CN104703619A - 用于诊断、预测和治疗肌营养不良症的方法 - Google Patents

用于诊断、预测和治疗肌营养不良症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于诊断、预测和治疗肌营养不良症的方法。还公开了确定治疗肌营养不良症的药剂的效果的方法。提供了通过向有需要的受试者给予半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1和/或半乳糖凝集素-3，增强肌肉的再生、修复或维持的方法。还公开了通过向有需要的受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物、半乳糖凝集素-3组合物或其结合，增加或维持受试者的肌力和/或骨密度的方法。公开了通过向有需要的受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物、半乳糖凝集素-3组合物或其结合，预防、抑制和/或减少受试者的肌肉损失和/或骨损失的方法。

Description

用于诊断、预测和治疗肌营养不良症的方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年8月10日提交的美国申请号13/572508的优先权，美国申请号13/572508要求2011年8月11日提交的美国临时申请号61/522507的优先权，在此整体引入上述申请的内容。
技术领域
本申请涉及肌营养不良症的领域，特别涉及用于诊断、预测和治疗患肌营养不良症患者的方法，如分区蛋白缺陷型先天性肌营养不良症1A型、肢带型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、贝克尔(Beckers)肌营养不良症和杜兴氏(Duchenne)肌营养不良症。
背景技术
肌营养不良症是多样的、遗传性的神经肌肉疾病，表现为以初级或次级骨骼肌损害为特征的一组破坏性神经肌肉疾病。杜兴氏肌营养不良症(DMD)是X染色体连锁疾病，也是肌营养不良症的最常见形式。在3500个存活男婴中会有1个受到DMD的影响，患者遭受慢性肌肉退化和肌无力的痛苦。临床症状在2-5岁的年龄间首次被检测到，而且患者在处于少年时期时失去独立行走能力。患者通常在他们30岁以前由于心肺衰竭而发生死亡。
先天性肌营养不良症(CMD)是指一组特征为出生时或在婴儿期肌无力的一组遗传性神经肌肉紊乱。受影响的婴儿会表现出肌肉张力差，很少运动。儿童的生活和寿命质量都受到发展式肌营养不良症、呼吸妥协和脊柱强直影响。分区蛋白缺陷型先天性肌营养不良症(MDC1A)是最常见和最严重的先天性肌营养不良症，占全部CMD确诊病例的30-40％。MDC1A的特点是先天性肌张力低下、明显的关节挛缩、以及缺乏独立行走能力。由于出现呼吸问题，通常需要安置饲管和进行正压通气。MDC1A尚无疗法，患者通常在他们到达10岁的年龄前死亡。目前，对DMD或MDC1A尚无疗法。
发明内容
包括MDC1A、DMD、肢带型肌营养不良症(LGMD)、面肩肱型肌营养不良症(FHMD)、贝克尔肌营养不良症的肌营养不良症是破坏性神经肌肉疾病。除了对这种疾病没有治疗方法外，对这些状况也没有非侵入性的诊断、预测或评估疗效的方法。目前，血清肌酸激酶水平和细针穿刺活检被用于检测DMD、LGMD、FMD、贝克尔肌营养不良症和MDC1A。然而，肌肉活检是疼痛的、侵入性的，并且始终如一地操作是不现实的，血清肌酸激酶水平在同一个病人上可以每日都会变化，导致其成为不可靠的变化指标。需要一种可以很容易地在如血清或尿液中被监测且可以可靠地指示疾病发展的生物标记。
本发明公开了可以被作为生物标记物使用以诊断和/或预测肌营养不良症的肌营养不良症相关分子，该肌营养不良症包括DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症和/或MDC1A。在一些实施方案中，所述肌营养不良症相关分子可包括、基本上由、或者由解聚素和金属蛋白酶组成的物质，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，或其任意组合。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、Co16A1、Itga3、Iga6、Itga7、Tnc和Timp1。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-3和Tnc。在一些实例中，肌营养不良症相关分子至少包括半乳糖凝集素-3用于检测DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A。在一些实例中，肌营养不良症相关分子至少包括半乳糖凝集素-3用于检测DMD。
本发明还公开了诊断或预测患有肌营养不良症的受试者的方法。在一些实例中，该方法包括在来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的风险或者患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的受试者的样本中检测至少一种所述肌营养不良症相关分子，从而诊断或预测患肌营养不良症的受试者。在一些实例中，该方法还包括将来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的风险或者患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的受试者的样本中的半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3的表达与对照物比较，相对于对照物增加的半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3分子的表达表明受试者患肌营养不良症。
此外，公开了在患肌营养不良症受试者中确定治疗肌营养不良症药剂效果的方法。在一些实例中，该方法包括在来自接受药剂治疗受试者的样本中检测肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-3)的表达；将治疗后的肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-3)的表达与标准值比较，其中，接受治疗的肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-3)的表达发生变化，表明该药剂对治疗受试者的肌营养不良症可能是有效的。
还公开了治疗肌营养不良症的方法。在一些实例中，该方法包括向患有肌营养不良症的受试者给予有效量的改变肌营养不良症相关分子表达或生物活性的药剂，从而治疗肌营养不良症和增加受试者的生存机会或者推迟一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的发作。取决于药剂，该改变可能是降低或增加。
还公开了使用半乳糖凝集素或含半乳糖凝集素的组合物治疗受试者的方法。例如，一些实施方案提供通过向受试者给予有效量的半乳糖凝集素或含半乳糖凝集素(包括其片段、衍生物、或类似物)的组合物改善受试者肌肉健康(例如增强肌肉的再生、维持或修复)的方法。
在一些实施方案中，提供了增加/维持肌力和/或骨密度的方法。在一些实施方案中，提供了预防、抑制和/或减少肌肉和/或骨损失的方法。在一些实例中，给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)以增加肌力和/或骨密度和/或预防、抑制或减慢肌肉和骨损失。在一些实例中，向处于罹患肌肉/骨损伤或肌肉/骨损失的风险的受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)，该受试者如运动员、宇航员、或任何其它参与可能会导致肌肉/骨损伤和/或损失活动的个人。在一些实例中，提供一个所述疗法(如所述半乳糖凝集素-1疗法)以阻止肌肉/骨损伤和/或损失。在一些实例中，提供一个所述疗法(如所述半乳糖凝集素-1疗法)以维持骨密度和/或肌力。在一些实例中，提供一个所述疗法(如半乳糖凝集素-1疗法)以治疗经历骨密度和/或肌力损失的受试者，其中疗法的给予方式是增加骨密度和/或肌力或维持现有的肌力和骨密度(例如预防肌力和/或骨密度的进一步损失)。
在一些实例中，向处于罹患或遭受与肌肉损失、骨损失、肌肉密度损失、和/或肌力损失有关的状况或疾病的风险的受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)，该受试者例如但不限于处于罹患或遭受脊柱后凸、肌营养不良症、骨折、肌肉拉伤、肌肉撕裂、肌腱损伤、骨质疏松症、类风湿关节炎、狼疮、脊柱侧凸和/或多发性硬化的风险。在一些实例中，给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)以预防、治疗或减缓与衰老相关的迹象或症状的发展。可以预期的是，半乳糖凝集素组合物可以短期或长期给予，从几天到几年。可以预期的是，可以给予半乳糖凝集素组合物作为营养补充。
在一些实例中，在手术后给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1)，如向已经历手术并可能处于患肌肉损失、骨损失、肌力损失或肌肉密度损失的风险或患肌肉损失、骨损失、肌力损失或肌肉密度损失的受试者。在一些实例中，向怀孕后的雌性受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1)。在一些实例中，向短期或长期昏迷的受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1)。
在一个具体实施例中，半乳糖凝集素是完整的半乳糖凝集素蛋白，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3。在另外的实例中，半乳糖凝集素选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3，及其组合物。在另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物包括一种至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质。在又另外的实施方式中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物包括至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的多肽。
在另外的实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物由半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合组成。在又另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物由至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质组成。在一个具体实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物不包括半乳糖凝集素片段，如仅包括一个完整的半乳糖凝集素蛋白。
在又另外一个例子中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物基本上由半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合组成。在另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物实质上是由至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质组成。在又另外的实施方案中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物本质上是由至少基本上与半乳糖凝集素α1链同源的多肽组成。在一个具体实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物不包括半乳糖凝集素片段，如基本上仅包括一个完整的半乳糖凝集素蛋白。
本发明所述方法的另外实施方案包括诊断具有通过给予半乳糖凝集素或含有半乳糖凝集素组合物(如通过给予半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或其组合或含有半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及组合的组合物)可治疗的病症的受试者。在一个实例中，所述受试者被诊断患肌营养不良症，如LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症和/或MDC1A。在另外的实例中，病症的特征在于：受试者不能、或受试者的能力不足以表达一种或多种与细胞外基质的形成或维持相关的蛋白质，如不能修复或不能生产半乳糖凝集素、整联蛋白、肌营养不良蛋白、肌营养不良蛋白相关蛋白(utrophin)或肌营养不良蛋白聚糖。
在一个具体的实施方案中，本发明还提供一种通过给予有效量的半乳糖凝集素组合物(如有效量的半乳糖凝集素-1和/或半乳糖凝集素-3组合物)增加受试者肌肉再生的方法。例如，老年受试者、患肌肉疾病的受试者、和患肌肉损伤(包括活动引起的肌肉损伤，如由锻炼导致的损伤)的受试者，可从此实施方案获益。
在所述方法的又一实施方案中，以预防性的方式给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物(如含半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或其组合的组合物)，例如，从而预防或减少肌肉或骨损伤或伤害(如活动或锻炼诱发的损伤)。例如，可以为了预防、消除或改善骨或肌肉损害(damage)、损伤(injury)或疾病而治疗老年受试者、手术后受试者、怀孕后受试者、容易发生肌肉损伤的受试者、或有肌肉损伤风险的受试者(如运动员)。
本发明公开的实施方案也可用于促进伤口愈合。在一些实例中，半乳糖凝集素或含半乳糖凝集素的组合物被给予到伤口中或贴近伤口。在进一步的实例中，全身性给予该物质。尽管通常在伤口出现后给予该物质，在一些实例中也可预先给予该物质。
在另外的实施方案中，本发明公开的方法包括与一种或多种另外的药理物质(例如治疗剂)一起给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或其含组合物。在一些方面，另外的治疗剂增强半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物的治疗效果。在另外的方面，治疗剂向正被治疗的病症提供独立的治疗成效。在多种实施例中，另外的治疗剂是细胞外基质的成分，如整联蛋白、肌营养不良症蛋白、肌营养不良蛋白、肌营养不良蛋白聚糖、肌营养不良蛋白相关蛋白、或生长因子。在另外的实例中，治疗剂降低或提高增强细胞外基质形成或维持的物质的表达。
在一些实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物被施加到待治疗受试者的特定区域。例如，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物可以被注射到待治疗的特定区域中，如肌肉。在另外的实例中，给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，使其分散到受试者的多个区域，如全身给予或局部给予。
可以通过任何合适的方法，如局部、肠胃外(例如静脉内或腹膜内)、或口服，给予半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、或其组合)或含半乳糖凝集素的组合物。在一个具体实例中，全身给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，如经肠胃外给予，如胃注射或腹腔注射。
虽然本发明所述的方法通常是相对于肌肉再生描述的，这些所述的方法也可用来增强对其它组织和器官的修复或维持、或预防损害。例如，源自对细胞或组织而不是对骨骼肌肉的效果，本发明所述的方法可用于治疗肌营养不良症的症状，如受损或改变的脑功能、平滑肌肉或心脏肌肉。
还提供了鉴定用于治疗肌营养不良症的药剂的方法。在一些实例中，该方法包括在足以使一种或多种测试药剂改变肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)活性的情况下，将一种或多种测试药剂与样本相接触；在所述一种或多种测试药剂的存在下，检测营养不良-相关分子，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3的活性；并且将在所述一种或多种测试药剂的存在下肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)的活性与标准值比较，以确定肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)的表达是否有改变，其中，肌营养不良症相关分子(如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)表达的改变表明，所述一种或多种测试药剂可以用于治疗肌营养不良症症。在一些实例中，增加的半乳糖凝集素-1表示测试药剂可用于治疗肌营养不良症。
根据下面的详细描述并参考附图，本发明的前述和其它特征将更加明显。
附图说明
图1A和1B是柱形图，说明Lgals1和Lgals3的转录在dyW-/-小鼠中发生改变。图1A表明在野生型4周龄和8周龄的动物两者中，Lgals1(半乳糖凝集素-1)的转录显著增加。图1B表明在野生型4周龄和8周龄的动物两者中，Lgals3(半乳糖凝集素-3)的转录也显著增加。**P<0.01，****P<0.00001。
图2A-2C是数字图像和柱形图，表明对4周龄和8周龄的dyW-/-和野生型小鼠的半乳糖凝集素-1蛋白质印迹研究。图2A表示在4周龄dyW-/-小鼠肌肉中的半乳糖凝集素-1蛋白的区别与野生型动物显著不同。图2B表明，在8周龄dyW-/-动物的腓肠(grostocnemius)肌中的半乳糖凝集素-1蛋白水平与在野生型中的测量值不存在显著区别。图2C表明，在4周龄和8周龄的dyW-/-小鼠中的半乳糖凝集素-1蛋白没有区别。
图3A是4周龄和8周龄dyW-/-和野生型小鼠中的半乳糖凝集素-3蛋白质印迹结果的数字图像。
图3B是柱形图，定量表示在4周龄和8周龄dyW-/-动物腓肠肌中半乳糖凝集素-3蛋白的水平，并与野生型(对照)的小鼠作比较。
图4A和4B是数字图像和柱形图，表示对4周龄和8周龄的dyW-/-和野生型小鼠血清的半乳糖凝集素-3蛋白质印迹研究。图4A表明，与野生型动物相比，在4周龄dyW-/-小鼠的血清中，半乳糖凝集素-3蛋白没有显著差异。图4B表明，在4周龄和8周龄的dyW-/-小鼠的血清中，半乳糖凝集素-3蛋白没有显著差异。
图5是一系列4周龄和8周龄的dyW-/-和野生型小鼠的半乳糖凝集素-3免疫荧光数字图像。免疫荧光被用来评估在小鼠的胫骨前肌中半乳糖凝集素-3的水平。与野生型小鼠相比，发现在4周龄dyW-/-小鼠中半乳糖凝集素-3提高。在8周龄的dyW-/-小鼠和野生型小鼠中，半乳糖凝集素-3的情况相似。在4周龄和8周龄的dyW-/-小鼠中，半乳糖凝集素-3的水平也相似。在野生型小鼠中，随着年龄增加，半乳糖凝集素-3的水平看起来增加。
图6A和图6B是柱形图，表示在mdx鼠中Lgals1和Lgals3转录的变化。图6A表示Lgals1(半乳糖凝集素-1)转录在野生型的5周龄和10周龄动物二者中显著增加。图6B表示Lgals3(半乳糖凝集素-3)转录在野生型的5周龄和10周龄动物中显著增加。
图7A-7C是2周龄、5周龄和10周龄的mdx和野生型小鼠的半乳糖凝集素-1的蛋白质印迹结果的柱形图和数字图像。图7A表示，与野生型动物相比，在5周龄mdx小鼠的肌肉中未观察到半乳糖凝集素-1蛋白存在显著差异。图7B表明，与野生型相比，在5周龄mdx动物的腓肠肌中，未观察到半乳糖凝集素-1蛋白的水平存在显著差异。图7C表明，在2周龄和5周龄的mdx小鼠中，半乳糖凝集素-1蛋白没有区别。在2周龄和10周龄小鼠以及5周龄和10周龄小鼠中，存在显著差异。
图8A和8B是在5周龄和/或10周龄的mdx和野生型小鼠中半乳糖凝集素-3的蛋白质印迹结果的柱形图和数字图像。图8A表明，与野生型动物相比，在5周龄mdx小鼠的肌肉中半乳糖凝集素-3蛋白存在显著差异。图8B表示了在5周龄和10周龄mdx和野生型小鼠的腓肠肌中半乳糖凝集素-3蛋白的水平，并表明10周龄mdx动物的半乳糖凝集素-3蛋白的水平显著大于5周龄mdx动物的半乳糖凝集素-3蛋白的水平。
图9A和图9B是在5周龄和10周龄的mdx和野生型小鼠的血清中半乳糖凝集素-3的蛋白质印迹研究的柱形图和数字图像。图9A表明，与野生型动物相比，在5周龄mdx小鼠的血清中半乳糖凝集素-3的蛋白没有显著差异。图9B表明，在10周龄mdx小鼠血清和年龄匹配的野生型血清之间，半乳糖凝集素-3蛋白没有显著差异。
图10是一系列5周龄和10周龄的mdx和野生型小鼠的半乳糖凝集素-3免疫荧光数字图像。免疫荧光用于评价胫骨前肌的半乳糖凝集素-3水平。与野生型小鼠相比，在5周龄和10周龄mdx小鼠中半乳糖凝集素-3提高。与5周龄小鼠相比，在10周龄mdx小鼠中半乳糖凝集素-3提高，而在5周龄和10周龄野生型小鼠中半乳糖凝集素-3的水平相似。
图11是对DMD的金毛猎犬肌营养不良症(GRMD)狗模型的肌肉的半乳糖凝集素-3水平的蛋白质印迹研究的数字图像。在GRMD狗的肌肉、通道A和E中检测到半乳糖凝集素-3蛋白的水平提高。在未受影响的对照狗样本、通道B-D中没有或几乎没有观察到半乳糖凝集素-3。
图12是从Talon亲和柱洗脱的半乳糖凝集素-1片段的数字图像。
图13是表明半乳糖凝集素-1的治疗减少mdx小鼠肌肉损伤的图和表。
图14是表明半乳糖凝集素-1治疗增加α7整联蛋白的图、表和数字图像。
图15A-15D表明，半乳糖凝集素-1治疗成肌细胞和肌管导致a7和b1整联蛋白水平在转录和蛋白水平两个方面的提高。图15A是柱形图，表示具有提高的重组半乳糖凝集素-1水平的a7+/bGal成肌细胞的效果，并使用FDG活性分析法检查了β半乳糖苷酶活性的增加(ITGA7表达水平的报道基因)。图15B是柱形图，表示使用半乳糖凝集素-1或PBS对C2C12成肌细胞的治疗效果，并相对于GAPDH水平检查了α7整联蛋白水平，定量并用图表示。图15C是柱形图，表明使用半乳糖凝集素-1或PBS对C2C12成肌细胞的治疗效果，并用Ponceau S染料检查β1整联蛋白水平，定量并用图表示。图15D是柱形图，表明来自使用PBS或0.2mM重组半乳糖凝集素-1治疗C2C12成肌细胞和肌管的ITGA7、ITGB1和LGALS1水平的定量实时PCR结果。
