KR102150912B1 - 위장관, 특히 장에서의 병리학적 변화를 검출하기 위하여 대변에서 바이오마커의 동기적 증명을 위한 시험 키트 (복합-신속 시험) - Google Patents

Abstract

본 발명은 위장관 (식도, 위, 소장, 담도, 췌장 및 결장)에서의 병리학적, 특히 악성 현상의 지표로서 제공될 수 있는, 인간 또는 동물 대변에서의 바이오마커를 제공하는 방법의 성능을 개선시키기 위한 시험 키트에 관한 것이다. 본 발명은 선행 기술과 비교해서 보다 효율적이고 신규한 복합-신속 시험의 방법 뿐만 아니라 그의 용도 및 실시양태를 교시하고 기재한다. 본 시험 키트를 수행하기 위해 사용된 복합-신속 시험 카트리지 및 그의 최적으로 조화된 시약은 M2-PK 바이오마커와 헤모글로빈 바이오마커의 기술적 의미에서의 동기적 증명을 위하여, 선행 기술과 비교해서 보다 효율적이고 신규한 2개의 측방 유동 시험 스트립을 함유한다. 본 시험은 장암 스크리닝 프로그램 (장암 조기 검출 검사)의 일부로서 발단자를 진단하기 위한 "이중 필터"로서 제공된다. M2-PK 및/또는 헤모글로빈 바이오마커가 양성으로 진단되면, 의사에 의한 추가 진단을 위해 즉시 결장경검사를 한다. 이 시험은 장암 및 그의 결과를 조기에 검출함으로써 비용면에서 매우 효율적이고 의료 시스템의 비용을 절감시켜 준다. 그 시험 결과는 바람직하게는 각종 색상, 문자, 숫자 및/또는 기하학적 도면의 형태로 나타낸다.

Description

위장관, 특히 장에서의 병리학적 변화를 검출하기 위하여 대변에서 바이오마커의 동기적 증명을 위한 시험 키트 (복합-신속 시험) {TEST KIT (COMBI-QUICK TEST) FOR THE SYNCHRONOUS PROOF OF BIOMARKERS IN FAECES FOR DETECTING PATHOLOGICAL CHANGES IN THE GASTROINTESTINAL TRACT, PARTICULARLY IN THE INTESTINE}

본 발명은 인간 및/또는 동물 대변에서 바이오마커를 검출하는 방법을 수행하기 위한, 상업적으로 적용가능하고 비용 절감되는 신규 시험 키트 (복합 신속 시험 카세트, 시험관내 의료 기기, 측방 유동 카세트, 현장 현시 검사(point of care test), 복합 신속 시험, 생물검정, 신속한 측방 유동 시험 스트립, 플랫폼)에 관한 것이다. 이러한 시험 키트는 병리학적 변화, 특히 위장관 (식도, 위, 소장, 담도, 췌장 및 결장)에서의 악성 현상, 특히 장의 종양 및 종양 전구체 (폴립, 선종)의 징후를 제공할 수 있는 바이오마커를 검출함으로써 건강 분석, 조기 검출 및 "결장암 예방"을 위해 사용된다. 본 발명은 보다 특히, 복합 신속 시험 및 복합 신속 시험 카세트 및 그의 성분들 뿐만 아니라 면역크로마토그래피에 의한 검출 방법을 동기적으로 수행하는 데 필요한 시약에 관한 것이다. 동기적은 "동시의"의 언어적 의미이긴 하지만, 복합 신속 시험 카세트에서 2가지 바이오마커인 종양 M2-PK와 헤모글로빈을 검출하기 위한 적극적인 페어링 (크로마토그래피 조건, 막, 시약, 분배율 등; 설명 참조)의 통상적인 최적 조화의 기술적 의미이기도 하다.

본 발명은 추가로, 상기 시험을 평가하고 그 결과의 제시 (교통 신호등의 색상을 이용하는 "위험 영향 도식")를 평가하기 위한 더 간단한 방법에 관한 것이다.

상기 복합 신속 시험은 결장암 스크리닝 프로그램에서 발단자(proband)를 "예비-필터링"하기 위해 사용된다. 비-침습적 복합 신속 시험을 수행하는 것이 발단자에서 침습적 결장경검사를 수행하는 것보다 상당히 덜 불안을 야기시키기 때문에, 상기 시험을 결장경검사에 참여시키는 것이 증가하게 된다.

암, 특히 결장암은 독일에서 가장 흔한 암이다 (65,000명의 새로운 증례가 있고, 그중 사망자 수는 27,000명이다). 유럽에서는, 매년 200,000명이 이러한 위험한 질환으로 인해 사망한다. 결장암의 기원 방식으로 인해, 결장암 질환에 따른 결과는 성공적인 스크리닝에 의해, 즉 전구체 (폴립/선종)를 검출하고 그를 제거함으로써 상당히 최소화될 수 있다.

독일에서는 20분마다 1명씩 결장암으로 인해 사망한다. 결장암은 거의 대부분이 초기에는 장 내층 (점막)의 양성 혹으로부터 발생된다. 이러한 암은 병에 걸린 사람이 이를 알아채지 못할 정도로 장기간 동안 서서히 진행된다. 통상적으로, 증상은 종양이 크거나 이미 전이된 경우에만 나타난다. 결장암을 치료하지 않은 채로 두면, 종종 12개월 이내에 사망에 이르게 된다.

결장암의 기원 방식 때문에, 그에 따른 결과는 무증상 발단자를 성공적으로 스크리닝함으로써 거의 완전히 예방할 수 있다. 전구체 (폴립/선종)는 스크리닝 조치에 의해 조기에 검출될 수 있다. 결장경검사가 결장암을 조기 검출하기 위한 가장 우수한 방법 (최적 표준)으로 간주된다. 결장경검사는 특수하게 훈련된 의사 (예를 들어, 위장병 전문의)에 의해서만 수행되는 침습적 방법이다. 이러한 과정은 위험 (예를 들어, 천공, 진정제 투여에 따른 위험)과 연관이 있다. 예방적 결장경검사는 55세 이상의 모든 사람들에 대해 의료 보험이 적용된다. 그러나 참여율은 단지 2 내지 3% 정도이고, 상당한 교육적 노력과 마케팅 캠페인에도 불구하고, "매력적인 세계적 행동"은 오늘도 여전히 감소중이다! 그 이유는 특히, 많은 사람들이 불쾌하게 여기는 (심리적 억제 임계치) 검사 과정에 있다.

본 발명의 목적:

1. 심리적 억제 임계치를 저하시킨다.

2. 스크리닝 결장경검사의 참여율을 증가시킨다.

3. 교정한다 (질적 차이를 제거한다).

4. 표준화한다.

5. 진단 정확도를 증가시킨다.

해결책:

2가지 특이적 바이오마커 (M2-PK 및 헤모글로빈)의 동기적 검출에 의해, 비정상적인 위장 질환, 특히 결장암 및 그의 전구체를 검출하는 데 적합하기도 한, 간단하고도 강건하며 저렴한 일상적으로 적합한 측방 유동 시험을 제공하는 것이다. 간단하면서도 용이하게 수행될 수 있는 복합 신속 시험이 스크리닝 결장경검사 관점에서 심리적 억제 임계치를 저하시키는 데 적합하다. M2-PK 및/또는 헤모글로빈 중 단지 하나의 바이오마커라도 양성인 것으로 진단되면, 의사는 추가 진단을 위해 결장경검사를 즉시 수행할 것이다. 이로써 결장경검사에 의한 결장암 및 그의 전구체의 검출률은 더 높아질 것인데, 이는 이전의 복합 신속 시험을 이용하여 발단자를 미리 선별할 수 있었기 때문이다. 복합 신속 시험은 결장암에 대한 2가지 중요한 바이오마커를 동기적으로 결정하기 때문에, 이러한 시험은 결장경검사에 앞서 이중 필터로서 제공된다.

전구체를 수반한 결장암 (폴립-암 순서)은 장의 내부 (점막)에서 시작한 다음, 조직의 다른 부위 (점막하, 근층, 장막)로 확대된다. 점막 경계를 벗어난 종양의 성장은 초기 또는 진행 단계의 결장암으로 불리운다. 대변은 장의 점막과 직접적으로 접촉하고 있기 때문에, 바이오마커는 혈액에서 보다는 위장관에서의 병리학적 변화의 지표로서 초기에 보다 구체적이면서도 분석적으로 검출될 수 있다. 이러한 이유로 인해, 대변 샘플이 혈액 샘플보다 선호된다. 종양이 점막하에 도달한 경우에만, 초기에 바이오마커가 혈액에서 검출가능하다. 이들 바이오마커가 혈액에서 검출가능해지면, 이들은 "말기" 형태의 결장암 및 그의 전구체이다. 일반적으로, 대변 중의 바이오마커를 측정하는 것이 혈액 중의 바이오마커를 측정하는 것에 비해 유리하다. 암 및 그의 전구체를 더 빨리 검출할수록, 그 예후는 더 좋아진다. 시작된 치료 (예를 들어, 치유 결장경검사, "작은 내장" 수술)는 초기 단계의 결장암을 거의 100% 치유해준다.

결장경검사는 장에서의 악성, 특히 종양 과정을 검사하기 위한 "최적 표준"으로 간주된다.

특별히 자격을 갖춘 의사만이 결장경검사를 수행할 수 있다. 결장경검사는 추가로, 이것이 표준화되어 있지 않다는 단점을 지니고 있다. 추가로, "잘못된" 발단자가 결장경검사를 받는다. 조기 검출의 핵심 구성요소인 장 검사 (결장경검사) 동안, 진단의 약 70%가 정상 범위 내에 있다. 증례의 약 1/4에서만 전구체가 진단되고, 증례의 1%에서 암종이 진단된다. 따라서, 너무 많은 건강한 발단자가 결장경검사를 받기 때문에, 스크리닝 결장경검사는 매우 비효율적이고, 또한 고가의 스크리닝 방법이다 (의료 비용을 줄여야 함!).

따라서, 표적화된 방식으로 양성 시험 결과를 수반하는 발단자가 결장경검사를 진행하도록 하기 위해서는 (사망률을 줄이기 위함), 결장경검사 이전에, 다수의 바이오마커를 동기적으로 측정해 주는 비-침습적이고 저렴하며 감수성인 신뢰성 시험을 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르는 비-침습적 복합 신속 시험을 이용함으로써, 결장암 및 그의 전구체를 검출하기 위한 스크리닝 프로그램의 참여율이 크게 증가될 수 있었고, 이에 따라서 결장암 또는 그의 전구체를 갖는 환자의 생존율이 (발단자와 비교해서!) 상당히 증가될 수 있다. 결장암 및 그의 전구체가 늦지 않게 검출된다면, 환자의 회복 확률은 거의 100%이다. 진단: M2-PK 수준 및/또는 헤모글로빈 수준이 증가하면, 병력 등의 도움으로 "패키지" 조치를 개시하고, 결장암 진단에 이르는 추가의 단계로 이어진다. 결국에는 이러한 진단으로 의사는, 예를 들어 외과적 치료 방법을 지시하게 되고, 궁극적으로 결장암을 치유하게 된다. 예를 들어, 수술에 의한 치료는 사망률을 감소시킬 수 있다.

시험관내 시험 역시, 모든 진단 방법에서와 동일하게, 소위 감수성과 소위 특이성이 결정적인 품질 특징이다. 감수성은 그 자체로 병든 개개인을 확인할 수 있는 확률이다. 이러한 품질 조치는 의료 분야에서 극히 중요한데, 이는 물론 조기 검출 조치에서 가능한 한 아픈 사람들이 간과되지 말아야 하기 때문이다. 특이성은 그 자체로 건강한 사람을 확인할 수 있는 확률이다. 이러한 조치 또한, 조기 검출에 중요한데, 이는 건강한 사람이 아픈 것으로 잘못 진단되어 불필요한 치료를 받는 것을 피해야 하기 때문이다.

최신 기술.

구아이악 시험( Guaiac test) ( gFOBT ) (샘플 재료: 대변).

이러한 화학적 대변 시험은 구아이악 수지에 기초한다. 화학적 산화환원 반응을 통하여, 잠혈 양이 환자의 대변 샘플에서 검출된다. 이러한 화학적 시험은 산화환원 전위에 기초하고, 이러한 산화환원 전위는 산화제 및 환원제에 의해 방해를 받기 때문에, 상기 시험이 교란될 것이며 저 감수성과 특이성이 초래될 것이다. 산화제와 환원제는 식품 속에 함유되어 있다. 따라서, 상기 시험은 저 감수성과 특이성을 지니므로, 오래되어 사용되지 않는 것으로 간주된다. 또한, 심하게 출혈하는 형태의 결장암 또는 그의 전구체만이 검출될 수 있고, 약하게 출혈하는 형태의 결장암 또는 그의 전구체는 그렇지 못한 것으로 공지되어 있다. 더욱이, 출혈성, 비-출혈성 및 간헐적 출혈성 형태의 암 및 그의 전구체가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 샘플링 시간에 따라, 결장암 및 그의 전구체가 간과될 수도 있다.

면역학적 대변 시험 ( iFOBT ) (샘플 재료: 대변).

면역학적 시험관내 시험 또한, 전구체 (폴립) 또는 초기 단계에 의해 그의 방식으로 대변을 조사하여 잠혈을 검색한다. 헤모글로빈에 대한 특이적 항체 또는 헤모글로빈/합토글로빈 복합체에 대한 특이적 항체를 사용함으로써 검출을 달성한다. 10개 초과의 제조업자/유통업자가 이들 iFOB 시험을 제공한다. 그러나, 시중에 제공된 시험은 품질 면에서 (감수성 및 특이성 측면에서) 극단적인 차이를 보이고, 전문가들만이 이러한 차이를 인식할 수 있지만, 경우에 따라 다수의 일반 실행자 (사용자)는 그렇지 못하다.

