CN101226195B - 一种检测肿瘤型m2丙酮酸激酶的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医药和医学检验领域，涉及检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒及制备方法。本试剂盒包括底板(1)、有色微粒结合物垫(3)、测试样品垫(4)、吸水垫(5)和用于反应的微孔滤膜(2)，所述的有色微粒结合物垫上固定有色微粒标记的抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体，微孔滤膜上设测定区(a)和参比区(b)，测定区包被抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体，参比区包被抗鼠IgG或抗原液；对肿瘤型M2丙酮酸激酶进行半定量分析测定，10分钟内完成测试。本试剂盒便于携带和保存，操作简便，方法稳定，不需测试仪器和酶、能在固相膜介质上简便、快速检测肿瘤型M2丙酮酸激酶。

Description

一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属生物医药和医学检验技术领域，涉及免疫化学检测技术，具体涉及一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒，更具体涉及一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的有色微粒标记的免疫层析试剂盒及其制备方法。

背景技术

据报道，恶性肿瘤发病率和死亡率呈逐年上升趋势。降低恶性肿瘤死亡率的主要途径是早期诊断和早期治疗。目前，肿瘤诊断主要依赖影像学检查，细胞学、生化学和免疫学检验。后者为主要检查血清肿瘤标志物(tumor marker，TM)，由于TM的敏感性和特异性相对较高，较为经济，检查时痛苦少，且适合大批量标本检测，TM的临床应用受到了广泛的关注。

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解中的三大关键酶之一。它有四种同工酶，分别为L型、R型、M1型和M2型，它们的分布具有相对的组织特异性，通常均以酶的活性四聚体形式存在。研究发现，当恶性肿瘤发生时，在癌基因编码的激酶作用下，M2-PK可在肿瘤细胞中大量表达并且其Ser和Tyr位点发生磷酸化，原先具有高度活性的四聚体解离为无活性的二聚体形式，即形成了肿瘤型M2丙酮酸激酶(tumor type M2 pyruvate kinase，TU M2-PK)。它与磷酸烯醇式丙酮酸的亲和力低得多，因此导致磷酸烯醇类物质的堆积，有利于肿瘤细胞进行有氧糖酵解。TU M2-PK是上世纪末始广受关注的一种新型肿瘤标志物，在肾癌、肺癌、胃肠道肿瘤等的临床诊疗中已显现出较好的应用价值和前景。

常用的测定肿瘤标志物的方法有酶免疫法、放射免疫法、化学发光免疫法等所述的定量测定法需用特殊的仪器和试剂，且出报告时间长，不适合广泛的推广筛查使用。目前临床上应用的肿瘤型M2丙酮酸激酶检测基本为酶免疫测定法，Quantificationof tumor type M2 pyruvate kinase(TU M2-PK)in human carcinomas(人类肿瘤中的肿瘤型M2丙酮酸激酶测定，Anticancer Res(抗癌研究)1997，17(4B)，3153-3156)。但该方法尚存在操作相对繁琐、需要反复多次洗涤，需要借助酶标仪读数，不能达到单个快速检测的目的。

免疫层析技术(Immunochromatograph Assay)是上世纪九十年代初发展起来的一门生物技术，因其快速、操作简便、试剂稳定、不易污染等特点而得到广泛应用。可以实现真正意义上的一步快速检测，特别适用于人群普查。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，同时满足快速报告的需求，提供一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒，更具体的涉及一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的有色微粒标记的免疫层析试剂盒。本发明不需要测试仪器，能在固相膜介质上简便、快速的检测肿瘤标志物-肿瘤型M2丙酮酸激酶。

本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法。

本发明试剂盒由底板(1)、有色微粒结合物垫(3)、测试样品垫(4)、吸水垫(5)和用于反应的微孔滤膜(2)所构成；其中所述的有色微粒结合物垫上固定有有色微粒标记的抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体，所述的微孔滤膜上设测定区(a)和参比区(b)，所述的测定区(a)包被有抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体，所述的参比区(b)包被抗鼠IgG或抗原液；所述的测定区(a)和参比区(b)均呈线形加样，其中，两者加样的距离间隔为5mm，参比区(b)加样位置为距吸水垫3mm处。