图16A-16D是柱形图，表示使用重组半乳糖凝集素-1对mdx小鼠胫骨前(TA)肌肉的肌间(IM)注射减少了肌肉损伤和对再生的需要，这是通过中心定位细胞核(CLN)的组织学外观确定的。4周龄、3周龄、5周龄和5周龄的mdx小鼠的TA肌肉分别被IM注射20ng(图16A和16B)、1.5mg(图16C)或150mg(图16D)的重组半乳糖凝集素-1蛋白。在注射48小时后进行组织解剖，冷冻切片，使用标准的苏木精和曙红程序染色并分析CLN。通过史蒂顿特测试计算显著性(ns＝无显著性，*P<0.05)。
图17A-17J是柱形图，表示对mdx小鼠的半乳糖凝集素-1治疗增加肌膜稳定肌营养不良蛋白聚糖复合物(DGC)的蛋白水平，该DGC在肌营养不良蛋白不存在时通常是不足的。每周使用PBS或5mg/kg的重组半乳糖凝集素-1腹腔注射治疗mdx小鼠，并使用标准印迹程序检查该小鼠的TA蛋白。关于α7A整联蛋白(图17A)、α7B整联蛋白(图17B)、β1D整联蛋白(图17C)、α-肌营养不良蛋白聚糖(图17D)、β-肌营养不良蛋白聚糖(图17E)、β-肌聚糖(图17F)、γ-肌聚糖(图17G)、δ-肌聚糖(图17H)、ε-肌聚糖(图17I)以及肌长蛋白(sarcospan)(图17J)的结果被量化，分成2个鼠组，并相对a-微管蛋白绘图。通过史蒂顿特测试计算显著性(*P<0.05，P<0.01，***P<0.001)。
图18A-18C是柱形图，说明mdx小鼠的半乳糖凝集素-1治疗增加α7β1整联蛋白复合物和LGALS1成员的转录水平。且使用定量实时PCR分析mdx小鼠的TA转录，该mdx小鼠每周通过腹膜注射PBS或5mg/kg重组半乳糖凝集素-1治疗。与GAPDH比较计算相对倍数后，ITGA7(图18A)、ITGB1(图18B)和LGALS1(图18C)的结果如所示。
图19A-19D是表明半乳糖凝集素-1对mdx小鼠的治疗增加相对强度、减少疲劳和正常化肌肉组织纤维尺寸的图。(图19A)使用标准程序对被每周腹腔注射PBS或5mg/kg重组半乳糖凝集素-1治疗的mdx小鼠或者未经治疗的黑-10小鼠进行握力研究。然后计算和绘图平均力量/克体重(图19B)和疲劳百分比(图19C)。(图19D)TA被冰冻切片成10mM片和并通过最小Feret直径测量法在H&E染色部分确定纤维的尺寸。以至少1000根纤维为1组分析Feret直径。通过史蒂顿特测试计算显著性(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图20是一组数字图像和柱形图，显示mdx小鼠的半乳糖凝集素-1治疗导致肌力增加，预防10周龄小鼠的脊柱后凸。对PBS(顶部，n＝2)或5mg/kg/周重组半乳糖凝集素-1(底部，n＝4)治疗的10周龄mdx小鼠拍摄矢状X射线图像。通过绘制从颈部的脊柱底部向在髋骨起始处的脊柱底部的直线分析脊柱弯曲(脊柱后凸)。然后从脊柱曲线的顶点向下做垂线，并根据这条线的长度测量脊柱后凸。通过史蒂顿特测试计算显著性(*P<0.05)。
图21A-21F表明半乳糖凝集素-1治疗的mdx小鼠导致增加发育过程的骨骼生长。对10周龄的mdx小鼠的颅骨(图21A，实施例)和冠状体(图21B，s实施例)拍摄了矢状X射线图像，该mdx小鼠通过PBS或5mg/kg/周的重组半乳糖凝集素-1治疗。根据这些图像测量下颌长度(图21C)、股骨长度(图21D)、股骨区(图21E)以及胫骨长度(图21F)，并绘图。通过史蒂顿特测试计算显著性(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
具体实施方式
几个实施方案的详细说明
I.几个实施方案的概览
本发明公开了可以用作生物标记物来诊断和/或预测肌营养不良症的肌营养不良症相关分子，该肌营养不良症包括DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症和/或MDC1A。在一些实施方案中，所述肌营养不良症相关分子可包括、基本上由、或者由解聚素和金属蛋白酶组成的物质，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，或其任意组合。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、Co16A1、Itga3、Iga6、Itga7、Tnc和Timp1。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-3和Tnc。在一些实例中，肌营养不良症相关分子至少包括半乳糖凝集素-3用于检测DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A。在一些实例中，肌营养不良症相关分子至少包括半乳糖凝集素-3用于检测DMD。
本发明还公开了诊断或预测肌营养不良症的受试者的方法。在一些实施方案中，包括在来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的风险或者患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的受试者的样本中检测至少一种所述肌营养不良症相关分子，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3，从而诊断或预测该受试者患肌营养不良症。
在一些实施方案中，诊断或预测患肌营养不良症的受试者的方法，包括在来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的风险或者患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的受试者的样本中检测半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3的表达，从而诊断或预测该受试者患有肌营养不良症。在一些实例中，该方法还包括将来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关迹象或症状的风险或者患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的受试者样本中的半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3的表达与对照物比较，其中相对于对照物增加的半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3的表达表明受试者患肌营养不良症。
在一些实施方案中，肌营养不良症是MDC1A、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或DMD。
在一些实施方案中，检测表达包括检测半乳糖凝集素-3和/或半乳糖凝集素-1。
在一些实施方案中，与对照物比较增加的半乳糖凝集素-3分子的表达表明，受试者具有不好的预测和降低的存活机会。
在一些实施方案中，肌营养不良症是DMD。
在一些实施方案中，样本是血液或尿液样本。
在一些实施方案中，通过实时定量聚合酶链反应、微阵列分析或蛋白质印迹分析测量表达。
在一些实施方案中，公开了治疗受试者的肌营养不良症的方法。在一些实施方案中，该方法包括对患肌营养不良症的受试者给予有效量的药剂，该药剂可以改变半乳糖凝集素-3的表达或生物活性，从而治疗一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状，增加受试者的生存机会。在一些实施方案中，所述药剂降低半乳糖凝集素-3的生物活性。在一些实施方案中，所述药剂增加半乳糖凝集素-3的生物活性。
在一些实施方案中，公开了治疗受试者中的肌营养不良症的方法。在一些实施方案中，该方法包括对患肌营养不良症的受试者给予有效量的药剂，该药剂可以增加半乳糖凝集素-1的表达或生物活性，从而治疗一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状，增加受试者的生存机会。在一些实施方案中，该药剂增加半乳糖凝集素-1的生物活性。
在一些实施方案中，还公开了使用半乳糖凝集素或含半乳糖凝集素的组合物治疗受试者的方法。例如，一些实施方案提供通过向受试者给予有效量的半乳糖凝集素或含半乳糖凝集素(包括其片段、衍生物、或类似物)的组合物改善受试者肌肉健康的方法，例如增强肌肉的再生、维持或修复。在一个具体实例中，半乳糖凝集素是一个完整的半乳糖凝集素蛋白。在另外的实例中，半乳糖凝集素选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、及其组合。在另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物包括一种至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质。在又另外的实施方式中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物包括至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的多肽。
在一些实施方案中，提供了增加/维持肌力和/或骨密度的方法。本发明还公开了预防、抑制和/或减少肌肉和/或骨损失的方法。在一些实例中，给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)以增加肌力和/或骨密度和/或预防、抑制或减慢肌肉和骨损失。在一些实例中，向处于罹患肌肉/骨损伤或肌肉/骨损失的受试者给予半乳糖凝集素组合物，例如半乳糖凝集素-1组合物，该受试者如运动员，宇航员，或任何其它参与可能会导致肌肉/骨损伤和/或损失的活动的个人。在一些实例中，提供所述疗法(如半乳糖凝集素-1疗法)以阻止肌肉/骨损伤和/或损失。在一些实例中，提供所述疗法(如半乳糖凝集素-1疗法)以维持骨密度和/或肌力。在一些实例中，提供所述疗法(如半乳糖凝集素-1疗法)以治疗经历骨密度和/或肌力损失的受试者，其中疗法的给予方式是增加骨密度和/或肌力或维持现有的肌力和骨密度(例如，预防肌力和/或骨密度的进一步损失)。
在一些实例中，向处于罹患或经历与肌肉损失、骨损失、肌肉密度损失有关的病症或疾病的风险的受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)，该受试者例如但不限于处于罹患或经历脊柱后凸、肌营养不良症、骨折、肌肉拉伤、肌肉撕裂、肌腱损伤、骨质疏松症、类风湿关节炎、狼疮、脊柱侧凸和/或多发性硬化的风险。在一些实例中，给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1组合物)，以预防、治疗或减慢与衰老相关的迹象或症状的发展。可以预期的是，半乳糖凝集素组合物可以短期或长期给予，从几天到几年。在一些实例中，在手术后给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1)，如向已经历手术并可能处于经历肌肉损失、骨损失、肌力损失或肌肉密度损失的风险或患肌肉损失、骨损失、肌力损失或肌肉密度损失的受试者。在一些实例中，向怀孕后的雌性受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1)。在一些实例中，向短期或长期昏迷的受试者给予半乳糖凝集素组合物(如半乳糖凝集素-1)。
II.术语
以下提供的术语和方法的解释用于更好地描述本发明公开的内容，指导本领域技术人员实现本发明。除非上下文另外明确指出，单数术语“a”，“an”和“the”包括复数对象。类似地，除非上下文另有明确说明，单词“或”也表示包括“和”。术语“包括”是指“包含”。因此，“包含A或B”，意味着“包括A、B、或A和B”，但不排除其它成分。
还应该理解的是，关于核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子质量值，都是近似的，并且是用于说明的。尽管与本发明所述相类似或等同的方法和材料可用于实现或测试本发明，但合适的方法和材料如下所述。
除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的技术人员通常的理解相同。分子生物学常用术语的定义可见：Benjamin Lewin，GenesV，Oxford University Press出版，1994年(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，Black well ScienceLtd.出版，1994年(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编)，MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCHPublishers，Inc.出版，1995年(ISBN1-56081-569-8)。
所有出版物、专利申请、专利和本发明提及的其它参考文献都通过引用整体结合入本发明。以公开的基因库登记号提供的、2011年8月11日可用的所有序列通过引用结合入本发明。在冲突的情况下，以本说明书，包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限定性的。
为了便于理解本发明公开的各个实施方案，为特定术语提供了下列解释：
给予：通过任何有效的途径提供或给予受试者药剂。给予的示例性途径包括但不限于：注射(如皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、口服、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。例如，也可使用这些技术的结合给予受试者半乳糖凝集素或其组合物。
合适的固体或液体药用制剂形式是：如气雾剂、(微)胶囊、乳膏、滴剂、滴剂或安瓿形式的可注射溶液、乳剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、悬浮液、糖浆、片剂、包衣片剂、以及活性化合物缓释释放的制剂，在该制剂中通常使用如上所述的赋形剂和添加剂和/或助剂，如粘合剂、包衣剂、崩解剂、调味剂、润滑剂、增溶剂、甜味剂、或溶胀剂。该药物组合物适合用于多种药物传输系统。用于药物传输的多种方法的简述，见Langer，New Methods of Drug Delivery，Science249:1527-1533(1990)，通过参考结合如本发明，结合程度以不与本发明公开的内容冲突为限。
半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3或所述组合物或本发明公开的其它治疗剂或营养剂可被制剂成可胃肠外或口服给予受试者的活性药物或营养组合物。肠胃外给予途径包括但不限于表皮、动脉内、肌肉内(IM和贮藏IM)、腹膜内(IP)、静脉内(IV)、胸骨内注射或输注技术、鼻内(吸入)、鞘内、注射入胃、皮下注射(皮下(SQ和贮藏SQ))、经皮、局部、和眼部。
半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3或所述组合物或其它治疗剂或营养剂可以与药学上可接受的赋形剂混合或结合以制备合适的药物组合物。药学可接受的赋形剂/载体包括但不限于：氧化铝、硬脂酸铝、缓冲剂(例如磷酸盐)、甘氨酸、离子交换剂(如、以帮助控制电荷物质的释放)、卵磷脂、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物酸、山梨酸钾、血清蛋白(如人血清白蛋白)、山梨酸、水、盐或电解质如纤维素基物质、胶体二氧化硅、磷酸氢二钠、三硅酸镁、聚丙烯酸酯、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸氢钾、硫酸鱼精蛋白、组1的卤化物盐如氯化钠、羧甲基纤维素钠、蜡、羊毛脂、和锌盐。脂质体悬浮液作为药学可接受载体也可能是合适的。
在混合或加入所述组合物、或其它治疗剂时，所得到的混合物可以是固体、溶液、悬浮液、乳剂或类似物。可以根据本领域技术人员的已知技术制备这些物质。所得混合物的形式取决于许多因素，包括给予的预期模式和药剂在所选载体内的溶解度。
适合给予半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗剂的药物载体包括适合特定给予模式的任何已知载体。此外，半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗性物质也可以与其它不损害所期望的效用的非活性或活性材料混合，或者与补充所期望的效用的材料、或具有另外效用的材料混合。
对在载体中表现为溶解度不足的药剂，可采用增溶的方法。这些方法是已知的，包括但不限于，使用如二甲基亚砜(DMSO)的共溶剂、和使用如(ICI Americas，Inc.，Wilmington，DE)的表面活性剂溶解于碳酸氢钠水溶液中。
半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗剂可以与保护它们免于从体内快速消除的载体一起制备，如涂层或时间缓释制剂。这样的载体包括控释制剂，例如但不限于微胶囊递送系统。半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3)或其它治疗剂以在所治疗的受试者上足以发挥治疗有用效果的用量、通常以避免不期望的副作用的用量被包括在药学上可接受的载体中。通过在已知的针对所治疗病症的体外和体内模型系统中测试化合物，可以经验确定治疗有效浓度。例如，可以使用肌营养不良症的鼠模型来确定随后可以转换到其它受试者(如人类)上的有效量或浓度，这是本领域已知的。
配制注射溶液或悬浮液，可使用合适的无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，如1,3-丁二醇、等渗氯化钠溶液、甘露醇、林格氏液、生理盐水溶液、或水；或合适的分散或润湿剂和悬浮剂，如包括合成的单或二甘油酯的无菌无刺激固定油类，，和包括油酸的脂肪酸；天然存在的植物油如椰子油、棉籽油、花生油、芝麻油及其类似物；甘油；聚乙二醇；丙二醇；或其它合成溶剂；抗微生物剂如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；调整张力剂如氯化钠和右旋糖；及其组合。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃、塑料或其它合适的材料制成的多剂量小瓶中。可根据需要加入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。在静脉内给予的情形下，合适载体包括生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、以及含有增稠剂和增溶剂的溶液(如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇、及其混合物)。包括组织-靶向脂质体的脂质体悬浮液也可以适合作为药学可接受载体。
对于局部应用，半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗剂可以在合适的含水或非水载体中制成乳膏、洗剂、软膏、溶液或悬浮液。局部给予也可以通过包括治疗物质的经皮贴剂或绷带来实现。添加剂也可以包括例如，缓冲剂，如偏亚硫酸氢钠或依地酸二钠；防腐剂，如杀菌剂和杀真菌剂，包括乙酸苯汞或硝酸根、苯扎氯铵、或氯己定；和增稠剂，如羟丙甲纤维素。
如果半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗剂是作为悬浮液被口服给予，药物组合物可根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可以含有悬浮剂如藻酸或藻酸钠、填充剂如微晶纤维素、粘度增强剂如甲基纤维素、和甜味剂/调味剂。口服的液体制剂可以含有常规添加剂例如悬浮剂，如明胶、葡萄糖糖浆、氢化食用脂肪、甲基纤维素、山梨糖醇、和糖浆；乳化剂，如阿拉伯树胶、卵磷脂、或脱水山梨糖醇单油酸酯；非水载体(包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、如甘油的油酯、丙二醇或乙醇；防腐剂如甲基或丙基对羟基苯甲酸或山梨酸；并且，如果需要的话，含有常规调味剂或着色剂。当配制为快速释放的片剂时，这些组合物可以包含磷酸二钙、乳糖、硬脂酸镁、微晶纤维素、和淀粉和/或其它粘合剂、稀释剂、崩解剂、赋形剂、增量剂和润滑剂。
如果口服给予是理想的，该半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗性物质可以是以在胃的酸性环境中保护它的组合物形式提供。例如，可以将半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或所述组合物或其它治疗剂与在胃中保持其完整性并在肠道中释放活性化合物的肠溶包衣一起配制。也可将半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或所述组合物或其它治疗剂与抗酸剂或其它此类成分一起结合配制。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体，并可以被压缩成片剂或封装在明胶胶囊中。为了口服治疗给予的目的，可将半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3)或所述组合物或其它治疗性物质结合赋形剂并以胶囊、片剂、或锭剂的形式使用。可包括药学相容的辅助物质或结合剂作为组合物的一部分。
胶囊、丸剂、片剂、锭剂及其类似物可含有任何具有相似性质的下列成分或化合物：粘合剂，例如但不限于阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮、或山梨糖醇；填料，例如磷酸钙、甘氨酸、乳糖、微晶纤维素或淀粉；崩解剂，例如但不限于藻酸和玉米淀粉；润滑剂，例如但不限于硬脂酸镁、聚乙二醇、二氧化硅、或滑石粉；助流剂，例如但不限于胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；崩解剂如马铃薯淀粉；分散剂或润湿剂如十二烷基硫酸钠；和调味剂如薄荷、水杨酸甲酯、或水果香料。
当剂量单位的形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，还可以包含液体载体，如脂肪油。另外，剂量单位的形式可含有改变剂量单位物理形式的各种其它材料，如糖包衣和其它肠溶剂。半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3)或所述组合物、或其它治疗剂也可作为酏剂、悬浮液、糖浆、晶片、茶、口香糖及其类似物的成分给予。除了活性化合物外，糖浆剂可含有作为甜味剂的蔗糖或甘油、以及某些防腐剂、染料、着色剂、香料。
当口服给予时，该化合物可以通常的剂量形式口服给予。这些剂量形式包括通常的固体单位剂量形式，如片剂和胶囊剂，以及液体剂量形式，如溶液、悬浮液和酏剂。当使用固体剂量形式时，可以是缓释类型的，以便不必频繁给予化合物。
药剂：任何蛋白、核酸分子(包括化学改性的核酸)、化合物、抗体、小分子、有机化合物、无机化合物、或其它感兴趣的分子。药剂可以包括治疗剂、诊断剂或药物剂。治疗剂或药物剂单独或与另外的化合物联合诱导所期望的反应(例如在向受试者给予时诱导治疗或预防效果，包括治疗患肌营养不良症的受试者)。