더욱이, 이들 소위 대변 중 혈액 시험은 단지 결장암 및 그의 전구체를 간접적으로 검출해주는데, 이는 상기 시험이 암 및 그의 전구체에 대해 특이적이지 않을 뿐만 아니라 혈액 (결장암에 대해 비특이적임)을 검출하는 데에도 특이적이지 않기 때문이란 것을 언급해야 한다. 이들 시험은 전통적인 구아이악 시험 (gFOBT)과 마찬가지로, 출혈성 형태의 결장암 또는 그의 전구체만을 검출할 수 있다. 게다가, 출혈성, 비-출혈성 및 간혈적 출혈성 형태의 결장암 및 그의 전구체가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 측정 시간에 따라, 결장암 및 그의 전구체가 간과될 수도 있다.

gFOBT 및 iFOBT 시험을 사용함으로써, 출혈성 종양 및 그의 전구체만을 검출할 수 있다.

따라서, 이들 시험은 결장암 및 그의 전구체를 "검출"할 수도 있고 "간과"할 수도 있다.

일반:

따라서, 뜻밖에도 그리고 병리생리학적으로, 대변 중의 잠혈은 단지 결장암 및 그의 전구체와 간접적으로 관련이 있다!

효소적 대변 시험 (M2-PK) (샘플 재료: 대변).

이는 대변 중의 잠혈을 검출할 수는 없지만, 암에 대해 전형적인 효소를 검출하는 시험이다. 이 효소는 항상, 악성적으로 변형된 각종 암 조직 (결장암 포함)이나 악성적으로 변형된 결장 폴립에 더 다량으로 존재한다. 측방 유동 시험 및 ELISA의 포맷으로 시중에서 입수가능하기도 하는 상기 시험은 바이오마커 종양 M2-PK를 검출한다. 종양 M2-PK는 피루베이트 키나제 (PK)의 특수 동종효소이다. 정상 조직에서는, 피루베이트 키나제 (M1-, M2-PK 형태)가 사량체 형태 (M2-PK 사량체)로서 존재한다. 암 및 그의 전구체에서는, 이러한 PK의 이량체 형태 (M2-PK 이량체 = 종양 M2-PK)가 더 많이 더 자주 발견된다. 이러한 특별한 종양 M2-PK 분자에 대하여 2개의 상이한 모노클로날 항체가 생성되었다. 종양 M2-PK에 대해 특이적인 이들 특수 항체가 시중에서 입수가능한 시험에 사용될 수 있다 (ELISA 및/또는 측방 유동 포맷에 사용됨).

일반:

뜻밖에도 그리고 또한 병리생리학적으로, 바이오마커 M2-PK는 암 및 그의 전구체와 직접적으로 관련이 있다. 효소 M2-PK (동종효소 M2-PK의 이량체 형태)는 지금까지 검사된 모든 종양 (예를 들어, 상이한 조직/기관의 12개 종양)에서 항상 검출가능하고, 또한 결장암 및 그의 전구체에서도 검출가능하다.

임상 연구 결과, 시중에 나와 있는 종양 M2-PK 시험 (측방 유동 및/또는 ELISA 포맷)이 출혈성 결장암 및 그의 전구체와 비-출혈성 결장암 및 그의 전구체 둘 다를 검출할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

그러나, 이들 시험 (시험 스트립)은 또한, 결장암 및 그의 전구체를 "간과"할 수도 있다. 따라서, 개선된 M2-PK 시험 (시험 스트립)을 제공하는 것이 본 발명의 추가 목적이다.

기술적 해결책:

본 발명에 따르는 시험 키트는 플라스틱 카세트 뿐만 아니라 M2-PK 및 헤모글로빈을 결정하기 위하여 선행 기술 ("iFOBT", "면역학적 시험", "잠혈 시험")에 비해 개선된 2개의 신규 시험 스트립으로 이루어진 복합 신속 시험을 포함한다.

혈액 시험 (샘플 재료: 혈액).

종양은 DNA (및/또는 메틸화 DNA)를 혈류 내로 방출시킨다. 이러한 방식으로, 결장암은 특유의 시그너처(signature) - 바이오마커를 남긴다. 이 바이오마커는 혈액 시험으로 검출가능하다. 이를 위하여, 의사는 발단자로부터 혈액 샘플을 취하고, 일상적으로 사용하기에는 매우 강건하지 않은 PCR 기술을 통하여 비교적 복잡하고 비용이 많이 드는 측정 및 평가를 위해 전문 실험실로 보낸다.

일반:

뜻밖에도 그리고 또한 병리생리학적으로, DNA 메틸화 패턴, 시그너처, 전형적인 추적 (바이오마커 SEPT9, 셉틴(septin)-9 혈액 시험)은 단지 암 및 그의 전구체와 간접적으로 관련이 있다.

M2-PK는 단지 출혈성 및 비-출혈성 종양 및 그의 전구체를 검출할 수 있다. 그러나, M2-PK 시험 역시, 결장암 및 그의 전구체를 "간과"한다. 따라서, 개선을 달성하는 것이 본 발명의 목적이다. 이러한 목적은 본 발명의 기술적 설명 및 청구범위에 의해 달성된다.

이전에 공지된 종양 M2-PK 시험 (측방 유동 PCT/EP00/09303 및/또는 ELISA 포맷) 뿐만 아니라 gFOBT 및 iFOBT의 단점은, 단독으로 취한 세 가지 시험 중 어느 것도, 특히 환자와 관련해서, 진단적으로 관련된 전체 기간을 다루고 있지 않다는 것이다.

문헌 [WO 2007/071366 A1 (Roche Diagnostics GmbH)]으로부터, 대변 중의 종양 M2-PK와 헤모글로빈 둘 다를 결정하는 방법이 공지되어 있다. 두 파라미터를 정량적으로 결정하는 것은 두 가지 별개의 시험으로 수행되는데, 그 평가는 수학적 알고리즘을 통하여 이루어져야 한다. 상기 문헌의 설명에서는, 평가 알고리즘이 실제적으로 밝혀지지는 않았지만, 이러한 알고리즘을 개발하는 데 기초가 될 수 있는 수많은 가능한 방법이 언급되어 있다 (7면 12행 - 9면 21행 참조). 따라서, 상기 문헌의 기술적 교시는 평가 알고리즘만을 검색하기 위한 방법에 관한 것이다.

폴립-암 순서의 모든 단계의 완전한 진단적 검출/발견을 위한 접근 방식은 선행 기술에서 언급되지 않았다.

따라서, 폴립-암 순서의 진단적으로 검출가능한 모든 단계를 단일 시험으로 신뢰할만한 수준으로 완전하게 검출할 수 있게 해주는, 결장암 및 그의 전구체를 검출하기 위한 시험을 개발하는 것이 목적이었다. 이러한 시험으로, 헤모글로빈과 종양 M2-PK를 동기적으로 결정할 수 있어야 한다.

이러한 목적은 헤모글로빈과 종양 M2-PK를 특이적으로 검출함으로써 시험 키트 (복합 신속 시험)를 통하여 장에서의 병리학적 변화를 진단/검출하기 위한 본 발명에 따르는 방법에 의해 달성된다. 본 발명에 따르는 방법의 도움으로, 상기 분석물 (헤모글로빈, 종양 M2-PK) 중 어느 하나라도 보이기 시작하면, 그 즉시 병리학적 변화를 안전하고도 매우 조기에 검출하는 것이 가능하다.

놀랍게도, 본 발명에 따라서 복합 신속 시험, 및 M2-PK와 헤모글로빈을 결정하기 위한 2개의 신규 개선된 시험 스트립, 뿐만 아니라 면역크로마토그래피에 의한 검출 방법을 동기적으로 수행하는 데 필요한 시약을 사용함으로써, 기술적인 문제점, 즉 2개의 별개의 카세트 또는 1개의 카세트 상에 2개의 바이오마커를 사용하는 것과 비교해서 전반적인 감수성이 증가하는 것이 해결될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 보다 특히, 복합 신속 시험 및 복합 신속 시험 카세트 및 성분 뿐만 아니라 면역크로마토그래피에 의한 검출 방법을 동기적으로 수행하는 데 필요한 시약에 관한 것이다. 동기적으로는 동시에의 언어적 의미이긴 하지만, 복합 신속 시험 카세트에서 2가지 바이오마커인 M2-PK와 헤모글로빈을 검출하기 위한 적극적인 페어링, 크로마토그래피 조건 (특히 2개의 신규 시험 스트립에 대해서임)의 통상적인 최적 조화의 기술적 의미이기도 하다.

그러나, 이는 카세트와 모든 성분의 최적화 (막 및 명세 (모세관 유속 등)의 선택), 소위 백킹(backing)의 선택, 세제 및 가용화제의 선택, 액체 확산 대 단백질 확산, 선택된 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 대 나일론)의 특이성, 샘플 패드 선택 및 명세, 접합체 패드 선택 및 명세, 흡수성 패드 선택 및 명세, 접착성 카드 선택 및 명세, 하우징 (플라스틱 카세트, 이중 카세트) 선택 및 명세, 제조 도식에 의해서만 가능하였다.

면역크로마토그래피 원리에 기초한 시험관내 진단 시험 스트립은 선행 기술에서 이미 공지되어 왔다. 모든 생성물 개선을 통하여 설계 단계부터 최종 제조 공정까지의 면역크로마토그래피 시험 스트립을 고려하면, 생물학, 화학, 물리학 및 공학의 모든 원리가 이용된다.

다음 특허 번호는 이와 관련된 기술적 교시를 언급하고 있다: 예를 들어, US 433,734, US 4,376,110, US 4,435,504, US 4,703,017, US 4,855,240, US 4,954,452, US 5,028,535, US 5,075,078, US 95/16207, US 5,654,162, EP 0810436 A1.

1개의 시험 카세트 중에 2개 이상의 시험 스트립을 갖는 시험 카세트 (복합 시험 카세트)는 선행 기술에 속한다 (스트립 시험에 의한 약물 검출). 추가로, 이들 카세트는 헤모글로빈/합토글로빈 복합체 및 헤모글로빈을 결정하는 것으로 공지되어 있다. 단일 시험 카세트만이 M2-PK와 헤모글로빈을 동기적으로 결정하는 것으로 지금까지 공지되어 있다. 두 시험 중 하나만으로도 많은 병리학적 변화를 "간과"한다. 그 이유는 특히, 시험 스트립의 "좋지 못하게" 설정된 컷-오프(cut-off)와 시험 시스템의 좋지 못하게 선택된 크로마토그래피 조건이다. 시험 시스템의 제조업자에게 어려운 과제는 소위 "컷-오프"의 최적의 선택이다. 원칙적으로, 이러한 컷-오프는 발단자 집단의 측정치의 히스토그램으로부터 취할 수 있다. 기술적 문제점은 "건강한" 발단자와 "병든" 발단자 간을 구별하는 것이다. 이는 본 시험 키트에 의해 그리고 개선된 컷-오프를 수반하는 2개의 신규 시험 스트립과 크로마토그래피 조건을 제공함으로써 기술적으로 해결된다. 컷-오프의 중요성은 반 로숨(van Rossum)에 의한 연구에서 설명되는데, 최적화된 컷-오프를 이용하여 헤모글로빈과 종양 M2-PK의 측정을 개시할 것으로 공지되는 시험 키트는 사용하지 않았다.

컷-오프 및 좋지 못하게 선택된 크로마토그래피 조건을 개선시키는 것이 본 발명의 목적이다. 이는 본 발명에 따라서, 시험 키트, "잘" 조정된 컷-오프를 수반한 2개의 신규 시험 스트립을 함유하는 복합 신속 시험 카세트 뿐만 아니라 이러한 복합 신속 시험을 수행하기 위해 잘 선택된 크로마토그래피 조건을 제공함으로써 기술적으로 달성된다.

문헌 (WO 01/21826 A2, WO 02/50546 A2, 및 WO 03/069343 A2)으로부터, 위장관의 종양에 대한 종양 마커를 검출하기 위한 상이한 방법이 공지되어 있는데, 여기서는 발단자의 대변을 대상으로 하여 종양 마커를 알아보기 위해 검사한다. 이들 방법은 실제로 성공적인 것으로 입증되었지만, 여전히 다수의 가성 음성 및/또는 가성 양성 결과를 나타낸다. 이는 개선 가능하다.

또 다른 한편, 종양에 대한 종양 마커를 검출하기 위한 각종 방법이 공지되어 있는데, 이들 방법은 혈액이나 혈청 중의 종양 마커를 검출하는 것에 기초한다 (예를 들어, 문헌 [Anticancer Research 19:2785-2820 (1999)], [WO 03/065003 A2], [Leman ES, et al., Cancer Res. 67 (12):5600-5605 (2007)], 및 [Leman ES et al., Clinical Cancer Research 14:1349-1354 (2008)] 참조). 한편, 이것이 종양 질환을 전부 진단하는 데 유리할 것이긴 하지만, 또 다른 한편으론 각종 종양 질환에 대한 바이오마커를 검출하는 것이 병에 걸린 기관이나 조직의 성질 및 국재화에 관한 신뢰할만한 정보를 허용하지 않는데, 이는 종양 마커가 실제로 조직-특이적인 가장 희귀한 증례에 있으므로, 종양 마커에 대한 혈액 분석의 양성 결과의 경우에는, 병에 걸린 조직과 관련한 신뢰할만한 결론이 전혀 가능하지 않기 때문이다. 따라서, 실제적으로 존재하는 유형의 종양을 신뢰할만한 수준으로 결정하는 데 필요한 부가의 비용이 드는 복잡한 진단 방법이 있다. 따라서, 혈액, 혈장 또는 혈청 중의 마커는 주로 종양의 치료 및 추적에 사용된다.

또한, 이러한 검출 방법은 종양 내에 형성된 종양 마커가 혈류 내로 또는 혈청 내로 충분한 양으로 자신의 길을 찾아가고 있음을 시사한다. 암, 특히 결장암 발생의 초기 단계에서는, 이들 종양 마커의 충분한 양이 아직까지는 혈류 내로 자신의 길을 찾아가지 못하므로, 혈액이나 혈청 검사를 통한 검출은 가능하지 않다.

바이오마커의 동기적 검출.

