는 통상의 환자의 처치 동안에 수집될 수 있는 점이 이해될 수 있을 것이다.

상기 생물학적 샘플이 오줌일 경우, 상기 샘플은 의사의 직접적이거나 간접적인 감독 하에서 환자의 전체적인 임상적 관리로 수집될 수 있지만, 통상적으로는 환자들 자신들에 의해 물리적으로 수집될 수 있다.

특정 실시예에 있어서, 본 발명의 방법은 의사에 의하거나, 의사의 감독 하의 사람이나 사람들에 의하거나, 이들의 결합으로 수행된다. 의사의 감독 하의 사람은, 예를 들면, 보건 의료 전문가, 약사, 임상의, 의학 또는 병리학 실험실 연구원, 혹은 과학자들이 될 수 있다. 본 발명의 방법이 임의의 실험실에서 의사에 의하거나, 의사의 감독 하의 사람이나 사람들에 의하거나, 이들의 결합으로 수행될 수 있는 점이 이해될 수 있을 것이다. 예를 들면, 상기 생물학적 샘플(들)의 수집, 제조 및/또는 시험은 치료적 투여량이 환자에게 투여되는 위치와 다른 위치에서 수행될 수 있다. 유사하게, 상기 지방조직의 수집, 상기 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제조 및 투여는 다른 개체들로 수행될 수 있고, 다른 위치들에 수행될 수 있다. 이러한 일이 발생되는 경우, 통상적으로 모든 단계들은 상기 방법에 걸쳐 환자의 임상적 관리에 대해 주요 책임이 있는 등록 의사에 의하거나 등록 의사의 감독 하에서 수행될 수 있다.

생물학적 샘플의 시험

여기서 언급되는 것들과 같은 바이오마커의 존재에서 생물학적 샘플을 시험하기 위한 방법들은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 관심의 대상이 되는 바이오마커를 잠재적으로 포함하는 샘플이 바이오마커 폴리펩티드(polypeptide) 또는 그 조각(fragment)에 특이적으로 결합되는 항체와 접촉될 수 있다. 선택적으로는, 상기 항체는 상기 항체를 샘플과 접촉시키기 이전에 세척 및 후속되는 복합체의 분리가 가능해지도록 고체 지지체(solid support)에 고정될 수 있다. 고체 지지체들의 예들은, 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)들, 비드(bead)들, 틱(tick)들 또는 마이크로비드(microbead)들을 포함한다. 항체들은 또한 해당 기술 분야에서 알려진 단백질 칩 어레이(Protein Chip array) 또는 프로브 기판(probe substrate)에 부착될 수 있다.

항체-마커 복합체(antibody-marker complex)의 존재를 검출하거나 양을 측정하기 위한 유용한 측정들은, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착 측정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 측방 유동 측정(lateral flow assay), 방사면역 측정(radioimmune assay: RIA), 또는 웨스턴 블롯 측정(Western blot assay)을 포함한다. 이와 같은 방법들은, 예를 들면, "Clinical Immunology(Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991); "Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology"(volume 37(Asai, ed. 1993)); 및 Harlow 및 Lane의 앞서의 문헌에 기재되어 있다.

상기 방법은 온전한 단백질들, 펩티드들 또는 그 조각의 검출을 포함할 수 있다. 따라서, 바이오마커의 레벨을 결정하는 것 또는 이와 유사한 표현들에 대한 언급이 본 문에서 다르게 나타내지 않는 한, 상기 바이오마커가 전체적으로 검출되는 상황뿐만 아니라 펩티드 조각과 같은 바이오마커의 조각이 검출되는 상황을 포괄하도록 의도되는 점이 이해될 것이다. 그러나, 상기 바이오마커 자체가 완전한 단백질의 분해 산물일 경우, 그 역은 적용되지 않는다. 따라서, 분류에 의하여, 상기 바이오마커가 콜라겐의 조각인 CTX-II인 경우, CTX-II의 레벨을 결정하는 것에 대한 언급이 상기 콜라겐의 레벨을 결정하는 것을 포괄하도록 의도되지는 않는다. 상기 방법은 또한 상기 방법의 정확하거나 일정한 수행을 위한 것과 같은 조절들 포함을 더 포함할 수 있다.

CTX-II의 경우, 예를 들면, CTX-II는 크레아티닌(creatinine) 농도를 이용하여 보정되며, 환자 내에서 ng/mmol의 크레아티닌 레벨들로서 표현될 수 있다. 여기의 실험예들에 이용되는 대상들에서, 관찰된 레벨들은 약 100ng/mmol 내지 약 1500ng/mmol 사이였다.