在一些实例中，药剂可直接或间接地起作用以改变半乳糖凝集素-1和/或半乳糖凝集素-3的活性。治疗剂的例子是，可改变与肌营养不良症有关的基因或基因产品的活性的治疗剂(如增加存活时间，或者减轻与肌营养不良症相关的一种或多种迹象或症状)，如通过临床反应测量。治疗剂还包括模仿治疗有效的肽、抗体或核酸分子的作用的有机物或其它化学化合物。
“药物剂”是一种化学化合物或组合物，在单独或与另一种治疗剂或药学可接受载体组合给予于受试者时，能够诱导所期望的治疗或预防效果。在一个特定实例中，药物剂显著降低了肌营养不良症相关分子的表达和/或活性，从而增加受试者的存活时间。
抗体：一种多肽，包括至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区，该可变区特异性识别和结合抗原的表位，如肌营养不良症相关分子或其片段。抗体由一个重链和一个轻链组成，其中每一个链都具有一个可变区，称为可变重链区(VH)和可变轻链区(VL)。VH区和VL区一起负责结合由抗体识别的抗原。本发明公开的抗体包括特异于肌营养不良症相关分子的抗体，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3。
术语抗体包括完整免疫球蛋白，及其变体和部分，如Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、和二硫化物稳定Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接体结合，而在dsFvs中，链已变异成引入二硫键来稳定链的缔合。该术语也包括遗传工程的形式，如嵌合抗体(如人源化鼠抗体)、异源抗体(如双特异性抗体)。也见Pierce Catalog and Handbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，New York，1997。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型：拉姆达(λ)和卡帕(κ)。重链有五种主要的类别(或同种型)，它决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链含有恒定区和可变区(该区域也被称为“结构域”)。在组合中，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区含有一个被三个高变区中断的“框架”区，该结构也被称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR的范围已被定义(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Departmentof Health and Human Services，1991)。Kabat数据库现在在网上可用。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于定位和对齐在三维空间中的CDR。
CDR主要负责结合抗原的表位。每条链的CDR通常称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端开始按顺序编号，并且通常还由特定CDR所在的链识别。因此，VH CDR3位于其被发现的抗体的重链可变结构域上，而VL CDR1是来自其被发现的抗体的轻链可变结构域上的CDR1。结合RET的抗体具有特定的VH区和VL区的序列，由此具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(如不同的结合位点对应不同的抗原)具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间的CDR不同，但在CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。在CDR中的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括的Fv、scFv、dsFv或Fab。
“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单个克隆体或细胞产生的抗体，其中单一抗体的轻链和重链基因已被转染。单克隆抗体是通过本领域已知的方法产生的，例如从融合骨髓瘤细胞与免疫脾细胞制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“多克隆抗体”是指从不同的B细胞系衍生的抗体。多克隆抗体是针对特定抗原分泌的免疫球蛋白分子混合物，各分子识别不同的表位。这些抗体是由本领域已知的方法产生的，如通过向合适的哺乳动物注射抗原(例如小鼠、兔或山羊)，诱导B淋巴细胞产生抗原特异的IgG免疫球蛋白，然后从哺乳动物的血清中提纯。
“嵌合抗体”具有一个物种的框架残基，如人，以及来自另一物种的CDR(通常提供抗原结合)，如特异性结合肌营养不良症相关分子的鼠抗体。
“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人类(如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一种或多种CDR的免疫球蛋白。所述非人类免疫球蛋白提供的CDR被称为“供体”，和人免疫球蛋白提供所述框架被称为“受体”。在一个实例中，所有的CDR是来自在人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果恒定区不存在的话，该恒定区是ly相同于人免疫球蛋白恒定区的，如至少约85-90％相同，如约95％或更多相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有位置，除CDR的可能位置外，基本上是与对应天然人免疫球蛋白序列的部分相同的。人源化免疫球蛋白可通过基因工程的方法来构建(见，如美国专利号5,585,089)。
表达的改变或调制：基因、基因产品或其调制物(如本发明公开的一种或多种肌营养不良症相关分子)的表达的改变，是指相对于对照物(如来自没有肌营养不良症受试者的样本)或者已知的指示未患病基因、基因产品或其调制物水平的参考值，生物样本(如来自处于患肌营养不良症的风险或患肌营养不良症的受试者的样本)中的可检测基因、基因产品或其调制物水平的改变或差异(如增加或减少)。表达的“改变”包括表达的增加(上调)或表达的下降(下调)。
类似物：与一种化合物足够同源的化合物，在期望的目的下，具有与原始化合物相似的功能活性。与特定的物质比较，类似物包括具有一种或多种氨基酸取代基的多肽。
至少基本上同源：在本发明中所用的短语，是指一定程度的同源性，足以在肌肉再生、维持或修复、或伤口愈合方面使参考材料产生至少一部分活性。在一些实例中，当它们是至少约95％、至少约98％、或至少约99％与参考材料同源的，则材料是至少基本上同源的。
生物活性：药剂对活体的有利或不利影响。当药剂是一种复杂的化学混合物时，活性是由物质的活性成分或药效作用引起的，但可以通过其它成分进行改性。活性一般是剂量-依赖的，不常见的是当一种物质从低剂量到高剂量时，药效从有利转为不利。在一个实例中，药剂显著降低一种或多种减弱与肌营养不良症相关的一种或多种迹象或症状的本发明公开的肌营养不良症相关分子的生物活性。
生物标记：由身体产生的天然物质，用作特定生物状态的指标。生物标记可以监测状况(包括被诊断的疾病)和这样监测的发展，以及测试疾病治疗效果。肌营养不良症是一组缺乏生物标记的疾病。血清肌酸激酶水平(肌肉分解的副产品)先前已用作肌营养不良症的生物标记，但不能准确地跟踪疾病发展。本发明所述的是对应肌营养不良症的生物标记。在具体实例中，生物标记指示特定类型的肌营养不良症的存在或者病症的严重性(如增加的半乳糖凝集素-3的水平表明预测不良)。
骨密度：指每平方厘米骨的矿物质含量的术语。骨密度在临床医学上用作各种状况和疾病的间接指标，各种状况和疾病包括但不限于骨质疏松症和骨折风险。许多技术可用于确定骨密度，但超声已被描述成一种更具成本效益的方法。该测试是通过测量特定一根骨或多根骨(通常是脊椎、髋部和腕部)进行。将这些骨头的密度与基于年龄、性别和尺寸的平均指数相比较。比较结果用于确定个体的骨折风险和骨质疏松症阶段。平均骨密度＝BMC/W[g/cm2]；BMC＝骨矿物含量＝g/cm；和W＝扫描线宽度。一般通过2次测量得到结果，即T-分数和Z-分数。分数表示骨矿物密度含量相对于平均值的变化，负分表明较低的骨密度，而正分表明较高的骨密度。
在筛查骨质疏松症时，T-分数是相关测量值。当与年轻正常标准平均值相比时，它是该位置的骨矿物密度。这是病人的BMD与三十岁的健康人的比较值。美国的标准是使用30岁的同一性别和种族的数据，但WHO建议对所有人使用30岁白人女性数据。30岁的数值适合用于绝经后的妇女和50岁以上的男子，因为该数值能更好地预测未来的骨折风险。WHO的标准是：正常的T-分数是-1.0或更高；骨质减少被定义为在-1.0和-2.5之间；而骨质疏松被定义为-2.5或更低，这意味着该骨质密度低于三十岁男人/女人平均值两个半标准偏差。
Z分数是相对于年龄匹配正常值的比较值，通常用在严重的骨质疏松症病例上。这是受试者的BMD与该受试者的年龄、性别和种族的平均BMD的标准偏差值。该值用在绝经前妇女、50岁以下男性和儿童中。当该分数低于此正常值在2个标准偏差内时是最有用的。在这种情形下，有助于细察可能导致骨质疏松症的共存疾病，如糖皮质激素治疗、甲状旁腺功能亢进症或酗酒。
接触：以直接物理关联的形式放置，包括以固体和液体两种形式。可通过向提纯的细胞加入药剂在体外或可通过向受试者给予药剂在体内发生药剂与细胞接触。
对照物：用来与测试样本比较的样本或标准，如来自无特定疾病或病症(如肌营养不良症)的患者(或多个患者)的生物样本。在一些实施方案中，对照物是来自健康患者(或多个患者)的样本(在此也称为一个“正常”的对照物)，如正常生物样本。在一些实施方案中，对照物是历史对照值或标准值(例如，先前测试的对照样本或样本组，该对照样本或样本组代表基准值或正常值(如，表达值)，如没有肌营养不良症的受试者的特定基因、基因产品的基准值或正常值)。在一些实例中，该对照物是表示来自多个患者的样本的平均值(或平均值范围)的标准值(如没有肌营养不良症的受试者的基因或基因产品的值的平均值或平均值范围)。
降低：为减小某物的质量、量或强度。在一个实例中，治疗降低一种或多种与肌营养不良症相关的症状，例如与未采用该疗法时的反应相比。在一个特定实例中，治疗降低(也称为下调)肌营养不良症相关分子的表达，如降低了至少10％，至少20％，至少50％，甚至至少90％，从而增加受试者的存活机会。在一些实例中，表达的降低是指任何使一种或多种肌营养不良症相关分子的生产降低的方法。基因产品可以是RNA(如mRNA，rRNA，tRNA和结构RNA)或蛋白。因此，基因下调或失活包括降低基因转录或mRNA翻译的过程。
降低转录过程的例子包括促进转录起始复合物的降解、降低转录起始速率、降低转录延伸率、减少转录向前进行和增加转录阻抑。基因下调包括在现有水平上的降低表达。降低翻译的方法的例子包括降低翻译起始、降低翻译延伸和降低mRNA稳定性。
基因下调包括在基因产品的生产中任何可检测的降低。在某些实施例中，与对照物(在正常细胞中的基因表达量)相比，基因产品的生产至少降低2倍，如至少3倍或至少4倍。在一个实例中，一个对照物是来自受试者的生物样本的基因表达或蛋白表达的量，该受试者未患有肌营养不良症，例如DMD或MDC1A。使用本发明公开的方法可以测量这种降低。例如，“检测或测量基因产品的表达”包括定量基因、基因产品及其调节物在样本中的存在量。定量可以是数值或相对的。使用本领域已知的方法或本发明所述的方法，例如通过PCR(如RT-PCR)测量核酸和通过ELISA法测量蛋白质，可以实现检测基因、基因产品及其调节物的表达。在主要实施方案中，检测到的变化是表达的增加或降低，该增加或降低是与对照物相比的，如标准值或健康对照受试者。在一些实例中，与对照或标准相比，检测到的增加或降低是至少2倍的增加或降低。对于不同表达的判断，用于与样本做比较的对照物或标准值，包括被认为是正常的样本(因为它们没有变为所期望的特性，例如来自未患肌营养不良症的受试者的样本，如DMD或MDC1A)以及实验室值(如值的范围)，即使可能是任意设置，应谨记这些值从一个实验室到另一实验室是可以变化的。
可以基于已知或确定的人口值设置实验室标准值，并且可以以图或表的格式提供，从而可以与测量值、实验确定值相比较。
定性或定量方式的表达水平可以检测核酸或蛋白。示例性的方法包括微阵列分析、RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹和质谱法。
衍生物：物质(如半乳糖凝集素或其部分)的一种形式，与母体化合物相比，有至少一个被改变、增加或移除的官能团。
诊断：通过其迹象、症状和多种测试结果鉴定疾病(如肌营养不良症)的过程。通过该过程得出的结论也被称为“诊断”。通常进行测试的形式包括血液测试，医学成像，尿液分析和活检。
有效量：一种药剂用量，足以产生所期望的反应，例如减少或抑制一种或多种与病症或疾病有关的迹象或症状。当给予受试者时，存在实现目标组织/细胞浓度的常用剂量。在一些实例中，“有效量”是指治疗一种或多种症状和/或任何病症或疾病潜在诱因的用量。在一些实例中，“有效量”是治疗有效量，其中药剂单独与另外的治疗剂(例如抗致病剂)一起诱导所期望的反应，如治疗肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A。
在具体实例中，药剂的量能够调节与肌营养不良症相关的一种或多种所述基因、基因产品及其调节物，该药剂的调节程度至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％(对疾病的消除超过检测水平)。
在一些实例中，有效量是药物制剂单独、或者与药学可接受载体或者与一种或多种另外治疗剂一起引起所期望的反应的量。
在一个实例中，所期望的反应是通过减缓疾病的发展，增加受试者的存活时间。与不使用药物制品的一般情况相比，该疾病不需要完全被药物制品抑制以表明药物制品是有效的。如药物制品可以以期望量减缓疾病发展，如至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％，与通常无该药物制品的进展相比。
在另外或附加的实施例中，有效量是足以部分或完全地减轻受试者的肌营养不良症状的量。治疗可以涉及仅暂时减缓疾病发展，还可以包括永久性阻止或逆转疾病发展。
本发明所述的药物有效量可以通过许多不同的方式确定，例如在受试者中分析与肌营养不良症相关的一种或多种体征或症状的减少，或者测量已知的与肌营养不良症相关的一种或多种分子的表达水平。有效量还可以通过各种体外、体内或原位的方式分析确定，包括本发明所述的分析确定法。
所述治疗剂在治疗过程中可以单个剂量或几个剂量给予，例如每日给予。然而，有效量可以取决于应用来源(例如从细胞提取物提纯的核酸分子，以及与之相对的化学合成的和提纯的核酸)、治疗受试者、严重程度和治疗的病症类型、以及给予方式。
表达：基因的编码信息转变成细胞的操作、非操作或结构部分的过程，如蛋白的合成方法。基因表达受外部信号的影响。例如，暴露于激素的细胞可能刺激激素诱导基因的表达。不同类型的细胞可以不同地响应于相同的信号。也可以在从DNA至RNA至蛋白的路径中的任何位置调节基因表达。调节可包括对转录、翻译、RNA运输和处理、中间分子(如mRNA)降解的控制，或者在特定蛋白分子产生后，通过活化、失活、分区或降解控制特定蛋白分子。在一个例子中，基因表达可被监控，以诊断和/或预测患肌营养不良症的受试者，如预测患DMD、LGMD或MDC1A的受试者的存活时间。
相对于正常(野生型)核酸分子，核酸分子的表达可以改变。基因表达的改变，如差异表达，包括但不限于：(1)过表达；(2)表达不足；或(3)表达抑制。核酸分子表达的改变(实际上就是原因)还与相应蛋白表达的改变有关。
蛋白质表达也可以以某种方式改变为与蛋白质在正常(野生型)情况下的表达不同。这包括但不一定限于：(1)在蛋白质中的突变，使得一种或多种氨基酸残基是不同的；(2)一个或几个(如不超过10-20)氨基酸残基在蛋白质序列上的缺失或加入；(3)氨基酸残基(如至少20个残基)的更长的缺失或加入，使得整个蛋白质结构域或亚结构域被去除或增加；(4)与对照物或标准量相比，蛋白质量增加的表达；(5)与对照物或标准量相比，蛋白质量减少的表达。(6)蛋白质的亚细胞定位或靶向的变更；(7)改变蛋白质的暂时调节表达(这样，使通常不被表达的蛋白得以表达，或者通常表达的蛋白不被表达)；(8)通过使仍定位在细胞中的蛋白增加生存时间，改变蛋白的稳定性；和(9)改变蛋白(这样，使通常不被表达的蛋白得以表达，或者通常表达的蛋白不被表达)的局部(如器官或组织特异性或亚细胞定位)表达，每个都是与对照物或标准相比。为了确定差异化的表达，与样本比较的对照物或标准包括：被认为是正常的样本(因为它们没有变为所希望的特性，如来自未患有肌营养不良症的受试者的样本，如DMD或MDC1A)，以及实验室值(例如值的范围)。该实验室值虽然有可能被任意地设置，应谨记这些值从一个实验室到另一实验室是不同的。
可以基于已知或确定的人口值设置实验室标准值，并且可以以图或表的格式提供，从而可以与测量值、实验确定值相比较。
细胞外基质：组织或其层的细胞外结构，包括一种或多种基体成分(如蛋白)的排列、组成、和形式，该蛋白包括如胶原蛋白和弹性蛋白的结构蛋白、如纤连蛋白和层粘连蛋白的蛋白、和蛋白多糖。基体可包括具有纤维网络的原纤蛋白胶原。在一些实例中，通过肋节蛋白网络细胞外基体被连接至细胞。
片段：物质(如半乳糖凝集素)的一部分。在一些实例中，该片段可以是蛋白质的特定结构域或链。例如，本发明公开的具体实施方案包括给予半乳糖凝集素的片段，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3的片段。片段可以是合成的，或者可以衍生自较大的母体物质。
官能团：除烃基外的增加物质的物理或化学性质的基团。
半乳糖凝集素：β-半乳糖苷-结合动物凝集素，能调节细胞外基质的相互作用、细胞粘附和分化、以及癌症侵入和转移。迄今已经确定了15种哺乳动物的半乳糖凝集素，半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3是两种最具特征的。半乳糖凝集素-1由位于染色体22q12的Lgals1基因编码。半乳糖凝集素-1，大约尺寸为15kDa，结合上许多细胞外基质成分，如层粘连蛋白、及几种整联蛋白，包括α7β1整联蛋白。它在细胞内和细胞外都存在，并已被证明在免疫抑制、细胞生长调控、细胞凋亡和前mRNA切片方面发挥作用。半乳糖凝集素-1在骨骼肌中发现，并已蕴含在皮肤成纤维细胞向肌肉的转化中，这是由于它与层粘连蛋白竞争和α7β1整联蛋白结合。
半乳糖凝集素-3，约30kDa大小，由位于染色体14q22的Lgals3基因编码。这种蛋白具有结合碳水化合物的羧基末端结构域，以及交联碳水化合物和非碳水化合物配体的氨基末端结构域。类似于半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3也在细胞内和细胞外都有发现。在细胞内，已表明半乳糖凝集素-3调节细胞周期和细胞凋亡。在细胞外，半乳糖凝集素-3调整细胞-细胞的相互作用，以及细胞-细胞外基质的相互作用。半乳糖凝集素-3也是由巨噬细胞和单核细胞分泌和表示的。半乳糖凝集素-3在单核细胞分化期间特异性上调，并在分化为树突状细胞期间下调。
在一些实例中，在患肌营养不良症，例如DMD、MDC1A、FHMD、贝克尔肌营养不良症或LGMD的受试者中，半乳糖凝集素-1的表达增加。术语半乳糖凝集素-1包括任何半乳糖凝集素-1基因、cDNA、mRNA、或者来自任何生物体的蛋白，该蛋白是半乳糖凝集素-1，并在患肌营养不良症，例如DMD、MDC1A、FHMD、贝克尔肌营养不良症或LGMD的受试者的样本中表达。
在一些实例中，在患肌营养不良症，例如DMD、MDC1A、FHMD、贝克尔肌营养不良症或LGMD的受试者中，半乳糖凝集素-3的表达增加。术语半乳糖凝集素-3包括任何半乳糖凝集素-3基因、cDNA、mRNA、或者来自任何生物体的蛋白，该蛋白是半乳糖凝集素-3，并在患肌营养不良症，例如DMD、MDC1A、FHMD、贝克尔肌营养不良症或LGMD的受试者的样本中表达。
半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3的核酸和蛋白序列是公开可用的。例如，登记号：NM_002306；NM_003225；NM_00177388公开了半乳糖凝集素-1核酸序列，以及登记号：NP_002296公开了一种半乳糖凝集素-1蛋白序列，2011年8月11日提供的所有这些内容都通过引用结合入本发明。登记号：NP_032521.1也提供了一种半乳糖凝集素-1蛋白序列，2012年8月10日提供的所有这些内容都通过引用整体结合入本发明。
登记号：NM_001177388；NM_002306；NP_003225公开了半乳糖凝集素-3的核酸序列，以及登记号：_BA22164公开了一种半乳糖凝集素-3的蛋白序列，2011年8月11日提供的所有这些内容都通过引用整体结合入本发明。登记号：NP_034835.1也提供了一种半乳糖凝集素-3的蛋白序列，2012年8月10日提供的所有这些内容都通过引用整体结合入本发明。
在一个实例中，半乳糖凝集素-1包括全长野生型(或天然)序列，以及半乳糖凝集素-1等位基因变异体、片段、同系物或融合序列，如保持增加α7整联蛋白表达或生物活性能力的半乳糖凝集素-1等位基因变异体、片段、同系物或融合序列。在某些实例中，半乳糖凝集素-1具有至少80％的序列同一性，例如与半乳糖凝集素-1具有至少85％、90％、95％、或98％的序列同一性。
在一个实例中，半乳糖凝集素-3包括全长野生型(或天然)序列，以及半乳糖凝集素-3等位基因变异体、片段、同系物或融合序列，如保持增加α7整联蛋白表达或生物活性能力的半乳糖凝集素-3等位基因变异体、片段、同系物或融合序列。在某些实例中，半乳糖凝集素-3具有至少80％的序列同一性，例如与半乳糖凝集素-3具有至少85％、90％、95％、或98％的序列同一性。
改善肌肉健康：与先前存在的状态相比、或者与没有治疗的状态相比，肌肉健康的改善。例如，改善肌肉健康可以包括增强肌肉再生、维持、或修复。改善肌肉健康还可包括前瞻性治疗受试者以预防或减少肌肉的损伤或伤害。
抑制的疾病或病症：该短语指抑制疾病或病症的发展，如减少，降低或减缓与疾病或病症相关的体征或症状，例如受试者处于罹患疾病/病症的风险或者患有特定疾病/病症。本发明公开的特定方法还提供了抑制肌营养不良症的方法。
脊柱后凸：胸椎(上背部)过度弯曲的病症。它可以是退化性疾病(如关节炎)的结果，也可以是发育问题(最常见的例子是休门氏(Scheuermann)病)，还可以是骨质疏松症的椎骨压缩性骨折，或创伤。在畸形的意义上说，它是脊柱的病理弯曲，其中脊柱的部分失去一部分或全部的脊柱前凸轮廓。这会引起背的弯曲，看起来是一个懒散的姿势。Cobb角是衡量脊柱后凸的首选方法。