또한, 본 발명에 따르는 바이오마커 (M2-PK 및 헤모글로빈)를 동기적으로 정확하게 검출하기 위하여, 시험 카세트 중의 두 바이오마커의 결정 (신뢰할만한 검출 = 통계적 신뢰 구간의 초과 없음)의 통상적인 조화를 위한 기술적 해결책이 요구된다. 그것은 통상적인 크로마토그래피 조건을 의미한다 (도 1 내지 도 6 참조).

이것은 본 발명에 따르는 파라미터 선택의 의미에서 복합 신속 시험 카세트 중의 2개 바이오마커인 M2-PK와 헤모글로빈을 검출하기 위한 크로마토그래피 조건의 통상적인 최적 조화를 선택함으로써 달성된다.

특히, 카세트와 그의 성분의 최적화 (막 및 명세 (모세관 유속 등)의 선택), 소위 백킹 공정의 선택, 세제 및 가용화제의 선택, 액체 확산 대 단백질 확산, 선택된 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 대 나일론)의 특이성, 샘플 패드 선택 및 명세, 접합체 패드 선택 및 명세, 흡수성 패드 선택 및 명세, 접착성 카드 선택 및 명세, 하우징 선택 및 명세, 제조 도식에 의해 달성된다.

2개의 시험 필드 (니트로셀룰로스 막을 이용함)를 이용하여 본 발명에 따르는 상기 복합 카세트를 생성시키는 것은 시험관내 진단 장치 (IVD) 디렉티브(Directive) 98/79/EC, 및 ISO 13485 및 품질 관리 QM ISO 9001에 따라서 수행한다.

기술적 문제점:

적용된 스크리닝 방법 (gFOBT, iFOBT, 종양 M2-PK, 스크리닝 결장경검사)에 의한 불량한 임상적 감수성 및 특이성.

발명의 목적:

임상적 감수성 (양성 예측 값) 및 특이성 (음성 예측 값), 특히 감수성의 개선.

기술적 해결책:

본 발명에 따르는 복합 시험 카세트를 사용함으로써, 2개의 시험 카세트 (가능하게는 2명의 상이한 제조업자의 것임)를 사용하는 것에 비해 상당한 이점 (전반적인 감수성이 더 높음)이 달성될 것이다. 선행 기술에서는, 무증상 발단자에 대한 결장경검사의 표적 도입을 위한 측방 유동 시험 (쉐보(ScheBo) M2-PK 신속 시험)이 존재하였다.

기술적 문제점:

감수성과 특이성의 개선.

기술적 해결책:

잠혈 중의 바이오마커 및 종양 M2-PK를 동기적으로 면역화학적 결정할 수 있게 해주는, 본 발명에 따르는 복합 시험 카세트를 사용한다.

본 발명에 따르는 복합 시험 카세트는 2개의 측방 유동 시험 스트립을 함유한다. 두 시험 스트립은 선행 기술에 상응하지 않지만, 각각 본 발명에 따르는 보다 우수한 측방 유동 시험 방법을 나타낸다. 즉, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 복합 시험 카세트 상에, 선행 기술과 비교해서 최적화된 종양 M2-PK 시험 = M2-PK 플러스 시험 및 개선된 iFOB 시험 = iFOB 플러스 시험이 존재한다.

복합 카세트 (시험을 수행하는 데 필요한 모든 시약 및 성분을 수반한 시험 키트)에서 조화된 컷-오프를 이용하여 바이오마커인 종양 M2-PK 및 헤모글로빈을 동기적 (기술적 의미에에서) 검출하는 것은 2개의 측방 유동 카세트 (시험을 수행하기 위한 시약 및 성분의 2가지 상이한 설정을 갖는 2개의 시험 키트)에 의해 두 바이오마커 (종양 M2-PK 및 헤모글로빈)를 시간-변화 프로세싱 (결정)하는 것에 비해 이점을 지니고 있는데, 이는 특이적 고체상/액체상 항체 뿐만 아니라 복합 시험 키트의 요구되는 모든 시약 및 성분들이 잘 조화되기 때문이다. 예: 사용자가 종양 M2-PK를 결정하기 위해 쉐보 측방 유동 시험을 구매하고, 헤모글로빈을 측정하기 위해 또 다른 제조업자로부터 또 다른 측방 유동 시험을 구매한 다음, 이들을 시간-변화 방식으로 프로세싱할 경우, 사용자는 이들 상이하고 비-조화된 시험에 의해 더 안 좋은 임상적 감수성과 특이성을 달성하게 될 것이다.

본 발명의 목적 및 기술적 해결책:

1. 결장경검사를 표적화 도입함으로써 보건 의료 지출을 줄인다.

2. 결장암의 조기 검출을 위하여 표적화된 간단하고도 관리가능한 "진입 진단학"을 제공한다.

3. 결장경검사에 의한 특이적 진입 진단을 요구하는 특정 개개인 (발단자)의 최적화된 선택을 위한 iFOB-결정 및 종양 M2-PK의 동기적 결정을 위하여 본 발명에 따르는 복합 신속 시험 카세트를 제공함으로써 조기 진단에 의해 상기 개개인의 결장암 질환의 예후를 개선시킨다. 결장경검사를 위한 예비-선별의 기술적 문제점은 본 발명에 따르는 복합 신속 시험 카세트를 이용하여 해결될 수 있다. 분석물 (종양 M2-PK 및/또는 iFOB 시험)의 측정시 양성인 것으로 진단된 발단자만이 표적화된 방식으로 결장경검사를 받도록 한다. 본 발명에 따르는 복합 신속 시험 카세트는 기술적으로, 선별 공정에서 이중 "필터"로서 작용한다.

4. 특이적 물리-화학적 특성, 예를 들어 특이적 결합 상수 및 특이적 동역학 특징을 지닌, 본 발명에 따르는 측방 유동 이중 시험 카세트 및 모든 관련 시약, 특이적 항체 (항-종양 M2-PK (특수 에피토프), 항-헤모글로빈 (특수 에피토프))를 제공한다. 추가로, 2가지 상이한 분석물에 대하여 유도되는, 상기 선택된 고체상 및 액체상 항체는, 예를 들어 측방 유동 측정 방법에서 특이적 특성 (예를 들어, 유리 섬유, 니트로셀룰로스 막과의 화합성, 예를 들어 금 콜로이드에 대한 우수한 커플링 특성)을 지니고 있다.

5. 종양 M2-PK 또는 헤모글로빈에 대한 그들의 결합 특성에 있어서 둘 다 특이적이고 면역크로마토그래피 방법에서 사용될 수 있는 (예를 들어, "막-적합성", "세제-적합성"인) 특이적 항체를 복합 신속 시험에 사용한다.

6. 침습적 방법 - 결장경검사 - 에 표적화 도입함으로써 치료적 과정 (수술, 화학요법)을 위한 표적화된 제제 ("진단" 조치에 따라서 - 결정 트리/결정 매트릭스)에 표적화 도입하기 위하여 본 발명에 따르는 복합 신속 시험을 제공함으로써 결장암으로 인한 사망률을 감소시킨다.

7. 결장암 및 그의 전구체의 검출과 관련한 스크리닝 조치의 비용/이익을 최적화한다.

문헌 WO 01/21826으로부터, 종양 M2-PK는 크로마토그래피 공정에 의해 시험 스트립 상에서 검출될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 이러한 시험에서는, 시험 스트립 (니트로셀룰로스)이 사용될 수 있는데, 그 위에는 요구되는 항체가 상기 시험 스트립의 각종 영역 내에 고정된 고체상으로 또는 가용성 형태로 배열되어 있다. 샘플 (예를 들어, 대변 추출물, 많은 물질의 혼합물 뿐만 아니라 세제 용액 중에서 검출될 분석물) 또는 샘플의 액체 부분 또는 추출물은, 예를 들어 종양 M2-PK 및/또는 헤모글로빈이 이러한 샘플에 존재하는 경우에, 시험 스트립을 통하여 이동하여 검출 부위에 신호를 창출시킬 수 있다. 본 발명에 따라서 고도로 특이적인 포획 항체를 사용하면, 대변 샘플 추출물로부터의 표적 단백질 (예를 들어, 종양 M2-PK)이 반드시 결합한다. 그 위에 제2의 고도로 특이적인 항체가 존재하는 금 콜로이드를 사용함으로써, 예를 들어 종양 M2-PK의 존재하에 면역 복합체가 형성된다. 이러한 분석물 검출 복합체는 시험 스트립 상의 라인으로서 육안으로 볼 수 있다. 시험 스트립 상의 개개 성분의 정확한 배열은 적용된 면역학적 방법에 좌우되고 통상의 기술자에 의해 공지되어 있다. 특별한 도전 과제는 최적의 항체를 사용하는 것이다. 본 발명에 따르는 복합 신속 시험에서는, 종양 M2-PK와 특이적으로 결합하는 특수 항체를 사용하였다.

종양 M2-PK-특이적 항체는 적어도 4개의 아미노산의 길이를 갖는 다음 에피토프 또는 그의 단편 중 하나와 결합한다 (또한, M2-PK의 이량체 형태와 입체특이적으로 결합한다):

4개 아미노산의 최소 길이를 갖는 이들 에피토프 또는 그의 단편, 또는 이들의 조합물 중 하나가 대변 샘플 추출물에 존재하는 것은 위장관 내에서의 병리학적 변화 (결장암 또는 그의 전구체)의 징후이다.

소위 대변 중 혈액 시험 (gFOBT)은 결장암을 검출하는 데 있어서 단지 25% 정도의 불충분한 감수성을 나타낸다. 이와는 달리, 종양 M2-PK 시험은 80%의 보다 높은 감수성을 나타낸다. 종양 M2-PK 시험을 이용하여, 1 cm 초과의 폴립을 60%의 감수성으로 검출할 수 있고 (FOBT: 20%), 1 cm 미만의 폴립은 20%의 감수성으로 검출할 수 있다 (FOBT: 0%) (모든 값은 95%의 특이성에 대한 것이다).

일반적으로, 면역크로마토그래피에 의한 대변 중 혈액 시험은 통상적으로 사용되고 있는 gFOBT 보다 결장암 및 그의 전구체에 대한 감수성이 더 높은 것으로 나타나므로, gFOBT는 어떠한 표현을 써도 iFOBT 보다 못하다.

양성률 뿐만 아니라 특이성 및 감수성은 이들 시험 간에도 광범위하게 다양하다. 관찰된 패턴은 강력하게 상이한 양성률이 상이한 컷-오프 수준, 상이한 경계 영역, 및 상이한 나라로부터의 다양한 제조업자의 시험 제한 사항에 기초하고 있다는 것을 제안한다. 상이한 제조업자로부터의 시험의 생산 품질 역시 다양하다.

상이한 제조업자로부터의 시험 키트는 상이한 컷-오프 (= 내성 한계치, 이는 내성 값을 나타냄)에 역점을 두고 있다. 내성 값은 시험 결과에 긍정적 또는 부정적으로 간주될 때부터 명시된다. 컷-오프는 검출 한계의 개념과 구별되어야 한다.

문헌 [Inter-test agreement and quantitative cross-validation of immunochromatographic fecal occult blood tests, Hermann Brenner et al., Int. J. Cancer (2010)] 참조.

이의 결과로서, 개개 시험의 시험 특징에 있어서의 강력한 변동이 관찰될 수 있다 (기술적 문제점). 따라서, 상기 과학 문헌에는 더 나은 시험 키트를 사용할 수 있도록 하고 최적화된 컷-오프를 찾아 사용하도록 요청되어 있다 (문헌 [H. Brenner, S. Tao, European Journal of Cancer (2013)] 참조).

추가 연구는 시중에서 입수가능한 시험 키트의 높은 변동을 입증한다 (문헌 [Brenner et al., Int. J. Cancer, 2010] 참조). 이로써, 가장 높은 가능 진단 효율을 보장해 주는 컷-오프를 이용하여, 대변 샘플 중의 종양 M2-PK 및 헤모글로빈을 표시할 수 있는 시험 키트가 당해 분야에 상당한 필요해진다.

이러한 기술적 문제점은 선행 기술에 비해 개선되는 2개의 시험 스트립을 함유하는 복합 카세트를 포함하는 시험 키트를 제공함으로써 해결된다.

두 바이오마커에 대한 컷-오프 수준, 경계 영역 및 한계치가 포괄적인 사내 측정에 의해 발견되고 결정되었다. 결정은 서술적 통계 분석 및 바이오마커 수준 히스토그램 (박스 플롯 분석과 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 계산)의 해석에 의해 수행되었다. 더 우수한 임상적 감수성과 특이성을 달성하기 위하여 두 바이오마커의 동기적 결정을 위한 크로마토그래피 조건의 조정 및 두 시험 스트립의 생산이 주요 도전 과제를 나타낸다. 이는 모든 화학적 및 물리적 조건을 조정함으로써 기술적으로 해결되었다 (청구범위 및 실시예 참조). 따라서, 모든 결과의 총합과 비교해서 모든 진성 양성 시험 결과와 진성 음성 시험 결과의 비를 표시하는 진단 효율을 상당히 개선시키기 위하여, 상기 복합 시험을 수행할 경우에 "가성 양성" 및 "가성 음성" 결과가 가능한 한 적게 수득되도록 상기 2개의 바이오마커를 결정하기 위한 모든 조건을 선택하였다.

이러한 목표를 달성하기 위하여, 기술적 해결책을 찾았고 이를 발견하였다. 기술적 해결책에 대해서는, 조화된 크로마토그래피 조건 및 조화된 재료 조건하에 기술적 의미에서의 바이오마커의 동기적 검출이 밝혀졌는데, 즉 막, 수행 조건 등의 적당한 선택이 밝혀졌다 (실시예 및 청구범위 참조).

종양 마커는 정상의 비교 조직과 관련해서 종양 조직에서 차등적으로 발현되는 유전적 생성물인데, 즉 종양 마커는 정상 조직과 비교해서 종양 조직에서 과발현되거나 불충분하게 발현된다. 실제적으로는, 과발현되는 종양 마커가 더 중요한데, 이는 샘플의 양성 분석 결과 (바이오마커의 존재)가 바이오마커-특이적 종양의 존재를 암시하기 때문이다. 종양 마커는 조직 세포의 세포질에 존재하지만, 체액, 예컨대 혈액, 뇨, 땀, 정액, 타액 등에 존재할 수 있을 뿐만 아니라 대변에도 존재할 수 있다.