COMP 및 MIF의 정량화는 알 앤 디 시스템즈(R & D systems)로부터의 ELISA 측정을 이용하여 수행되었다. 제조업자들의 지시에 따라 CTX-II는 유린 프리클리니칼 카르틸랍스®)(Urine Pre-clinical Cartilaps®)(CTX-II) ELISA(면역진단 시스템즈(Immunodiagnostic systems), 영국) 측정을 이용하여 수행되었다. CTX-II 레벨들은 크레아티닌(Cr) using 상기 크레아티닌 파마미터 에세이(Creatinine Parameter Assay)(R & D 시스템스, 미국)를 사용하여 크레아티닌(Cr)에 대해 보정되었다. MIF ELISA는 지시들(http://www.rndsystems.com/Products/SMF00B) 및 Alexander 등의 "Exp Neurol."(2012, August; 236(2): 351-362)에 기재된 바와 같이 수행되었다. COMP 및 CTX-II ELISA 측정들은 각기 개시 사항들이 여기에 참조로 포함되는 지시들(http://www.rndsystems.com/Products/DCMP0) 및 V.B. Kraus 등의 "Osteoarthritis and Cartilage"(19(2011)), 특히 COMP 및 CTX-II에 대한 측정들을 위한 ELISA가 기재된 많은 논문들에 대한 참조를 포함하는 표 II에 기재된 바와 같이 수행되었다.

혈액 수집 . 원하는 시점들에서, 8-36mL의 혈액이 18게이지(gauge) 바늘들을 사용하여 환자로부터 EDTA를 함유하는 진공 채혈기들(벡톤 디키슨(Becton Dickinson), 미국) 내로 수집되었다. 혈액 구성 성분들은 피콜 밀도 구배 분리(ficoll density gradient separation)를 이용하여 분리될 수 있다. 완전한 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(로체(Roche), 스위스)이 1：50의 희석으로 혈장에 첨가되고, 샘플들은 얼음 위에서 실험실로 이송된다. 혈장은 임의의 세포 물질을 제거하도록 5분 동안 16,000×g로 원심 분리되고, 부분 표본으로 되며, -80℃에서 저장된다.

바이오-플렉스(Bio-Plex) 분석. 바이오-플렉스 서스펜션 어레이 시스템(Bio-Plex suspension array system)(바이오-라드, 미국)은 고유한 형광 색상의 비드(bead)들이 단일 웰(well) 내에 100의 분석물(analyte)들까지의 동시 수량화가 가능하도록 이용한다. 표적 분석물들은 바이오-플렉스 이중 레이저 유동계(Bio-Plex dual-laser flow-based) 마이크로플레이트 리더(microplate reader) 시스템을 사용하여 1차 항체 및 대응하는 수용체 복합체에 접합되는 상기 고유한 비드의 검출에 의해 수량화된다. 샘플들은 5분 동안 9000×g에서 바이오-이널트®(Bio-Inert®)멤브레인(폴 사이언티픽(Pall Scientific), 미국)으로 0.2㎛의 나노셉(Nanosep) MF 원심 분리 장치들을 통해 여과되었다. 50㎕의 각 샘플은 제조업자의 지시에 따라 원하는 바이오-플렉스 에세이(바이오-라드, 미국)를 사용하여 분석된다. 바이오-플렉스 프로(Bio-Plex Pro) II 자기 세척 스테이션이 세척 단계들을 위해 사용될 수 있고, 데이터는 버전 5.0 소프트웨어로 바이오-플렉스 200 시스템(바이오-라드, 미국)을 사용하여 획득할 수 있다.

본 발명은 이하에서 다음의 실험예들에 대한 예시들에 의하여 보다 상세하게 기재된다. 이러한 실험예들은 본 발명을 예시하는 데 기여하도록 의도되는 것이며, 본 명세서 전체에 걸친 발명의 설명의 보편성을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

키트들 및 조성물들

본 발명은 또한 본 발명의 방법들의 수행에 유용한 하나 또는 그 이상의 성분들을 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 예를 들면, MSC들을 포함하는 것과 같은 약학 조성물 또는 지방조직 유래 세포 서스펜션이, 예를 들면 기재된 지시들과 같은 의도된 치료에 유용한 추가적인 구성 요소들을 포함하는 키트의 일부로서 제공될 수 있거나, 상기 조성물의 단일 바이알(vial) 또는 부분 표본과 같이 단일 항목으로 제공될 수 있다.

키트는 생물학적 샘플의 수집이나 제조를 위하거나, 특정한 바이오마커의 검출을 위해 하나 또는 그 이상의 제제들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 MIF, CTX-II 및 COMP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 바이오마커들에 결합될 수 있거나 및/또는 검출할 수 있는, 바람직하게는 특이적으로 결합될 수 있거나 및/또는 검출할 수 있는 하나 또는 그 이상의 제제(들)를 포함할 수 있다. 키트는 생물학적 샘플 내의 MIF, CTX-II 및 COMP의 임의의 하나 또는 그 이상과 같은 바이오마커의 레벨을 수량화하는 데 사용되기 위해 하나 또는 그 이상의 제제들을 포함할 수 있다.

키트는 시약들이 구분되는 용기들 내에 함유되는 임의의 키트를 포함하는 용어인 구획화된 키트일 수 있으며, 작은 유리 용기들, 플라스틱 용기들 또는 플라스틱이나 종이의 스트립들을 포함할 수 있다. 이와 같은 용기들은 샘플들과 시약들의 상호 오염을 방지하면서 하나의 구획으로부터 다른 구획까지 시약들의 효과적인 전송 및 수량적인 방식으로 하나의 구획으로부터 다른 구획까지 각 용기의 약제들이나 용액들의 첨가를 가능하게 할 수 있다. 이와 같은 키트들은 또한 테스트 샘플을 수용하게 되는 용기, 측정에 사용되는 항체(들)를 함유하는 용기, 세척 시약들(인산염 완충 식염수, 트리스-완충제(Tris-buffers) 및 유사한 것과 같은)을 함유하는 용기들, 그리고 검출 시약을 함유하는 용기들을 포함할 수 있다. 키트의 다른 성분들은 다른 온도들에서 존재할 수 있거나, 저장될 수 있거나, 수송될 수 있다.

