JP5335802B2 - 潜血を検出する方法および装置 - Google Patents
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Description
ヘモグロビンおよびトランスフェリンに対するモノクローナル抗体の準備
抗体の産生のために、BALB/cマウスを、3か月間、精製ヒトヘモグロビンを使用して免疫の感作をさせた。抗血清の濃度が所望のレベルに到達した後、マウスは屠殺された。分離された脾臓細胞がSP20系の細胞とのハイブリドーマ融合に使用された。1対のハイブリドーマ株化細胞、Hb10E11G12およびHb2H11D12が分離され、BALB/cマウスから腹水を作るために用いられた。それから、腹水から抗ヘモグロビン抗体が精製され、ヘモグロビンを検出するサンドイッチ免疫測定で使用された。
金の粒子と抗体との結合体の準備
抗体と結合した金の粒子が、側方流動免疫測定法における検出手段として選択された。塩化金を、クエン酸ナトリウムによってこれらの混合物の沸点で還元することによって、コロイド状の金の粒子の溶液が準備された。約10から40nmの大きさの金の粒子を含んでいる、ピンクから紫の色が付いているコロイド状金溶液が、金−抗体の結合体の準備に使用された。一対の抗体の一方が、抗体のpI値に近いpH値で、金の粒子の被覆のために使用された。BSAとPEGとが、金の粒子上に残っている結合部位を遮断し、結合している金−抗体溶液を洗浄および凝集させるために使用された。パッドは、通常、ファイバーグラスまたはレーヨンからなり、結合している金−抗体溶液中に浸漬され、金−抗体結合体がパッド上に付着するように、その後乾燥された。
テスト線と対照線
平均の大きさが約5から20μmの穴を有するニトロセルロース薄膜が試験膜として選択された。選択された2つの抗体が、薄膜上の指定された2つのテスト線ゾーンの位置に固定化された。試験の物理的な性能を確認するため、ヤギ抗マウスIgG抗体が固定化された対照線ゾーンが、試験膜上に配された。
テストストリップの組み立ておよび性能
図2〜図3は、サンドイッチ免疫測定法に基づいて、トランスフェリンとヘモグロビンとを同時に検出するテストストリップの組立品を示している。
トランスフェリンの検出
便のサンプル採取装置内の希釈緩衝溶液(通常はPBS緩衝液)は、最終的なトランスフェリンの濃度がそれぞれ10、20、40、50、75および100ng/mlとなるように、添加(トランスフェリンの補足)が行われた。複数の健常者から3つの無作為の便のサンプルが採取され、トランスフェリンを添加した緩衝溶液を収容している採取装置に挿入した。これら3つのサンプルが図2〜図3に示している試験装置を用いて試験された。その結果を表1に示している。トランスフェリンのレベルがカットオフ値である30ng/mlよりも高い全てのサンプル溶液は、陽性の信号を示し、トランスフェリンがカットオフ値よりも低い全てのサンプルは陰性の結果を示した。
ヘモグロビンの検出
便のサンプル採取装置内の希釈緩衝溶液は、最終的なヘモグロビンの濃度がそれぞれ0.05、0.1、0.2、0.5、20および2000μg/mlとなるように、添加が行われた。複数の健常者からの3つの無作為の便のサンプルを採取し、ヘモグロビンが添加された緩衝溶液を収容している採取装置に挿入した。これら3つのサンプルが図2〜3に示している試験装置を使用して試験された。その結果を表2に示している。ヘモグロビンのレベルがカットオフ値である0.2ng/mlよりも高い全てのサンプル溶液は陽性の信号を示し、ヘモグロビンがカットオフ値よりも低い全てのサンプルは陰性の結果を示した。
便のサンプルを使用した上部消化管の出血の鑑別診断
表3に示す、臨床的に確認された胃の異常を感じている患者の便のサンプルを検査するため、ヘモグロビンとトランスフェリンとの組み合わせの試験およびグアヤック試験を行った。抗ヘモグロビン抗体のみに基づいている側方流動サンドイッチ免疫測定の結果、62件中7件のみが、便潜血について陽性であると検出した。グアヤック試験、つまりヘムのペルオキシダーゼ活性を検出する化学試験では、25件が識別された。しかし、グアヤック試験の特異度の欠如のため、これらの25件の識別は疑わしいものとなった。他方、抗トランスフェリン抗体は、62件中51件を、便潜血について陽性であると識別した。表3はこれらの結果を示している。したがって、トランスフェリンは上部消化管の出血の検出に関しては、より敏感なマーカーである。トランスフェリンとヘモグロビンとの組み合わせによる免疫測定によって、上部消化管の出血のさまざまな診断が可能になる。