标签：可检测的药剂，例如通过ELISA法、分光光度法、流式细胞术或显微镜。例如，标签可以附着到核酸分子或蛋白上(如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)，由此允许检测核酸分子或蛋白。标签的实例包括但不限于放射性同位素、酶基板、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶、及其组合。标记的方法以及为各种目的选择合适标签的方法，例如见Sambrook等(MolecularCloning:Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)和Ausubel等(In Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，New York，1998)的讨论。在一个特定实例中，标签结合至与一种或多种肌营养不良症相关分子相结合的药剂，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3，以允许检测和预测受试者的疾病。
红斑狼疮：术语，指自身免疫性疾病的集合，该疾病使人体免疫系统变得过度活跃并攻击正常、健康的组织。这些疾病的症状会影响许多不同的身体系统，包括关节、皮肤、肾脏、血细胞、心脏和肺部。细胞或组织的维持：短语，指在至少基本上相同的生理条件下，例如在通常会造成损害、损伤或疾病的刺激的存在下也保持这一条件，保持细胞或组织，如肌肉细胞或肌肉组织。
多发性硬化症：一种自身免疫性疾病，一般被描述为中枢神经系统白质在时间和空间上紊乱传播，在80-85％的患者中呈现为复发-缓解疾病。可以通过脑和脊髓的磁共振成像(MRI)、感诱发电位分析和脑脊液分析做诊断，以检测免疫球蛋白或寡克隆带的增加。MRI是特别敏感的诊断工具。指示MS的存在或进展的MRI异常包括T2加权的高信号白质信号、液体衰减反转恢复图像、活动性病变的钆增强、低强度“黑洞”(表示胶质增生和轴突病理学)、和T1-加权的脑萎缩研究。串行MRI研究可以被用来指示疾病进展。复发-缓解型多发性硬化症是被表征为明确限定的MS临床过程，即有完全或部分恢复的严重攻击和在攻击之间疾病不发展。二次-发展性多发性硬化是MS的临床过程，最初是复发-缓解型，然后以可变的速率发展，可能带有偶尔复发和小缓解。原发性发展性多发性硬化最初以发展的形式呈现。
肌肉：任何由成肌细胞、肌细胞、肌纤维、肌管或其它结构组成的肌肉细胞。肌肉或肌细胞可以是骨骼肌、平滑肌、或心肌。在本发明公开的特定实施方式中，肌肉也可以指能够形成肌细胞的细胞或其它材料，例如干细胞和卫星细胞。
肌肉密度：术语，指在休息状态下的肌肉刚性(“硬度”)。肌肉密度也称为肌张力(例如肌肉的连续和被动部分收缩，或者在休息状态时肌肉的被动拉伸抗性)。
肌力：肌肉以单次最大努力可以产生的力量。
肌营养不良症：术语，用于指一组导致发展性肌无力的遗传性疾病。肌营养不良症会导致骨骼肌无力和骨骼肌蛋白缺陷，导致多种生理功能的受损。对肌营养不良症尚无满意的治疗方法。现有的治疗方法通常集中在改善疾病的影响和改善病人的生活质量，例如通过物理治疗或提供矫形装置。
与肌营养不良症相关的突变基因负责编码与肋节蛋白网络相关的蛋白。此类蛋白包括层粘连蛋白-2、胶原、肌营养不良蛋白聚糖、整联蛋白、小窝蛋白-3、锚蛋白、肌营养不良症蛋白、α-小肌营养蛋白、纽蛋白、网蛋白、BPAG1b、肌肉LIM蛋白、结蛋白、肌动蛋白-相关LIM蛋白、α-肌动蛋白、肌联蛋白、视松蛋白、密码子、肌节蛋白、和肌聚糖/肌长蛋白复合物。
肌营养不良症的最常见形式是杜兴氏肌营养不良症(DMD)，3500活男婴中发生1例。DMD是X连锁隐性紊乱，特点是编码肌营养不良症蛋白的基因中的突变。肌营养不良症蛋白是约430kDa大小的细胞骨架蛋白。这种蛋白连接细胞的骨架和细胞外基质。DMD患者抗肌萎缩蛋白的消失造成收缩时在细胞外基质附着的肌肉纤维的损失，最终导致发展性纤维损伤、膜泄漏和肌肉功能丧失。大多数患者在他们达到30岁之前因呼吸或心脏衰竭死亡。
贝克尔肌营养不良症(也称为良性假肥大型肌营养不良症，Benign pseudohypertrophic muscular dystrophy)与杜兴氏肌营养不良症相关，因为两者都是由于肌营养不良症蛋白基因突变的结果，但在杜兴氏肌营养不良症中没有产生功能性肌营养不良症蛋白，使得DMD要比BMD更严重。BMD是X连锁隐性遗传疾病，特点是腿和骨盆的缓慢发展性肌肉无力。BMD是一种肌营养不良蛋白病，包括一系列的肌肉疾病，其中肌肉细胞的肌营养不良症蛋白的产生不足，导致不稳定的肌细胞膜的结构。这是由肌营养不良症蛋白基因的突变引起的，该基因编码肌营养不良症蛋白。BMD的症状发展模式类似于DMD，但在发展后期，发展速率慢得多。
先天性肌营养不良症是由影响其它肋节蛋白生产的基因突变引起的。MDC1A是由于在LAMA2基因上基因突变的先天性肌营养不良症，该基因突变导致缺乏或完全丧失层粘连蛋白-α2蛋白。层粘连蛋白α2的此损失导致缺乏层粘连蛋白-221/211。层粘连蛋白-221/211是细胞外基质的主要成分，并在肌肉细胞的发育中发挥重要作用。在肌细胞分化期间，层粘连蛋白结合至α7β1整联蛋白。没有层粘连蛋白-α2，肌纤维不能粘附到经历凋亡的基底膜和肌管上。肌肉再生也会失败，导致肌肉修复损失和增加肌肉纤维化和炎症。这种慢性的组织损伤是MDC1A发病率和死亡率高的主要原因
先天性肌营养不良症(CMD)和肢带型肌营养不良症(LGMD)是高度异质性肌营养不良症的常见形式，可通过发病年龄来区分二者。CMD的发病是在出生时或出生后前6个月内；LGMD的发病是在晚期儿童期、青春期、甚至成年期。LGMD可以是常染色体显性遗传(LGMD类型1)或常染色体隐性遗传(LGMD2型)，CMD是隐性遗传。CMD及LGMD可以在临床和基因两个方面重叠。
MDC1A是一个发展性肌肉萎缩病，导致孩子被限制在轮椅上，需要呼吸机辅助呼吸，以及过早死亡。可检测症状是出生时肌肉张力差和“软盘”婴综合症。DMD、BMD和LGMD是通常在3-5岁孩子表现出包括走路和爬楼梯的能力的发育迟缓时被诊断出来的发展性肌肉变性疾病。该病是发展性的，孩子在十几岁时通常被限制在轮椅上，且需要呼吸机帮助。
面肩肱型肌营养不良症(FHMD)是与发展性肌无力和肌肉组织损失相关的一种肌营养不良症形式。不像DMD和BMD主要影响下半身，FHMD影响上半身，主要是脸部、肩部和上臂的肌肉。但是，它也可能会影响骨盆、臀部、和小腿周围的肌肉。FHMD症状往往直到10-26岁才出现，，但症状也不会不寻常地太晚出现。在某些情况下，症状不会发展。症状通常是温和的和非常缓慢地变差的。面部肌肉无力是常见的，可能包括眼睑下垂、不能吹口哨、减少的面部表情、沮丧或愤怒的表情、发音困难、肩部肌肉无力(导致畸形，如明显的肩胛骨(翼状肩胛)和倾斜的肩膀)、下部无力、听力损失和可能的心脏症状。
肌营养不良症相关分子：在肌营养不良症受试者中表达或生物活性被改变的分子。此类分子包括如：核酸序列(如DNA、cDNA或mRNA)和蛋白。特定的基因包括本发明及实施例公开的内容，以及全长基因的片段、cDNA、或mRNA(蛋白质由其编码)，这些物质的表达发生相应于肌营养不良症的改变(如上调或下调)，该肌营养不良症包括DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症和/或MDC1A。因此，各肌营养不良症相关分子的存在或不存在可用于诊断和/或确定肌营养不良症的预测，特别是患有DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A的受试者，以及治疗患肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A的受试者。在一些实例中，它是与肌营养不良症相关病症或疾病的一种或多种迹象或症状相关的分子。在一些实例中，肌营养不良症相关分子是一种或多种与DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症和/或MDC1A相关的分子，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3。
骨质疏松症：发展性骨疾病，特征在于骨质量和密度的降低，导致骨折风险的增加。在骨质疏松症中，骨矿物质密度(BMD)降低，骨微结构劣化，骨中的蛋白量和种类也发生变化。世界卫生组织(WHO)定义的骨质疏松症是骨矿物质密度低于平均峰值骨质量(年轻、健康成年人的平均值)2.5个标准差或更多，该平均峰值骨质量通过双能X线吸光分析法测量；术语“既定骨质疏松症”包括脆性骨折的存在。该疾病可分类为原发性1型、原发性2型、或二次型。
最常见于绝经后妇女的骨质疏松症形式被称为原发性1型或绝经后骨质疏松症。原发性2型骨质疏松症或老年性骨质疏松症发生在75岁之后，并被认为在女性和男性中是2:1的比例。二次型骨质疏松可在任何年龄发生，平等地影响男性和女性。当疾病被称为类固醇-或糖皮质激素-引起的骨质疏松症时，这种形式的骨质疏松症来自医疗问题或疾病的慢性诱发，或长期使用如糖皮质激素的药物。
可药用载体：在本发明中可用的可药用载体(媒介物)是常规的。Remington's Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin编，MackPublishing Co.，Easton，PA，第19版(1995)公开了适合用于一种或多种治疗剂的药物运输组合物和制剂，例如一种或多种包括特异性结合于至少一个所述肌营养不良症相关分子结合剂的组合物，。
一般来说，载体的性质将取决于给予所采用的特定模式。例如，肠胃外制剂可以包括可注射流体，该可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为媒介物。除了生物学-中性的载体，待给予的药物组合物可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯、钠乳酸、氯化钾、氯化钙和三乙醇胺油酸。
聚合酶链式反应(PCR)：一种增加核酸分子复制数(例如样本或标本中的核酸分子)的体外放大技术。在一个例子中，从受试者采集的生物样本与一对寡核苷酸引物在允许引物杂交到样本的核酸模板中的条件下接触(如实施例1或2所示)。该引物在合适的条件下延伸，从模板解离，然后重新退火，延伸，并且解离，以放大核酸的复制数。使用标准技术或本领域中已知的其它标准技术，可以通过电泳、限制性内切酶裂解模式、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序表征PCR产品。
预测：疾病过程的预测，如肌营养不良症。该预测可以包括确定受试者发展侵袭性、复发性疾病，生存一定时间的可能性(如确定受试者生存1、2、3年或5年的可能性)，以响应特定的疗法或及其组合。
再生：细胞或组织，如肌肉细胞或包括肌肉细胞的组织(或器官)的修复，这包括肌肉细胞在受损伤或损害后，至少部分恢复肌肉或组织到与损伤或损害发生之前细胞或组织的存在状态相似的状态。再生也指在患影响这些细胞或组织的疾病的受试者中为修复细胞或组织提供便利，以消除或改善疾病的影响。在更具体的实例中，再生将细胞或组织置于与损伤或损害发生前或没有疾病存在的状态相同的状态下或提高的生理状态下。
细胞或组织的修复：短语，指损伤或其它外伤后治疗如肌肉细胞或组织(或器官)的细胞或组织损伤的生理过程。
类风湿关节炎(RA)：一种自身免疫性疾病，导致慢性、全身性炎性紊乱，该紊乱可能影响许多组织和器官，但主要是攻击柔性(滑液)关节。该病造成残疾和痛苦的状态，如果没有适当治疗，会导致患者丧失大量功能和活动力。过程包括：继发于滑膜细胞膨胀(肿胀)的关节周围(滑膜)的胶囊的炎症反应、滑膜液(turgescence)过量、以及滑膜中纤维组织(血管翳)的发展。疾病过程的病理往往导致关节的关节软骨和关节强直(融合)的破坏。RA还可以在肺、心脏周围(心包)膜、肺(胸膜)膜和眼白(巩膜)产生弥漫性炎症、以及结节病变，最常见于皮下组织。RA是在症状、身体检查、X光片(X光)和实验室试验的基础上做出的临床诊断。
样本(或生物样本)：含有来自受试者的基因组DNA\RNA(包括mRNA)\蛋白及其组合的生物样本。实例包括但不限于，外周血、尿、唾液、组织活检、手术标本和尸检材料。在一个实例中，样本包括肌肉活检，如来自患DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A的受试者。
脊柱侧凸：人的脊椎从一边弯曲到另一边的状态。虽然这是复杂的三维畸形，但在X光中从后面看，患有脊柱侧凸的个体的脊柱会呈“S”或“C”形，而不是一条直线。脊柱侧凸通常分为先天性(由出生时脊椎畸形引起)、特发性(病因不明，细分为婴儿、少年、青年或成年时发病)、或继发于原病症。脊柱侧凸被定义为在检查者面对受试者时(在冠状面)，超过10度的脊柱弯曲到右侧或左侧。畸形也可能存在于正面或背面(在矢状面)。定量评估曲率的标准方法是Cobb角，这是两条直线间的角度，所述直线垂直于所涉及的最上椎骨的上部端板和所涉及的最低椎骨的下部端板之间。
迹象或症状：关于疾病或受试者状况的任何主观证据，例如，受试者提供的证据；表明受试者状况的一部分身体或精神状态的显著变化。“迹象”是在受试者的检查或评估中发现的任何疾病的异常指示。迹象一般是疾病的客观指标。迹象包括但不限于任何可测量的参数，如检测肌营养不良症的测试，包括测量肌酸激酶水平、肌电(以确定是否虚弱是由肌肉组织的破坏造成的，而不是由神经的破坏造成的)，或免疫组织化学/免疫印迹/免疫分析法(例如，ELISA法)测量肌营养不良症相关分子。在一个实例中，降低或抑制与肌营养不良症相关的一种或多种症状或迹象，包括减少或抑制一个或更多个所述肌营养不良症相关分子的活性或表达至所期望的量，例如相对于未经治疗的患者的活性和/或表达，减少或抑制至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％。肌营养不良症的症状包括但不限于：肌肉无力和损失、跑步困难、跳跃困难、跳跃困难、行走困难、呼吸困难、乏力、骨骼变形、肌肉畸形(脚踝收缩；小腿肌肉假性肥大)、心脏疾病(如扩张型心肌病)、血液肌酸激酶(CK)水平提高、或其组合。
受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人类和非人类哺乳动物的一类。
治疗有效量：有效减轻、改善、消除、预防或抑制所治疗的疾病、紊乱、或病症的至少一种症状，并且可以根据经验确定的一个量。在本发明的各实施方案中，“治疗有效量”是“肌肉再生促进的量”，与对照物相比，该量足以实现统计学显著地促进组织或细胞再生，如肌细胞再生的。特别地，可通过各种方法评估肌肉健康的指标(如肌细胞再生、维持或修复)，所述方法包括监测肌肉再生的标记物，如Pax7、Pax3、MyoD、MRF4和肌细胞生成素的转录因子。例如，这种标志物增加的表达表明肌肉再生正在发生或已在近期发生。肌肉再生的标志物，如胚胎球蛋白重链(eMyHC)的表达，也可用于测量肌肉再生、维持或修复的程度。例如，eMyHC的存在可以指示在受试者中最近已发生的肌肉再生。
肌细胞再生、维持或修复也可以通过确定肌细胞的周长或平均横截面积，或者肌纤维密度来监测。肌肉病症的其它指标包括肌肉重量和肌肉蛋白含量。有丝分裂指数(如通过测量BrdU结合)和肌形成，也可以用于评估肌肉再生的程度。
在具体实例中，与对照组相比，肌肉状况的改善，如再生，是至少约10％，如至少约30％，或至少约50％或更多。
组织：细胞聚集体，通常是一种特定种类的聚集体，其与它们的细胞间物质一起，形成动物的结构材料之一，而且在动物中包括结缔组织，上皮，肌肉组织和神经组织。
治疗疾病：一种治疗性干预，改善与肌营养不良症相关的疾病或病理状况的迹象或症状，例如肌营养不良症的迹象或症状。治疗可诱导病症的缓解或治愈，或者减缓发展。例如在某些情况下可包括抑制疾病的充分发展，如预防肌营养不良症的发展。预防疾病不需要完全没有疾病。例如，减少至少20％、如至少30％、至少40％、至少50％的与病症或疾病(如MD)有关的迹象或症状，可以是足够的。如本发明所述，参照的疾病或病症，术语“改良”是指治疗的任何可观察到的有益效果。所述有益效果可以如下证实，例如，在易患病受试者中疾病或病症的临床症状的延迟发作、该疾病或病症的一部分或全部临床症状严重性的降低、疾病或病症的变慢发展、疾病或病症的复发数下降、受试者的总体健康或幸福的改善、在本领域中已知的特异于该特定疾病或病症的其它参数、及这些因素的组合。
III.诊断和预测肌营养不良症的方法
公开了在受试者中诊断和预测肌营养不良症的方法，如DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症(BMD)、或MDC1A。在一个实例中，所述方法包括在来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的风险或患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的受试者样本中，检测至少1(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少30、至少50、至少80、至少100、至少190或更多)种肌营养不良症相关分子的表达。在一些实例中，所述肌营养不良症相关分子可包括、基本上由、或者由解聚素和金属蛋白酶组成的物质，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)，粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，或其任意组合。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、Co16A1、Itga3、Iga6、Itga7、Tnc和Timp1。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3。在一些实例中，肌营养不良症相关分子包括半乳糖凝集素-3和Tnc。在一些实例中，肌营养不良症相关分子至少包括半乳糖凝集素-3用于检测DMD、LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症或MDC1A。在一些实例中，肌营养不良症相关分子至少包括半乳糖凝集素-3用于检测DMD。在本发明中“基本上由……组成”表示可以评估额外分子的表达(如对照物)，但所包含的这些分子不包括多于所列的肌营养不良症相关分子。因此，在一个实例中，可评估对照物的表达，如持家蛋白或rRNA(例如18SRNA、β-球蛋白、GAPDH、和/或18SrRNA)。在一些实例中，“基本上由……组成”表示被评估的其它分子不超过5个，如不超过4个、3个、2个、或1个其它分子。在本发明中，“由……组成”表示仅评估所述分子的表达；不评估额外分子的表达。
该方法还可包括将来自处于患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的风险或患一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状受试者样本中的至少一个肌营养不良症相关分子的表达与对照物比较，其中，相对于对照物的至少一个肌营养不良症相关分子的表达的增加表明该受试者的生存机会降低。例如，半乳糖凝集素-3的表达相对于正常对照试样或标准值(或值范围)增加，表明诊断不良，如生存机会降低。在一个例子中，生存机会降低包括存活时间自诊断时起等于或小于50个月，如40个月、30个月、20个月、12个月、6个月、3个月。相反，肌营养不良症相关分子的表达下降或表达水平与对照物水平相近，表明良好的诊断，如生存机会增加(如生存时间从诊断时起是至少50个月，如从诊断时起是60个月、80个月、100个月、120个月或150个月)。例如，可以将检测的肌营养不良症相关分子的水平与对照值或标准值比较，该对照值或标准值如在未患有肌营养不良症的受试者中肌营养不良症相关分子水平的预期值。在一个实例中，将在来自被评估受试者的样本中检测的肌营养不良症相关分子与在来自未患有肌营养不良症的受试者的样本中检测的该分子的水平相比较。在某些实施例中，与对照物中这些分子的相对量相比，在测试样本中检测到肌营养不良症相关分子的相对量增加了至少2倍，如至少3倍、至少4倍、至少6倍或至少10倍，这表明该受试者患肌营养不良症(如DMD、LGMD、MDC1A)，具有较差的诊断(例如自诊断时起生存时间小于50个月，如自诊断时起40个月、30个月、20个月、12个月、6个月、3个月，或肌肉恶化增加)，及其组合。在一些实例中，与对照样本中这些分子的相对量相比，在测试样本中观察到的肌营养不良症相关分子的统计学相似相对量(或减少量)的检测结果，表明该受试者未患肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A，或具有良好的诊断(自诊断时起至少50个月的生存时间，如自诊断时起60个月、80个月、100个月、120个月或150个月)，及其组合。
可以在核酸水平(例如，通过实时定量聚合酶链反应或微阵列分析)或在蛋白质水平(如通过蛋白质印迹分析或ELISA法)上测量表达的改变。
在一些实例中，这样的方法可用于识别从本发明疗法受益的受试者。例如，这样的诊断或预测方法可在受试者的治疗之前进行。在其它实例中，这些方法用于预测受试者存活时间或给定治疗方法的效果，及其组合。因此，本发明的方法是有价值的工具，使执业医师就如何治疗肌营养不良症做出快速治疗决定，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A。这些治疗决定可以包括：给予药剂治疗一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状，并且监测受试者的肌营养不良症相关状态的开始和/或发展。本发明所述方法也可以用于监控治疗的有效性。
以下是本发明所述的测量一种或多种分子的表达水平的方法，通常记录分析结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议，并传达给例如技术人员，医生和/或患者。在某些实施方案中，计算机被用于将这些信息传达给有关各方，如患者和/或主治医师。根据测量结果，可以调整对受试者给予的治疗。
在一个实施方案中，所述的基于测试受试者的一种或多种肌营养不良症相关分子表达水平的诊断、预测和/或治疗建议，在分析完成且诊断和/或预测生成后，被尽快传达给受试者。结果和/或相关信息可以由受试者的治疗医师传达给受试者。或者，结果可以通过任何交流手段直接传达给测试受试者，包括文字，例如通过提供书面报告，电子形式的交流，如电子邮件或电话。可以使用计算机促进交流，例如以电子邮件的形式。在某些实施方案中，交流内容包括诊断测试结果和/或由诊断测试得出结论和/或基于测试的治疗建议，该交流内容在产生后自动传送给使用计算机软硬件结合体的受试者，该计算机软硬件对电子交流领域人员而言是熟悉的。一个健康关怀-面向交流系统的例子是如美国专利号6283761所述；然而，本发明不限于利用该特定的交流系统的方法。在本发明公开的方法的某些实施方案中，所有或一部分的方法步骤，包括样本分析、疾病诊断、和交流分析结果或诊断，可以在不同的(如国外)管辖区内进行。
在几个实施方案中，确认受试者患有肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A，则医师为治疗受试者例如开出一种或多种用于抑制或延迟与肌营养不良症相关的迹象或症状的药剂。在另外的实施方案中，基于利用本发明公开的方法得到的信息调整剂量或剂量方案。
检测肌营养不良症-相关核酸
在一个实例中，一种或多种肌营养不良症相关分子可通过聚合酶链式反应(PCR)来检测。在条件足以允许放大这种产品的条件下，可将生物样本与允许放大一种或多种所述的肌营养不良症(如DMD、LGMD、或MDC1A相关mRNA)的引物一起培养。