실험예들

실험예 1: 골관절염 줄기 세포 선행 조사 연구

골관절염 줄기 세포 선행 조사 연구(Osteoarthritis Stem Cell Advanced Research Study: OSCARS)는 OA 치료를 위한 자가 지방조직 유래 세포 치료의 안정성과 효능을 평가하기 위한 무작위적인 이중 맹검(double-blind)의 플라시보-대조 시험(placebo-controlled trial)이었다. 전체 40명의 환자들이 이들의 시험 무릎 내로 자가 지방조직 유래 세포들 또는 플라시보의 단일 관절내 주사를 수용하도록 무작위(20: 20)로 되었다. 참가자들은 자가 보고된 통증 질문서(간헐적 및 지속적 골관절염 통증(Intermittent and Continuous Osteoarthritis Pain: ICOAP] 지수)를 완성하였다. 연골 퇴행의 정도는 MRI T2 매핑(mapping)을 이용하여 기초 및 6개월의 후-치료에서 평가되었고, 연골 퇴행은 오줌 내의 연골 특이적 콜라겐 조각(CTX-II) 및 혈청 내의 48의 사이토카인(cytokine)들의 패널을 이용하여 측정되었다.

모든 환자들은 상기 시험에 내내 유지되었던 이들의 전체 통증 점수(pain score)들에서 크고 상당한 감소를 경험하였다. MRI T2 매핑은 자가 지방조직 유래 세포 치료가 심각한 연골 손상이 있는 대상에서도 연골 퇴행을 느리게 하여 질병 변경 효과를 가질 수 있는 점을 입증하였다. 이러한 발견과 부합하여, CTX-II 레벨들은 기초 및 6개월 사이에 상기 치료 그룹에서 감소되었지만, 상기 플라시보 그룹에서는 상당히 증가되었다(p=0.04). 연골 퇴행 경로에 수반되는 키 시토카인(key cytokine)인 대식세포 이동 저해 인자(MIF)의 혈청 레벨의 상당한 감소가 상기 치료 그룹에서 관찰되었다.

OSCAR들은 OA 환자들에서 무릎 통증을 감소시키기 위한 자가 지방조직 유래 세포 치료의 효과를 평가하기 위하여 설계된 세계 최초의 시험이다. 이러한 중간 보고서에서 결과들은 중단기의 증상 변경에 대한 단축이 상기 플라시보 및 치료 그룹들 모두에서 유사하였던 것을 입증한다. 연골 퇴행의 객관적인 마커들은 상기 치료 그룹에서 감소되었고, 이는 자가 지방조직 유래 세포 치료가 보다 긴 기간에서 상기 OA의 진행을 느리게 할 수 있고 개선된 결과들을 생성할 수 있는 점을 나타내는 MRI T2 매핑에 의해 지지되었다.

상기 연구가 수행되었던 방식의 보다 상세한 설명 및 상기 연구의 결과들과 영향들이 다음에 기재된다.

시험 설계

OSCAR들은 오스트레일리아의 시드니의 로열 노스 쇼어 병원(Royal North Shore Hospital)에서 수행되었던 윤리적으로 승인된 상(phase) II의 이중 맹검 플라시보-대조 시험이었다. 연령이 >40세인 환자들은 이들이 내측이나 측방 구획 내의 국제 골관절염 학회(Osteoarthritis Research Society International: OARSI)의 등급 1 또는 2의 방사선 관절 간격 협착(joint space narrowing), 또는 관절 간격 협착이 없이 내측이나 측방 구획 내의 골돌기체(osteophyte) 등급 2 또는 3으로 등급이 구분되고, 점수식 평정 척도(numerical rating scale: NRS) 상에서 적어도 4의 증후성 무릎 골관절염 통증으로 진단된 무릎 골관절염을 가졌을 경우에 상기 시험에 참여하는 데 적격이었다. 전체 40명의 환자들은 이들의 시험 무릎 내로 자가 지방조직 유래 세포들 또는 플라시보의 단일 관절내 주사를 수용하도록 임의로 할당(1：1)되었다.

상기 연구 목적은 진단된 무릎 골관절염이 있는 환자들에서, 자가의 증량되지 않은 지방유래 줄기 세포들의 주사는 통증을 개선시켰고, 질환 진행을 변경시켰던 점을 결정하는 것이었다. 일차적인 목적은 무릎 골관절염에서 통증 증상들을 감소시키기 위한 상기 자가 유래 줄기 세포들을 사용하는 효능을 경정하는 것이었다. 이차적인 목적들은, (a) 무릎 골관절염의 치료에서 자가 유래 줄기 세포들을 사용의 중단기 안정성을 결정하는 것, (b) 질환 진행의 바이오마커들에 대한 자가 유래 줄기 세포들의 주사의 영향을 평가하는 것, (c) 생활의 질에 대한 자가 유래 줄기 세포들의 사용의 영향을 결정하는 것이었다.