上部消化管系からの嘔吐サンプルおよび液体サンプルを使用した上部消化管の出血の診断
この例では、臨床的に確認されている上部消化管不調の患者からの7つの嘔吐および胃液サンプルが、ヘモグロビン/トランスフェリンの組み合わせ試験装置およびグアヤック試験によって再び試験された。表4の結果は、グアヤック試験とマーカーとしてのヘモグロビンについての免疫測定とにおいて、すべてのサンプルの試験が陰性であったことを示している。他方、全てのサンプルについてのトランスフェリンの試験は陽性であり、上部消化管サンプルからの潜血を示している。
便サンプルを使用した下部消化管の出血の診断
表5は、下部消化管の不調が臨床的に確認されている患者からの45個の便のサンプルに対する試験の結果を示している。ヘモグロビンの試験で陽性とされた40件では、トランスフェリンの試験も陽性であった。この結果は、ヘモグロビン試験とトランスフェリン試験がFOB検出の試験感度を増大させるように互いに補完し合うことも示している。いずれか一方の試験のみでは、数個の陽性のサンプルを見逃してしまったが、組み合わせ試験(いずれかの試験の結果が陽性であることに基づいてFOBを判断する)は2つの陽性サンプルを除いて全てを検出した。この結果は、さらに、ヘモグロビンとトランスフェリンの試験は、グアヤック試験よりもよりも感度が高いことを示している。
Claims (15)
- 消化管からの出血を検出する方法であって、便のサンプル中のトランスフェリンおよびヘモグロビンの検出をすることと、検出された前記トランスフェリンの量および前記ヘモグロビンの量を、トランスフェリンおよびヘモグロビンのそれぞれの所定の値と比較することと、を有し、
前記トランスフェリンの前記量がトランスフェリンの前記所定の値よりも多く、かつ、前記ヘモグロビンの前記量がヘモグロビンの前記所定の量よりも少ない場合、前記検出の結果は上部消化管からの出血を示している、方法。 - 消化管からの出血を検出する方法であって、嘔吐サンプルまたは胃から採取された液体サンプル中のトランスフェリンおよびヘモグロビンの検出をすることと、検出された前記トランスフェリンの量および前記ヘモグロビンの量を、トランスフェリンおよびヘモグロビンのそれぞれの所定の値と比較することと、を有し、
前記トランスフェリンの前記量がトランスフェリンの前記所定の値よりも多く、かつ、前記ヘモグロビンの前記量がヘモグロビンの前記所定の量よりも少ない場合、前記検出の結果は上部消化管からの出血を示している、方法。 - 下部消化管からの出血と上部消化管からの出血を区別する方法であって、
便のサンプル中のトランスフェリンおよびヘモグロビンの検出をすることと、
検出された前記トランスフェリンの量および前記ヘモグロビンの量を、トランスフェリンおよびヘモグロビンのそれぞれの所定の量と比較することと、を有し、
前記トランスフェリンの前記量がトランスフェリンの前記所定の値よりも多く、かつ前記ヘモグロビンの前記量がヘモグロビンの前記所定の量よりも少ない場合、前記検出の結果は前記上部消化管からの出血を示しており、
前記トランスフェリンの前記量がトランスフェリンの前記所定の値よりも多く、かつ前記ヘモグロビンの前記量がヘモグロビンの前記所定の量よりも多い場合、前記検出の結果は前記下部消化管からの出血を示している、方法。 - 前記トランスフェリンおよび前記ヘモグロビンの前記検出は、サンドイッチ免疫測定法によって行われる、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランスフェリンおよび前記ヘモグロビンの前記検出は、側方流動免疫測定装置によって行われる、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記装置は、
(1)消化管サンプルが塗られるサンプルサイトと、
(2)標識抗トランスフェリン抗体と標識抗ヘモグロビン抗体とが付着し、前記サンプルサイトの下流の結合体サイトと、
(3)抗トランスフェリン抗体が固定化されている一方のサイトと、抗ヘモグロビン抗体が固定化されて付けられている他方のサイトとの、2つの別個のサイトを有している、前記結合体サイトの下流のテストゾーンと、
(4)対照抗体が固定化されている対照サイトと、
を有するテストストリップを備えている、請求項5に記載の方法。 - 前記装置は、2つのテストストリップを有し、