在另一个例子中，在高严格条件下，将生物样本与可结合一种或多种所述肌营养不良症相关核酸序列(如cDNA，基因组DNA或RNA(如mRNA))的探针一起培养。然后可以使用本领域中已知的方法(例如通过蛋白质印迹分析法)检测杂交结果。
在一个例子中，将提纯的核酸分子或放大的产品与阵列一起培养，该阵列包括与至少一个肌营养不良症相关分子互补的寡核苷酸，如解聚素和金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，或其任意组合，持续足够允许提纯核酸分子和寡核苷酸探针杂交的时间，从而形成提纯核酸分子:寡核苷酸复合物。然后分析提纯核酸分子:寡核苷酸复合物，以确定提纯核酸分子的表达是否被改变。
在一些实例中，阵列内包括与半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、Col6A1、Itga3、Iga6、Itga7、Tnc和Timp1互补的寡核苷酸。在一些实例中，阵列包括至少与半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3互补的寡核苷酸。在一些实例中，阵列包括至少与半乳糖凝集素-3和Tnc互补的寡核苷酸。在一些实例中，阵列包括至少与检测DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A的半乳糖凝集素-3互补的寡核苷酸。在一些实例中，阵列包括至少与检测DMD的半乳糖凝集素-1互补的寡核苷酸。在一些实例中，阵列包括至少与检测DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A的半乳糖凝集素-1互补的寡核苷酸。在一些实例中，阵列包括至少与检测DMD的半乳糖凝集素-1互补的寡核苷酸。
检测肌营养不良症相关的蛋白
作为分析核酸存在样本的替代方法，可以通过本领域已知的方法测量蛋白表达的改变，如蛋白质印迹分析、免疫分析(如ELISA法)、质谱法或蛋白微阵列法。例如，可以通过使用包括一种或多种捕获剂(如对一种或多种所述肌营养不良症相关分子特异的抗体)的蛋白阵列法确定一种或多种肌营养不良症相关分子的存在。
在一个实例中，特异性结合肌营养不良症相关分子(例如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)的抗体被直接标上可检测标记。在另一实例中，每个特异性结合肌营养不良症相关分子的抗体(第一抗体)是未标记的，并且第二抗体或可结合至人抗体的其它分子是被标记的，该第二抗体或其它分子特异性结合相应的肌营养不良症相关分子。如本领域技术人员已知的，第二抗体被选择为能够特异性结合特定种类和类别的第一抗体。例如，如果第一抗体是人IgG，则第二抗体可以是抗人IgG。可以结合抗体的分子包括但不限于：蛋白质A和蛋白质G，两者都是市售的。
用于抗体或二次抗体的合适标记包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性药剂和放射性材料。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、Cy3、Cy5、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。一个非限制性的示例发光材料是鲁米诺；一个非限制性的示例磁性剂是钆，以及非限制性的示例放射性标记包括125I、131I、35S或3H。
在一些实例中，可以使用ELISA法确定一种或多种肌营养不良症相关分子的存在。ELISA是一种异质免疫分析法，自20世纪70年代早期起广泛用于实验室实践，并且可以在本发明公开的方法中使用。该分析法可用于检测各种格式的蛋白抗原。在“三明治”格式中，所分析的抗原位于两种不同的抗体之间。在该方法中，在固体表面上首先涂覆的固相抗体。随后加入含抗原(例如诊断蛋白)的测试样本、或含抗原组合物(如来自感兴趣的受试者的尿样)，然后允许该抗原与结合抗体反应。洗掉任何未结合的抗原。然后允许已知量的酶标记抗体与结合的抗原反应。在反应后洗掉任何过量的未结合的酶联抗体。然后加入在分析中使用的酶基板，基板和酶之间的反应产生颜色的变化。视觉上的颜色改变量是特定酶共轭结合抗体的直接测量法，由此得到本测试样本中的抗原。
在可选的例子中，可通过竞争免疫分析法，利用用可检测物质标记的肌营养不良症相关分子标准品和未标记的特异性结合至想要的肌营养不良症相关分子的抗体，分析肌营养不良症相关分子。在该分析中，结合生物样本(如血清、组织活检、或从组织活检提纯的细胞)、标记的肌营养不良症相关分子标准品和特异性结合至肌营养不良症相关分子的抗体，并且确定结合至未标记抗体的被标记的标准肌营养不良症相关分子的量。生物样本中肌营养不良症相关分子的量与标记的标准肌营养不良症相关分子结合至特异性结合肌营养不良症相关分子的量成反比。
在一些实例中，ELISA法也可以用来作为一种竞争性分析。在竞争性分析形式中，将含待确定抗原的测试样本与精确量的酶标记抗原混合，二者都争相结合至与附着在固体表面的抗-抗原抗体。在加入酶的基板之前，洗掉过量的游离酶标记的抗原。由酶-基板相互作用产生的颜色强度值是测试样本的抗原量的测量。异源免疫分析法，例如ELISA法，可用于检测与肌营养不良症相关的任何分子。
如本发明所述方法，如患MD的受试者的诊断方法或确定特定治疗方案的有效性的方法，可以手动执行或自动执行，例如在具有检测核酸和蛋白序列并比较这些序列的表达水平的能力的自动化样本处理仪器上执行。如果不是基本上完全的，该自动化系统通常是至少部分地在计算机控制下。因为自动化系统通常是至少部分地由计算机控制的，某些本发明的实施方案还涉及一种或多种有形的计算机可读介质存储计算机可执行指令，用于使计算机执行该方法的公开的实施方案。因此，本发明公开的是具有关于所述方法的指令的计算机或有形计算机可读介质。有形计算机可读介质是指可以存储和/或执行的计算机指令的任何物理对象或计算机元件。有形计算机可读介质的例子包括但不限于压缩盘(CD)、数字多功能光盘(DVD)、蓝光盘(BD)、USB软盘驱动器、软盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、光纤等。应当指出的是，有形计算机可读介质甚至可以是纸或其它合适的介质，其中的指令可被电子捕获，例如光学扫描。在光学扫描发生的情形下，如果需要的话，指令可以被编译、解释、或以合适的方式另外处理，然后存储在计算机存储器中。
或者，它可以是被包括在、或下载和安装在计算机应用程序中的一个插件或软件代码的一部分。作为一个插件，它可以是可嵌入在任何类型的计算机文件中，如网页、Word文档、pdf文件、mp3文件等。
用于实现所述方法的示例性计算机系统，例如诊断MD受试者的方法或确定特定治疗方案有效性的方法，包括计算机(例如个人计算机、笔记本电脑、掌上型电脑、机顶盒、服务器、大型机、手持设备和其它品种的计算机)，包括处理单元，系统存储器和耦合各种系统组件(包括系统存储器至处理单元)的系统总线。该处理单元可以是任何各种市售的处理器，包括 以及和其它公司的兼容微处理器，包括Cyrix、AMD和Nexgen；来自Digital的Alpha；来自MIPS科技的MIPS，NEC，Siemens和其它公司；来自和摩托罗拉的Power PC。双微处理器和其它多处理器架构也可以用作处理单元121。
系统总线可以是若干总线结构类型的任何一种，包括存储器总线或存储器控制器、外围总线、以及使用各种常规总线体系结构任何一种的本地总线，如PCI、VESA、AGP、微通道、ISA和EISA，这里仅举几例。基本输入/输出系统(BIOS)被存储在ROM中，包含有助于在计算机内元件间传递信息的基本例程，如在启动期间。系统存储器包括只读存储器和随机存取存储器(RAM)。
该计算机还可以包括硬盘驱动器、磁盘驱动器(例如读取或写入可移动磁盘)、以及光盘驱动器(例如用于读取CD-ROM盘)、或读取或写入其它光学介质。硬盘驱动器、磁盘驱动器、和光盘驱动器通过硬盘驱动器接口、磁盘驱动器接口、和光盘驱动器接口分别连接到系统总线。驱动器及与其相关联的计算机可读介质为计算机提供数据、数据结构(数据库)、计算机可执行指令等的非易失性存储。
本领域技术人员应理解，尽管计算机可读介质的上述说明指的是硬盘、可移动磁盘和CD，但是在示例性操作环境中也可以使用其它类型的可由计算机读取的介质(如磁带、闪存卡、数字视频盘、伯努利盒式磁带等)。
使用者可以使用各种输入装置，如键盘和指点装置，例如鼠标，输入命令和信息进入计算机。其它输入设备可以包括麦克风、卫星天线、扫描仪或类似物。这些和其它输入设备通常通过耦合到系统总线的串行端口接口连接到处理单元，但是也可以通过其它接口连接，如并行端口、游戏端口或通用串行总线(USB)。监视器或其它类型的显示设备也经由接口连接至系统总线，如视频适配器。除监视器之外，计算机通常还包括其它外围输出设备，如打印机。
计算机可以在网络环境中操作逻辑连接的一种或多种其它计算机系统，例如计算机。其它计算机系统可以是服务器、路由器、对等设备或其它常见的网络节点，并且通常包括许多或所有上述相对于计算机的元件。逻辑连接可包括局域网(LAN)和广域网(WAN)。这样的联网环境在办公室、企业范围计算机网络、内联网和因特网中是普遍的。
当在LAN联网环境中使用时，计算机通过网络接口或适配器连接到本地网络。当在WAN联网环境中使用时，计算机120通常包括调制解调器或其它装置，用于在广域网(如因特网)内建立通信(例如经由LAN和网关或代理服务器)。调制解调器可以是内部的或外部的，经由串行端口接口连接到系统总线。在联网环境中，相对于计算机或其部分，所述的程序模块可以存储在远程存储设备中。可以理解，所示的网络连接是示例性的，在计算机系统之间建立通信链路的其它方式也是可用的(包括以太网卡、ISDN终端适配器、ADSL调制解调器、10BaseT的适配器、100BaseT的适配器、ATM适配器，或类似物)。
如上所述的方法，包括它们包含的动作和操作，可以由计算机来执行。这类动作和操作有时被称为被计算机执行。应该理解的是，动作和符号表示的操作包括通过表示数据比特的电信号的处理单元进行处理，这一处理将导致所表示的电信号转化或还原，并且在存储器位置中存储系统(包括系统存储器、硬盘驱动器、软盘和CD-ROM)中保持数据比特，从而可以重新配置或以其它方式改变计算机系统的操作以及其它信号的处理。保持数据比特的存储器的位置是对应数据比特的具有特定电、磁或光学特性的物理位置。
可以设想，分布式计算环境可以用来实现本发明公开的方法和系统。该分布式计算环境包括通过连接介质连接的两个计算机系统，尽管所述方法同样可应用于通过连接介质连接的任意更多的计算机系统。该计算机系统可以是任何类型的计算机系统配置，包括个人计算机、多处理器系统、手持设备，及其类似物。在与其它计算机系统的逻辑关系方面，计算机系统可以是客户机、服务器、路由器、对等设备或其它常见的网络节点。附加的计算机系统可通过任意数量的连接介质进行连接。连接介质可以包括任何局域网(LAN)、广域网(WAN)或其它计算机网络，包括但不限于以太网、企业范围计算机网络、内联网和因特网。
用于自动基因检测和定量的软件的一部分，以及存储相关数据的数据库可以设置在单一的计算机系统，随后通过应用分发到分布式计算环境的其它计算机系统中。用于确定基因表达和定量的软件的一部分，也被设置分布式计算环境中，在该分布式计算环境中，由作为远程处理设备的一个计算机系统执行任务，该计算机与通信网络连接，随后通过应用分发到的其它计算机系统中。在网络化环境中，程序模块包括软件，用于确定基因的表达和定量，以及存储相关数据的数据库可以位于多个计算机系统中。分布式计算网络中的计算机系统之间的通信可以包括通信数据的加密。
在某些实施方案中，含诊断测试结果和/或基于该测试得出的结论和/或治疗建议的交流内容可以自动生成和传送给使用计算机软硬件组合的受试者、设备、医师等，这是电信领域技术人员熟知的。一个健康关怀-面向的交流系统的例子如美国专利6283761所述，然而本发明不限于利用该特定交流系统的方法。在本发明公开的方法的某些实施方案中，所有或一部分的方法步骤，包括样本分析、疾病诊断、和交流分析结果或诊断，可以在不同的(例如国外)管辖区内进行。
IV.使用方法
本发明表明，肌营养不良症与肌营养不良症相关分子的不同表达水平有关，该肌营养不良症相关分子由解聚素和金属蛋白酶组成，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。基于这些观察，减少或消除一种或多种与肌营养不良症(如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A)相关的迹象或症状的方法，是如本发明所公开的降低至少一种所述肌营养不良症相关分子的表达水平。在一个特定实例中，受试者是人。
本发明公开的治疗肌营养不良症(如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A)的方法。在一个实例中，该方法包括对肌营养不良症的受试者给予有效量的药剂，其中该药剂改变一种或多种所述肌营养不良症相关分子的生物活性或表达，例如该肌营养不良症相关分子由一种或多种解聚素和金属蛋白酶组成，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。这样的药剂可以改变的核酸序列(如DNA、cDNA或mRNA)和蛋白的表达。在一些实例中，药剂减少或改变一种或多种所述肌营养不良症相关分子的生物学活性或表达。表达的降低并不需要是100％才表明该组合物是有效的。例如，药剂可以以所期望的量减少表达或生物学活性，例如与对照物的表达或活性相比，减少至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、或甚至至少100％。在一些实例中，一个药剂增加一种或多种所述肌营养不良症相关分子的生物活性或表达。
在具体实例中，所述药剂是结合至并减小一种或多种所述肌营养不良症相关分子的表达的特异性结合剂。特异性分子包括解聚素和金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素如半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，以及全长分子的片段、cDNA、或mRNA(和由其编码的蛋白)，该全长分子的片段表达的增加相应于肌营养不良症(如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A)。药剂可以改变一个或更多个所述肌营养不良症相关分子以及参与肌营养不良症发展的其它分子的活性或表达。
在具体实例中，药剂作为一种所述肌营养不良症相关分子的抑制剂，如siRNA或抗体，该肌营养不良症相关分子在肌营养不良症患者中上调。例如，所述药剂可以是干扰一种所述肌营养不良症相关分子的mRNA表达的siRNA。例如，所述药剂是siRNA，是减少一种或多种所述肌营养不良症相关分子表达的抑制剂。在另外的实例中，组合物包括至少两种药剂，例如两种特异性siRNA，每种结合到它们各自的肌营养不良症相关核苷酸序列上，抑制一种或多种体征与受试者肌营养不良症相关的迹象或症状。在一些实例中，所述药剂是活化剂或激动剂，用于刺激或增加一种所述肌营养不良症相关分子中的生物活性或表达。
还公开了增加/维持肌力和/或骨密度的方法。在一些实例中，给予有效量的半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1组合物，以增加肌力和/或骨密度和/或预防、抑制或减缓肌肉和骨损失。在一些实例中，向处于罹患肌肉/骨损伤或肌肉/骨损失的风险的受试者给予半乳糖凝集素组合物，例如半乳糖凝集素-1组合物，该受试者如运动员、宇航、或任何其它参与可能会导致肌肉/骨损伤和/或损失的活动的个人。在一些实例中，提供了所述方案，如所述半乳糖凝集素-1方案，预防肌肉/骨损伤和/或损失。在一些实例中，提供了所述方案，如所述半乳糖凝集素-1方案，维持骨密度和/或肌力。在一些实例中，提供了所述方案，如所述半乳糖凝集素-1方案，用于治疗经历骨密度和/或肌力损失的受试者，由此治疗方案给予的方式，使受试者增加骨密度和/或肌力或维持现有的肌力和骨骼密度(例如，预防肌力和/或骨密度的进一步损失)。
在一些实例中，向处于罹患或经历与肌肉损失、骨损失、肌肉密度损失有关的病症或疾病的风险的受试者给予半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1组合物，该受试者例如但不限于处于罹患或经历脊柱后凸、肌营养不良症、骨折、肌肉拉伤、肌肉撕裂、肌腱损伤、骨质疏松症、类风湿关节炎、狼疮、脊柱侧凸和/或多发性硬化的风险。在一些实例中，给予半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1组合物，以预防、治疗或减慢与衰老相关的迹象或症状的发展。可以预期的是，半乳糖凝集素组合物可以短期或长期给予，从几天到几年。在一些实例中，半乳糖凝集素组合物，例如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-1组合物，在手术后给予，如给予已经历手术的和可能处于患肌肉损失、骨损失、肌力损失或肌肉密度损失的风险或患肌肉损失、骨损失、肌力损失或肌肉密度损失的受试者。在一些实例中，半乳糖凝集素组合物，例如半乳糖凝集素-1，在雌性受试者怀孕后给予。在一些实例中，半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1，给予于短期或长期昏迷的受试者。
药剂
期望的药剂是当以有效量给予时诱导所期望的反应(例如，预防、抑制或治疗特定病症或疾病的一种或多种迹象，包括但不限于脊柱后凸、肌营养不良症、脊柱侧凸、断骨、肌肉菌株、肌肉撕裂、肌腱损伤、骨质疏松症、类风湿关节炎、狼疮、脊柱侧凸和/或多发性硬化)。在一个例子中，药剂是以高亲和力结合至感兴趣的分子而不是其它分子的特异性结合剂。例如，特异性结合剂可以是以高亲和力结合至所述肌营养不良症相关分子的一种基因或基因产品的药剂，但基本上不与另一种基因或基因产品结合。在一些实例中，特异性结合剂结合至血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，上述物质在患有肌营养不良症的受试者中上调，从而减少或抑制基因的表达，但特异性结合剂不结合至其它基因(或基因产品)。
在一些实例中，该药剂干扰基因表达(转录、加工、翻译、翻译后改性)，如通过干扰基因的mRNA和通过阻断基因产品的翻译或通过基因产品的翻译后改性、或者通过引起细胞内定位改变。在另一实例中，特异性结合剂以0.1-20nM的结合亲和力结合至与特定病症或疾病相关的一种本发明所述基因编码的蛋白，并且减少或抑制这种蛋白的活性。在一些实例中，所述药剂增加基因表达(转录、加工、翻译、翻译后改性)，或增加与特定病症或疾病有关的蛋白活性。
特异性结合剂的实例包括siRNA、抗体、配体、重组蛋白、肽模拟物、以及可溶性受体片段。特异性结合剂的一个例子是siRNA。临床制备siRNA的方法可以是已知的现有技术。可用于生产和给予它们的特定siRNA和方法详细描述如下。在一个具体实例中，特异性结合剂包括半乳糖凝集素-3siRNA分子。
特异性结合剂的其它具体实例是抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体。制备可在临床上使用的抗体的方法是已知的现有技术。特定抗体和用于产生它们的方法是本领域技术人员熟知的。此外，半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3的抗体是市售的。
在进一步的例子中，小分子量抑制剂/拮抗剂或受体蛋白活化剂/激动剂可用于调节活性，如肌营养不良症相关分子的表达或生产。在一个特定实例中，使用由以下基因编码的蛋白质的小分子量抑制剂/拮抗剂或蛋白活化剂/激动剂：血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。
特异性结合剂可以是治疗性的，如通过改变与肌营养不良症发展相关的核酸或蛋白的生物活性。例如，特异性结合剂以高亲和力结合至一种或多种所述基因(该基因在患有肌营养不良症的受试者中上调)，可实质上减少该基因或基因产品的生物学功能。在其它实例中，特异性结合剂是以高亲和力结合至一种所述蛋白(该蛋白在患有肌营养不良症的受试者中上调)，可实质上减少该蛋白的生物学功能。此类药剂可以有效量给予到有需要的受试者中，如患具有肌营养不良症的受试者，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A。
在其它实例中，特异性结合剂以高亲和力结合至一种或多种所述基因(该基因在患肌营养不良症的受试者中上调)，可实质上增加该基因或基因产品的生物学功能。在其它实例中，特异性结合剂是以高亲和力结合至一种所述蛋白(该蛋白在患有肌营养不良症的受试者中上调)，可实质上增加该蛋白的生物学功能。此类药剂可以有效量给予到有需要的受试者，如患具有肌营养不良症的受试者，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A。
例如，半乳糖凝集素或包含半乳糖凝集素组合物可以是治疗性的。本发明公开的内容涉及通过向受试者给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物(包括半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)使受试者受益的方法。在一个具体的实施方案中，本发明公开的内容提供了增强的肌肉再生的方法，如治疗肌营养不良症，通过向受试者给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物。
在各种实施方案中，本发明公开的内容提供了给予半乳糖凝集素或包括半乳糖凝集素组合物治疗受试者的方法。例如，一些实施例提供改善肌肉健康的方法，例如通过向受试者给予有效量的半乳糖凝集素或含有半乳糖凝集素组合物，包括片段、衍生物或类似物，增强受试者的肌肉再生、维持或修复。在一个具体实施例中，半乳糖凝集素是一个完整的半乳糖凝集素蛋白。在另外的实例中，半乳糖凝集素选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、及其组合。在另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物包括至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质。在又另外的实施方式中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物包括至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的多肽。
在另外的实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物由半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、及其组合组成。在又另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物由一种至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质组成。在一个具体实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物不包括半乳糖凝集素片段，如仅包括一个完整的半乳糖凝集素蛋白。