本发明所述的底板采用塑料、薄膜或胶片材料制备。

本发明所述的有色微粒选自胶体金、胶体硒或彩色胶乳；

所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；

所述的抗原液是从离体的人肿瘤组织中提取的肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原；

所述的测定区包被的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体浓度为2.0～2.5mg/ml，所述的参比区包被的抗鼠IgG或抗原液与测定区的抗体浓度匹配，分别为1.5mg/ml或1.0mg/ml；

所述的反应的微孔滤膜选自硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、硝酸/醋酸纤维素混合膜、聚酯膜或尼龙膜。

本发明通过以下技术方案实现，

以盐析法和层析法从离体的人肿瘤组织中提取出肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原，通过实验动物，制备得到一对特异性的高效价的抗体，获得的抗体经分离纯化后，将有色微粒标记于该对抗体中的一株，然后将其固化在所述的结合物垫上，将另一株加样到微孔滤膜测定区(a)内；同时将抗鼠IgG(市购)或上述抗原加样到参比区(b)内，根据双抗体夹心法的原理，对肿瘤型M2丙酮酸激酶进行半定量分析测定。

本发明所述的试剂盒通过下述方法和步骤制备：

①提取肿瘤型M2丙酮酸激酶：以盐析法和层析法从离体的人肝癌组织中提取出肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原并进行活化；

②抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体的制备及纯化：

用上述纯化得到的抗原通过实验动物，制备特异的高效价的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶的抗体并进行纯化；

③制备有色微粒；

④有色微粒标记抗体：

调整获得的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体pH值，将有色微粒标记于该抗体；

⑤微孔滤膜的抗体包被和结合物垫上有色微粒结合物的固定：

在微孔滤膜上包被抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体和抗鼠IgG或抗原液；在结合物垫上进行有色微粒标记的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体固化干燥；

⑥制备成免疫层析试剂盒；

⑦样品测试：

根据双抗体夹心的免疫层析原理，对肿瘤型M2丙酮酸激酶进行测定分析，得到半定量结果，整个测试过程在10分钟内完成。

所建立的试剂盒的检测结果显示，对肿瘤型M2丙酮酸激酶浓度分三个水平区段：小于15U/ml，15～100U/ml之间，大于100U/ml，检测结果可反映肿瘤型M2丙酮酸激酶的变化范围和发展趋势，能满足临床诊断和治疗监测需求，且可在10分钟内完成测试。

本试剂盒便于携带和保存；操作简便，方法稳定、且可单个测试，具有可半定量测定的特点，能反映肿瘤型M2型丙酮酸激酶的浓度范围和变化趋势，明显方便临床诊断和治疗监测的使用。本发明不需要测试仪器，不需要酶、无需繁琐的洗涤步骤；能在固相膜介质上简便、快速的检测肿瘤标志物-肿瘤型M2丙酮酸激酶。

附图说明

图1为检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的有色微粒标记的免疫层析试剂盒正面观图；

图2为检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的有色微粒标记的免疫层析试剂盒侧面观图。

具体实施方式

实施例1

采用盐析粗提和层析法纯化抗原：

取切除离体的人肝癌组织块，去除脂肪和结缔组织，加入含0.5mmol/L 1，6-二磷酸果糖和10mmol/Lβ-巯基乙醇的匀浆缓冲液(20mmol/Ltris-HCl pH7.5缓冲液，100mmol/LKCl，5mmol/LMgSO4，1mmol/LEDTA)，低温条件下进行匀浆，15000rpm离心20min，取上清，采用分段盐析法作预处理：用45-75％的硫酸铵分段沉淀，获得粗提物，用生理盐水和磷酸缓冲液分别透析平衡后，用磷酸纤维素柱(经酸碱处理并经10mmol/L磷酸缓冲液平衡)加样结合，用含0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸的洗脱缓冲液(10-140mmol/L磷酸缓冲液)线性浓度梯度洗脱解离，并经浓缩后用10mmol/LpH7.2的PBS充分透析活化，用BCA(Bicinchoninic Acid)法测定蛋白质的浓度，再经冷冻干燥成冻干粉，分装-20℃保存；