방법론

모든 참가자들은 대략 200g의 지방조직을 수확하기 위해 통상의 지방흡인술 과정을 거쳤다. 상기 조직은 이전에 기재된 경우(개시 사항이 여기에 참조로 포함되는 Blaber S. P., Webster R. A., Hill C. J. 등의 "Analysis of in vitro secretion profiles from adipose-derived cell populations"(J Transl Med 2012; 10: 172-88))와 같이 처리되었다. 요약하면, 상기 지방조직은 콜라게나아제(collagenase)로 소화되었고, 펠릿화된 세포들(SVF) 및 상기 지방세포들을 얻기 위해 원심 분리되었다. 상기 SVF 및 지방 세포 서스펜션은 식염수로 두 번 세척되었다. 결과적인 혼합된 세포 모집단은 5mL의 최종 부피까지 식염수 내에 다시 현탁되었다. 상기 치료 그룹은 독립적인 방사선 전문의에 의해 이들의 시험 무릎 내로 이러한 세포 서스펜션의 관절내 주사를 맞았던 반면, 상기 플라시보 그룹은 식염수의 관절내 주사를 맞았다. 상기 참가자들과 조사자들은 상기 치료 전체에 걸쳐 치료 할당에 대해 알지 못하게 남았다. 환자들은 상기 연구에 걸쳐 유해 사례들(AE들) 및 병용 약물들에 대해 모니터되었다.

참가자들은 1개월, 3개월, 6개월 및 12개월에서 자가보고 통증 질문서(간헐적 및 지속적 골관절염 통증[ICOAP] 지수)를 완성하였다. 연골 질은 MRI T2 매핑을 사용하여 기초 및 6개월의 후-치료에서 평가되었다. 이차적인 결과 측정들은 기초, 1개월 및 6개월의 후-치료에서의 오줌 및 혈청 바이오마커들의 평가를 포함하였다. CTX-II는 ELISA 키트를 이용하여 로열 노스 쇼어 병원에서 오줌 내에서 측정되었다. 오줌의 크레아티닌 레벨들도 ELISA에 의해 측정되었고, 도시된 모든 CTX-II 데이터 보정된 크레아티닌이다. 혈청은 맥쿼리 대학(Macquarie University)의 오스트레일리아 프로테움 분석 설비(Australian Proteome Analysis Facility: APAF)에서 바이오-라드 바이오-플렉스 키트들을 이용하여 48의 시토카인들의 패널에 대해 분석되었다. 데이터는 치료 의향(intention-to-treat) 원리들을 이용하여 분석되었다.

결과 및 논의

이러한 연구는 자가 지방조직 유래 세포들 치료가 안전하고 임상적으로 실행 가능하였던 점을 입증한다. 상기 치료는 환자들이 잘 견디었고, 주요 중단기 안정성 문제들과 관절 감염들이 없었다.

상기 플라시보 및 자가 지방조직 유래 세포들 치료 그룹들 모두는 ICOAP에 의해 측정되었던 경우에 기초 상태로부터 이들의 전체 통증 점수들에서 크고 상당한 감소를 경험하였고, 이는 12개월의 최종 추적 시점까지 유지되었다(도 1). 플라시보가 자가 보고된 결과들의 측면에서, 특히 통증에서 OA 환자들의 치료 효과를 가지는 것으로 설정되었기 때문에 상기 플라시보 그룹에서 상당한 효과는 기대되지 않았다.

MRI에 의한 연골 퇴행의 평가. 환자들은 모두의 무릎들의 방사선 영상으로 이러한 시험으로의 포함에 대해 검진되었다. 모든 환자들은 내측이나 측부 구획들 내의 국제 골관절염 학회(OARSI) 등급 1 또는 2의 관절 간격 협착, 또는 관절 간격 협착이 없는 내측이나 측부 구획 내의 골돌기체 등급 1 또는 2로 등급이 구분되었고, 상기 플라시보 또는 치료 그룹들로 임의로 추출되었다. 관절들의 방사선 영상은 관절 간격 협착에 의해 관절 연골의 질의 직접적인 측정을 제공하지만, 연조직 염증은 제공하지 않는다. MRI는 연골 형태와 생리의 평가를 가능하게 하는 효과적이고 감도 높은 영상 기술이다. MRI T2 매핑은 분자 함량과 연골의 구조의 정량적 평가를 가능하게 한다. 특히, T2 매핑은 콜라겐 다발 배향과 프로테오글리칸-콜라겐(proteoglycan-collagen) 기질의 통합뿐만 아니라 수분 함량을 통해 연골 손상의 범위를 평가한다.

MRI T2 매핑은 기초 및 6개월의 후-치료에서 모든 참가자들의 시험 무릎에 대해 수행되었다. 상기 분석은 MRI 영상에 특화된 독립적인 임상 시험 대행 기관인 큐메트릭스 테크놀로지스(Qmetrics Technologies)에 의해 수행되었다. 상기 T2 매핑은 연골의 손실이 6개월의 후-치료 시점에서 예상되는 경우보다 느려졌던 점을 나타냈다. 양 그룹들이 진행되는 경우보다 안정하게 남아있는 대상들의 보다 큰 비율을 나타내었던 점이 발견되었다. 비록 모든 참가자들이 OARSI 관절 간격 협착 등급 1 또는 2를 가졌지만, 기초에서 연골 손상의 상세한 평가는 포함 기준의 일부는 아니었다.