종양 마커는 다음 특성을 지녀야 한다: i) 고 특이성, 즉 양성 질환과 건강한 사람에 대해서는 검출가능하지 않고, ii) 고 감수성, 즉 종양 환자에게서 높은 비율로 검출될 수 있으며, iii) 기관 특이성, iv) 종양 병기 또는 종양 덩어리와의 우수한 상관 관계, v) 예후에 대한 관계, 및 vi) 신뢰할만한 예측 수준. 100% 특이성 및 100% 감수성의 기준, 및 기타 열거된 기준은 공지된 종양 마커 중 어느 하나에 의해서도 지금까지 충족되지 못한다.

특히, 위장관의 종양에 대해 특이적인 종양 마커는 CCSA-2, CCSA-3, CCSA-4, CC2, CC3, CC4, CC5, CC6a, CC6b, L1, L2, N1, N2, N3, N4, N5, 및 N6을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [WO 03/065003 A2], [Leman ES, et al., Cancer Res. 67 (12):5600-5605 (2007)], 및 [Leman ES, et al., Clinical Cancer Research 14:1349-1354 (2008)] 참조). 그러나, 이들 종양 마커는 상기 언급된 단점들을 초래하여, 혈장 시험만의 맥락에서 선행 기술에 사용되고 있다.

특히 종양이 아직까지 신체의 혈관계와의 접촉을 완수하지 못한 성장기 (예를 들어, 이미 "폴립-암 순서"에 있는, 즉 점막하로의 침윤이 일어나기 전의 시점)에서 위장관 내에서의 종양 현상을 가능한 한 빨리 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 특히 폴립에서 소위 선종-암종 순서와 관련해서 위장관에서 의심되는 신생물 현상의 경우, 선행 기술에서는 각종 결정 방법에 의해 대변 중의 잠혈을 검출하고자 하였다. 이를 위하여, 비-면역학적 시험 (예를 들어, 슈도퍼옥시다제 활성, 포르피린 검출) 및 면역학적 시험이 이용된다 (문헌 [Favenne L. et al., (1992) Ann. Biol. Clin. 50:311-313] 참조).

그러나, 두 시험 원리는 매우 특이적이지 못하다. 또한, 산화환원 반응 (시험 원리)에 기초한 비-면역학적 시험은 각종 요인들 (가성 양성/가성 음성, 예를 들어 일부 환자 및 수많은 약물에 관하여 절대적으로 필요한 식이 요구 사항의 비-준수 및 과도한 비타민 C 투여 (예를 들어, 야채, 과일 주스 등))에 의해 방해를 받을 수 있다 (문헌 [Thomas L., Labor und Diagnose, 5th edition, 1998] 참조).

대변 중의 잠혈에 대한 양성 시험은 출혈 근원지의 위치를 정확히 찾아낼 때까지 또는 출혈의 원인을 밝혀낼 때까지의 일정 시간 동안 명확하게 해야만 한다. 임상적 진단은 어떠한 경우에서도, 예를 들어 내시경검사, 초음파, X선에 의해 신속하게 수행된 추가 진단학 ("배제에 의한 진단")을 정당화시켜 준다.

발명의 기술적 문제점.

기존의 선행 기술 M2-PK 측방 유동 시험 (시험 스트립)은 병리학적 변화를 간과한다.

본 발명에 따르는 M2-PK 플러스 시험 스트립도 또한 병리학적 변화를 간과한다.

기존의 선행 기술 iFOBT는 병리학적 변화를 간과한다.

본 발명에 따르는 iFOBT 플러스 시험 스트립은 병리학적 변화를 간과한다. 개선된 시험 M2-PK 플러스와 iFOBT 플러스 둘 다를 본 발명에 따라서 복합 카세트 중의 시험 스트립으로서 합치는 경우, 장에서의 병리학적 변화에 대한 더 높은 인식율이 본 발명에 따라서 수득된다. 두 바이오마커의 동기적 검출을 위한, 상기 문제점의 기술적 해결책, 특히 적극적인 페어링의 선택 (실시예 및 목록 참조; 본 발명에 따르는 성분 및 활성 성분, 항체의 올바른 선택 및 두 파라미터에 대한 컷-오프의 올바른 선택, 분석적 감수성, 모세관 유속 등)이 본 발명에 따르는 파라미터 선택의 주제이다.

따라서, 인간 또는 동물 대변에서 마커, 바이오마커, 특히 효소 바이오마커를 검출하기 위한 방법으로서 제공되는, 간단한 구성의 시험 키트 (복합 신속 시험)를 명시하는 것이 본 발명의 기술적 목적인데, 이러한 방법은 위장관 및 복강 (식도, 위, 소장, 담도, 췌장 및 결장)에서의 악성 현상, 특히 장의 종양 및 종양 전구체 (폴립, 선종)를 검출하는 데 적합하다. 본 발명에 따르는 복합 시험 키트 (복합 신속 시험)는 시험이 기술 담당자에 의해 수행될 수 있도록 병리학적 변화를 간단한 방식으로 검출할 수 있게 하기 위한 것이다.

특히, 병리학적 현상, 특히 신생물 현상이 특히 소위 폴립을 수반하는 선종-암종 순서의 문제점과 관련하여 특히 조기에 그리고 의심없이 검출될 수 있도록, 특이적이고도 용이하게 수행되는 방법에 대해 지속적으로 증가하고 있는 수요를 충족시키는 것이 본 발명의 기술적 목적이다.

발명의 원리 및 바람직한 실시양태.

이러한 기술적 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 위장관 내에서의 병리학적 현상을 검출하기 위한 시험 키트 (복합 신속 시험)를 교시하는데, 이러한 시험 키트에서는 특수 추출 완충제에 용해된 인간 또는 동물 대변 샘플을 담체 상에 적용하고, 종양 M2-PK와 헤모글로빈 둘 다를 지지체 상에서 검출한다. 이때, 판독은 육안으로 (장치의 도움없이) 시각적으로 간단한 방식으로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 헤모글로빈은 헤모글로빈/합토글로빈 복합체 (Hb/Hp)의 형태로 결정된다. 상기 언급된 바이오마커의 측정이 조기 악성 변화, 특히 신생물을 검출하는 데 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 이러한 바이오마커 복합물인 종양 M2-PK 플러스 헤모글로빈; 종양 M2-PK 플러스 헤모글로빈/합토글로빈 복합체 (Hb/Hp)를 측정함으로써, 설명서 (보고)의 정확성에 있어서 현저한 개선이 달성되는데, 특히 가성 음성 진단 뿐만 아니라 가성 양성 진단이 상당히 감소한다.

이것은 특히 놀라운 일인데, 대변 중의 기타 특이적 분석물 (단백질)에 대한 광범위한 연구는 그들을 바이오마커, 특히 종양 마커로서 적용하는 어떠한 증거도 허용하지 않았기 때문이다. 언급된 종양 마커의 구조와 물리-화학적 특성 둘 다는 명백하게도, 위장관의 중요한 단백질분해 활성 및 극단적인 생리학적 조건 (예를 들어, 위 내의 pH, 산, 장 내의 알칼리)의 결과로서 영향을 받지 않는다. 이는 면역학적 방법을 통한 바이오마커의 검출에도 적용된다. 따라서, 상기 언급된 위장관 내에서의 단백질 변성 및 단백질 분해에도 불구하고, 종양 환자의 대변 중의 몇 가지 효소 바이오마커의 특이적 검출을 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

효소 바이오마커를 결정하는 데 필요한 시스템은 상부피가긴 하지만 용이하게 입수가능하지 않다. 본 발명에 따르는 복합 신속 시험을 개발하기 위하여, 검출 제한 사항 뿐만 아니라 시약 (본 발명에 따르면, 분석물의 동기적 측정을 위해 최적화된, 두 분석물에 대한 고체상 및 액체상에 대해 특이적인 항체), 완충제 용액, 세제 등의 조성 둘 다를 비용이 매우 많이 드는 방식으로 조정해야만 했다.

따라서, M2-PK 및/또는 헤모글로빈-양성 대변 샘플에서는, 위장관, 즉 장, 식도, 위, 담도, 췌장 및/또는 결장 내에서의 병리학적, 잠재적 신생물성, 특히 악성 현상의 징후를 즉시 얻을 수 있으므로, 위장관 내에서의 상기 현상의 위치를 알아내는 것이 가능하다.

전체 위장관은 생물학적으로 몸의 외부에 위치하고 있기 때문에, 대변 샘플이 "체액" 샘플로서 간주될 수 없다는 것을 인지해야 한다.

본 발명에 따르는 방법을 이용하여, 복수 개의 상기 종양 마커 단백질을 결정함으로써 대변 중의 악성 종양 현상을 간단한 방식으로 비-침습적 방법으로 검출하는 것이 가능하고, 이와 동시에 양성 시험 과정을 이용하여, 종양이 위장관 내에 존재하고 신체 내의 다른 곳에는 존재하지 않는다는 것을 명백하게 규정할 수 있다.

이러한 방법에 의해, "초기 의심", "일차 진단", 진단을 초래하는 것이 가능할 뿐만 아니라 추적도 가능하다. 개별 단백질 분포 때문에, 개별 진단이 가능하다.

놀랍게도, 본 발명에 따르는 복합 신속 시험을 이용하여, 상기 효소 바이오마커를 대변 중의 자유 단백질로서 검출하는 것이 가능하다. 이것은 추가로 유리한데, 이는 시험이 보조원, 예를 들어 의료 기술 보조원 (MTA)에 의해 수행될 수 있기 때문이다. 두 분석물 (종양 M2-PK 및 헤모글로빈)이 동기적으로 결정된다는 사실로 인해, 특히 판독 오류 (예를 들어, MTA에 의함)를 피할 수 있는데, 이는 본 시험을 수행하기 위하여, 환자의 샘플 두 방울이 성공적으로 적용되고 (자연적으로, 몇 초 지연됨), 몇 분의 특정 기간이 지난 후, 두 결과를 판독한다. 이러한 과정에 의해 시험 과정이 더 고도로 편리해졌을 뿐만 아니라 (통상적인 시험과 비교해서) 오류 공급원도 감소된다.

본 발명에 따르는 시험의 경우에는, 대변으로부터 세포를 단리시키고 이러한 세포 내에 함유된 단백질을 분석하는 것이 요구되지 않는다. 고형 종양은 상기 언급된 효소 바이오마커를 가용성 단백질로서 위장관의 내강 내로 방출시키고, 이들 바이오마커는 떨어져 나간 위장 상피 세포에는 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다. 상기 효소 바이오마커는 종양 세포로부터 방출되고, 단백질로서 위장관을 통과한 다음, 최종적으로 대변 중의 단백질로서 검출될 수 있다. 이러한 가능성, 즉 이들 단백질이 위와 장을 통과한 후에도 여전히 대변에서 검출가능하다는 것은 예상할 수 없었던 일인데, 이는 정상적으로는 각각의 단백질이 정상적인 소화 과정시 고도로 분해되는 것으로 예상되었기 때문이다.

본 발명의 맥락에서, 상기 효소 바이오마커는 심지어 장기간 동안 저장되어 온 (예를 들어, 샘플이 수송된 경우) 고도로 균질화된 대변 샘플에서도 여전히 정량적으로 검출가능한 것으로 밝혀졌다. 대변을 상당히 희석시킨 경우에서도, 강력한 반응이 수득된다. 또한, 이전의 추출 공정 없이도 대변 샘플에서의 검출이 선택적으로 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 예를 들어 특수 세제 (예를 들어 CHAPS)를 이용하는 추출 방법을 사용한다 (추출 공정은 실시예 2에 보다 상세히 기재되어 있다).

본 발명에 따르는 방법에서는, 바람직하게는 인간 또는 동물의 위장관에서의 악성 현상을 결정한다. 더욱이, 특히 항-종양 마커 항체를 통하여 종양 마커를 면역화학적으로 검출하는 것이 바람직하다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다. 유리하게는, 대변의 기타 성분, 특히 기타 대변 단백질과는 교차반응하지 않는 항체를 사용한다.

본 발명의 의미에서의 단편은 상기 종양 마커 중 하나의 부분 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 단편의 길이는 5 aa (aa = 아미노산) 내지 n-1 aa (n = 단편이 유래되는 종양 마커의 길이)일 수 있다. 전형적으로, 길이는 10 aa 보다 더 길다.

본 발명에 따라서 사용될 항체는 선행 기술 방법에 따라서 생성될 수 있다. 통상의 기술자는 특이적 모노클로날 항체를 생성하는 방법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 이를 위하여, 항원, 즉 본 발명의 경우에는 효소 바이오마커를 항체 생성에 사용한다. 원칙적으로, 쾰러(Koehler)와 밀슈타인(Milstein)에 의해 최초로 보고된 상기 방법을 사용할 수 있지만, 이들 방법의 변형 및 추가의 개발 또한 통상의 기술자에 의해 공지되어 있다. 이러한 유형의 생성에 의해 특이적 항체를 수득할 수 있는데, 특이성은 선택에 의해 결정될 수 있다. 그 선택은 효소 바이오마커와는 결합하지만, 기타 대변 단백질과는 결합하지 않는 특이적 항체에 대해 수행된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 면역검정의 원리를 이용함으로써 검출을 수행한다. 본 발명에 따라서 바람직한 면역검정은 a) 샘플이 적어도 2개의 상이한 수용체 (그중 제1 수용체 R1은 고체상에 존재하고 종양 마커와 결합할 수 있으며, 제2 수용체 R2는 액체상에 존재하고 동일한 효소 바이오마커와 결합할 수 있으며, 수용체 R2는 표지를 수반하거나 또는 검출가능한 분자와의 결합을 매개함)와 접촉되게 하는 방식, b) 고체상이 액체상으로부터 분리되는 방식, 및 c) 상기 상들 중 하나, 바람직하게는 고체상 중의 검출가능한 분자 또는 표지를 결정하고, 이에 따라 수용체 R1 또는 R2 중의 적어도 하나로서 항체를 사용함으로써 (이러한 항체는 종양 M2-PK와는 특이적으로 결합할 수 있지만, 특히 기타 대변 단백질과는 그렇지 않음) 샘플에 존재하는 효소 바이오마커의 양을 정량화하는 방식으로 수행한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 종양 M2-PK에 대한 항체는 수용체 R1로서 사용되고, 또한 수용체 R2로서 사용된다. 종양 M2-PK는 본 발명에 따라서 상기 효소 바이오마커의 이량체 형태 (사량체 형태와는 상이함)로서 이해된다.