取上述肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原冻干粉，复温，取0.3mg，溶解于1ml生理盐水，免疫8周龄，体重20克左右的BALB/c小鼠3只。首次将抗原100μg/只加福氏完全佐剂(抗原/佐剂比例为1∶1)腹腔注射，间隔两周，第二次同样抗原剂量加不完全佐剂腹腔注射，间隔三周，第三次抗原100μg/只，不加佐剂直接溶解于生理盐水(N.S)中腹腔注射，一周后，取小鼠眼眶血以间接ELISA法测定抗体效价。经三次免疫后一个月，取抗体效价高的小鼠，细胞融合前三天，腹腔注射50μg、尾静脉注射50μg肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原加强免疫，于加强免疫后三天，无菌取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(细胞比例为5∶1)在50％PEG4000(pH7.8-8.0)的作用下，按常规方法进行细胞融合。融合细胞以RPMI1640液洗涤一次去除PEG4000后，重新悬浮于HAT选择性培养液中。接种于预置饲养细胞层的96孔细胞培养板，每孔1×10⁵个细胞，置37℃、5％CO₂，培养箱培养10-13天，观察杂交瘤细胞生长情况，当细胞克隆长至一个中倍镜视野时，取其培养上清液采用间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选，筛选出的阳性孔，用有限稀释法进行克隆化培养3-5次，获得稳定分泌抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将已建株的单克隆杂交瘤细胞注入预先用硅胶H处理过的BALB/c小鼠腹腔，待腹部膨大时抽取腹水。3000rpm离心30min，取上清液加入1/1000(w/v)NaN₃后，4℃保存、纯化鉴定。

单克隆抗体腹水的纯化采用辛酸法。1ml腹水加2ml 0.06mol/LpH4.0的醋酸缓冲液，用1mol/LHCl调至pH4.8。加33ul辛酸，摇匀。于室温继续搅拌30min，再4℃10000rpm离心30min，取上清用50倍体积的0.02mol/L PBS pH7.4透析液，4℃透析24小时，换透析液两次。上清用BCA法测定蛋白质的浓度即为免疫球蛋白的含量，分装，-20℃冻存备用。

制备有色微粒胶体硒溶液：取4℃蒸馏水于269ml玻璃烧瓶，加入碳氢树脂材料搅拌珠，转速580rpm，加入5.6ml 1.6M抗坏血酸钠，5.6ml的0.58M亚硒酸，振荡、混匀8～10秒，澄清溶液变色，变浑，15分钟后加温至42℃，维持反应至1小时，得胶体硒溶液，4℃保存备用。

上述制得的有色微粒胶体硒溶液100ml用0.1mol/L的碳酸钾调节pH至中性，加入1/10(v/v)3-3.5mg的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶单克隆抗体溶液，室温反应15分钟后，加入聚乙二醇(PEG)至终浓度为1％，继续搅拌15分钟。12000r/min离心30min，弃去上清，所得沉淀即为纯化的微粒标记的抗体，将其复悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，4℃保存。

在纤维素的微孔膜上，测定区(a)和参比区(b)分别平行包被2.0mg/ml的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶单克隆抗体和1.0mg/ml抗原液，均呈线状加样，干燥备用；取有色胶体硒微粒标记的抗体溶液与1％BSA溶液按1∶1比例混匀，喷涂于结合物垫(玻璃纤维)上，干燥固定，备用。

制备试剂盒：在66mm×250mm的单面胶PVC底板上，依次粘贴上已平行包被抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体和抗原液的微孔滤膜、固定有色微粒标记抗体的结合物垫、加样的玻璃纤维垫以及吸水材料；微孔滤膜与吸水材料重叠2mm，与结合物垫重叠1mm，横向切割PVC底板为5mm×66mm的试剂条。