상기 MRI 분석은 기초에서 상기 자가 지방조직 유래 세포들 치료 그룹에서 선행되는 진행된 연골 손상이 있는 상당히 많은 참가자들이 있었던 점과 상기 플라시보 그룹보다 상기 치료 그룹에서 상당한(p=0.03) 보다 높은 등급 4의 OA 환자들이 있었던 점을 보여주었다. 도 2는 OA 등급으로 평가된 MRI에 의한 기초에서 연골 손상의 큐메트릭스(QMetrics) 평가를 나타낸다. 이는 상기 자가 지방조직 유래 세포들 치료 그룹이 OA의 가속 진행을 향하게 만드는 경향이 있을 수 있으며, 이에 따라 상기 그룹들 사이에 상당한 차이들이 관찰될 수 있는 가능성이 적어지게 할 수 있지만, 이러한 점은 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과는 자가 지방조직 유래 세포들 치료가 연골 퇴행을 느리게 하여 질환 변경 효과를 가질 수 있는 점을 제시한다.

OA 바이오마커들의 평가에 의한 질환 진행의 분석. 분자 레벨에서 자가 지방조직 유래 세포들 치료의 효과들을 조사하기 위하여, OA 바이오마커들이 기초, 1개월 및 6개월의 후-치료에서 참가자들의 오줌 및 혈청 내에서 측정되었다. CTX-II는 제2형 콜라겐의 C-말단 텔로펩티드이며, 오줌에서 측정되는 연골 손상의 비침입성 마커이다. 이러한 시험에 있어서, 오줌의 CTX-II에서 31%의 증가가 상기 플라시보 그룹에서 기초 및 6개월 사이에 관찰되었다(p=0.04; 도 3). 상기 평균 CTX-II 레벨은 상기 시험의 과정에 걸쳐 상기 자가 지방조직 유래 세포 치료 그룹에서 감소하였다. 이러한 결과는 이러한 그룹이 기초에서 선행의 진행된 연골 손상이 있는 상당히 많은 대상들을 포함하였던 점을 나타내었던 예상치 않았던 정해진 MRI 분석이었다. 이와 같은 결과는 자가 지방조직 유래 세포들이 이미 진행된 연골 손상이 있는 대상들에서도 연골 퇴행을 느리게 하는 점을 나타내는 큐메트릭스 T2 매핑 MRI 결과들과 연관성이 있다.

골관절염은 역사적으로 비염증성 질환으로 언급될 수 있었지만, 낮은 등급의 염증이 OA 질환 진행에서 주요한 역할을 하는 점이 이제 점점 더 분명해진다. OA는 퇴행과 치유 기전들 사이의 불균형을 수반하며, 전체 관절 구조에 영향을 미친다. 염증에 대한 자가 지방조직 유래 세포 치료의 효과를 조사하기 위해, 48의 시토카인들, 케모카인(chemokine)들 및 성장 인자들의 패널이 APAF(맥쿼리 대학)에서 참가자들의 혈청 내에서 측정되었고 분석되었다.

상기 분석은 자가 지방조직 유래 세포 치료가 상기 플라시보 그룹에 비하여 1개월 및 6개월 모두에서 염증을 감소시켰던 점을 나타내었다. 상기 키 시토카인은 대식세포 이동 저해 인자(MIF)였으며, 이는 6개월에서 상기 자가 지방조직 유래 세포 치료 그룹 내에서 상당히 감소되었다(p=0.00; 도 4). MIF는 T 세포들 및 윤활막 섬유모세포들을 포함하는 많은 세포들에 의해 생성되었다. MIF는 건강한 대조군보다는 무릎 OA가 있는 환자들의 혈청 및 윤활액 내에서 보다 높은 레벨들로 검출되었다. MIF는 농도 및 시간에 의존하는 방식으로 윤활막 섬유모세포들 내에 기질 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase) MMP-1 및 MMP-3의 상향 조절을 유도한다. MMP들은 상기 연골의 파괴에 일차적인 역할을 수행한다. 그러므로, 상기 자가 지방조직 유래 세포 치료 그룹에서 순환 MIF 레벨들의 감소는 감소된 효소 레벨들을 통해 감소된 연골 퇴행이 있을 가능성이 있다.

MRI 유래 OA 등급들에 의한 CTX-II 결과들의 계층화. 골관절염은 보편적으로 사람들의 무릎에서 양방향으로 발달되지만, 신체의 다른 관절들에도 영향을 미칠 수 있다. 상기 OSCAR들의 시험은 자가 지방조직 유래 세포 치료 또는 식염수의 플라시보 주입으로 편측성 무릎 OA를 치료하도록 설계되었다. 그러나, 상기 기초 방사선 검사는 참가자들의 대부분도 이들의 치료되지 않은 무릎에서 OA의 증거를 가졌던 점을 나타내었다. 일부 경우들에서, 이들의 치료되지 않은 무릎은 이들의 시험 무릎에 이해 보다 선행된 관절 간격 협착 및 골돌기체 점수들을 가졌다. 이러한 연구에서 조사된 상기 OA 바이오마커들이 시험 참가자들의 혈청과 오줌에서 측정되었기 때문에, 치료되지 않은 무릎 및 다른 관절염에 걸린 관절들 내의 손상의 범위도 이러한 결과들에 기여할 것이다. CTX-II의 레벨들이 선행된 연골 퇴행이 있는 대상들에서 증가되는 지를 판단하기 위하여, 상기 결과들은 MRI에 의한 OA 등급 평가로 계층화되었다. 도 5A 및 도 5B는 MRI 유래 OA 등급들에 의해 계층화된 플라시보 및 자가 지방조직 유래 세포 치료 그룹들에 대한 CTX-II 값들을 나타낸다.