헤모글로빈의 결정은 상기 종양 M2-PK에 대해 언급된 시험 원리에 따라서 이루어진다.

본 발명에 따르는 방법을 면역검정의 포맷, 특히 ELISA의 포맷으로 수행하는 것 이외에도, 기타 검출 기술, 예컨대 결정 발진기 기술, 마이크로-규모 기술, 측방 유동 기술, 촛대 기술, TRACE 기술, 또는 전기화학발광 기술 뿐만 아니라 단백질 칩을 이용하는 것과 같은 액체상 또는 고체상 또는 어레이 기술 중의 다중화 기술 및 마이크로- 또는 나노-입자를 이용한 응집 (비탁측정법에 의해 측정됨)을 사용할 수도 있다. 이들 기술은 통상의 기술자에게 친숙하므로, 본원에서는 상세히 기재할 필요가 없다.

바람직하게는, 측방 유동 기술을 사용한다. 따라서, 본 발명의 주제는 효소 바이오마커 복합물을 결정함으로써, 상기 언급된 방법을 수행하기 위해 특히 제공되는, 인간 또는 동물 중의 위장관 내에서의 악성 종양 현상을 검출하고/하거나 의심 진단하기 위한 복합 신속 시험인데, 이러한 복합 신속 시험은 종양 M2-PK와 헤모글로빈 또는 헤모글로빈/합토글로빈을 동기적으로 결정한다.

바람직하게는, 복합 신속 시험은 기타 어떠한 대변 단백질과도 교차반응하지 않는 종양 M2-PK에 대한 항체; 및 헤모글로빈/합토글로빈을 특이적으로 검출하고 기타 어떠한 대변 단백질과도 교차반응하지 않는 항체를 함유한다. 적용가능한 경우, 상기 시험 키트는 임의로, 면역검정을 수행하는 데 필요하거나 또는 각각 제공된 시험 과정을 수행하는 데 필요한 기타 시약을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 고체상과 결합되고 상기 효소 바이오마커 중 적어도 하나에 대해 특이적인 항체를 함유한다.

본 발명의 또 다른 주제는 상기 효소 바이오마커 중 하나와 특이적으로 결합하고 바람직하게는 기타 어떠한 대변 단백질과도 교차반응하지 않는 항체, 특히 모노클로날 항체이다. 항체는, 예를 들어 쾰러와 밀슈타인의 방법에 의해 생성될 수 있다 (문헌 [Nature 256, 495-497 (1995)] 참조)

더욱이, 본 발명은 상기 언급된 항체 대신에, 상기 효소 바이오마커 중 하나와 특이적으로 결합하고 임의로는 기타 어떠한 대변 단백질과도 교차반응하지 않는 압타머(aptamer) 또는 스피에겔머(spiegelmer) 및 이들의 용도에 관한 것이다 (기타 모든 항체 관련 설명이 유사한 방식으로 적용된다). 압타머는 특이적 결합 특성을 지닌 올리고뉴클레오티드 서열이다. 이러한 압타머는, 예를 들어 문헌 [US 5,270,163] 또는 [Sumedha, Clin. Chem. 45 (1999), 1628-1650]에 기재된 방법에 따라서 생성되거나 확인될 수 있다. 스피에겔머는 L-올리고뉴클레오티드로부터 형성되는 압타머이다.

본 발명에 따르는 시험의 평가는 자동화 분류, 군락 분석, 패턴 인식을 이용함으로써 수행된다. 특히, "최대 가능성 방법" 또는 확률 분포를 통한 군락 멤버십의 방법을 적용한다.

실험실 직원 및 담당 의사의 경우에는, 그 결과가 다중 색상 삽화 (위험 영향 도식), 결정 매트릭스, 및 결정을 위한 기타 알고리즘의 형태로 제시되는 것이 바람직하다.

예를 들어, 측정된 파라미터 (헤모글로빈 및 M2-PK)는 다음과 같이 배정될 수 있다:

어떠한 경우에도, 본 발명에 따르는 키트는 대변용 샘플링 장치를 함유한다. 이를 위하여, 편리한 모든 장치, 예를 들어 DE 102 05 709 A1에 기재된 장치를 사용할 수 있다.

최적의 작동 원리를 달성하기 위한 특별한 도전 과제는 최적의 적극적인 페어링의 선택이었다. 이들 적극적인 페어링은 다음 실시예, 목록, 청구범위, 및 특히 도 1 내지 6에 열거되어 있다.

예를 들어, 도 2, 3, 4 및 6은 상이한 함수를 도시하고 있다. 본 발명에 대한 특별한 도전 과제는 수많은 상이한 함수 하에 (조합의 가능성), 최적의 작동 원리를 달성하기 위한 최적의 적극적인 페어링을 선택하는 것이었다 (파라미터의 선택).

본 발명의 특별한 실시양태에서는, 평가를 자동으로 수행한다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 시험 키트의 사진을 찍을 수 있고, 그 시험 결과를 평가 프로그램에 의해 적당한 수준의 위험으로 배정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 시험 키트의 사진을 찍기 위한 장치, 및 시험 결과를 바람직하게는 다중 색상의 디스플레이의 형태 (위험 영향 도식)로 표현하기 위한 평가 프로그램을 포함한다. 그 배정의 예가 도 10에 도시되어 있다.

실시예 .

본 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 설명된다.

실시예 1: 시험 키트 .

면역검정에 기초한 시험 키트는 2개의 샘플링 및 제조 장치 및 시험 카세트로 이루어진다.

두 샘플링 장치는 요구되는 양의 대변 (4 내지 30 mg, 바람직하게는 25 mg)을 수용할 수 있는 막대를 함유한다. 샘플링 장치는 추가로, 완충제 용액으로 채워진, 각각 샘플을 수용하기 위한 하나의 튜브를 포함한다.

종양 M2-PK 시험을 위한 수성 완충제 용액은 다음 성분을 갖는다:

완충제 1 = 10 - 70 mM 포스페이트 완충제 (pH 6.7 내지 7.6) 또는 완충제 2 = 10 - 70 mM HEPES 완충제 (pH 7.6 내지 8.2) 또는 완충제 3 = 10 - 70 mM 트리에탄올아민 (pH 7.3 내지 7.7), 이들의 바람직한 혼합물 부피 각각 1:1:1.

세제 1 = CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필) 디-메틸암모니오]-1-프로판 술포네이트, 10 mM - 50 mM [시그마(Sigma)], 세제 2 = 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 0.01% - 0.1%) [예를 들어, 바이오크롬(Biochrom)으로부터 입수가능함], 세제 3 = 라우릴디메틸아민 옥시드 (10 mM - 50 mM) (예를 들어, 바이오크롬으로부터 입수가능함) 또는 이들의 혼합물.

헤모글로빈 시험을 위한 수성 완충제 용액은 다음 성분을 함유한다:

완충제 1 = 10 - 70 mM 포스페이트 완충제 (pH 6.7 내지 7.6) 또는 완충제 2 = 10 - 70 mM HEPES 완충제 (pH 7.6 내지 8.2) 또는 완충제 3 = 10 - 70 mM 트리에탄올아민 (pH 7.3 내지 7.7) 또는 이들의 혼합물.

사용된 항체.

특이적으로 결합할 수 있는 항체인, 측정을 위해 요구되는 4개 항체 (각각 "액체상"의 항체 및 "고체상"의 하나의 항체)는 폴리클로날 항체일 수 있지만, 모노클로날 항체가 바람직하다.

폴리클로날 및 모노클로날 항체는 동물을 각각의 항원으로 면역시키는 전통적인 방법에 의해, 또는 바람직하게는 쾰러와 밀슈타인의 하이브리도마 방법을 이용함으로써 선행 기술에 따라서 수득가능하다.

인간 피루베이트 키나제와 결합하고 또한 피루베이트 키나제의 동종효소와 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 선행 기술에 속한다. 이량체 형태, 즉 피루베이트 키나제의 종양 형태와 결합하는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체가 바람직하다.

단백질의 4차 구조는 이러한 단백질의 서브유닛의 공간 배열에 관한 것이다.

"정상적인 M2-PK"는 사량체 구조를 갖는다 (4차 형태). 건강한 사람의 M2-PK는 "종양 M2-PK"와 상이하다. "종양 M2-PK"는 이량체 구조를 갖는다.

이들 특수 형태 (종양 M2-PK 이량체 또는 M2-PK 사량체)에 대한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 통상적인 면역화 방법 뿐만 아니라 하이브리도마 방법 (쾰러-밀슈타인 기술)에 의해 수득가능하다.

따라서, 종양 형태의 M2-PK를 세정한 다음, 이를 항원으로서 사용할 수 있다. 또 다른 옵션은 또한 종양 형태로 유전적으로 발현된 M2-PK를 구매하고, 이를 면역화에 사용하는 것이다. 또 다른 방식은 특이적 단편, 즉 아미노산 서열을 합성하고, 이를 면역화에 사용하는 것이다.

종양 M2-PK 항체.

니트로셀룰로스 막 상으로 분무하는 데 바람직한 것은 모노클로날 마우스 항체이다 (클론 PATAM3AT, IgG1). 이 클론은 골수종 세포를 마우스의 B 림프구로 혼성화시킴으로써 생성시켰다. 아미노산 1-531을 수반한 이. 콜라이(E. coli)로부터의 재조합 인간 종양 M2-PK를 면역원으로서 사용하였다. 항체는 특히, 프로스펙(ProSpec; 미국 이스트 브런스윅) 회사로부터 입수가능하다. 임의로, 모노클로날 마우스 항체 (클론 AT1 E3, IgG1)를 사용할 수 있다. 재조합 인간 종양 M2-PK를 면역원으로서 사용하였다. 이 항체는 특히, 노부스 바이오로직칼스(Novus Biologicals; 미국 리틀턴) 회사로부터 입수가능하다. 금과 커플링하는 데 특히 바람직한 것은 모노클로날 마우스 항체 (클론 1 E3, IgG1)이다. 아미노산 서열 47-574를 수반하는 재조합 인간 종양 M2-PK를 면역원으로서 사용하였다. 이 항체는 특히 노부스 바이오로직칼스 (미국) 회사로부터 입수가능하다. 임의로, 양에서 생성된 폴리클로날 항체 (Ig 분획) [란독스(Randox; 영국) 회사로부터 입수가능함]를 사용할 수 있다. 이. 콜라이로부터의 재조합 인간 종양 M2-PK가 면역원으로서 제공되었다.

헤모글로빈 항체.

니트로셀룰로스 막 상으로 분무하는 데 바람직한 것은 모노클로날 마우스 항체이다 (클론 M1202100, IgG1). 이 항체는 인간 헤모글로빈으로 면역화시킴으로써 생성시켰다. 이 항체는 특히, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific; 미국 록포드) 회사로부터 입수가능하다. 또 다른 한편으론, 인간 헤모글로빈에 대한 모노클로날 항체를 사용할 수 있다. 클론 7202 SPR-5로부터의 상기 항체는 1x10^-10 l/mol의 친화도 상수와 5.8의 등전점을 갖는다. 이는 메딕스(Medix; 핀란드) 회사로부터 구입할 수 있다. 금과 커플링된 헤모글로빈 항체의 경우에는, 모노클로날 마우스 항체 (클론 HB11-2312)를 사용하였다. 정제된 인간 헤모글로빈을 면역원으로서 사용하였다. 이 항체는 써모 사이언티픽 (미국 록포드) 회사로부터 구입할 수 있다.

항체를 선택하는 데 가장 중요한 조건 중 하나는 이것이 대변의 기타 성분들, 특히 기타 피루베이트 키나제 동종효소 (예를 들어, M1-PK, M2-PK (사량체 형태), L-PK, R-PK)와 교차반응하지 않는다는 것이다.

상기 헤모글로빈 항체는 바람직한 형태 니트로셀룰로스의 막 (고체상)과 결합하는 데 특히 적합하다. 상기 언급된 항체는 돼지, 말, 양 및 소로부터의 헤모글로빈과 교차반응하지 않는다. 상기 헤모글로빈 항체는 바람직하게, 라텍스 또는 나노입자 - 바람직하게 금 콜로이드 - (액체상)과 결합하는 데 적합하다. 이들은 양, 말, 소 또는 돼지로부터의 헤모글로빈과 교차반응하지 않는다. 상기 항체는 헤모글로빈 A0 및 A1과 동등하게 잘 결합되고, A2와는 부분적으로 더 낮은 결합 상수로 결합되며, AS와는 부분적으로 극히 불량한 결합 상수로 결합된다. 고체상 항체는 바람직하게 1:1 w/w로 혼합된다. 액체상 항체는 바람직하게 1:1 w/w로 혼합된다.

세제 1 (CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필) 디-메틸암모니오]-1-프로판술포네이트, 10 mM (시그마)), 세제 2 = 소듐 도데실 술페이트 (SDS) (0.01% - 0.1%) (예를 들어, 바이오크롬으부터 입수가능함), 세제 3 = 라우릴디메틸아민 옥시드 (10 mM - 50 mM) (예를 들어, 바이오크롬으로부터 입수가능함) 또는 이들의 혼합물.

헤모글로빈 시험을 수행하기 위한 샘플링 장치는 상기 언급된 완충제 중 하나를 함유한다 (1.5 - 2.5 ml). 시험하고자 하는 사람은 투여 팁을 대변으로 이동시키고, 그 대변 샘플을 상응하는 완충제로 채워진 빈 튜브 내로 옮긴다.

의사가 시험하고자 하는 사람에게 넘겨준 종양 M2-PK 시험용 샘플링 장치는 어떠한 완충제도 포함하고 있지 않다. 환자는 투여 팁을 대변 내로 이동시키고 그 대변 샘플을 빈 튜브 내로 옮긴다.