在又一个例子中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物基本上由半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、及其组合组成。在另外的实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物本质上是由一种至少基本上与半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3同源的物质组成。在又另外的实施方案中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物本质上是由一种至少基本上与半乳糖凝集素α1链同源的多肽组成。在一个具体实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物不包括半乳糖凝集素片段，如基本上仅包括一个完整的半乳糖凝集素蛋白。
所述方法的另外实施方案包括通过给予半乳糖凝集素或含有半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合或含有上述物质组合物，诊断受试者具有可治疗的状态。在一个实例中，所述受试者被诊断为患肌营养不良症，如LGMD、FHMD、贝克尔肌营养不良症和/或MDC1A。在另外的实例中，病症的特征在于受试者不能或受试者的能力不足以表达一种或多种与细胞外基质的形成或维持相关的蛋白，如不能修复或不能生产半乳糖凝集素、整联蛋白、肌营养不良蛋白、肌营养不良蛋白相关蛋白、或肌营养不良蛋白聚糖。
在一个具体的实施方案中，本发明还提供了一种方法，通过给予有效量的半乳糖凝集素组合物，如有效量的半乳糖凝集素-1和/或半乳糖凝集素-3组合物，增加受试者的肌肉再生。例如，老年受试者、患肌肉疾病的受试者、和患肌肉损伤(包括活动引起的肌肉损伤，如由锻炼导致的损伤)的受试者，可从本实施方案中获益。
在所述方法的又一实施方案中，以预防性的方式给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或含其组合的组合物，例如，预防或减少肌肉和/或骨损伤或损伤(如活动或运动诱发的损伤)。例如，老年受试者、容易发生肌肉损伤的受试者、或处于肌肉损伤风险的受试者(如运动员)，如上处理后可以消除或改善肌肉损害、损伤或疾病。
本发明公开的实施方案也可用于促进伤口愈合。在一些实例中，向伤口中或贴近伤口给予半乳糖凝集素或含有半乳糖凝集素组合物。在另外的实例中，该物质是全身性给予的。尽管该物质通常在伤口出现后给予，在一些实例中该物质也可预先给予。
在另外的实施方案中，本发明公开的方法包括与一种或多种另外的药理学物质(例如治疗剂)一起，给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或含其组合的组合物。在一些方面，另外的治疗剂增强了半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物的治疗效果。在另外的方面，治疗剂向被治疗的状态提供了独立的治疗效益。在各种实施例中，另外的治疗剂是细胞外基质的成分，如整联蛋白、肌营养不良症蛋白、肌营养不良蛋白、肌营养不良蛋白聚糖、肌营养不良蛋白相关蛋白、或生长因子。在另外的实例中，治疗剂降低或提高增强细胞外基质形成或维持的物质的表达。
在一些实例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物被施加到待治疗受试者的特定区域。例如，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物可以被注射到待治疗的特定区域，如肌肉。在另外的实例中，给予半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物，使其分散到受试者的多个区域，如全身给予或区域给予。
可以通过任何合适的方法给予半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合)或含有半乳糖凝集素组合物，如局部、肠胃外(例如静脉内或腹膜内)或口服。在一个具体实施例中，半乳糖凝集素或半乳糖凝集素组合物是全身给予的，如通过肠胃外给予，如胃注射或腹腔注射。
虽然本发明所述的方法通常是相对于肌肉再生描述的，这些所述的方法也可用来增强，预防损害其它组织和器官的维修或保养。例如，根据对细胞或组织的效果而不是对骨骼肌肉的效果，本发明所述的方法可用于治疗肌营养不良症的症状，如脑功能、平滑肌肉或心脏肌肉的受损或改变。
预筛选治疗药物
在一些实例中，通过检测一种或多种肌营养不良症相关分子，对潜在的治疗剂进行初始筛选以用于治疗肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A(如在如下细节部分Ⅵ中讨论的)。例如，所述肌营养不良症相关分子可以用于鉴定能够降低或抑制一种或多种肌营养不良症迹象或症状的药剂。在一个例子中，在接受治疗之前，受试者可以先经受肌营养不良症的第一预筛选，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A，上述肌营养不良症对特定治疗剂有响应。
给予
所述组合物的给予方法是常规，并且可以由熟练的临床医师来确定。例如，所述治疗剂(如包括特异于所述肌营养不良症相关分子的结合剂或半乳糖凝集素的物质，如半乳糖凝集素-1)，可以通过注射、口服、局部、透皮、肠胃外、或通过吸入或喷雾给予。在一个具体实例中，组合物经静脉内给予给哺乳动物受试者，例如人。在另一实例中，组合物通过口服给予。在一些实例中，该组合物被施加到治疗受试者的特定者。例如，将组合物注射到肌肉。
可以根据所期望的效果和待治疗的受试者改变药剂的治疗有效量。在一个实例中，该方法向受试者每日给予至少1μg的治疗剂(例如人受试者)。例如，可每日给予一个人至少1μg或至少1mg的药剂，如每日10μg至100μg，每日100μg到1000μg，例如每日10μg，每日100μg或每日1000μg。在一个实例中，受试者被给予至少1μg(如1-100μg)的静脉内药剂(例如一种组合物，包括特异性结合于所述肌营养不良症相关分子的结合剂或半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)。在一个实例中，受试者被肌内给予至少1mg的所述组合物(例如在一个末端)。该剂量可每日以分开的剂量(例如每日2、3或4个分剂量)给予，或以单一的剂量给予。
在具体实例中，向受试者给予所述治疗组合物，该治疗组合物包含特异于一种所述肌营养不良症相关分子的结合剂或半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合，根据每日多次剂量安排，例如至少连续2天、连续10天等，例如长达数周、数月或数年的周期。在一个实例中，每日向受试者给予治疗组合物，该治疗组合物包含特异于一种所述肌营养不良症相关分子的结合剂或半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合，持续至少30天的周期，例如至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月。
组合物，如包括特异于一种所述肌营养不良症相关分子的结合剂或半乳糖凝集素(如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3及其组合)的组合物，还可以另外包括一种或多种生物活性或无活性化合物(或两者)，例如本领域中已知的用于减少或治疗一种或多种与肌营养不良症相关的迹象或症状的其它药剂，以及传统无毒药学可接受载体。例如，包括增强所述组合物的治疗效果的另外治疗剂，如细胞外基质的成分，如整联蛋白、肌营养不良蛋白、肌营养不良蛋白聚糖、肌营养不良蛋白相关蛋白、或生长因子。在另外的实例中，对于增强细胞外基质的形成或维持的物质，另外的治疗剂降低或增强这一物质的表达。在一些实例中，另外的物质可以包括蛋白聚糖、制管张素、钙黏着蛋白、胶原蛋白(包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、或IV型胶原)、核心蛋白聚糖、弹性蛋白、议定菌素、内皮抑素、纤维蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、腱生蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白、及其组合。也可以给予双糖链蛋白多糖、糖胺聚糖(如肝素)、糖蛋白(如肌营养不良蛋白聚糖)、蛋白聚糖(如乙酰肝素硫酸盐)、及其组合。一个特定的层粘连蛋白可与其它形式的层粘连蛋白、层粘连蛋白类似物、层粘连蛋白衍生物、或任何前述物质的片段一起给予。
在一些实例中，生长刺激剂例如细胞因子、多肽，和生长因子例如脑源性神经营养因子(BDNF)、CNF(睫状神经营养因子)、EGF(表皮生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、神经胶质生长因子(GGF)、神经胶质成熟因子(GMF)胶质源性神经营养因子(GDNF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子、角质细胞(kerotinocyte)生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3和神经营养蛋白-4、PDGF(血小板衍生的生长因子)、血管内皮生长因子(VEGF)，及其组合，都可与所述治疗剂一起给予。
在一个具体实例中，包括治疗有效量的治疗剂(例如结合剂，该结合剂特异结合一种所述肌营养不良症相关分子或半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3或及其组合)的治疗组合物，还包括一种或多种生物活性的化合物。这类生物活性化合物的例子包括但不限于：载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和载体。用于制剂的所述可药用载体是常规的(见Remington's PharmaceuticalSciences，E.W.Martin著，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版(1995))。一般来说，载体的性质取决于给予所采用的特定模式。例如，肠胃外制剂可包括可注射流体，该可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂、或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体，药物组合物的给予可包括少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。
该组合物可以配制成作为食品添加剂或补充剂给予的可口形式。这样可口形式通常是无异味的或味道被屏蔽或覆盖的，如制药领域技术人员已知的。其中所述化合物口服给予时，特别是当它们被作为营养补充给予时，可将化合物与食料碱混合。这样的混合物可以是乳液或固体食物混合物的形式。在一些实例中，所述组合物，如半乳糖凝集素-1组合物，可以与酸奶混合。例如但不限于，健康棒，该健康棒可以通过将各种赋形剂，如粘合剂、填充剂、调味剂、着色剂和类似物，连同一种或多种半乳糖凝集素，如半乳糖凝集素1，一同混合成塑形均匀体来制备。该均匀体随后或者挤压或者模压，以形成“直板”的形状，然后干燥或固化形成最终产品。
或者，该化合物可以口服的液体剂型给予，如溶液、乳液或悬浮液。所述液体剂型可以含有例如，合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、熔化剂、以及着色剂和调味剂，这都是技术人员熟知的。该化合物也可以加入到液体维生素制剂和含有电解质的饮料中。饮料可以是能量饮料、运动饮料、果汁饮料、柑桔饮料、碳酸饮料、干饮料混合料、其它适合的饮料介质及其组合的形式。
额外治疗
在具体实例中，在给予有效量药剂降低或抑制一种或多种与肌营养不良症有关的迹象或症状的之前、期间或之后，使受试者接受一种或多种其它疗法。在一个实例中，在给予对所述肌营养不良症相关分子或半乳糖凝集素特异性的药剂之前，使受试者接受一种或多种治疗，如半乳糖凝集素蛋白疗法(例如，半乳糖凝集素-1/半乳糖凝集素-3蛋白疗法)。这种治疗的实例包括但不限于，层粘连蛋白-111蛋白疗法，使肌膜稳定和减少肌肉退化。在一些实例中，可以添加肌肉细胞源，以帮助肌肉再生和修复。在本发明公开的一些方面，结合层粘连蛋白疗法向受试者给予卫星细胞。美国专利公开号2006/0014287提供了在肌细胞中富集细胞集合的方法，以及将这些细胞给予给受试者的方法，该专利以与本发明不相抵触的程度结合入本发明。在进一步的方面中，干细胞，如脂肪来源的干细胞，被给予受试者。准备和给予脂肪来源的干细胞的合适的方法在美国专利公开号2007/0025972中公开，该专利以与本发明不相抵触的程度结合入本发明。在一些例子中，还可以给予附加细胞材料，如成纤维细胞。
V.监视肌营养不良症的治疗效果的方法
本发明公开的方法也可用于监视肌营养不良症的治疗效果。在一些实例中，测定治疗患肌营养不良症的受试者中的肌营养不良症的药剂的效果的方法包括在来自接受药剂治疗的受试者的样本中，检测一种或多种所述肌营养不良症相关分子；将治疗后的肌营养不良症相关分子的表达与标准值或对照物相比较，如果治疗后的一种或多种肌营养不良症相关分子的表达发生变化，如减少或增加，表明药剂对受试者的肌营养不良症的治疗是有效的。在一些实例中，该方法利用生物流体，例如但不限于尿或血清，检测与肌营养不良症相关的分子，该相关分子包括但不限于，由解聚素和金属蛋白酶组成的物质，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)，或其任意组合。所述方法包括检测或测定一种或多种肌营养不良症相关分子的丰度(量)或活性，包括本发明所述的相关分子。
所述方法可以包括检测至少一个，如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或更多个肌营养不良症相关分子。在一个实例中，所述方法包括：检测至少一个，如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或十三个如下肌营养不良症相关分子：由解聚素和金属蛋白酶组成的物质，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)或其任意组合。在一些实例中，所述方法包括至少检测半乳糖凝集素-3。在一些实例中，所述方法包括至少检测半乳糖凝集素-1。
在一些实施方案中，该方法包括检测与标准值相比的降低，如统计学显著的降低，如至少1.5、2、3、4或5倍的一种或多种肌营养不良症相关分子的量的降低，包括一种或多种解聚素和金属蛋白酶的至少1.5、2、3、4或5倍的降低，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。
在一些实施方案中，该方法包括与标准值相比，检测与肌营养不良症相关的一种或多种分子的量的降低，如统计学显著的降低，如至少10％的降低，包括至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、在至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，包括10％至90％的降低、20％至80％的降低、30％至70％的降低、或40％至60％的降低(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、200％或更多的降低)；以及一种或多种解聚素和金属蛋白酶的降低，包括至少10％的降低，包括至少15％、至少20％、至少25％、至少30％的、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，包括10％至90％的降低、20％至80％降低、30％到70％的降低、或40％至60％的降低(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、200％或更多的降低)，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。
在一些实施方案中，该方法包括检测与标准值相比的增加，如统计学显著的增加，如至少1.5、2、3、4或5倍的一种或多种肌营养不良症相关分子的量的增加，包括一种或多种解聚素和金属蛋白酶的至少1.5、2、3、4或5倍的增加，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。
在一些实施方案中，该方法包括与标准值相比，检测与肌营养不良症相关的一种或多种分子的量的增加，如统计学显著的增加，如至少10％的增加，包括至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，包括10％至90％的增加、20％至80％的增加、30％至70％的增加、或40％至60％的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、200％或更多的增加)，以及一种或多种所述的分子肌营养不良症标记物(如半乳糖凝集素-1)的增加，包括至少10％的增加，包括至少15％、至少20％、至少25％、至少30％的、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，包括10％至90％的增加、20％至80％增加、30％到70％的增加或40％至60％的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、200％或更多的增加)。
在一些实施方案中，该方法可以随时间进行，监控受试者的一种或多种肌营养不良症的迹象或症状，如一种或多种与DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A相关的迹象或症状的发展或消退。该方法可以在指定时间段内执行多次，例如几天、几周、几个月或几年。在几个实例中，所述治疗包括使用药剂治疗肌营养不良症。如果参考样本是正常样本，并测试样本值(例如，评估肌营养不良症相关分子的表达或活性水平)在本质上是与正常样本一样的，受试者被确定为获得有效的治疗，而如果关于所评估的肌营养不良症相关分子的测试样本具有相对于正常样本显著更大的值，受试者被确定为未获得有效的治疗。变化的曲线也可以代表疾病病程的发展(或消退)。对正经治疗的受试者可以同时使用所述方法进行监控以评估治疗方案的效果。经过测量本发明确定的一种或多种分子的表达水平后，例如，分析结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议可以被记录并传送到技术人员、医生和/或患者。在某些实施方案中，计算机被用于这些信息传达给有关各方，如患者和/或主治医师。根据测量结果，给予受试者的疗法可以修改。例如，剂量或剂量方案是基于使用本发明公开的方法获得的信息进行修改。
在一个实施方案中，基于测试受试者中所述一种或多种肌营养不良症相关分子的表达水平得到的诊断、预测和/或治疗建议，在分析完成且诊断和/或预测生成后，尽快传达给受试者。结果和/或相关信息可以由受试者的治疗医师传达给受试者，或者，可以直接将结果通过任何交流手段传达给测试受试者，包括文字，例如通过提供书面报告，电子形式的交流，例如电子邮件或电话。可以通过使用计算机来促进交流，例如以电子邮件交流。在某些实施方案中，交流内容包括诊断测试结果和/或由诊断测试得出结论和/或基于测试的治疗建议，该交流内容在产生后自动传送给使用计算机软硬件结合体的受试者，该计算机软硬件对电子交流领域人员而言是熟悉的。一个健康关怀-面向交流系统的例子是如美国专利号6283761所述；然而，本发明不限于利用该特定的交流系统的方法。在本发明公开的方法的某些实施方案中，所有或一部分的方法步骤，包括样本分析、疾病诊断、和交流分析结果或诊断，可以在不同的(如国外)管辖区内进行。
VI.确定治疗肌营养不良症的药剂的方法
本发明提供用于确定药剂治疗肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、BMD和MDC1A的方法。在一些实例中，该方法包括将样本，如血液或尿液样本，与一种或多种测试药剂在足以使一种或多种测试药剂降低一种或多种肌营养不良症相关分子的表达或生物活性的条件下相接触。该方法还包括在一种或多种测试药剂的存在下，检测一种或多种肌营养不良症相关分子的表达或生物活性。在一种或多种测试药剂的存在下将一种或多种所述肌营养不良症相关分子的表达或生物活性与对照物相比，例如与标准值相比，以确定在一种或多种所述肌营养不良症相关分子的表达或活性上是否有改变，而一种或多种所述肌营养不良症相关分子的表达或活性的下降，表明所述一种或多种测试药剂可以用于治疗肌营养不良症症。
在一个实例中，通过使用体外分析确定一种或多种肌营养不良症相关分子的表达是否存在差异。例如，在测试药剂的存在和不存在的情况下，体外分析可用于比较一种或多种肌营养不良症相关分子在样本中的表达，例如血液或尿液样本中。表达水平可通过本领域技术人员已知的方法，包括实时定量聚合酶链反应、微阵列分析或蛋白质印迹分析来确定。在一些例子中，在一种或多种测试药剂的存在下，与标准值相比，至少2倍、至少3倍或至少5倍的一种或多种所述肌营养不良症相关分子的活性的降低，表明该一种或多种测试药剂是可以用来治疗肌营养不良症的。在一些例子中，在一种或多种测试药剂的存在下，与标准值相比，至少2倍、至少3倍或至少5倍的一种或多种所述肌营养不良症相关分子的活性的增加，表明该一种或多种测试药剂是可以用来治疗肌营养不良症的。
测试药剂
所述一种或多种测试药剂可以是任何物质，包括但不限于，蛋白质(例如抗体)、核酸分子(例如siRNA)、有机化合物、无机化合物、小分子或感兴趣的任何其它分子。在一个具体实施例中，测试药剂是siRNA，其减少或抑制一种所述肌营养不良症相关分子的活性(如表达)，所述肌营养不良症相关分子如解聚素和金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。例如，所述siRNA被导向至半乳糖凝集素-3。
在其它实例中，测试药剂是抗体。例如，所述抗体被导向至特异性结合于所述肌营养不良症相关分子，如解聚素和金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。在一个具体实例中，所述抗体被导向至半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3。
