CN106248953A - 一种免疫层析试纸卡及其制备方法和用途 - Google Patents

一种免疫层析试纸卡及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫层析试纸卡，包括底板(5)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(3)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。本发明提供的免疫层析试纸卡用于检测杜兴氏肌营养不良疾病的基因突变。

Description

一种免疫层析试纸卡及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及了一种免疫层析试纸卡、其制备方法和用途，具体而言，本发明涉及一种杜兴氏肌营养不良DMD基因突变检测的免疫层析试纸卡，及其制备方法和用途。
背景技术
DMD又称为杜氏型肌营养不良或假肥大型进行性肌营养不良。所述病症是由位于人X染色体上的肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的突变引起，假肥大型肌营养不良症是神经系统最常见的X连锁隐性遗传病，患者表现为骨骼肌进行性无力、萎缩、小腿腓肠肌假性肥大，分为两种类型。DMD是肌营养不良中发病率最高的一型。还有一种良性亚型，叫BMD(Becker Muscular Dystrophy)，称为贝克型肌肉营养不良。杜兴肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy，DMD)和贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)是最常见的童年形式的肌营养不良。DMD和BMD是由编码肌养蛋白的DMD基因中的基因缺陷引起的。
DMD基因是迄今为止发现的最大的人基因，位于Xp21.2-21.3，由79个外显子及其相应的内含子约2.4Mb组成。该基因有时会发生突变，发病情况比较复杂，约有65％左右与遗传有关，35％为个体突变所致。肌养蛋白基因DMD。突变的特征为移码插入、缺失或无义点突变，这导致功能性肌养蛋白的缺乏。BMD突变通常保持可读框完整，从而允许合成具有部分功能性肌养蛋白。肌养蛋白是细胞主链与细胞外基质之间相互作用必需的肌肉蛋白质，从而在收缩期间维持肌纤维的稳定性。肌营养不良蛋白是肌肉组织内的一种对细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物(DGC)提供结构稳定性的重要结构组分。肌营养不良蛋白连接内部细胞质肌动蛋白微丝网状结构和细胞外基质，从而对肌肉纤维提供物理强度。因此，改变肌营养不良蛋白或不存在肌营养不良蛋白会导致肌纤维膜功能异常。
目前对DMD缺乏有效的治疗，肌营养不良症尚无特效药物和根治方法,包括基因疗法和施用皮质类固醇。这些治疗方法只是延迟某些症状，但不能完全治愈DMD患者。所以检出假肥大型肌营养不良症患者的DMD基因突变并查找出相应的女性携带者是减少或预防假肥大型肌营养不良症患儿出生的有效治疗措施。只能通过对高风险胎儿进行产前诊断,以杜绝患儿的出生。全国每年新增约3000名DMD/BMD病人，患者总数约有10万人。其中新生男婴中1∶3500出现该基因的突变。
肌肉活检是能明确诊断是何种DMD基因突变类型，而且能区别是DMD还是BMD，也被作为临床诊断的“金标准”，其缺点具有一定的创伤性。基因检测(多重PCR，MLPA，Sanger测序和高通量测序)虽然能够无创性的并可提供多种信息的检测手段，但检测难度和费用均较大。上述检测方法在生物医学研究及法医学应用实践中存在的突出问题是：只能检出部分突变类型，检出率低，检测周期长；且对人有一定创伤。基因检测虽然检出率高但价格昂贵，普通家庭难以承受。
故此，本领域迫切需要建立一种可以一次性检测DMD基因所有突变且快速、简便的筛检方法，以满足临床上产前诊断、种植前诊断的需要。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种用于患有杜兴氏肌营养不良DMD检测试纸卡及其制备方法。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种免疫层析试纸卡，包括底板5、上样垫1、胶体金结合垫2、层析膜3和吸样垫4，其特征在于，上样垫1、胶体金结合垫2、层析膜3和吸样垫4依次粘贴在底板5上，所述胶体金结合垫2为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜3为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。
进一步地，所述层析膜3的两端分别搭接有吸样垫4、胶体金结合垫2，所述胶体金结合垫2的另一端搭接有上样垫1，所述上样垫1搭接压住胶体金结合垫2的1/3，所述胶体金结合垫2搭接压住层析垫的1/4，所述吸样垫4搭接压住胶体金结合垫2的1/10，
任选地，所述上样垫1为玻璃纤维膜或聚酯膜；
任选地，所述吸样垫4为吸水滤纸。
进一步地，所述层析膜3上设置有相互平行的检测线T、质控线C且沿着层析膜3的长度方向依次设置，所述检测线T包被DMD抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