본 발명에 따르는 시험 키트는 추가로, 시험 카세트를 포함하는데, 여기서 선행 기술에 비해 개선되는 2가지 면역검정이 측방 유동 기술에 의해 수행된다. 이를 위하여, 상기 시험 카세트는 대변 샘플을 적용하기 위한 2개의 바람직하게 원형 홈(recess)과 시험 결과를 판독하기 위한 2개의 바람직하게 길게 늘린 홈을 함유한다.

시험 카세트는 그의 내부에, 고정상으로서 135 sec/4 cm의 바람직한 모세관 유속을 나타내는 니트로셀룰로스를 함유한다.

본 발명에 따르는 시험 키트를 개발하기 위한 연구 동안, 니트로셀룰로스가 결과의 확산에 강력한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 이러한 확산은 신선하게 제조된 니트로셀룰로스에서 특히 커지지만, 3개월 내지 6개월 저장한 후에는 (숙성) 더 적어진다. 본 발명에 사용된 니트로셀룰로스는 추가의 시험을 수행하기 전에 3개월 내지 6개월 동안 저장하여 왔다. 이러한 "숙성된" 니트로셀룰로스를 사용하면, 결과의 확산이 상당히 감소될 수 있다. 특히, "신선한" 니트로셀룰로스에 대해서 보다는 상기 생성된 시험 키트의 상이한 배치들 간에 상당히 더 낮은 변동이 발생될 수 있었다.

항체는 콜로이드, 바람직하게는 금 콜로이드 또는 라텍스 콜로이드, 바람직하게는 직경이 20 나노미터인 금 콜로이드와 커플링시킨다.

고정상 = 니트로셀룰로스 (바람직하게는 90 sec/4 cm의 모세관 유속을 나타냄)는 헤모글로빈 항체 1, 헤모글로빈 항체 2를, 바람직하게는 상기 명시된 바와 같은 혼합 비로 함유한다.

고정상 = 니트로셀룰로스 (바람직하게는 135 sec/4 cm의 모세관 유속을 나타냄)는 추가로, 종양 M2-PK 항체 (클론 P1F3으로부터 유래됨), 종양 M2-PK 항체 (클론 P5A1로부터 유래됨), 바람직하게는 클론 P1F3의 항체와 P5A1의 항체의 혼합물을 다음 혼합비 부피 1:3.5 w/w로 포함한다.

클론 P1F3 및 클론 P5A1로부터의 항체가 막, 바람직하게는 니트로셀룰로스와의 결합을 위한 포획 항체 (고정상)로서 특히 유용하다. 클론 P1A6으로부터의 종양 M2-PK 항체는 금 콜로이드 또는 라텍스 콜로이드, 바람직하게는 직경이 80 나노미터인 금 콜로이드에 결합하는 데 바람직하다.

시험 키트 생성, 특히 2개의 시험 스트립의 생성을 위한 장치 및 프로토콜:

밀봉 장치 - 필름 밀봉 장치 [콥(Kopp) 회사], 패키징 시스템 [라이첸바흐(Reichenbach) 회사].

밀봉 온도 60℃, 유형 MSC 440 와트.

바이오도트(Biodot) 장치.

2. 바이오도트 장치.

제타 코포레이션(Zeta Corporation) 회사의 커터 (www.zetacorporation.com), 장치 유형 GC1800-081101.

장치는 CE 마크이다.

적층된 M2-PK 카드의 니트로셀룰로스 막 번호를 적층시키고 커팅하기 위한 프로토콜.

키네마틱(Kinematic) 회사의 장치 설정 및 작동 라미네이터 매트릭스 2210.

니트로셀룰로스 막 장치 설정, 작동 라미네이터 매트릭스 2210을 적층시키고 커팅하기 위한 프로토콜.

이행 장치 설정 및 작동.

제타 코포레이션 회사의 장치 설정 및 작동 커터 GSI-800.

카세트의 생산 및 쉐보 M2-PK 신속 키트 설치.

시험 카세트의 생산.

부분적으로 가공 처리된 생산물의 냉장고에의 저장.

품질 관리.

생산이 이루어지는 지역의 온도와 습도를 기록한다.

공기를 조절하고 습도와 온도를 일정하게 유지하기 위한 공기 조절기 FUJITSU DG 인버터. 공기 온도와 습도를 준수하는 것이 시험 막의 품질 보장을 위해 특히 중요하다.

작동 방식을 선택하고/자동 온도 조절장치 1을 설정하고, 팬 속도를 설정한다.

복합 카세트에서 2개의 시험 스트립을 최적으로 조화시키기 위한 결정적인 성공 요인은 특히 다음과 같다:

a) Hb 결정을 위한 하이델베르거(Heidelberger) 곡선,

b) M2-PK 결정을 위한 하이델베르거 곡선.

놀랍게도, 6.7% 소 담낭 [깨끗해진 자연 습윤제; 슈민케(Schmincke; 독일 에르크라트) 회사로부터 파트 넘버 50031로 입수가능함]을 최종 농도로서 M2-PK에 대한 추출 완충제와 혼합하는 경우에, 특히 재현가능한 우수한 면역크로마토그래피 결과가 수득되는 것으로 밝혀졌다.

놀랍게도, 2.8% 소 담낭을 최종 농도로서 헤모글로빈에 대한 추출 완충제와 혼합하는 경우에, 특히 재현가능한 우수한 면역크로마토그래피 결과가 수득되는 것으로 밝혀졌다.

복합 카세트 중의 두 분석물의 기술적 동기 결정.

크로마토그래피 출발 시간의 "시간 변화"를 최적화하기 위하여, 사용자는 M2-PK 대변 샘플 추출물을 카세트의 좌측 샘플 창에 뚝뚝 떨어뜨림으로써 (그 다음, 타이머를 5분으로 설정함) 크로마토그래피를 시작한다. 이러한 M2-PK 대변 추출물을 떨어뜨린지 1분 후에 Hb 대변 샘플 추출물을 카세트의 우측 샘플 창에 뚝뚝 떨어뜨리는데, 즉 두 크로마토그래피는 변화된 시간에 시작된다. 그러나, 두 시험의 결과는 5분 정지 시간이 소요된 후에 판독한다.

크로마토그래피, 특히 면역크로마토그래피에 의한 시험 방법은 그 이름이 의미하는 바와 같이 실질적으로 시간 뿐만 아니라 결합 친화도 (엑체상 및 고체상에서 항원에 대한 항체의 결합도 뿐만 아니라 니트로셀룰로스 막 내의 각종 동역학)에 좌우되는데, 즉 이들을 대상으로 각종 동역학이 실시된다.

나중에 판독되는 시험 결과는 효력이 없다! (이는 모두 복합 시험에 관한 설명 부분에 설명되어 있다). 시험 막의 니트로셀룰로스 시험 스트립의 시험 영역 내에 핑크빛을 띠는 적색 시험 라인이 형성되는 것이 생물물리학적으로 복잡한 응집 반응의 결과이다 (여기서는 각종 동역학 및 친화성이 특수한 역할을 하는데, 이는 또한 다음에 보다 상세히 기재될 하이델베르거 곡선을 참조할 수 있다).

본 발명에 따라서 분석물을 병렬식, 즉 기술적 의미에서 동기식으로 프로세싱하거나 결정한다.

1. "크로마토그래피" M2-PK를 시작한 다음, 크로마토그래피 Hb를 두 번째로 시작한다.

기술적 의미에서의 동기식 결정은 도전 과제인데, 이는 면역크로마토그래피에 의한 결정이 극히 복잡하기 때문이다.

본 발명에 따르는 다수의 목적을 달성하는 데 있어서 많은 파라미터가 특히 중요하다:

(많은 목적은 쉐보 바이오텍(ScheBo Biotech) AG에서 달성되었다).

이들 목적은 본 발명에 따라서, 예를 들어 특이적/본질적 적극적인 페어링을 확인함으로써 달성되었다:

1. 본 발명에 따르는 분석물인 각각의 물질 (단백질)에 대한 개개 항체의 결합 상수/친화도.

또 다른 결정적 요인은 또한, "건조된" 금의 조성 및 PAD 방출로부터 금의 "방출"인데, 즉 상응하는 분석물 (대변 샘플 추출물)을 함유하는 추출 완충제를 적가함으로써 상기 건조된 금 입자 (유리-섬유 매트릭스/건조 당 매트릭스 중)를 분해시키는 것이다.

두 분석물을 면역크로마토그래피에 의해 결정하기 위하여 이중 카세트를 함유하는 본 발명에 따르는 시험 키트의 제조.

이를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 소위 딥스틱(dipstick) 포맷으로 두 분석물의 면역크로마토그래피에 의한 결정을 최초로 시험하였다. 이러한 딥스틱 포맷은 훨씬 덜 복잡한데, 이는 이것이 접합체 방출 PAD를 함유하지 않기 때문이다.

다음 과제 및 도전 과제가 본 발명에 따라서 해결되어야만 한다:

본 발명에 따르는 기술적 해결책의 거의 어느 것도 "분명하지 않다".

일반적인 언급:

시험 스트립을 제조하기 위해서는, 습도를 18℃ 내지 25℃에서 40 내지 60%로 유지시키는 것이 특히 중요하다.

쉐보-바이오텍 AG의 R&D 부서에서 수행된 일련의 시험에 의해, 20℃에서 35%의 최적의 습도가 본 발명의 방식으로 결정되었다.

과제/도전 과제:

1a. 막 중의 액체를 서서히 유동시키거나 또는 심지어 크로마토그래피 액체 유동을 정지/중단시킨다.

1b. 액체 중의 샘플을 막 스트립의 중앙 (막의 유동 방향 중)에서 정지시킨다.

선택된 막이 본 적용을 위한 유속에 있어 너무 느린가?

막이 소수성으로 전환되었는가?

올바른 심지를 사용하였는가?

니트로셀룰로스 막은 "계면활성제"와 "습윤성 시약"을 함유하고 있다.

시험 막은 고 "배경 염색"을 갖고 있다 (이러한 배경 염색은 본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결되었다).

특이적인 차단 시약이 사용되어야 하는 지를 명료하게 할 필요가 있다.

최적의 완벽한 방식으로 금을 니트로셀룰로스 막 상으로 방출시키는 것을 설정한다 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

액체 앞면은 일직선이 아니다 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

시험 라인은 너무 두껍거나 "어렴풋하고", "흐릿하다" (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

시험 라인에서 훨씬 더 약한 신호가 재현가능한 수준으로 관찰되고/발견된다 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

시험 라인은 가성 양성/가성 음성 결과를 보여준다 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

본 발명에 따르는 시험 키트는 금속 콜로이드, 바람직하게는 금 콜로이드를 함유한다. 구체적인 실시양태는, 예를 들어 라텍스 입자, 및 또한 나노입자이다. 라텍스 입자는 염색시킬 수 있고, 또한 이에 형광성 염료를 제공할 수 있으며, 상이한 크기를 갖는다 (즉, 마이크로미터 범위의 크기 뿐만 아니라 나노미터 범위의 크기를 갖는다).

자기 입자 (특수 판독 장치 (판독기)를 이용한 초기 정량화) 또한 가능하다.

주요 기술적 도전 과제는 구체적으로, 품질 보증에 관한 것이다. 우수한 제조 프로토콜의 창출 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

목적/과제: 최적의 적은 검정 내에서의 변동과 검정 간의 변동을 달성하는 것. 특히 중요한 것은 매우 우수한 로트-대-로트 변동 (즉, 가능한 가장 적은 로트-대-로트 변동)이다.

이러한 적은 로트-대-로트 변동은 본 발명에 따르는 생산 공정시 품질 보증의 맥락에서 보장되어야 한다 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

동일한 로트 수, 동일한 만기 날짜를 이용한 100,000개 초과의 다수의 시험 키트의 생산 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

도전 과제: 극도로 우수한 품질을 보장해야 함 - 소비자에게 이득임 (본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결됨).

응집 - 정의.

의료 분야에서, 응집은 세포 병원체 등의 부착 또는 군집을 나타낸다.

응집 반응은 정량적 설명을 하기 위해 실험실 진단학에서 사용되고 있다. 응집은 비탁측정법에 의한 결정 방법에 의해 측정된다.

적색 시험 라인이 응집 반응에 의한 복잡한 동역학에서 형성된다. 시험 스트립의 니트로셀룰로스의 3차원적 구조에서 응집이 발생한다. 이러한 "응집"은 육안으로 핑크색 라인으로서 보인다.

이러한 핑크빛을 띠는 적색 라인은 항원/항체 반응의 물질 검출에 따른 결과이다. 이러한 항원/항체 반응은 각종 효과의 대상이 된다. 이들 효과 중 하나는 소위 후크(hook) 효과 (고 용량 후크 효과로서 지칭되기도 함)인데, 이는 매우 고 농도의 샘플 용액에 존재하는 분석물의 가성적으로 낮은 결정에서 일어난다 (즉, 특별한 경우에 고 농도의 분석물은 가성 음성 측정 신호를 가장할 수도 있다).

일단 분석물 농도가 너무 높으면, 항체 결합 부위는 분석물에 의해 점유될 수 있고 부가의 분석물 분자가 더 이상 결합 곡선에서 확인되지 않는다. 가성적으로 낮은 판독치가 될 것이다.

기술적 목적은 이러한 후크 효과를 피하기 위한 것이었다.

샘플의 각종 희석물을 병렬식으로 측정함으로써, 고 용량 효과의 존재를 인지할 수 있고, 이에 따라 측정을 교정할 수 있다 (기술적 문제점의 대상은 본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결되었다).

청구범위에 기재된 본 발명에 따르는 시험 키트는 선행 기술의 실시양태와 달리, 고 용량 후크 효과를 갖고 있지 않다. 이것은 컷-오프치를 200배 보다 더 많이 초과하는 종양 M2-PK 농도 (160,000 ng/ml 이하)를 갖는 샘플을 이용한 시험에 의해 설득력있는 방식으로 나타낼 수 있었다.