本发明公开的测试药剂还包括适体。在一个例子中，适体为单链核酸分子(例如，DNA或RNA)，它假定一个特异性的、序列依赖的形状，并且以高亲和力和特异性结合至靶蛋白(例如，半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)。适体通常包含少于100个核苷酸、少于75个核苷酸、或少于50个核苷酸(如10至95个核苷酸、25至80个核苷酸、30至75个核苷酸、或者25到50个核苷酸)。在一个具体的实施方案中，所述诊断特异性结合试剂是镜像适体(也称为)。镜像适体是高亲和性L对映体核酸(例如，L核糖或L 2'-脱氧核糖单元)，其与D寡核苷酸(例如，适体)相比，对酶降解显示高抗性。适体和镜像适体的靶结合性质是由体外选择过程决定的，该体外选择过程起始自寡核苷酸的随机池，例如见Wlotzka等，Proc.Natl.Acad.Sci.99(13):88988902，2002。产生适体的方法是本领域已知的(见例如Fitzwater和Polisky，Methods Enzymol.，267:275-301，1996；Murphy等，Nucl.Acids Res.31:el10，2003)。
在另一个例子中，适体以高亲和力和特异性结合到靶蛋白的的肽适体(例如，半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3)。肽适体可包括附接在蛋白支架两端的肽环(例如，对半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3有特异性的)。与抗体相比，这种双重结构约束大大增加了肽适体的结合亲和力水平(纳摩尔范围)。可变环路长度典型是8至20个氨基酸(例如，8至12个氨基酸)，并且该支架可以是任何稳定的、可溶的、小的、无毒的蛋白(例如，硫氧还蛋白-A、胱抑蛋白A三倍突变体、绿色荧光蛋白、水蛭蛋白酶抑制剂C、和细胞转录因子Sp1)。肽适体可以通过使用不同的系统进行选择，例如酵母双杂交系统(如Gal4酵母双杂交系统)或LexA相互作用陷阱系统。
VII.药剂盒
本发明提供了可用于诊断、预测或治疗肌营养不良症的药剂盒。例如，在本发明中公开的药剂盒用于诊断或预测肌营养不良症，如DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A，通过减少或抑制一种或多种与肌营养不良症相关的迹象，其中所述药剂盒包括至少一种能够改变一种或多种所述肌营养不良症相关分子的表达或生物活性的药剂。所述药剂盒可包括公开在药剂盒中组合物使用方法的说明材料。该说明材料可以写成电子形式(如计算机磁盘或光盘)，或者可以是视觉的(例如视频文件)。例如，该说明指示首先执行特定活性的基准测量，如测量所述一种或多种肌营养不良症相关分子的表达水平，如半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3。然后，根据本发明的教导给予已知组合物调节这些分子。给予之后重新测量特定活性。将治疗前的活性与观察到的经过治疗的活性相比较。与未经组合物治疗的活性相比，至少10％，例如，约15％至约98％、约30％至约95％、约40％至约80％、约50％至约70％，包括约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％的活性改变，表示这是一种有效的治疗方法。在具体的实施方案中，大于50％的改变表明这是一种有效的治疗方法。一种有效的治疗可以包括但不限于，增加患者的存活时间、减缓特定类型肌营养不良症的发展、良好预测、或者预防进一步的肌肉损伤。
所提供的药剂盒可以在本发明所述的治疗分析中使用。例如，药剂盒可以包括一种或多种组合物，能够检测一种或多种肌营养不良症的生物标记(例如，测量半乳糖凝集素-1或半乳糖凝集素-3、或其组合)的药剂(如抗体)。本领域技术人员可理解，该药剂盒可以包括其它药剂，以方便的药剂盒用于所设计的特定应用中。
在一个实例中，药剂盒用于治疗DMD。例如，这样的药剂盒可以包括一种或多种能够靶向抑制或降低半乳糖凝集素-3活性或表达组合物。
在一些实例中，药剂盒用于在生物样本中检测一种或多种所述肌营养不良症的生物标记。用于检测肌营养不良症相关分子的药剂盒可以包括特异性结合分子的一种或多种探针。在一个实例中，药剂盒包括一种或多种解聚素和金属蛋白酶，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)、整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)及其任意组合，以及对照物，如阳性和阴性对照物。在其它实例中，药剂盒包括特异性结合本发明所述肌营养不良症相关生物标记之一的抗体。在一些实例中，所述抗体被标记(例如，用荧光、放射性或酶标记)。这样的诊断药剂盒可另外含有检测标记的装置(如检测酶标记的酶基板、设置过滤器检测荧光标记、适当的第二标记如第二抗体，及其类似物)，以及缓冲液和用于特定诊断方法实践中的其它常规药剂。在一些实例中，药剂盒包括至少一种探针或抗体，该探针或抗体特异性结合至半乳糖凝集素-3，并且药剂盒被用于诊断或预测DMD、LGMD、FHMD、BMD或MDC1A。在一些实例中，药剂盒包括至少一种探针或抗体，该探针或抗体特异性结合到半乳糖凝集素-3，并且药剂盒用于预测DMD和/或确定DMD治疗的效果。
本发明由以下非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1
用于MDC1A的生物标记
本实施例研究了半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3作为一种用于MDC1A的生物标记的用途。
i.材料和方法
蛋白质印迹。用研钵和杵粉碎4和8周大的雄性野生型和dyw-/-型的动物腓肠肌，并在液氮中冷却。从血清和肌肉组织中以RIPA缓冲液(50mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，1mM Na3VO4，10mMNaF，0.5％Triton X-100，0.5％NP50，10％甘油，2mM PMSF和1:200稀释的蛋白酶抑制剂混合物集III)提取蛋白，用Bradford分析法(Bio-Rad Laboratories Inc，Herculues，CA)定量。通过SDS-PAGE法分离蛋白。使用1:1000稀释的抗半乳糖凝集素-1抗体(H00003956-D01P Abnova，Walnut，CA)检测半乳糖凝集素-1。使用1:1000稀释的抗半乳糖凝集素-3抗体(ab53082，Abeam)检测半乳糖凝集素-3。使用主抗体在4℃过夜培养印迹。然后使用1:5000稀释的山羊抗兔IgG二抗(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)培养1小时。使用Odyssey Imaging System成像印迹并使用相同的系统定量条带。用1:5000稀释的抗α微管蛋白(AbCam，Cambridge，MA)，然后再用山羊抗鼠IgG抗体(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)，将组织印迹标准化为α-微管蛋白。
免疫荧光。用LeicaCM 1850低温恒温器将4周龄和8周龄的雄性胫骨前(TA)肌肉制成冷冻切片(8毫米)，并置于预清洁Surgipath载玻片上。切片用4％多聚甲醛(PFA)固定5分钟，然后再用PBS水化。载玻片置于5％BSA的PBS中，然后用1:500稀释的ab53082(AbCam)培养1小时。然后将载玻片与1:1000稀释的FITC缀合抗兔IgG抗体培养1小时。使用具有DAPI的Vectashield设置载玻片，并使用Zeiss Axioskop 2 plus荧光显微镜成像。使用具有Axio Vision 4.1软件的Zeiss AxioCam HRc数码相机成像。
定量实时PCR分析。使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂从五个4周和8周大的雄性野生型和dyw-/-型腓肠肌提纯全部RNA。在确定浓度后，同样通过基因型汇集mRNA生产cDNA。使用随机六聚体和Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，CA)，按标准程序从3μg的汇集RNA中制备cDNA。定量实时PCR使用SYBRGreen Jumpstart(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的50pg总cDNA，以及Lgals1引物序列和Lgals3引物序列，并将结果相对Gapdh归一化。
统计。超过野生型的倍数变化使用归一化后的ΔΔCt方法计算，并计算了转录平均倍数变化和(+s.e.m.)。单程和双程方式的具有Bonferroni事后检验校正的ANOVA被用于确定在GraphPad Prism上的统计学意义。
ii.结果
使用定量实时PCR来确定Lgals1和Lgals3转录的变化(图1A-1B)。4周龄和8周龄营养不良的小鼠相比于年龄匹配的野生型小鼠，Lgals3的转录显著增加。与野生型动物相比，4周龄小鼠的半乳糖凝集素-3转录增加70.02倍。在8周龄小鼠中Lgals3转录降低；然而，相比野生型动物仍然显著提高9.37倍(图1B)。结果表明，层粘连蛋白-α2的损失导致了随营养不良小鼠的周龄半乳糖凝集素-3转录增加和转录水平下降。
相比于年龄匹配野生型动物，4周龄和8周龄营养不良小鼠也显著增加Lgals1的转录。与野生型动物相比，4周龄小鼠半乳糖凝集素-1的转录增加了9.19倍。在8-周龄小鼠中Lgals1的转录降低；然而相比野生型动物仍然显著提高1.7倍(图1A)。这些结果表明，层粘连蛋白-α2的损失，导致随营养不良小鼠的周龄半乳糖凝集素-1的转录增加和转录水平下降。
蛋白质印迹分析显示，与周龄匹配野生型动物相比，4-周龄或8-周龄dyw-/-动物的半乳糖凝集素-1蛋白水平无显著差异(分别是图2A和2B)。比较4-周龄或8-周龄dyw-/-动物时，在半乳糖凝集素-1蛋白之间没有显著差异(图2C)。
半乳糖凝集素-3的蛋白质印迹分析显著表明，4-周龄dyw-/-动物与周龄匹配野生型动物相比，半乳糖凝集素-3蛋白明显更多，8-周龄dyw-/-动物与周龄匹配野生型动物相比也是如此(图3A和3B)。
血清的蛋白质印迹分析显示，4-周龄dyw-/-小鼠和周龄匹配野生型小鼠之间，半乳糖凝集素-3蛋白无显著差异(图4A)。此外，血清蛋白质印迹表明，4-周龄dyw-/-小鼠比8-周龄dyw-/-小鼠具有显著更多的半乳糖凝集素-3蛋白(图4B)。这些结果表明，半乳糖凝集素-3释放到血流中的量不同于在肌肉中保持的量。
在4-周龄和8-周龄dyw-/-小鼠和野生型小鼠的胫骨前肌上，也完成了对半乳糖凝集素-3的免疫荧光分析。免疫荧光分析显示了与组织蛋白质印迹分析相似的图样。半乳糖凝集素-3的水平在4-周龄和8-周龄dyw-/-小鼠中是相似的，并且在8-周龄dyw-/-小鼠和年龄匹配野生型小鼠中也是相似的。因为野生型动物的年龄，半乳糖凝集素-3的水平也表现出增加(图5)。
虽然在dyw-/-动物中半乳糖凝集素-1转录显著提高，但它们并没有转化为可检测半乳糖凝集素-1蛋白的提高。这些研究表明，对于MDC1A模型的dyw-/-鼠，半乳糖凝集素-1不是一个很好的生物标记候选物。与此相反，半乳糖凝集素-3在dyw-/-小鼠的转录水平和肌肉蛋白水平方面显著提高，表明其可作为MDC1A的生物标记使用。
实施例2
用于DMD的生物标记
这个实施例论证了半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3作为一种用于DMD的生物标记的用途。
i.材料和方法
蛋白质印迹。
用研钵和杵粉碎2-周龄、5-周龄和10周龄的雄性野生型和mdx型动物腓肠肌，并在液氮中冷却。
从血清和肌肉组织中以RIPA缓冲液(50mM Hepes pH7.4，150mM NaCl，1mM Na3VO4，10mM NaF，0.5％Triton X-100，0.5％NP50，10％甘油，2mM PMSF和1:200稀释的蛋白酶抑制剂混合物集III)提取蛋白，用Bradford分析法(Bio-Rad Laboratories Inc，Herculues，CA)定量。通过SDS-PAGE法分离蛋白。使用1:1000稀释的抗半乳糖凝集素-1抗体(H00003956-D01P Abnova，Walnut，CA)检测半乳糖凝集素-1。使用1:1000稀释的抗半乳糖凝集素-3抗体(ab53082，Abeam)检测半乳糖凝集素-3。使用主抗体在4℃过夜培养印迹，然后使用1:5000稀释的山羊抗兔IgG二抗(Li-CorBiosciences，Lincoln，NE)培养1小时。使用Odyssey Imaging System成像印迹并使用相同的系统定量条带。用1:5000稀释的抗α微管蛋白(AbCam，Cambridge，MA)，然后再用山羊抗小鼠-IgG抗体(Li-CorBiosciences，Lincoln，NE)，将组织印迹标准化为α-微管蛋白。
免疫荧光。用LeicaCM 1850低温恒温器将5周龄和10周龄的雄性胫骨前(TA)肌肉制成冷冻切片(8毫米)，并置于预清洁Surgipath载玻片上。切片用4％多聚甲醛(PFA)固定5分钟，然后再用PBS水化。载玻片置于5％BSA的PBS中，用1:500稀释的ab53082(AbCam)培养1小时。然后将载玻片与1:1000稀释的FITC缀合抗兔IgG抗体培养1小时。使用具有DAPI的Vectashield设置载玻片，并使用Zeiss Axioskop 2 plus荧光显微镜成像。使用具有Axio Vision 4.1软件的Zeiss AxioCam HRc数码相机成像。
定量实时PCR分析。使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂从五个5周和10周大的雄性野生型和mdx型腓肠肌提纯总RNA。在确定浓度后，同样通过基因型汇集mRNA生产cDNA。使用随机六聚体和Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，CA)，按标准程序从3μg的汇集RNA中制备cDNA。定量实时PCR使用SYBRGreen Jump start(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)的50pg总cDNA，以及Lgals1引物序列和Lgals3引物序列，并将结果相对Gapdh归一化。
统计。超过野生型的倍数变化使用归一化后的ΔΔCt方法计算，并计算转录平均倍数变化和(+s.e.m.)。单程和双程方式的具有Bonferroni事后检验校正的ANOVA被用于确定在GraphPad Prism上的统计学意义。
ii.结果
使用定量实时PCR来确定Lgals1和Lgals3转录的变化。5周龄和10周龄营养不良的小鼠相比于年龄匹配的野生型小鼠，Lgals3的转录显著增加。5周龄小鼠相比野生型动物的半乳糖凝集素-3转录增加11.42倍。10周龄小鼠相比野生型动物的半乳糖凝集素-3转录增加67.20倍。在5周龄mdx小鼠(11.42倍增加)和10周龄mdx小鼠(67.20倍增加)中Lgals3转录依然增加。结果表明，肌营养不良蛋白的损失导致了随营养不良小鼠的周龄半乳糖凝集素-3转录增加和转录水平增加。
相比于野生型动物，只有10周龄mdx小鼠显著增加Lgals1转录水平。相比于野生型动物，5周龄小鼠半乳糖凝集素-1的转录增加了1.49倍，而10周龄营养不良小鼠半乳糖凝集素-1的转录增加了2.51倍。此外，Lgals1的转录水平从5周龄mdx小鼠(1.49倍增加)增加到10周龄mdx小鼠(2.51倍增加)(图6)。结果表明，肌营养不良蛋白的损失导致了随营养不良小鼠的周龄半乳糖凝集素-1的转录增加和转录水平提高。
蛋白质印迹分析显示，与年龄匹配的野生型动物相比，5-周龄或10-周龄mdx动物腓肠肌中半乳糖凝集素-1蛋白的水平无显著差异(分别是图7A和7B)。然而，2-周龄、5-周龄和10周龄的mdx动物相比较，半乳糖凝集素-1蛋白之间存在显著差异(图7C)。
在5周龄时，mdx动物比野生型动物在腓肠肌中具有显著更多的半乳糖凝集素-3蛋白(图8A)。此外，还有在5-周龄和10周龄的mdx动物中半乳糖凝集素-3蛋白水平有显著差异(图8B)。
尽管半乳糖凝集素-3蛋白水平无显著差异，5-周龄和10-周龄mdx和野生型的血清蛋白质印迹分析对于组织印迹显示了相似的结果(分别见图9A和图9B)。然而，这两个周龄点的mdx小鼠的趋势是更多的半乳糖凝集素-3蛋白。
也完成了对5和10周龄mdx和野生型小鼠胫骨前(TA)的肌肉的半乳糖凝集素-3荧光免疫分析。免疫荧光分析显示了与蛋白质印迹分析相似的图样。与年龄匹配的野生型动物相比，5周龄和10周龄mdx小鼠具有提高的半乳糖凝集素-3水平。相比5周龄mdx小鼠，10周龄mdx小鼠的半乳糖凝集素-3的水平似乎也提高了(图10)。
结果表明，尽管mdx动物的半乳糖凝集素-1转录显著提高，却未转化为可检测的半乳糖凝集素-1蛋白的提高。蛋白质印迹显示，在mdx和野生型小鼠之间，半乳糖凝集素-1水平无显著差异，但5周龄和10周龄的mdx小鼠之间可见显著差异。生物标记不仅需要遵循疾病的发展，还必须在与未患疾病的患者的水平有差异。鉴于结果未显示半乳糖凝集素-1水平的差异，对于DMD的mdx小鼠模型这不是一个好的生物标记候选物。
然而，在这项研究中，在mdx小鼠的转录水平以及肌肉蛋白水平方面，半乳糖凝集素-3显著提高。半乳糖凝集素-3由巨噬细胞和单核细胞分泌，在具有DMD标志的纤维化中可发现这两种细胞。因此，研究支持使用半乳糖凝集素-3作为DMD的生物标记。
已经进行了另外的研究，评估在DMD的GRMD犬模型的肌肉中半乳糖凝集素-3的水平。GRMD模型具有发展性和致命性的肌肉疾病，并已被证明表现出与DMD相同的病理生理疾病特征，包括发展性丧失肌肉功能、肌膜脆性、心肌病和过早死亡(Komegay等，Muscle Nerve 11:1056-1064，1988；Cooper等，Nature 334:154-156，1988)。GRMD狗模型通常被认为是黄金标准的临床前模型，以测试对DMD的治疗方法。
蛋白质分析揭示，与对照狗相比，GRMD狗在GRMD的股外侧肌肉中半乳糖凝集素-3的水平增加(图11)。免疫荧光研究显示，在未受影响的狗中，在周围的肌纤维中发现半乳糖凝集素-3，并与血管相关联。形成鲜明对比的是，半乳糖凝集素-3的量在肌肉中和局部范围内增加，变化成离散的位点，这些离散的位点与对应小血管的平滑肌肉肌动蛋白阳性区相关联。在未受影响的狗中，在血管的内皮/平滑肌内，半乳糖凝集素-3局部围绕肌纤维，并与大血管结合。在GRMD狗内肌营养不良蛋白的损失导致更高水平的半乳糖凝集素-3，该半乳糖凝集素-3在骨骼肌组织内点状分布。在GRMD狗内半乳糖凝集素-3从大血管向小血管定位时也会发生损失，半乳糖凝集素-3和平滑肌肌动蛋白的共存(colocalization)也会损失。
野生型和mdx小鼠的半乳糖凝集素-3血清水平通过ELISA法(表3)确定。在所有观察年龄的对照野生型(WT)动物中，变化非常小。当最一致观察营养不良病理时，mdx动物从5周龄至10周龄显示出平均血清水平的稳步上升。10周后这些动物中存在方差。锻炼对5周龄mdx小鼠的血清水平没有影响。
表3.野生型和mdx小鼠中的半乳糖凝集素-3血清水平
此外，测量了MDC1A患者的半乳糖凝集素-3血清水平，并与年龄匹配对照者相比较(表4)。根据年龄或者性别，将不超过3岁的患者和对照者分成年龄匹配的类别，其中患者具有显著高于对照者的血清水平。3岁以后，对于男性和女性，似乎患者血清水平小幅降低。患者最终的类别取决于肌肉能力的缺乏，并且这些患者具有最低的血清水平。表5提供表4所示的MDC1A患者的数据的摘要。
表4.与年龄匹配对照者相比，MDC1A患者的半乳糖凝集素-3血清分析。
表5.半乳糖凝集素-3在多种患者人群中的平均血清水平
dyw-/-小鼠的肌肉中半乳糖凝集素-3蛋白具有钟形曲线，峰值在4周左右，然后8周后落下，小鼠也由于肌肉无力变得越来越不活泼。与对照者相比，在MDC1A患者血清中也观察到了类似图样。3岁之前，半乳糖凝集素-3的平均血清水平高于对照者2倍(～7.5ng/mL对3.5ng/mL，分别地)。然而，3岁以后的水平低于性别匹配对照者。所观察到的降低表明肌肉的显著损失，这是由两个不能移动的、无辅助设备不能坐的病人具有极低的半乳糖凝集素-3的血清水平的事实支撑的。研究进一步表明半乳糖凝集素-3在MD方面的作用，以及藉此指示MD的存在。此外，对于MDC1A，3岁以前的半乳糖凝集素-3血清水平是可诊断的(高Gal-3血清水平)，并对严重病理是潜在预测的(极低Gal-3血清水平)。
实施例3
用于MDC1A的另外的生物标记
本实施例描述用于MDC1A的可能的生物标记。
i.材料与方法
转基因α7整联蛋白dyw-/-小鼠。转基因α7整联蛋白dyw-/-小鼠是通过将在骨骼肌中过量表达α7BX2整联蛋白的小鼠与dyw+/-动物一起繁殖产生的。产生的幼仔杂合粘连蛋白α2突变等位基因，并对α7BX2转基因呈阳性，将这些幼仔与dyw+/-小鼠一起繁殖。交配的雄性幼崽包括dyw+/-；itga7-(野生型)，dyw-/-；itga7-(dyw-/-)(层粘连蛋白-α2不足)，和dyw-/-；itga7+(层粘连蛋白α2不足，过表达α7BX2整联蛋白)小鼠。雄性同窝被用作所有研究的对照物。基因组DNA是从10天龄的尾部活检部分中使用Wizard SV基因组DNA提纯系统(Promega，Madison，WI)提纯的。如先前所述使用聚合酶链反应(PCR)检测层粘连蛋白-α2等位基因和α7BX2转基因。
骨骼肌提纯。将四周龄野生型dyw-/-和dyw-/-；itga7+雄性小鼠处死。对骨骼肌进行解剖并快速冷冻在液氮冷却异戊烷中。组织储存在-80℃。
蛋白质印迹分析。将4周龄雄性小鼠腓肠肌用研钵和杵粉碎，在液氮中冷却。以RIPA缓冲液(50mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，1mM Na3VO4，10mM NaF，0.5％Triton X-100，0.5％NP50，10％甘油，2mM PMSF和1:200稀释的蛋白酶抑制剂混合物集III)提取蛋白，用Bradford分析法(Bio-Rad Laboratories Inc，Herculues，CA)定量。通过SDS-PAGE法分离蛋白。使用1:1000稀释的抗α7B抗体过夜检测α7整联蛋白。使用1:1000稀释的CDB345抗体过夜检测α7A整联蛋白。使用AB1920抗体(Chemicon)定量α3整联蛋白。使用α1D抗体过夜实现α1D整联蛋白可视化。所有主抗体随后被1:5000山羊抗兔第二抗体(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)处理1小时。使用1:1000稀释的H00003956-D01P(Abnova，Walnut，CA)检测半乳糖凝集素-1。使用1:1000稀释的ab53082(Abeam，Cambridge，MA)检测半乳糖凝集素-3。使用1:5000稀释的抗-α微管蛋白(AbCam，Cambridge，MA)，然后再用1:5000稀释的山羊抗小鼠第二抗体，使免疫印迹标准化。使用Odyssey Imaging System确定带强度。