进一步地，所述DMD抗体浓度为0.5-2.5mg/mL。
进一步地，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8-2.5mg/mL。
进一步地，所述硝酸纤维素膜孔径为5-15μm。
在本发明的第二个部分，本发明提供了一种上述免疫层析试纸卡的制备方法，包括以下步骤：
胶体金溶液制备：向100ml HauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸，保持沸腾30min得到直径为5-20nm的胶体金溶液；
胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.0-9.0后加入6μg/mL-15μg/mLDMD抗体和封闭剂，10000rpm离心30min，将离心下来的沉淀复溶至含有BSA、蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；
层析垫制备：将DMD抗体用0.01M，pH为7.4的PBS稀释成0.5mg/mL、1.5mg/mL，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/mL、2mg/mL，检测线T包被DMD抗体，质控线C包被羊抗鼠IgG，然后用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.2μL/cm进行划线包被后干燥；
试纸卡组装：将已包被的层析膜3放置在底板5的中部粘贴，在层析膜3的T线一侧搭接胶体金结合垫2，搭胶体金结合垫2的1/4粘贴，在胶体金结合垫2另一侧搭接粘贴上样垫1，搭胶体金结合垫2的1/3粘贴；在层析膜3的C线一侧搭接吸样垫4，搭吸样垫4的1/10粘贴；用裁剪机将贴好的底板5切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡，任选地，所述封闭剂为1％BSA或0.1％PEG-20000。
进一步地，试纸卡组装是在温度为20～25℃，湿度小于30％的室内完成的。
在本发明的第三个方面，提供了一种免疫层析试剂盒，其包含上述的免疫层析试纸卡。
在本发明的第四个方面，本发明提供了一种检测杜兴氏肌营养不良疾病的基因突变的方法，即使用上述的免疫层析试纸卡或上述的免疫层析试剂盒。
本发明的有益效果是：
(1)根据大约有60-65％的DMD患儿是由于DMD基因外显子缺失所致，5-10％是由于DMD基因外显子重复所致，其余约30％是由于DMD基因微小突变导致。本发明对DMD基因的79个外显子、两侧相邻50bp内含子序列和已知位于内含子区突变附近序列设计并合成探针，DMD基因相关致病突变序列进行富集(外显子与内含子突变、包括了点突变和结构重排、已知突变和未知突变)构建蛋白抗体。
(2)与现有常规检测方法相比，本发明所开发的检测试剂盒能够一次性检测DMD基因各种突变信息，具有全面、快速、准确、价格适中的优点。
(3)本发明提供的检测DMD的免疫层析试剂盒，采用金标免疫层析技术对DMD抗体进行检测，检测中不需要昂贵的仪器和繁琐的操作过程，简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比基因分析方法缩短了许多。
(4)整个检测过程中，样本无需转入其它分析装置，直接滴加实现简易操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。血清、全血、尿液和羊水等多种组织样本，组化定性试验的组织切片、细胞涂片等样品均可作为检测样品。
(5)虽然肌肉活检是诊断DMD的金标准，但肌肉活检是有创性检查，给患儿带来痛苦，而且检测周期也比较长。而本试剂盒操作简便、无污染安全，可以在几分钟内得出实验结果且结果准确，可供群众自检自测，且可确认患者的待测样本中是否存在基因突变，进而为临床诊断和治疗提供参考，在大规模孕前预防、孕期干预、产后筛查及用药指导中可得到广泛应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为免疫层析试纸卡的结构示意图。
图中：1-上样垫；2-胶体金结合垫；3-层析膜；4-吸样垫；5-底板；T-检测线；C-质控线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
本实施例提供了一种检测DMD的免疫层析试纸卡，并提供了该试纸卡的制备方法。
一、主要材料
DMD特异性配对抗体、羊抗鼠IgG抗体：Abnova公司产品；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：SARTORIUS(德国)，CN140；德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
二、胶体金的制备方法
1、将100ml HauCl4的0.01％水溶液加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸；
2、继续加热煮沸30min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成橙红—红色-紫红。全过程约2～3min，得到直径为5-20nm的胶体金溶液.