상기 자가 지방조직 유래 세포 치료 그룹에 있어서, 15명의 등급 4의 OA 환자들은 기초에서 491ng/mmol의 평균 CTX-II 레벨을 가졌으며, 이는 6개월에서 477ng/mmol까지 감소되었다. 9명의 플라시보 등급 4의 OA 환자들의 CTX-II 레벨들은 43%(일방 t-검증을 이용하여 t-p=0.037; 양방 t-검증을 이용하여 p=0.074)의 증가율로 기초에서 490ng/mmol의 평균으로부터 to 6개월에서 702ng/mmol까지 증가되었다. 상기 시험 및 6개월의 후-치료에서 플라시보로부터의 상기 등급 4의 OA 환자들과 비교하여, 상기 15명의 시험 환자들은 477ng/mmol의 평균을 가지며, 상기 9명의 플라시보 환자들은 702ng/mmol을 가진다(일방 t-검증을 이용하여 p-값=0.066). 이러한 결과는 앞서 진행된 연골 손상이 있는 상기 플라시보 그룹 내의 연골 퇴행이 시험의 과정에 걸쳐 증가되었던 것을 나타낸다. 대조적으로, 연골 퇴행은 동등한 정도의 연골 손상이 있는 상기 자가 지방조직 유래 세포 치료 그룹 내의 참가자들의 집단에서 느려졌다. 함께 고려하면, 이들 결과들은 자가 지방조직 유래 세포 치료가 OA의 치료에 질환 변경 효과를 가질 수 있는 것을 지지한다.

OSCAR들은 OA 환자들에서 무릎 통증을 감소시키기 위한 자가 지방조직 유래 세포 치료의 효과를 평가하도록 설계된 세계 최초의 시험이었다. 상기 치료 과정은 잘 견디어졌고, 주요 중단기 안전성 문제들이 없었다. 결과들은 중단기 증상 변경에 대한 단축이 상기 플라시보 및 치료 그룹들 모두에서 유사하였던 점을 입증하였다. 연골 퇴행의 객관적인 마커들은 상기 치료 그룹에서 감소되었고, 이러한 점은 MRI T2 매핑에 의해 지지되었으며, 자가 지방조직 유래 세포 치료가 상기 OA의 진행을 느리게 할 수 있고, 보다 긴 기간에서 향상된 결과를 생성할 수 있는 점을 나타낸다.

실험예 2: MSC들로의 신경변성 질환의 치료

신경변성 질환(모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter) 8(MCT8) 결핍)이 있는 두 명의 4세 어린이들이 배양 증량된(culture expanded) 동종 제대혈 유래 MSC들로 2010년에 한 번 그리고 2011년에 한 번 치료되었다. 세포들은 정맥으로 투여되었다.

도 6은 2011년의 제2의 MSC 치료 전의 기초 MIF 레벨들 및 2개월과 5개월의 후-치료에서의 MIF를 나타낸다. MIF의 감소는 상기 소년들에 수행된 신경적 및 물리적 시험들에서의 개선들과 연관성이 있다.

상기 소년들은 다양한 신경적 및 물리적 과제들에 대해 치료 전문가들 및 기록된 이들의 점수들에 의해 지속적으로 평가된다(도 7). 이들은 각 MSC 치료 후에 예기치 않은 이득들을 나타내었다. 언어 및 직업 치료는 제1의 MSC 치료 후에 인상적인 개선을 보여주었다. 물리적 과제들을 수행하는 이들의 능력은 상기 제2의 MSC 치료 후에 뚜렷한 개선을 나타내었다.

실험예 3: 자가 지방조직 유래 세포들로의 근골격 상태들의 치료

이러한 실험예에서 언급되는 데이터 세트는 하이큐셀 관절 레지스트리(HiQCell Joint Registry)로부터의 골관절염 환자들을 포함한다. 상기 레지스트리 프로토콜은 벨베리 인간 연구 윤리 위원회(Bellberry Human Research Ethics Committee)에 의해 승인되었으며, 오스트레일리아 및 뉴질랜드 임상 시험 레지스트리로 등록되었다. 하이큐셀 치료 의사들(TMP들)은 연구에 대해 공동 조사자들이며, 정형외과 의사들 및 근골격 상태들의 진단과 치료에서 훈련된 스포츠 의학 내과 의사들을 포함한다. 이는 제한되지 않은 환자 모집을 갖는 관찰 레지스트리이다. 무작위의 대조 임상 시험과는 달리, 포함이나 배제 기준이 없으며, 이에 따라 리지니어스-승인(Regeneus-accredited) TMP로 하이큐셀 치료를 겪는 모든 환자들은 포함에 대해 적격이었으며, 이종의 집단의 결과로 되었다. 혈청 및 오줌 샘플들도 상기 하이큐셀 관절 레지스트리 이외의 하이큐셀 환자들로부터 수집되었다.