免疫荧光。用LeicaCM 1850低温恒温器将4周龄雄性胫骨前(TA)肌肉制成冷冻切片(8μm)，并置于预清洁Surgipath载玻片上。切片用4％多聚甲醛(PFA)固定2分钟或5分钟，然后再用水化用磷酸盐缓冲盐水(PBS)水化。载玻片置于5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，然后用层粘连蛋白-α2G或α1D整联蛋白抗体培养。使用H00003959-D01P(Abnova)抗体检测半乳糖凝集素-1。使用ab53082(abeam)使半乳糖凝集素-3可视化。使用抗体T3413(Sigma)检测结合腕蛋白C。使用抗体ab37150和ab86482(Abeam)分别检测MMP2和TEVIP1。使用合适的第二抗体培养载玻片，该第二抗体在所有情况下都是FITC-抗兔，除了腕蛋白C是FITC-抗鼠第二抗体。为检测血影蛋白，载玻片按照包装上的说明(FMK-2201VectorLaboratories，Inc.Burlingame，CA)在冰冷的丙酮中固定1分钟，然后使用M.O.MTM药剂盒处理。然后，用鼠单克隆抗体血影蛋白(NovoCastraNCL-spec2)以1:100处理30分钟，然后用FITC-抗鼠第二抗体以1:1000处理1小时。使用具有DAPI的Vectashield设置载玻片，并使用ZeissAxioskop2plus荧光显微镜成像。使用具有AxioVision4.1软件的ZeissAxioCamHRc数码相机成像。
炎症细胞浸入。将4周龄的TA肌肉冷冻切片固定在4％PFA中5分钟，随后使用PBS水合。使用1:1000的FITC大鼠抗-鼠CDlib抗体(BD Biosciences，Sanlose，CA)培养载玻片，以检测肌肉组织中的巨噬细胞。载玻片用PBS洗涤，并置于具有DAPI的Vectashield上。对每个基因型的5只小鼠的肌肉切片进行分析，并在400×放大倍数进下对每20个域的CD1lb阳性细胞计数。使用Zeiss Axioskop2 Plus荧光显微镜观看载玻片，并使用具有Axiovision 4.1软件的Zeiss AxioCam HRc数码相机成像
共聚焦显微镜。对各基因型的4周龄雄性小鼠的TA肌肉进行切片，进行免疫荧光分析。为了检测，α7B整联蛋白切片被固定在冰冷的丙酮(-20℃)中1分钟，然后再用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)水化。
将冷冻切片置于5％牛血清白蛋白PBS溶液中20分钟，随后使用CDB347(其识别小鼠和大鼠α7B整联蛋白的细胞质结构域)或α1DA2抗体培养1小时。然后用1％的BSA清洗载玻片，使用FITC缀合抗兔抗体培养1小时。再次用1％BSA洗涤载玻片。为了突出显示，将肌纤维切片用罗丹明标记小麦胚凝集素培养30分钟。使用具有DAPI的Vectashield设置载玻片。使用奥林巴斯FluoviewTM共焦扫描系统拍摄图像。
生存时间和体重增加分析。雄性小鼠成长伴随每日监测体重减轻和任何疼痛、痛苦或生病的迹象。一周期间体重减轻>10％被认为是终止信号，并对动物进行人道安乐死。比较每种基因型的动物在3周龄、8周龄和12周龄时的重量。
握力和活性分析。按照标准协议，测量4周龄和8周龄雄性野生型、dyw-/-和dyw-/-；itga7+小鼠的前肢握力，使用的设备是SDI握力系统和Chatillon DFE数字测力计(San Diego Instruments，Inc.，San Diego，CA)。对各小鼠进行连续五个试验和对每种小鼠基因型取数据平均值。为了评估移动能力，4周龄和8周龄雄性野生型、dyw-/-和dyw-/-；itga7+小鼠被置于干净的笼中并监测五分钟。在笼内走动、站起来、和挖掘动作的期间被认为是活动时间。另外，在此期间内，记录小鼠站起次数。只对身体上能站起来的动物进行站立测试。由于它们的周围神经病变的程度，一些小鼠排除在样本之外。
苏木精和曙红染色。用苏木精和曙红染色4周龄TA和膈肌冷冻切片，并使用Zeiss Axioskop 2 plus荧光显微镜确定肌纤维包含的位于中央的细胞核的比例。最少对每只动物的1000根纤维(每组5只动物)进行计数，由此计算具有位于中央的细胞核的肌纤维的百分数。使用Zeiss AxioCam HRc数码相机和Axiovision 4.1软件拍摄图像。
肌纤维面积分析。将4周龄TA和隔膜肌肉冷冻切片在4％低聚甲醛(PFA)中固定5分钟，再在PBS中水合。使用2μg/ml俄勒冈绿-488缀合WGA(Molecular Bioprobes，Eugene，OR)处理30分钟以突出显示。然后将切片用PBS洗涤15分钟，并设置在Vectashield中。对5只动物评定TA肌肉，每只动物最少1000根纤维。对于膈肌，使用每个基因型5只动物，每只动物最少500根纤维。肌纤维横截面积用Zeiss Axioskop 2Plus荧光显微镜确定，使用具有AxioVision 4.1软件的Zeiss AxioCam HRC数码相机拍摄图像。
定量实时PCR分析。使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂从4周雄性野生型、dyw-/-和dyw-/-；itga7+小鼠的腓肠肌提纯RNA。在确定浓度后，同样通过基因型汇集mRNA生产cDNA。使用随机六聚体和Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，CA)，按标准程序从4μg的汇集RNA中制备cDNA。定量实时PCR使用SYBRGreen Jumpstart(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)的50pg总cDNA，以及鼠细胞外基质基因引物序列进行，并将结果相对Gapdh归一化并列于表2中。使用归一化后的ΔΔCt方法计算超过野生型的倍数变化，并计算转录的平均倍数变化和平均值的标准误差。
统计。数据报告是平均值+/-标准偏差。方差单程分析(ANOVA)被用于比较各组的动物。Kaplan-Meier Log-Rank测试用于确定寿命变化的显著性。使用SAS的GLIMMIX统计分析软件包分析肌纤维横截面积。p值<0.05被认为是显著的。
ii.结果
转基因α7整联蛋白的表达改变了层粘连蛋白-α2不足肌肉的细胞外基质的组成。
在肌肉细胞外基质中，层粘连蛋白-211/221的损失是MDC1A肌肉疾病的一个根本原因。由于α7整联蛋白是肌肉的主要层粘连蛋白受体，我们接下来确定机制，即增加的α7β1整联蛋白在层粘连蛋白-211/221不存在的情况下救助dyw-/-小鼠。QRT-PCR法用于确定在4周龄野生型、dyw-/-和dyw-/-；itga7+小鼠的腓肠肌中编码细胞外基质蛋白的阵列的表达曲线。荧光定量PCR显示，与野生型相比，dyw-/-小鼠表现出增加的解聚素和金属蛋白酶水平转录水平(表6)，该金属蛋白酶具有血小板反应蛋白基序5(Adamts5)、集聚蛋白(Agrn)、胶原6A1(Col6al)、半乳糖凝集素-1(Lgals1)、半乳糖凝集素-3(Lgals3)、基质金属蛋白酶2(Mmp2)、整联蛋白α3(Iga3)，整联蛋白α6(Iga6)、整联蛋白α7(Iga7)、层粘连蛋白α4(Lama4)、层粘连蛋白α5(Lama5)、巢蛋白1(Nid1)、粘蛋白C(Tnc)、金属蛋白酶组织抑制剂1(Timp1)、金属蛋白酶组织抑制剂2(Timp2)。
表6.dyw-/-小鼠中基因表达的变化
结果是与野生型小鼠相比的表达增加的倍数。显著性设为P＜0.5。
与dyw-/-小鼠相比，dyw-/-；itga7+小鼠的α7整联蛋白的转基因表达导致了agrin和Mmp2转录水平的降低(表1)。与dyw-/-小鼠相比，dyw-/-；itga7+小鼠的α7整联蛋白的转基因表达导致了Col6A1、Lgals1、Lgals3、Itga3、Itga6、Itga7、Tnc和Timpl转录的增加(表1)。
接下来确定α7整联蛋白的转基因表达是否在层粘连蛋白-α2无效小鼠的肌肉中改变半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3的表达。相比于野生型小鼠，在dyw-/-肌肉中半乳糖凝集素-1转录增加了9.2倍，在dyw-/-；itga7+动物中增加了12.1倍(表1)。与野生型相比，dyw-/-；itga7+动物的半乳糖凝集素-1转录的增加与1.8倍的半乳糖凝集素-1蛋白增加有关。这些结果表明了在dyw-/-；itga7+动物腓肠肌中半乳糖凝集素-1蛋白的增加。
在4周龄dyw-/-和dyw-/-；itga7+肌肉中，与野生型相比，半乳糖凝集素-3的转录分别增加70倍和80倍(表1)。与野生型相比，半乳糖凝集素-3转录的增加导致在dyw-/-小鼠中半乳糖凝集素-3蛋白的2倍的增加和在dyw-/-；itga7+动物中半乳糖凝集素-3蛋白的7倍的增加。结果表明，层粘连蛋白-α2的损失导致了dyw-/-小鼠肌肉细胞外基质中半乳糖凝集素-3的增加，以及α7整联蛋白的转基因表达进一步提高了在层粘连蛋白-α2不足肌肉中半乳糖凝集素-3水平的提高。
腱生蛋白C通常位于肌腱结处，并已证实腱生蛋白C在层粘连蛋白α2不足肌肉的结外处富集，这关系到该区域的肌肉再生。荧使用QRT-PCR检测在dyw-/-小鼠肌肉中α7整联蛋白的转基因过表达是否改变腱生蛋白C的表达。与野生型相比，QRT-PCR证实在dyw-/-小鼠腓肠肌中28倍的腱生蛋白C转录增加，以及在dyw-/-；itga7+腓肠肌中49倍的腱生蛋白C转录增加。结果表明，α7整联蛋白的转基因表达增强层粘连蛋白α2无效肌肉中腱生蛋白C的转录。
免疫荧光法用于证实qRT-PCR和免疫印迹对几种蛋白的结果。免疫荧光法也表明，在细胞外基质中半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素-3、腱生蛋白C的增加，以及半乳糖凝集素-3、腱生蛋白C在dyw-/-；itga7+小鼠中更普遍。在dyw-/-；itga7+小鼠的细胞外基质中，与dyw-/-小鼠相比，免疫染色证实MMP2降低和TIMP1增加。结果表明，α7整联蛋白的过表达导致在dyw-/-；itga7+动物中存在的细胞外基质的增强和稳定。
α7整联蛋白的转基因表达预防dyw小鼠隔膜的肌肉疾病发展。
MDC1A患者表现出严重的限制性呼吸综合征，且作为严重隔膜肌肉病理的结果，需要呼吸机辅助呼吸。组织学分析和肌纤维面积的测量被用来确定α7整联蛋白的转基因表达是否抑制严重膈肌病理发作。H&E的研究揭示在dyw-/-4周龄隔膜肌肉的α7整联蛋白的转基因表达导致减少的单核细胞浸润、营养不良肌纤维、位于中心的细胞核和纤维化。
肌纤维横截面积分析证实在组织学研究中观察到肌肉病理的改善。相比于野生型的位于3.5-4.5μm2之间的肌纤维横截面积峰值，dyw-/-肌肉展示出大数量的营养不良肌纤维，该营养不良肌纤维的肌纤维面积峰值仅2μm2。相反地，dyw-/-；itga7+隔膜肌纤维表现出3.5-5μm2之间的肌纤维面积峰值，并且曲线与野生型更相似。在最大频率肌纤维区域，所有三个组均显著地彼此不同。这些结果表明，α7整联蛋白的转基因表达可以预防层粘连蛋白-α2不足小鼠的隔膜肌肉疾病发展。在本实施例中所述的研究见J.Cell Science:124:2287-2297，2011的Doe等的详细描述，通过引用整体结合入其内容。
实施例4
半乳糖凝集素-1治疗减少mdx小鼠的肌肉损害
这个例子说明了半乳糖凝集素-1增加mdx小鼠的肌肉修复。
为了产生重组半乳糖凝集素-1，将从总鼠肌肉mRNA提纯的LGALS1cDNA放大的PCR克隆到pET23b载体上。利用标准技术，用pET23b-LGALS1载体转变Rosetta E.coli细胞。提纯重组半乳糖凝集素-1并确定其具有对应于2012年8月10日提供的登记号NP_032521.1的序列，除了在氨基酸位置10有单个氨基酸取代，其中谷氨酰胺(Q)被取代为亮氨酸(L)。通过将诱导细胞裂解物装载至Talon亲和柱上提纯重组半乳糖凝集素-1。然后通过使用BCA蛋白分析、蛋白质印迹分析和Coomassie蓝染色确定半乳糖凝集素-1片段的纯度(见图12)。
为了确定半乳糖凝集素-1对肌肉损伤mdx小鼠的治疗效果，向mdx小鼠注射100μL的13μΜ重组半乳糖凝集素-1，通过肌肉内注射到它们的TA肌肉中。将TA肌肉切片用苏木精和曙红(H&E)染色。注射半乳糖凝集素-1的mdx TA显示了比注射PBS的减小的肌肉损伤，如CLN的肌纤维减少百分比所示(图13)。图14说明半乳糖凝集素-1的治疗增加α7整联蛋白。研究表明，半乳糖凝集素-1/3蛋白疗法对MD-半乳糖凝集素-1可以是有益的，增加α7整联蛋白并提供额外的细胞外基质(ECM)用于肌肉细胞附着。
实施例5
半乳糖凝集素-1的治疗增加/维持肌力和/或骨密度
本实施例说明了半乳糖凝集素-1治疗可用于增加和/或维持肌力和/或骨密度。
i.材料与方法
生产重组半乳糖凝集素-1。使用来自鼠肌肉总RNA(Trizol，Invitrogen)的标准逆转录酶(Superscript III，Invitrogen)生产小鼠半乳糖凝集素-1cDNA，然后用Platinum Taq Supermix(Invitrogen)做PCR。然后将这种PCR产品亚克隆到pGEM T-Easy载体中，测序和与NCBI数据库序列比较，最后克隆到有6x His tag的框架形式的pet23b载体(EMD Millipore)上。然后，使该载体转染进入Rosetta e.coli(EMD Millipore)，在0.4mM IPTG(Invitrogen)的存在下生长和诱导，以表达半乳糖凝集素-1。然后，如pet矢量手册所述的使用镍Talon(Clontech)柱和咪唑(Sigma-Aldrich)缓冲液洗脱，提纯半乳糖凝集素-1。随后在PBS中透析提纯的半乳糖凝集素-1，用于多种研究。
组织培养。如前所述(Rooney PNAS 2009)，C2C12成肌细胞和肌管生长。如本发明所述，α7βgal+/-成肌细胞最初提纯并保持(RooneyPNAS 2009)。简要地说，在DMEM中生长和保持成肌细胞，该DMEM不含无酚红(GIBCO，Grand Island，NY)、20％FBS(AtlantaBiologicals，Lawrenceville，GA)、0.5％鸡-胚胎提取物(CEE，Seralab，West Sussex，UK)、1％L-谷氨酰胺(GIBCO，Grand Island，NY)和1％青霉素/链霉素(PS)(GIBCO，Grand Island，NY)。所有成肌细胞保持低于70％的汇合，直至用在分析中。成肌细胞在DMEM中分化成肌管，该DMEM不含无酚红(GIBCO，Grand Island，NY)、1％马血清和1％青霉素/链霉(P/S)+L-谷氨酰胺。在37℃下用5％CO2将所有细胞保存在TC培养箱中。
成肌细胞α7整联蛋白药物增强检测。使用12孔多-pippette在Nunc黑色面TC涂覆的96孔板上将总计5000α7βgal+/-成肌细胞分散到100μL生长介质中。24小时后，将不同浓度的重组半乳糖凝集素-1加入到处理孔中，加入相同量的PBS作为比较的阴性对照物。培养48小时后，将介质吸出，按每个孔50μL哺乳动物蛋白提取药剂(MPER)做细胞裂解，之后在RT培养10分钟。通过加入50μL的FDG溶液(20％0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.0(Sigma)，0.2％1MmgCl2(Sigma)，0.2％20mM荧光素二半乳糖苷(FDG)(Marker GeneTechnologies)和79.6％dH2O)并在室温下黑暗中培养20分钟，确定每个孔中β半乳糖苷酶(βgal)水平。然后加100μL/孔的停止溶液(2xTE)，在具有485nm激发滤光器、535nm发射滤波器和0.1s/孔计数时间的Victor V(Perkin-Elmer)上读板。
C2C12成肌细胞的半乳糖凝集素处理。用不同量的重组半乳糖凝集素-1处理C2C12成肌细胞48小时，在PBS中洗涤，并且对于蛋白质印迹在lxRIPA与蛋白酶抑制剂混合物中、或者对于定量实时PCR在Trizol(Invitrogen)中裂解。
肌内(IM)胫骨前(TA)治疗。通过IM注射，输送20ng-150μg之间的半乳糖凝集素-1到鼠左TA肌肉，等体积PBS被输送到右边。在小鼠被处死48小时后，取出TA肌肉用于其它研究。
腹膜内(IP)半乳糖凝集素-1治疗。在10天龄开始治疗小鼠，每周或每两周用5mg/kg或20mg/kg的重组半乳糖凝集素-1，并用相应体积的PBS作为对照。所有治疗的耐受性良好，没有观察到副作用和对肌肉和骨的阳性结果。小鼠握力是使用如前所述的张力计(Rooney，PNAS 2009，其整体通过引用纳入本文)分析的。
蛋白质印迹。成肌细胞或鼠腓肠肌组织的提取物(在RIPA+ProtInhibs中提取蛋白质)的蛋白质浓度通过BCA(Pierce)进行分析，然后以相同的浓度装入SDS-PAGE凝胶中并在标准条件下使用。然后蛋白转移到硝化纤维素上，并使用兔多克隆或鼠单克隆抗体探测α7a整联蛋白、α7B整联蛋白、半乳糖凝集素-1(AbNovaH00003956-D01P)、β1D整联蛋白、α-肌营养不良蛋白聚糖、β-肌营养不良蛋白聚糖H-242(sc-28535)、β-肌聚糖H-98(sc-28279)、γ-肌聚糖Z-24(sc-133984)、δ-肌聚糖H-55(sc-28281)、ε-肌聚糖H-67(sc-28282，所有sc抗体均来自Santa Cruz Biotechnology)，和肌长蛋白。
定量实时PCR(qRTPCR)。使用Trizol(Invitrogen，Grand Island，NY)提纯来自粉末鼠TA肌肉或成肌细胞的总RNA，之后用DNase处理(Promega，Madison，WI)，按标准程序用随机六聚体(IDTDNA)和Superscript III(Invitrogen，Grand Island，NY)制造cDNA。使用有ROX Master Mix的Quanta Perfecta SYBR-绿进行定量实时PCR，并如前述运行和分析(Doe等，J.Cell Science:124:2287-2297，2011)。对ITGA7、ITGB1、和LGALS1引物，Doe等也做了描述(Id.)。
冷冻切片和组织学。使用Leica Cryostat得到小鼠的TA肌肉10-μm切片。使用标准方法进行苏木精和曙红(H&E)染色，并使用Olympus Fluoview FV1000激光共焦显微镜拍摄图像。使用标准程序进行中心定位核酸计数和最小Ferrets直径测量。
鼠的数字放射成像。使用Sound-eklin tru/Digital radiography机器，对5周龄和10周龄的mdx小鼠进行数字放射成像。股骨、下颚、和胫骨长度测量涉及使用两种Sound-eklin eSeries软件和图像J，并在X光照片上做简单直线/曲线长度测量。通过绘制从颈部的脊柱底部向髋骨起始处的脊柱底部的线，分析脊柱弯曲(脊柱后凸)。然后从脊柱曲线的顶点绘制垂直线，并通过这条线的长度测量脊柱后凸。
统计分析。使用GraphPad Prism 5软件进行所有统计分析。平均数据以平均值±标准误差(s.e.m.)的形式形成报告。使用史蒂顿特测试对两个组进行比较和在多个组之间使用Kruskal-Wallis单程ANOVA排列非参数数据。P<0.05被认为是统计学显著的。
ii.结果
图15A-15D展示了半乳糖凝集素-1对成肌细胞和肌管的治疗导致在转录和蛋白水平方面α7和β1整联蛋白水平的提高。图16A-16D表明对mdx小鼠胫骨前(TA)肌肉肌间(IM)注射重组半乳糖凝集素-1减少肌肉损伤和再生的需要，并且通过中央定位细胞核(CLN)的组织学外观来确定。还发现半乳糖凝集素-1对mdx小鼠的治疗增加了肌膜稳定肌营养不良蛋白聚糖复合物(DGC)成员的蛋白水平，在没有肌营养不良蛋白的情况下这种复合物通常是缺失的(见图17A-17J)。半乳糖凝集素-1对mdx小鼠的治疗增加了α7β1整联蛋白复合物成员和LGALS1的转录水平(见图18A-18C)。图19A-19D的图展示，半乳糖凝集素-1对mdx鼠的治疗增加相对强度，减少疲劳并且使肌肉组织纤维尺寸正常化。半乳糖凝集素-1对mdx小鼠的治疗所增加的肌力预防10周龄小鼠的脊柱后凸(图20)。此外，半乳糖凝集素-1对mdx小鼠的治疗在发育期间增加骨生长(见图21A-21F)。研究清楚地证明半乳糖凝集素-1的治疗活性，特别是半乳糖凝集素-1能够增加肌力、骨生长、减少肌肉损伤和降低肌肉疲劳的能力。
鉴于本发明公开的原理可以用在许多可能的实施方案中，应当认识到所示实施方案仅是优选的本发明实施例，而不应被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由下面的权利要求限定。因此，我们要求将在这些权利要求的范围和精神范围内的内容作为我们的发明保护。

Claims (15)

1.一种增强受试者的肌肉再生、修复或维持的方法，包括向有需要的受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物、半乳糖凝集素-3组合物或其组合。
2.一种增加或维持受试者的肌力、肌肉密度和/或骨密度的方法，包括向有需要的受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物、半乳糖凝集素-3组合物或其组合。
3.一种预防、抑制和/或减少受试者的肌肉损伤或损失和/或骨损失的方法，包括向有需要的受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物、半乳糖凝集素-3组合物或其组合。
4.如权利要求1-3任一的方法，其中所述方法包括给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物。
5.如权利要求1-4任一的方法，其中所述半乳糖凝集素-1组合物包含半乳糖凝集素-1或其片段，和一种载体。
6.如权利要求1-5任一的方法，其中通过全身给予来给予所述半乳糖凝集素-1组合物。
7.如权利要求1-5任一的方法，其中经肌内给予所述半乳糖凝集素-1组合物。
8.如权利要求1-5任一的方法，其中经腹膜内给予所述半乳糖凝集素-1组合物。
9.如权利要求1-8任一的方法，其中所述受试者罹患肌营养不良症或处于罹患肌营养不良症的风险。
10.如权利要求9的方法，其中所述受试者罹患杜兴氏肌营养不良症或处于罹患杜兴氏肌营养不良症的风险。
11.如权利要求1-8任一的方法，其中所述方法包括向受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物，该受试者罹患肌肉/骨损伤或肌肉/骨损失或处于罹患肌肉/骨损伤或肌肉/骨损失的风险，如运动员或宇航员。
12.如权利要求1-8任一的方法，其中所述方法包括向受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物，该受试者处于罹患或遭受下列病症的风险：脊柱后凸、肌营养不良症、脊柱侧凸、粉碎性骨折、骨折、肌肉拉伤、肌肉撕裂、肌腱损伤、骨质疏松、类风湿关节炎、红斑狼疮、脊柱侧凸和/或多发性硬化。
13.如权利要求1-8任一的方法，其中该方法包括在外科手术之前和/或之后，向受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物。
14.如权利要求1-8任一的方法，其中该方法包括在怀孕之前、期间和/或之后，向受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物。
15.如权利要求1-8任一的方法，其中该方法包括向短期或长期昏迷的受试者给予有效量的半乳糖凝集素-1组合物。
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