3、冷却至室温后用蒸馏水恢复至100ml。
DMD抗体免疫金标记：用柠檬酸三钠作为还原剂制备直径为5-20nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、pH7.5和pH8.0，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg将标记用DMD抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为0.1％的PEG20000或1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以10000r/m离心，弃上清，沉淀按50％原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(含BSA、蔗糖，可适当添加表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺20cm2的比例加样于玻璃纤维膜或聚酯膜上，在温度37℃真空干燥2～5小时，制成免疫金结合垫。
层析垫制备：用0.01M pH7.4PBS将包被DMD抗体稀释成0.5mg/ml、1.5mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，检测线T通过包被DMD抗体形成，质控线C包被羊抗鼠IgG，包被完成后将NC膜在温度37℃，相对湿度＜30％的干燥间干燥2～5小时。
试纸卡组装：在干燥室内，温度20～25℃，湿度小于30％，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金结合垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金结合垫，搭胶体金结合垫的1/4粘贴，在胶体金结合垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金结合垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。
所述检测试纸由上样垫、胶体金结合垫、层析膜及吸样垫依次相互交错粘贴在底板上构成。
所述检测线T，质控线C相互平行且沿着层析膜的长度方向依次设置。
所述检测线T通过包被人DMD的配对抗体形成。
所述质控线C通过包被羊抗鼠IgG抗体形成。
所述质控线位于所述层析膜的靠近所述吸样垫的端部。
所述层析膜为硝酸纤维素膜且为孔径5～15μm的多孔样结构膜。
所述上样垫为玻璃纤维膜或聚酯膜，吸样垫为吸水滤纸。
采用以上方法得到的检测DMD的免疫层析试纸卡，试纸卡由上样垫、胶体金结合垫、层析膜、吸样垫依次粘贴在塑料底板上构成，所述层析膜的两端分别搭接有吸样垫、胶体金结合垫，所述胶体金结合垫的另一端搭接有上样垫。胶体金结合垫为标记有DMD标记物的抗体的胶体金垫。层析膜为硝酸纤维素膜，是孔径5～15μm的多孔样结构膜，在层析膜上形成有相互平行的检测线T和质控线C。其中靠近胶体金结合垫的检测线T为DMD检测线，通过包被DMD的配对抗体形成；所述DMD的配对抗体能够与胶体金结合垫上结合的DMD的抗体特异性结合。质控线C通过包被羊抗鼠IgG抗体形成，其位于层析膜的靠近吸样垫的端部。
本例中，上样垫为玻璃纤维膜或聚酯膜，吸样垫为吸水滤纸。
将检测DMD的免疫层析试纸卡用于检测待测样品。将待测样品滴加于试纸卡上，15min内，根据检测线T及质控线C的显色情况，判断待测样品中DMD抗体的情况。若检测线T及质控线C均显紫红色，则待测样品中含有DMD抗体；若质控线C显紫红色，检测线T不显色，则待测样品中无或DMD抗体含量低于检测下限，若质控线C不显色则检测结果无效，需重新进行检测。
将上述检测DMD免疫层析试纸卡用于对患儿样本检测，为DMD患者或携带者人群做筛查，结果与基因检测方法的检测结果完全一致，说明了本试纸卡的有效性。
通过检测DMD，初步确认患者的待测样本中是否存在DMD异常。该免疫层析试纸卡可以应用于孕前预防、孕期干预、产后筛查及用药指导中，不需要昂贵的仪器和繁琐的操作过程，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
实施例2
本实施例提供了一种检测DMD的免疫层析试剂盒。