测试样品与判断：在试剂盒的加样玻璃纤维上，加待测血清80μl，在虹吸作用下，所述待测血清溶解结合物垫上的有色微粒标记的结合物并与之反应，经过包被有抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体处时，若样品中含待测的肿瘤型M2丙酮酸激酶，则在测定区(a)形成“抗肿瘤型M2丙酮酸激酶-肿瘤型丙酮酸激酶-有色微粒标记抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体”的复合物而显色，表明此时样品中的肿瘤型M2丙酮酸激酶浓度大于15U/ml；同时将显色线条颜色的深浅与包被抗原液的参比区(b)显色相对比，若深于参比区(b)显色，则为肿瘤型M2丙酮酸激酶浓度大于100U/ml，若有显色但浅于参比区(b)显色，则肿瘤型M2丙酮酸激酶浓度介于15U/ml和100U/ml之间；若测定区无显色，则表示肿瘤型M2丙酮酸激酶浓度小于15U/ml；若参比区无显色表明试剂盒失效。

实施例2

采用盐析粗提和层析法纯化抗原：制备同实施例1。

将上述肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原自冰箱中取出0.3mg，复温，用生理盐水稀释至1ml。免疫实验用新西兰雄性兔，体重2.5kg左右，先于家兔双后足掌皮下注射弗氏完全佐剂与融合蛋白抗原的混合物1mg/ml/只，初次免疫用福氏完全佐剂与抗原充分混匀至呈“油包水”状抗原乳化液。于2周后于双侧后肢肿大的腘窝淋巴结内各注入0.5ml弗氏不完全佐剂抗原混合物，于第6、8周背部多点注射总量1mg的弗氏不完全佐剂抗原混合物，注射后两周于皮下直接用1mg抗原加强免疫一次，心脏采血，采用间接ELISA法检测抗血清效价。即获得含多克隆抗体的抗血清，进一步使用辛酸-饱和硫酸铵法纯化。

抗血清的纯化采用辛酸-饱和硫酸铵法。抗肿瘤型M2丙酮酸激酶的抗血清1ml，加上4ml 0.06mol/LpH4.0的醋酸缓冲液，加120μl辛酸，4℃搅拌30min，10000rpm离心30min，取上清用50倍体积0.02mol/L PBS pH7.4的透析液，4℃透析过夜。取出，加等体积的pH8.0饱和(NH₄)₂SO₄，轻轻搅拌30min，于4℃10000rpm离心20min，去上清。沉淀溶于较小体积的0.02mol/LPBS pH7.4中，然后对50倍体积的上述的透析液于4℃透析36小时，换透析液三次。再4℃8000rpm离心15min，去除不溶物。在紫外分光光度计上测定A₂₈₀和A₂₆₀，根据公式：(1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀)×稀释倍数，计算蛋白浓度即为免疫球蛋白的含量，分装，-20℃冻存备用。

抗肿瘤型M2丙酮酸激酶的单克隆抗体的制备及纯化与实施例1相同。

有色微粒胶体金溶液制备：在100ml蒸馏水中加入1ml 1％氯金酸(V/V)，加热至沸腾，再加入1％柠檬酸三钠溶液1ml，继续煮沸10分钟，冷却后，4℃保存备用。取样用分光光度计扫描测定最大吸收峰，并进行透射电镜观察粒子大小。

上述制得的有色微粒胶体金溶液100ml用0.1mol/L的碳酸钾调节pH至中性，加入1/10(v/v)3-3.5mg的抗肿瘤型M2丙酮酸激酶的单克隆抗体溶液，室温反应15分钟后，加入聚乙二醇(PEG)至终浓度为1％，继续搅拌15分钟。12000r/min离心30min，弃去上清，所得沉淀即为纯化的胶体金微粒标记的抗体，并将其复悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，4℃保存。