일반적으로, 면역생물분석적 검출 방법, 특히 면역크로마토그래피 방법은 다음과 같은 실패를 겪는다:

1. 교차반응성 및 비특이적 결합에 의해 야기된 실패.

2. 매트릭스 효과에 의한 실패.

3. "항-동물 항체"에 의한 실패.

4. 샘플의 내인성 성분에 의한 실패.

5. 이종친화성 및 기타 가교결합성 간섭에 의한 실패.

(이들 실패 1 내지 5는 본 발명에 따르는 분명하지 않은 해결책에 의해 해결될 수 있었다).

특히 관심있는 것은 특수 로우크로스(LowCross) 완충제 (쉐보 바이오텍 AG에 의해 생산됨)를 사용하는 것이었다. 이는 각종 세제, 단백질, 폴리클로날 항체, 표면 활성 물질 뿐만 아니라 표면 장력을 변화시키는 물질을 포함한다.

이 모두는 상기 언급된 본 발명에 따르는 시험 키트의 시약, 물질 등과 함께, 기술적 의미에서의 적극적인 페어링의 최적 조화를 초래한다. 이 모두는 복합 시험 카세트에서 두 분석물을 동기적으로 결정할 수 있게 해준다.

놀랍게도, 시험 스트립 상에서 두 분석물을 통상적인 동기식으로 (기술적 의미에서) 결정하는 해결책의 경우에는, 항체 액체와 콜로이드성 금을 정확하게 분배할 때 습도 제어와 액체의 탈기화가 결정적으로 중요하였다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명에 따르는 시험 키트를 제공하기 위해서는 창조적일 뿐만 아니라 체계적인 작업이 필요하였다.

적극적인 페어링과 그들의 통상적인 최적 조화를 검출하기 위해서는 일련의 광범위한 시험이 필요하였다.

이는 강건하고 재현가능하며 신뢰할만한 시험을 신속 시험 형태 (플랫폼 및/또는 현장 현시 검사)로 개발하기 위한 기본 요구 사항이다.

입수가능한 재료의 샘플 (대변 발단자), 시약 및 항체의 매우 높은 가변성을 이용하여, 두 쌍은 각각 단계적으로 재현가능한 결과를 수득하기 위해 서로 협조해야만 한다.

이러한 복잡한 플랫폼을 설계하고 개발하는 경우, 예상하지 못한 방식으로 시험 결과에 영향을 미칠 수 있는 수많은 물리적 및 화학적 현상을 뜻밖에 만나게 된다.

시험 키트의 또 다른 실시양태는 "모든" 최적의 본질적인 적극적 페어링을 시험한 후, 본 발명에 따라서 바람직한 분석물 (ELISA와 같은 기타 면역화학적 시험 원리에 의한 바이오마커)의 정성적, 반-정량적 및 정량적 결정, 즉 응집을 사용하는 것인데, 바람직하게는 액체 상에서 응집을 개시하기 위한 나노입자를 사용하는 것이다.

최신 기술에 따르는 혼탁측정법, 비탁측정법에 의한 측정 기술은 측정 데이터의 생성을 허용해준다. 이들 측정 데이터는 적당한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 처리할 수 있다. "내부" 보정 곡선을 통하여 (또한, 배치에 따라 좌우됨), 예를 들어 본 발명에 따르는 두 분석물을 결정하는 것이 가능하다. 각종 그래프에 의한 표시, 예컨대 log-log, log-십진법 표시가 또한 가능하다.

특별한 실시양태는 통계학적 평가, 예를 들어 퍼지 논리 분석, 분류 및 패턴 및 이미지 인식, 탐색적 데이터 분석, 데이터 시각화, 견고한 컴퓨터-지원 통계, 초기 데이터 분석 (IDA)의 분야로부터의 알고리즘, 및 진화되고 있는 시스템 (ES), 데이터 마이닝 및 탐색적 데이터 분석, 퍼지 시스템, 신경세포 네트워크, 진화 알고리즘을 허용한다. 바람직한 것은 닥터 프랭크 클라본 교수(Prof. Dr. Frank Klawonn)의 알고리즘이다. 클라본 교수는 데이터 신뢰성을 개선시키는 우수한 평가 전략을 개발하였다. 클라본 교수는 컴퓨터 응용 과학 연구소(Institut fuer angewandte Informatik)의 임원이다.

또 다른 실시양태는 WLAN에 대한 인터페이스를 제공한다.

환자의 시간적 진행도 가능하다.

개별 환자 데이터 시리즈도 평가하는 것이 가능하다.

두 분석물을 측정하기 위한 기타 장치, 가전 제품 등을 생각할 수 있다.

기타 실시양태 플랫폼 "ELISA"를 생각할 수 있다.

각종 어레이: 액체 [루미넥스(Luminex)] 또는 고체상 (어레이)이 가능하다. 모든 면역화학적 검출 방법을 생각할 수 있다.

응집.

놀랍게도, 비말 크기 (나노리터 범위의 부피)와 이들 비말의 거리가 결정적이란 사실이 밝혀졌다.

비말 크기와 이들 비말 간의 거리가 특히 중요하다. 따라서, "라인"이긴 하지만, 개별 비말들이 분산되지 않는다. 니트로셀룰로스 막의 모세관 힘은 비말을 순식간에 흡수하여 라인이 형성되도록 한다. 액체에 존재하는 항체는 니트로셀룰로스의 3차원적 구조로 분배된다.

놀랍게도, 극히 정확한 라인을 달성하기 위해서는, "건조 수준"이 결정적이란 사실이 밝혀졌다.

놀랍게도, 소수성이 매우 매우 중요하다는 사실 또한 밝혀졌다. 사용될 니트로셀룰로스 막이 반드시 건조되게 하기 위해서는, 한쪽 면 위를 코팅시키고 어떠한 습기도 통과되지 못하게 한 알루미늄 필름으로 상기 막을 미리 밀봉시키고, 개봉하며, 항체를 공급한 다음, 즉시 건조제가 부가된 알루미늄 필름으로 재밀봉시켰다. 놀랍게도, 이들 생산 단계는 중요하였고, 6분 주기로 수행되었다.

놀랍게도, 막 전반에 걸쳐 반드시 일정하게 유동시키기 위하여, 시험 스트립을 적당한 순서로 구축하였다는 것은 주목할만한 일이었다.

시험 스트립의 반응 영역 (시험 결과 라인 영역)에서는, 상응하는 라인 (핑크빛을 띠는 적색 라인)이 형성된다.

색이 있는 시험 결과 라인 (양성 결과)은 항원/항체 반응의 결과이고, 결정된 "하이델베르거 곡선"은 항체 과량 및 항원 과량의 함수로서의 측정 신호를 보여준다. 그것은 "하이델베르거 곡선"에 따라서 등가 범위를 사용하기 위한 목적이다.

항원/항체 반응을 최적으로 사용하는 것, 즉 정지된 항체를 M2-PK 시험 스트립의 등가 영역 내의 액체 상에 존재하는 항체-커플링된 금 입자와 조화시키는 것이 시험 스트립 상의 M2-PK에 대한 최적의 신호를 제공한다.

항원/항체 반응을 최적으로 사용하는 것, 즉 정지된 항체를 Hb 시험 스트립의 등가 영역 내의 액체 상에 존재하는 항체-커플링된 금 입자와 조화시키는 것이 시험 스트립 상의 Hb에 대한 최적의 신호를 제공한다.

항원/항체 반응을 하나의 M2-PK 시험 스트립의 등가 영역 내와 Hb 시험 스트립의 등가 영역 내에서 최적으로 사용하는 것이 본 발명의 목적이었다.

본 발명의 목적은, 특히 항체의 적당한 선택, 세제의 적당한 선택 등에 의해서 뿐만 아니라 특히 두 니트로셀룰로스 시험 막 상에 항체 용액을 재현가능하게 고-정밀도로 제공함으로써 적극적인 페어링의 최적의 통상적인 조화에 의해 달성된다.

이로써 발단자로부터의 대변 샘플 중의 두 분석물을 동기적으로 검출할 수 있게 되었다. 이들 모든 적극적인 페어링과 기술적 해결책은 본 출원에 기재되어 있다. 이를 위하여, 종종 분명하지 않은 해결책이 필요하였는데, 운이 좋은 우연의 일치는 긍정적인 결과로 이어졌다.

헤모글로빈 시험 튜브와 M2-PK-튜브는 48시간 이내에 의사의 사무실에 제출해야만 한다. 대변 샘플이 있는 투여 팁을, 상기 언급된 완충제가 채워진 튜브 내로 옮긴다. M2-PK 시험용 튜브와 헤모글로빈 시험용 튜브 둘 다를 격렬하게 진탕시킨다.

준비된 대변 샘플 추출물을 서로 즉시 2개의 홈 위에 적용한다. 5 내지 10분 후, 표기된 라인의 도움으로, 측정된 바이오마커 중 하나 또는 둘 다가 양성인지를 판독한다.

위장관 내에서의 악성 현상의 신뢰할만한 결정에 대해 중요한 것은 소위 "컷-오프"의 선택이다. 컷-오프는 샘플 중의 분석물의 최소 농도를 표시하는데, 이는 양성 결과를 암시한다. 본 발명에 따르는 시험 키트 내에서의 헤모글로빈 시험의 컷-오프는 대변 1 그램당 헤모글로빈 18 내지 38 ㎍, 바람직하게는 대변 1 그램당 헤모글로빈 24 ㎍이다. 종양 M2-PK에 대한 컷-오프는 대변 추출물 1 ml당 3 내지 6 유닛, 바람직하게는 4±1 유닛/ml이다.

검출 한계치는 대변 추출물 1 ml당 헤모글로빈 150 ng이다.

예를 들어 도 10에 도시된 바와 같이, 시험 결과를 평가하고 위험 수준으로 배정하는 것은 수동으로, 반자동으로 또는 완전 자동으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 시험 카세트는 수동으로 판독 장치에 부하할 수 있는데, 이 장치에서 광전지 또는 카메라를 통하여 평가를 수행한 다음, 결과를 모니터 상에 디스플레이한다. 바람직하게는, 그 표현이 색상으로 이루어진다 (위험 영향 도식). 안전성의 이유로 인해 특히 바람직한 것은 또 다른 형태로 병렬식으로 표현한 것이다 (예를 들어, 위험 수준 1 내지 4, 또는 유사한 것).

물론, 예를 들어 전기화학적 수단에 의해서 또는 시험 키트의 광 기록 (스캐닝)에 의해 금 입자를 검출함으로써 완전 자동화 평가가 가능하도록 시험 장치를 설정할 수도 있다.

실시예 2:

본 발명에 따르는 복합 신속 시험 카세트는 M2-PK를 결정하기 위해 시중에 나와있는 기존의 측방 유동 시험 스트립은 함유하지 않지만, M2-PK (종양 M2-PK 플러스)를 결정하기 위한 본 발명에 따르는 신규의 개선된 측방 유동 시험 스트립, 예를 들어 사르토리우스(Sartorius)를 함유한다.

더욱이, 상기 복합 신속 시험 카세트는 헤모글로빈을 결정하기 위해 시중에 나와있는 기존의 측방 유동 시험 스트립은 함유하지 않지만, 헤모글로빈 (iFOB 플러스)을 결정하기 위한 본 발명에 따르는 신규의 개선된 측방 유동 시험 스트립, 예를 들어 사르토리우스를 함유한다.

본 발명은 특히, 복합 신속 시험 및 성분들 뿐만 아니라 면역크로마토그래피에 의한 검출 방법을 동기적으로 수행하는 데 필요한 모든 시약에 관한 것이다. 동기적으로는 동시에의 언어적 의미이긴 하지만, 복합 신속 시험 카세트에서 2가지 바이오마커 M2-PK와 헤모글로빈을 검출하기 위한 크로마토그래피 조건의 통상적인 최적 조화의 기술적 의미이기도 하다.

검출 시약:

각종 검출 시약이 사용될 수 있다: 라텍스 비드, 콜로이드성 금 입자, 콜로이드성 은 입자 등. 이들 입자의 가장 중요한 특성 중 하나는 그 집단이 일정한 구형 크기로 단분산되어야 한다는 것이다.

본 발명에 따라서 바람직한 것은 금 입자이다.

콜로이드성 금 입자의 생산은 원칙적으로 널리 공지되어 있다. 전형적으로, Au³⁺를 함유하는 용액은 신속한 교반 하에 화학적으로 환원되는데, 이에 따라 원자 금 입자가 침전되어 시간이 경과함에 따라 집합된다. 집합은 안정화제에 의해 방지될 수 있다. 올바른 첨가제를 선택함으로써, 형성된 콜로이드의 크기를 설정할 수 있다. Au^{3 +} 공급원으로서, H[AuCl₄]를 종종 사용한다. 시트르산나트륨 용액, 수소화붕소나트륨 또는 히드로퀴논을 환원제로서 사용할 수 있다. 안정화시키기 위하여, 종종 황 화합물 (예컨대 알칸티올)을 사용할 수 있다. 금 입자를 함유하는 용액은 각종 공급원으로부터 입수가능하다.

중합체 조성 및 단백질 결합.

측방 유동 시험을 생산하기 위하여, 니트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하-변형 나일론, 폴리에테르술폰을 사용한다.

중합체 표면 크기는 기공 크기, 기공률, 두께, 및 기타 구조적 특징에 좌우된다.

표면은 기공 크기에 따라 비-선형적으로 증가하지만, 두께에 따라 선형적으로 증가하고, 기공률에 따라 비-선형적으로 증가한다. 소정의 표면 영역에 대한 단백질 결합은 단백질의 밀도, 그의 구조, 및 그의 스토크스(Stokes) 반경 (유효 직경)에 좌우된다. 더욱이, 중합체에 대한 단백질의 결합은 pH 및 고정화 용액에 좌우된다.

본 발명에 따르는 복합 신속 시험에서는, 바람직하게는 셀룰로스가 소위 샘플 패드용으로 사용되고, 니트로셀룰로스가 시험 막용으로 사용되며, 셀룰로스가 흡수성 패드용으로 사용된다.

접합체/샘플 패드 = 22 mm (+/- 0.2 mm) x 5 mm (+/- 0.2 mm).