所述试剂盒包括检测试纸和胶体金定量读数仪，以及用于容置检测试纸的塑料卡，将检测试纸装入塑料卡内形成试纸卡，具体的，试剂盒还包括吸滴管、血清加样杯和一次性注射器。所述检测试纸为实施例1所提供的检测DMD的免疫层析试纸卡。所述胶体金定量读数仪是一种已知的光学检测系统。
该试剂盒适用的样品与检测DMD的免疫层析试纸卡所适用的样品相同，可选用血清、全血、尿液和羊水等作为检测样品，此外组化定性试验的组织切片、细胞涂片等样品均可作为样品。
将上述试剂盒用于对DMD患儿样本检测，为DMD患者或携带人群做筛查，结果与基因检测的检测结果完全一致，说明了本试剂盒的有效性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种免疫层析试纸卡，包括底板(5)、上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)，其特征在于，上样垫(1)、胶体金结合垫(2)、层析膜(3)和吸样垫(4)依次粘贴在底板(5)上，所述胶体金结合垫(2)为包被胶体金标记DMD抗体的玻璃纤维膜或聚酯膜，所述层析膜(3)为包被DMD抗体的硝酸纤维素膜。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述层析膜(3)的两端分别搭接有吸样垫(4)、胶体金结合垫(2)，所述胶体金结合垫(2)的另一端搭接有上样垫(1)，所述上样垫(1)搭接压住胶体金结合垫(2)的1/3，所述胶体金结合垫(2)搭接压住层析垫的1/4，所述吸样垫(4)搭接压住胶体金结合垫(2)的1/10。
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述层析膜(3)上设置有相互平行的检测线T、质控线C且沿着层析膜(3)的长度方向依次设置，所述检测线T包被DMD抗体，所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述DMD抗体浓度为0.5-2.5mg/mL。
5.根据权利要求1至3任一项所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述羊抗鼠IgG抗体浓度为0.8-2.5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述硝酸纤维素膜孔径为5-15μm。
7.一种权利要求1所述的免疫层析试纸卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
胶体金溶液制备：向100ml HauCl4的0.01％水溶液中加入1％柠檬酸三钠水溶液2.00—4.50mL，混匀煮沸，保持沸腾30min得到直径为5-20nm的胶体金溶液；
胶体金结合垫制备：将胶体金溶液调至pH7.0-9.0后加入6μg/mL-15μg/mLDMD抗体和封闭剂，10000rpm离心30min，将离心下来的沉淀复溶至含有BSA、蔗糖的胶体金溶液中，将复溶产物加至玻璃纤维膜或聚酯膜后干燥；
层析垫制备：将DMD抗体用0.01M，pH为7.4的PBS稀释成0.5mg/mL、1.5mg/mL，羊抗鼠IgG分别稀释成1mg/mL、2mg/mL，检测线T包被DMD抗体，质控线C包被羊抗鼠IgG，然后用喷膜仪在硝酸纤维素膜上按1.2μL/cm进行划线包被后干燥；
试纸卡组装：将已包被的层析膜(3)放置在底板(5)的中部粘贴，在层析膜(3)的T线一侧搭接胶体金结合垫(2)，搭胶体金结合垫(2)的1/4粘贴，在胶体金结合垫(2)另一侧搭接粘贴上样垫(1)，搭胶体金结合垫(2)的1/3粘贴；在层析膜(3)的C线一侧搭接吸样垫(4)，搭吸样垫(4)的1/10粘贴；用裁剪机将贴好的底板(5)切成3～5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡，
任选地，所述封闭剂为1％BSA或0.1％PEG-20000。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述试纸卡组装是在温度为20～25℃，湿度小于30％的室内完成的。
9.一种免疫层析试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至6所述的免疫层析试纸卡。
10.一种检测杜兴氏肌营养不良疾病的基因突变的方法，其特征在于，使用权利要求1至6所述的免疫层析试纸卡或权利要求9所述的免疫层析试剂盒。
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