在纤维素的微孔膜上测定区(a)和参比区(b)分别平行包被2.2mg/ml的兔抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体和1.5mg/ml的抗鼠IgG，均呈线状加样，干燥备用；取有色胶体金微粒标记抗体溶液与1％BSA溶液按1∶1比例混匀，用定量喷头喷涂于结合物垫(玻璃纤维)上，进行干燥固定，备用。

制备试剂盒，测试样品与判断：方法和步骤同实施例1。

所建立的试剂盒的检测结果显示出对肿瘤型M2丙酮酸激酶浓度分：小于15U/ml，15～100U/ml之间，大于100U/ml三个水平区段，检测结果能反映肿瘤型M2丙酮酸激酶的变化范围和发展趋势，可满足临床诊断和治疗监测需求，测试在10分钟内完成。

本发明不限于上述实施方式，还可以将检测装置放入塑料盒中组成试剂板，因此利用上述发明原理制成试剂板也应落在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒，包括底板(1)、有色微粒结合物垫(3)、测试样品垫(4)、吸水垫(5)和用于反应的微孔滤膜(2)；其特征是所述的有色微粒结合物垫上固定有有色微粒标记的抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体，所述的微孔滤膜上设测定区(a)和参比区(b)，所述的测定区包被有浓度为2.0～2.5mg/ml的抗人肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体，参比区包被浓度为1.5mg/ml的抗鼠IgG或浓度为1.0mg/ml的肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原液；所述的测定区和参比区的间距为5mm，参比区加样位置为距吸水垫3mm处。

2.按权利要求1所述的检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒，其特征是所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

3.按权利要求1所述的检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒，其特征是所述的有色微粒选自胶体金或胶体硒。

4.按权利要求1所述的检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒，其特征是所述的反应的微孔滤膜为聚酯膜。

5.权利要求1所述的检测肿瘤型M2丙酮酸激酶的试剂盒的制备方法，其特征是通过下述步骤：

①提取肿瘤型M2丙酮酸激酶：

用45-75％的硫酸铵分别沉淀，获得粗提物；磷酸纤维素柱层析进一步纯化，用含0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸的洗脱缓冲液解离，浓缩后用pH7.2PBS透析活化，冷冻干燥成冻干粉-20℃保存；

②制备及纯化抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体：

用获得的肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原用杂交瘤技术进行细胞融合、间接ELISA法筛选阳性孔、克隆培养获得单抗；用获得的肿瘤型M2丙酮酸激酶抗原与福氏佐剂混匀，通过实验动物，获得含多克隆抗体的抗血清后，用辛酸法和/或饱和硫酸铵纯化，获得多克隆抗体；

③制备有色微粒：

在100ml蒸馏水中加入1ml 1％氯金酸V/V，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液1ml，煮沸10分钟，冷却后得胶体金，4℃保存；在4℃269ml蒸馏水中加入5.6ml0.58M亚硒酸，5.6ml 1.6M抗坏血酸钠，振荡混匀，15分钟后加温至42℃，反应1小时，得胶体硒，4℃保存；

④有色微粒标记抗体：

取制得的有色微粒胶体溶液100ml用0.1mol/L的碳酸钾调节pH至中性，加入1/10v/v的抗体溶液，室温反应15分钟后，加入聚乙二醇至终浓度为1％，搅拌15分钟，12000r/min离心30min，弃上清，所得沉淀为纯化的微粒标记的抗体，将其复悬于相当于原体积1/5的1％BSA溶液中，4℃保存；

⑤微孔滤膜的抗体包被和结合物垫上有色微粒结合物的固定：

在微孔滤膜上包被抗肿瘤型M2丙酮酸激酶抗体和抗鼠IgG或抗原液；取有色微粒标记的抗体溶液与1％BSA溶液按1∶1比例混匀，定量喷涂于结合物垫或玻璃纤维上，干燥固定；

⑥制备免疫层析试剂盒：

在单面胶PVC底板上，依次粘贴已平行包被抗体的微孔滤膜、固定有色微粒标记抗体的结合物垫、加样的玻璃纤维垫和吸水材料，横向切割所述PVC底板成条。

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