第1のストリップは、
(1)消化管サンプルが塗布されるサンプルサイトと、
(2)標識抗トランスフェリン抗体が付着している、前記サンプルサイトの下流の結合体サイトと、
(3)抗トランスフェリン抗体が固定化されているテストサイトを有する、前記結合体サイトの下流のテストゾーンと、
(4)対照抗体が固定化されている対照サイトと、
を有し、第2のストリップは、
(1)消化管サンプルが塗布されるサンプルサイトと、
(2)標識抗ヘモグロビン抗体が付着している、前記サンプルサイトの下流の結合体サイトと、
(3)抗ヘモグロビン抗体が固定化されているテストサイトを有する、前記結合体サイトの下流のテストゾーンと、
(4)対照抗体が固定化されている対照サイトと、
を有する、請求項5に記載の方法。 - 前記テストストリップは、ニトロセルロースからなる試験膜を有する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記標識抗トランスフェリン抗体と前記標識抗ヘモグロビン抗体とは、共に、金の粒子に結合した抗体である、請求項6または7に記載の方法。
- 前記ヘモグロビンの前記所定の値は0.2μg/mlであり、前記トランスフェリンの前記所定の値は30ng/mlである、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- サンプル中のトランスフェリンとヘモグロビンとを同時に検出する側方流動免疫測定装置であって、
(1)便のサンプルが塗布されるサンプルサイトと、
(2)標識抗トランスフェリン抗体と標識抗ヘモグロビン抗体とが付着している、前記サンプルサイトの下流の結合体サイトと、
(3)抗トランスフェリン抗体が固定化されている一方のサイトと、抗ヘモグロビン抗体が固定化され標識付けられている他方のサイトとの、2つの別個のサイトを有している、前記結合体サイトの下流のテストゾーンと、
(4)対照抗体が固定化されている対照サイトと、を有するテストストリップを備え、
前記テストストリップは、前記サンプル中に存在するヘモグロビンの量がヘモグロビンの所定の値よりも多い場合に前記抗ヘモグロビン抗体が固定化されている前記サイトに陽性の信号が表れ、前記サンプル中に存在するトランスフェリンの量がトランスフェリンの所定の値よりも多い場合に前記抗トランスフェリン抗体が固定化されている前記サイトに陽性の信号が表れるように構成されており、下部消化管からの出血と上部消化管からの出血との区別を可能にする、装置。 - サンプル中のトランスフェリンとヘモグロビンとを同時に検出する側方流動免疫測定装置であって、
2つのテストストリップを有し、
第1のストリップは、
(1)サンプルが塗布されるサンプルサイトと、
(2)標識抗トランスフェリン抗体が付着している、前記サンプルサイトの下流の結合体サイトと、
(3)抗トランスフェリン抗体が固定化されているテストサイトを有している、前記結合体サイトの下流のテストゾーンと、
(4)対照抗体が固定化されている対照サイトと、
を有し、
第2のストリップは、
(1)サンプルが塗布されるサンプルサイトと、
(2)標識抗ヘモグロビン抗体が付着している、前記サンプルサイトの下流の結合体サイトと、
(3)抗ヘモグロビン抗体が固定化されているテストサイトを有している、前記結合体サイトの下流のテストゾーンと、
(4)対照抗体が固定化されている対照サイトと、
を有し、
前記2つのテストストリップは、前記サンプル中に存在するヘモグロビンの量がヘモグロビンの所定の値よりも多い場合に前記抗ヘモグロビン抗体が固定化されている前記サイトに陽性の信号が表れ、前記サンプル中に存在するトランスフェリンの量がトランスフェリンの所定の値よりも多い場合に前記抗トランスフェリン抗体が固定化されている前記サイトに陽性の信号が表れるように構成されており、下部消化管からの出血と上部消化管からの出血との区別を可能にする、装置。 - 前記テストストリップは、ニトロセルロースからなる試験膜を有する、請求項11または12に記載の装置。
- 前記標識抗トランスフェリン抗体と前記標識抗ヘモグロビン抗体とは、共に、金の粒子に結合している抗体である、請求項11または12に記載の装置。
- 前記ヘモグロビンの前記所定の値は0.2μg/mlであり、前記トランスフェリンの前記所定の値は30ng/mlである、請求項11または12に記載の装置。
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