방법론

모든 참가자들은 대략 100-200g의 지방조직을 수확하도록 통상의 지방흡인술 과정을 거쳤다. 상기 조직은 앞서 기술한 경우(개시 사항들이 여기에 참조로 포함된 Blaber S. P., Webster R. A., Hill C. J. 등의 "Analysis of in vitro secretion profiles from adipose-derived cell populations"(J Transl Med 2012; 10: 172-88))와 같이 처리되었다. 간단히 하면, 상기 지방조직은 콜라게나아제로 소화되었고, 펠릿화된 세포들(SVF) 및 상기 지방세포들을 덕기 위해 원심 분리되었다. 상기 SVF 및 지방 세포 서스펜션은 식염수로 두 번 세척되었다. 결과적인 혼합된 세포 집단은 주사되는 관절들의 숫자에 따라 5mL 내지 10mL의 최종 부피까지 식염수 내에 다시 현탁되었다. 상기 혼합된 세포 집단의 일부가 각각의 영향을 받은 관절들 내로 주사되었다.

15명의 환자들의 하위 세트에서, 결과 측정들은 기초 및 매월마다의 후-치료 시점들에서 오줌 및 혈청 바이오마커들의 평가를 포함하였다. CTX-II는 맥쿼리 대학의 오스트레일리아 프로테움 분석 설비(APAF)에서 ELISA 키트를 이용하여 오줌에서 측정되었다. 오줌의 크레아티닌 레벨들도 ELISA에 의해 측정되었고, 도시된 모든 CTX-II 데이터는 보정된 크레아티닌이다. 혈청은 연골 올리고체 기질 단백질(COMP) 및 MIF에 대해 분석되었다. COMP는 OA 환자들 내에서 상당히 상승되는 혈청 레벨들로 골관절염 및 관련 연골 퇴행의 인정된 바이오마커이다("J Orthop Res."(2013 Jul; 31(7): 999-1006. doi: 10.1002/jor. 22324. Epub 2013 Feb 19), "무릎 골관절염 내의 혈청 연골 올리고체 기질 단백질(COMP)(Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in knee osteoarthritis): 새로운 진단 및 예측 바이오마커(a novel diagnostic and prognostic biomarker)").

결과들

2014년 7월에, 하이큐셀로 치료된 494명의 환자들의 전체 숫자의 78%를 나타내는 전체 386명의 환자들이 관절 레지스트리에 포함되었다. 모든 치료된 관절들에 대한 평균 통증 점수는 2주의 후-치료에서 24% 정도; 6개월의 후-치료에서 46% 정도; 1년의 후-치료에서 49% 정도 및 2년의 후-치료에서 51% 정도로 모든 후-치료 시점에서 감소되었다.

도 8은 전-치료(pre-treatment)로부터 4개월의 후-치료까지의 혈청 MIF 레벨들의 상자그림(boxplot)을 나타낸다. 추세 분석은 4개월의 후-치료에 걸쳐 MIF 레벨들의 상당한(p=0.001) 감소를 보여준다. 도 9 및 도 10은 전-치료로부터 4개월의 후-치료까지의 CTXII 및 COMP에 대한 상자그림들 및 추세선들을 나타낸다. 경향은 상기 OSCARS 연구에서 관찰된 경우(실험예 1)와 유사하며, 연골 퇴행이 상기 하이큐셀 관절 레지스트리로부터 분석된 15명의 참가자들에서 느려졌던 점을 나타낸다. 함께 고려할 경우, 이들 결과들은 자가 지방조직 유래 세포 치료가 OA의 치료에 대해 질환 변경 효과를 가질 수 있는 점을 지지한다.

실험예 4: MSC들로의 궤양성 대장염의 치료

염증성 장 질환(inflammatory bowel disease: IBD)의 형태인 궤양성 대장염이 있는 두 명의 성인들이 탯줄(umbilical cord) MSC들로 치료되었다. 궤양성 대장염은 대장의 염증과 다중 궤양들로 특징지어진다. 개체들은 각기 정맥내로 투여된 배양 증량된 동종 제대혈 유래 MSC들의 단일 투여량으로 2013년에 치료되었다. 도 11은 6주 및 12주의 후-치료에서 평가하였을 때에 측정 가능한 MIF 내의 감소를 나타낸다. 세포 치료는 염증(혈청 내의 검출 가능한 MIF로 측정된 바와 같이)을 감소시키고 질환의 증상들을 감소시키는 데 효과적이었다.

여기서의 실험예들에서 입증된 바와 같이, 상기 환자로부터의 생물학적 샘플들 내에서 결정되는 객관적인 바이오마커들의 레벨들과 상기 상태 사이의 연관성은, 예를 들면 치료하는 의사가 상기 환자에게 치료적 투여량을 투여하는 적절한 시간을 결정하는 것을 보조하도록 상기 환자 내의 상태를 평가하는 방법에 대한 기초를 제공한다.