니트로셀룰로스 막 = 25 mm (+/- 0.2 mm) x 5 mm (+/- 0.2 mm).

흡수성 패드 = 16.5 mm (+/- 0.2 mm) x 5 mm (+/- 0.2 mm).

시험 막의 폭 = 4 mm (+/- 0.2 mm).

모세관 유속: 통상적으로는 1 - 6 cm/min이고; 본 발명에 따르면 3.74 cm/min이다.

검출 한계치.

4 유닛 M2-PK/ml의 특히 바람직한 컷-오프가 M2-PK 대변 시험 ELISA를 조사한 각종 연구에서 밝혀졌다. 본 발명에 따르는 크로마토그래피 조건, 예컨대 본 발명에 따르는 복합 신속 시험의 컷-오프 값은 M2-PK 대변 시험 ELISA의 앞서 결정된 컷-오프 값을 기준으로 하여 결정되었다.

니트로셀룰로스 막에 대한 모세관 유속.

분석 감수성은 모세관 유동에 따라 감소되는데, 즉 가장 느린 모세관 유동 시간을 나타내는 니트로셀룰로스는 가장 높은 분석 감수성을 초래한다. 모세관 유동 시간은 240 내지 75 sec/4 cm이다. 본 발명에 따르는 모세관 유속은 120 sec/ 4 cm이다.

본 발명에 따르는 성분 및 본 발명에 따르는 활성 성분의 목록.

추출/수행 완충제

본 발명에 따르는 시험 키트의 개발 동안의 시험에서 놀랍게도, 임상 감수성과 특이성 둘 다 뿐만 아니라 화학-분석적 감수성은 면역크로마토그래피 시험 원리 중의 수행 액체가 pH 5 내지 6, 바람직하게는 pH 5.7을 갖는 경우에 상당히 증가된다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 발견은 단백질의 특성과 관련하여 최신 기술에 따르면, 이들이 pH 5.7 하의 부분적으로 변성된 조건에 존재해야 하기 때문에 특히 놀라운 것이다. 따라서, 이러한 분야에서는 감수성, 특이성 뿐만 아니라 반응성의 개선을 달성시키는 것이 놀라운 일이다. 헤모글로빈을 결정하기 위하여 지금까지 시중에서 입수가능한 모든 면역크로마토그래피 시험 키트는 수행 완충제 중의 7 내지 7.5의 pH를 필연적으로 수반한다. 이에 대한 최종 과학적 설명은 아직까지 제시되지 않을 수 있다. 가능하게는, 이러한 설명에 얽매이는 것을 원하지 않지만, 상기 분석물의 에피토프가 각종 항체에 더 접근가능해지는 방식으로 부분 변성이 있다. pH 5 내지 6, 특히 5.7을 갖는 수행 액체를 이용하여 본 발명의 상기 실시양태를 수행하기 위해서는, 안정화제로서 0.1% 알부민을 추가로 함유하는 것이 유리한 상응하는 완충제, 즉 아세테이트 완충제 (pH 약 5.7)가 필요하다. 이러한 완충제 시스템은 통상의 기술자에게 친숙하고, 이 시점에서 더 심화할 필요가 없다.

도면의 설명

도 1.

측방 유동 신속 시험의 플라스틱 카세트 중의 시험 스트립의 도식도.

도 2.

"기포 점"과 기공 크기 간의 관계.

막의 "기포 점"은 습윤 막을 통해 공기를 강제하는 데 필요한 압력이다.

도 3.

측방 유동 신속 시험의 분석 감수성에 대한 모세관 유속의 효과.

예:

유속 = 1.00 cm/min → 유효 분석물 농도 = 1.00 x.

유속 = 1.25 cm/min → 유효 분석물 농도 = 0.65 x.

도 4.

막의 상이한 성능 특징에 대한 세제 또는 습윤제 농도의 효과.

도 5.

분배율의 함수로서 밴드폭의 계산.

막 충진 부피 = 10 ㎕/㎠.

시약 분배율 = 1 μ/cm.

밴드폭 = 시약 분배율/막 충진 부피 = 1 μ/cm/10 ㎕/㎠ = 0.1 cm.

도 6.

막의 유속과 면역크로마토그래피 시험의 함수 간의 전형적인 관계.

감수성 = 분석 감수성 = 검출량 (㎍) = 질량.

도 7 - 9.

도 7 내지 9는 본 발명에 따르는 시험 키트를 예시적 방식으로 도시한 것이다. 도 7에서는 샘플링 장치를 볼 수 있다. 도 9는 실제적 시험 카세트를 도시한 것이다.

도 10.

도 10은 각종 측정 결과를 위험 수준으로 배정한 예를 도시한 것이다. 판독의 용이성을 위해, 그 결과가 유리하게는 색이 있는 방식으로 도시되어 있다. 예를 들어, 색맹인에 의한 가성 판독을 피하기 위하여, 부가의 식별 특색을 이용할 수 있다 (예를 들어, 상이한 형태, 숫자 및/또는 문자).

본 발명의 목적

본 발명의 목적은 따라서 다음과 같다:

1. 도구 = 발견의 진성 매트릭스에서 진단 및 배정을 위한 분급기: 진성 및 가성 분류. 이는 예/아니오 질문이기 때문에, 시험이 양성인지 (비정상적인 것을 의미함) 아니면 음성인지 (정상적인 것을 의미함)를 말할 수도 있다. 단지 하나의 바이오마커를 이용한 시험이 양성인 경우, 이러한 양성 진단에 대한 추가의 평가는 결장경검사에 의해 권고된다.

2. 특정의 특색 (M2-PK/헤모글로빈의 결정)에 기초한, 분류하기 위한 도구.

3. 결정하기 위한 도구는 추가의 진단: 예/아니오를 위해 수행될 결장경검사여야 한다.

4. 개선된 초기 진단에 의한 의료 지침을 용이하게 하기 위한 도구 (상당한 부가 혜택).

5. 조치, 예를 들어 기타 진단 절차, 예를 들어 결장경검사 등의 적용, 또는 치료적 조치, 예를 들어 수술, 화학 요법 등에 대한 의학적 결정을 용이하게 하기 위한 도구.

6. 발단자의 대변 샘플에 기초하여 보고되는, 예측의 정확도를 개선시키기 위한 도구.

7. 결장암을 검출하기 위하여 헤모글로빈과 M2-PK에 대한 높은 전반적 감수성 및 전반적 특이성을 지닌 시험 키트. 이 시험 키트는 결장경검사를 통한 결장암 스크리닝의 일부로서 "이중 예비-필터"로서 사용된다.

8. 생산 배치 내에서 뿐만 아니라 배치들 간의 시험 결과의 가장 좋은 비교를 허용하는 더 낮은 "로트-대-로트" 편차를 수반한 시험 키트.

9. 치료적 성공을 예측하기 위한 도구.

10. 치료 모니터링을 개선하기 위한 도구.

11. 시험 결과를 시각화하기 위한 도구 (위험 영향 도식).

12. 본 발명에 따르는 시험 키트는 예측되는 문제점을 예방하기 위해 사용된다:

1. 바람직하지 못한 발생이 우연히 일어나지 못하게 한다는 의미에서의 예방 (피하다, 방지하다, 예방하다).

a. 질환, 발병기전, 및 질환 심각성 (중증도)의 예방.

b. 특정 의료 절차, 예를 들어 불필요하고 위험하며 비용이 많이 드는 조치 (수술, 화학 요법, 부작용)의 예방.

본 발명에 따르는 시험 키트는 진단 결장경검사와 비교해서 최적의 손상/이득/위험 대가의 맥락에서 생각해야 한다. 뿐만 아니라, 매우 중요한 것은 삶의 질을 보존하고 조기 사망을 예방하는 것이다.

13. 본 발명에 따르는 시험 키트의 목적: 본 시험 키트는 전세계적으로 심각한 건강 상의 문제점을 해결하기 위해 제공된다. 본 시험 키트는 비정상적인 발단자의 "선별"을 위해 제공된다 (효율 증가).

상기 도구는 본 발명에 따라서, 복합 신속 시험을 제공함으로써 달성된다.

효소 바이오마커 종양 M2-PK와 바이오마커 혈액 (헤모글로빈)을 동기적으로 분석 결정하기 위한 복합 신속 시험.

시험 카세트 상에 시험 스트립 (종양 M2-PK 플러스) + 시험 스트립 (iFOB 플러스)을 포함한 복합 신속 시험.

효소 바이오마커 종양 M2-PK와 바이오마커 헤모글로빈/합토글로빈 복합체 (Hb/Hp 복합체)를 동기적으로 분석 결정하기 위한 복합 신속 시험.

시험 카세트 상에 시험 스트립 (종양 M2-PK 플러스) + 시험 스트립 (Hb/Hp 복합체 플러스)을 포함한 복합 신속 시험.

바람직한 검출 방법은 면역크로마토그래피 방법이다. 특별한 실시양태에서, 어레이, 미니-어레이 포맷의 면역화학적 방법, 또한 혼탁측정 방법이 추가로 가능하다. 본 발명의 주제는 추가로 모노클로날 항체이다.

종양 M2-PK 또는 헤모글로빈에 대한 결합 특성 둘 다에서 특이적이고 면역크로마토그래피 방법에 사용될 수 있는 (예를 들어, "막-적합성", "세제-적합성"인) 복합 신속 시험에서의 특이적 항체의 용도.

본 발명에 따르는 복합 신속 시험을 제공하기 위한 특이적 항체 (클론 P1F3 AK는 특이적으로, M2-PK의 공간적 이량체 입체형태를 검출함)의 용도. 이러한 종양 M2-PK-특이적 항체는 바람직하게는, 4개 아미노산의 최소 길이를 갖는 다음 에피토프 또는 그의 단편, 또는 조합물 (에피토프 또는 그의 단편) 중 하나와 결합한다:

Claims (12)

1. 제1 대변 샘플링 장치를 함유하는 제1 샘플 튜브,
   완충제 1 = 10 - 70 mM 포스페이트 완충제 (pH 6.7 내지 7.6) 또는 완충제 2 = 10 - 70 mM HEPES 완충제 (pH 7.6 내지 8.2) 또는 완충제 3 = 10 - 70 mM 트리에탄올아민 (pH 7.3 내지 7.7) 또는 완충제 4 = 10 - 70 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.7) 또는 이들의 혼합물을 함유하는 제1 완충제 용액,
   제2 대변 샘플링 장치를 함유하는 제2 샘플 튜브,
   완충제 1 = 10 - 70 mM 포스페이트 완충제 (pH 6.7 내지 7.6) 또는 완충제 2 = 10 - 70 mM HEPES 완충제 (pH 7.6 내지 8.2) 또는 완충제 3 = 10 - 70 mM 트리에탄올아민 (pH 7.3 내지 7.7) 또는 완충제 4 = 10 - 70 mM 아세테이트 완충제 (pH 5.7) 또는 이들의 혼합물을 함유하는 제2 완충제 용액,
   고정상으로서 니트로셀룰로스 막을 수반한 측방 유동 시험 시스템을 함유하는 시험 카세트이며, 상기 니트로셀룰로스 막은 또한
   모노클로날 종양 M2-PK 마우스 항체 (클론 PATAM3AT, IgG1) 및 금-커플링된 모노클로날 마우스 항체 (클론 1 E3, IgG1), 및
   모노클로날 헤모글로빈 마우스 항체 (클론 M1202100, IgG1) 및 금-커플링된 모노클로날 마우스 항체 (클론 HB11-2312)
   를 함유하는 것인 시험 카세트,
   제1 샘플 튜브로부터 대변 샘플을 적용하기 위한 제1 개구부,
   제2 샘플 튜브로부터 대변 샘플을 적용하기 위한 제2 개구부
   로 이루어지며, 여기서 종양 M2-PK의 양이 대변 추출물 1 ml당 4±1 유닛을 초과하는 경우, 제1 대변 샘플의 분석 결과는 양성이고, 헤모글로빈의 함량이 대변 1 그램당 헤모글로빈 24 ㎍을 초과하는 경우, 제2 대변 샘플의 분석 결과는 양성인,
   인간 대변에서 바이오마커를 검출하기 위한 시험 키트.
2. 제1항에 있어서, 종양 M2-PK 및/또는 헤모글로빈의 검출이, 대변의 기타 성분, 또는 기타 피루베이트 키나제 동종효소와는 교차반응하지 않는 특이적 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 통하여 수행되는 것인 시험 키트.
3. 제1항에 있어서, 두 완충제 용액이 5 내지 6 또는 5.7의 pH를 갖는 아세테이트 완충제를 포함하는 것인 시험 키트.
4. 제1항에 있어서, 제2 대변 샘플의 헤모글로빈의 결정이 헤모글로빈/합토글로빈 복합체를 기초로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
5. 제1항에 있어서, 종양 M2-PK를 결정하기 위하여, 상기 언급된 종양 M2-PK 항체로부터 선택되는 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
6. 제1항에 있어서, 헤모글로빈을 결정하기 위하여, 상기 언급된 헤모글로빈 항체로부터 선택되는 항체가 사용되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
7. 제1항에 있어서, 포획 항체가 금 콜로이드에 결합되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
8. 제1항에 있어서, 4가지 가능한 시험 결과가 4가지 상이한 색상, 문자, 숫자, 부호 및/또는 기하학적 형태로써 표현되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 담당 의사에 의한 추가의 진단을 개시하는 신호를 생성시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
10. 제9항에 있어서, 신호가 기술적 수단에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 시험 키트.
11. 2개의 샘플링 장치를 사용하여 2개의 대변 샘플을 수집하는 단계,
    상기 대변 샘플들을 각각 하나의 완충제 용액에 용해시키는 단계,
    각각의 대변-함유 완충제 용액을 각각의 관련 개구부 상에 적용하는 단계,
    예정된 대기 시간을 기다리는 단계,
    결과를 각각의 판독 개구부에서 판독하는 단계
    를 특징으로 하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 시험 키트를 사용함으로써 위장관 내에서의 악성 현상을 나타낼 수 있는 바이오마커를 검출하기 위한 방법을 동기적으로 수행하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 결과를 평가하기 위하여 위험 영향 도식을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

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