Claims (34)

1. 염증 상태(inflammatory condition)를 갖는 환자 내의 질환 진행을 모니터링하기 위한 방법에 있어서, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플(biological sample) 내의 바이오마커(biomarker) MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 레벨의 변화가 질환 진행을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 증가는 상기 염증 상태의 병리학적 진행 또는 악화를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 감소는 상기 염증 상태의 안정화 또는 개선을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 시간에 걸쳐 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션의 다중 투여량(dose)들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포(non-adipocyte cell)들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션(autologous adipose tissue-derived cell suspension)의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 후속되는 투여량 또는 투여량들은 냉동되어 저장되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션(allogeneic adipose tissue-derived cell suspension)의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 모든 투여량들은 냉동되어 저장되었던 세포 서스펜션을 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 치료의 개시 이전의 상기 대상으로부터의 기초 샘플(baseline sample)이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 제1 투여량 후의 상기 대상으로부터의 샘플이며, 상기 바이오마커 MIF의 레벨이 상기 제1 샘플과 비교해 상기 제2 샘플에서 대략 동일할 경우, 상기 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 대상에 투여되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것을 특징으로 하는 방법.
9. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 이전의 상기 대상으로부터의 기초 샘플이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 제1 투여량 후의 상기 대상으로부터의 샘플이며, 상기 바이오마커 MIF의 레벨이 상기 제1 샘플과 비교해 상기 제2 샘플에서 대략 동일할 경우, 상기 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 세포 서스펜션의 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것을 특징으로 하는 방법.
10. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 제1 투여량 후에 상기 대상으로부터 얻어지고, 상기 제1 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커 MIF의 레벨의 증가가 결정될 경우, 상기 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 추가 투여량은 상기 치료의 개시에서 상기 대상에 투여되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 상기 일부는 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것을 특징으로 하는 방법.
11. 치료를 필요로 하는 대상 내의 염증 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 제1 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 바이오마커 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 제1 투여량 후에 상기 대상으로부터 유래되고, 상기 제1 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내에서 상기 바이오마커 MIF의 레벨의 증가가 결정될 경우, 상기 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 세포 서스펜션의 모든 투여량들은 사용 이전에 냉동되어 저장되었던 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 MSC들은 자가 유래(autologous) 세포들, 동종(allogeneic) 세포들, 제대혈 세포(cord blood cell)들, 증량된 제대혈 세포(expanded cord blood cell)들 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증 상태는 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지거나 관련되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증 상태는 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis)인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증 상태는 OA 또는 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지거나 관련되는 상태로부터 선택되며, 상기 생물학적 샘플 또는 샘플들 내의 CTX-II 및 COMP로부터 선택되는 적어도 제2의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 연골 손상 또는 퇴행과 같은 염증 및 조직 퇴화로 특징지어지는 상태를 갖는 환자 내의 질환 진행을 모니터링하기 위한 방법에 있어서, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 포함하며, 상기 제1 생물학적 샘플에 비해 상기 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 레벨의 변화가 질환 진행을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 시간에 걸쳐 중간엽 줄기 세포(MSC)들을 포함하는 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포들을 포함하는 자가 지방조직 유래 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 제1 투여량은 새롭게 제조된 세포 서스펜션의 일부를 포함하고, 후속되는 투여량 또는 투여량들은 냉동되어 저장되었던 상기 세포 서스펜션의 일부를 포함하며, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 치료를 필요로 하는 대상 내의 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태를 치료하는 방법에 있어서, 상기 대상에 시간에 걸쳐 지방조직 유래 비지방 세포를 포함하는 동종 지방조직 유래 세포 서스펜션의 다중 투여량들을 포함하는 치료의 과정을 투여하는 단계를 포함하며, 모든 투여량들은 냉동되어 저장되었던 세포 서스펜션을 포함하고, 상기 대상으로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커의 레벨을 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생물학적 샘플과 비교해 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 증가는 상기 상태의 병리학적 진행 또는 악화를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생물학적 샘플과 비교해 제2 샘플 내의 상기 바이오마커의 검출 가능한 레벨의 감소는 상기 상태의 안정화 또는 개선을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 16 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 만성 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 16 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 골관절염(OA) 또는 류마티스 관절염(RA)과 같은 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 16 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연골 손상 또는 퇴행으로 특징지어지는 상태는 연골에 대한 손상 또는 외상과 같은 급성 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF의 둘 또는 그 이상의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자로부터의 적어도 제1 및 제2 생물학적 샘플 내의 COMP, CTX-II 및 MIF의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 기초 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 후의 1주 내지 12개월의 상기 환자로부터의 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 생물학적 샘플들 모두는 상기 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 샘플들인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 생물학적 샘플은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전의 상기 환자로부터의 샘플이고, 상기 제2 생물학적 샘플은 상기 치료의 개시 후의 상기 환자로부터의 샘플이며, 상기 제1 및 제2 샘플들 내의 상기 적어도 하나의 바이오마커의 결정된 레벨이 대략 동일할 경우, 상기 세포 서스펜션의 추가 투여량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 제3, 제4, 제5 등의 생물학적 샘플과 같은 상기 환자로부터의 추가적인 생물학적 샘플들 내의 상기 바이오마커의 레벨들을 결정하는 단계를 더 포함하며, 각각의 상기 생물학적 샘플들은 상기 상태에 대한 치료의 개시 이전 및/또는 후의 다른 시간들에서 상기 환자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.

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