CN102246045B - 用于检测和治疗脊柱和关节疼痛的生物标志物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了生物标志物和检测它们的方法，所述生物标志物包括脊柱或关节疼痛和炎症相关的分离的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物。还提供了通过检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平来鉴定治疗疼痛和炎症中脊柱或关节中的治疗位点的方法。还提供了治疗脊柱或关节疼痛和炎症的方法。

Description

用于检测和治疗脊柱和关节疼痛的生物标志物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年10月16日提交的美国临时专利申请第61/106,059号、于2008年11月26日提交的美国临时专利申请第61/118,401号和于2008年12月12日提交的美国临时专利申请第61/122,045号的优先权，以上所有申请的申请人都是Gaetano J.Scuderi、Lewis S.Hanna和Robert Bowser，并且通过引用将以上所有申请整体并入本文。
发明领域
本发明通常涉及诊断与脊柱或关节相关疼痛相关的病变的方法以及用于治疗脊柱或关节相关疼痛的组合物和方法。
发明背景
脊柱和关节疼痛难于治疗。具体而言，难于鉴定脊柱和关节疼痛的原因。对关节施加的渐增的力度导致关节损伤。异常的关节解剖结构通常是衰老的特征，但是关节损伤也常见为外伤的结果。例如，软骨损伤常见于运动员。由外伤引起的关节损伤通常与急性炎症有关，而由衰老导致的异常的关节解剖结构(例如，骨关节炎)是慢性疾病状态。目前，医生还没有可用于区别外伤引起的急性损伤和年龄相关的关节退变的系统或方法。目前，由于常常不清楚患者的具体疾病状态是急性还是慢性，所以难于为给定患者确定合适的治疗安排。
极其高比例的探查性膝关节镜检查突出了诊断半月板损伤的难度。MRI是目前诊断该病变的主要依靠，但MRI的低特异性使该问题更加严重。已经证实，MRI会将高达65％的无症状的人鉴定为半月板损伤，这使得用MRI作为诊断工具遭到质疑，并且突出了异常的半月板解剖结构和膝部疼痛之间缺乏关联。异常的半月板解剖结构和膝部疼痛之间明确关联的缺乏在多数发展为骨关节炎的老年患者人群中的问题尤其明显。尽管大量证据质疑它的功效(Moseley，et al，N.Engl，J.Med.，347(2)：81-8(2002))，但是仅在美国每年仍进行的膝关节镜检查就估计为660,000次(AAOS网站)。
通常将脊柱相关疼痛分为椎间盘性疼痛、小关节性疼痛或神经根性疼痛。神经根性疼痛的表现常规上归因于各种身体/机械异常，例如与诸如椎间盘突出、狭窄、脊椎前移、坐骨神经痛、梨状肌综合征、闭孔综合征、囊性病变(例如，神经节和滑膜)、肿瘤和其它病变的疾病状态相关的神经根压迫或机械刺激。
已经证实，将髓核施加到脊柱神经根可以导致轴突损伤和神经根显微解剖结构的功能性改变，导致疼痛相关的行为。因此，已经推知将髓核释放进硬膜外间隙的机械缺损可以引起神经根损伤，导致根性疼痛。该“化学性神经根病”仅可以解释具有诸如椎间盘突出的机械缺损的患者人群的一部分中神经根性疼痛的存在，而其余的患者仍无疼痛。
很多研究试图阐明脊柱相关疼痛的病变生理学，并且已经暂时涉及了数个分子途径。然而，还未能证实从损伤或退变到疼痛状态的清楚的因果关系途径。分子标志物可以与临床症状相关联，并且作为开发诊断和治疗工具的可能靶标。尽管一些研究已经提供了硬膜外间隙可以受椎骨间的椎间盘突出影响的证据，但是还没有人测量硬膜外间隙中生物分子的浓度，从而检测受累的人和未受累的人之间的差异。
因此，本发明的一个目的是提供指示脊柱或关节疼痛的生物标志物。
本发明的另一目的是提供用于鉴定脊柱或关节中用于治疗疼痛的位点的生物标志物和方法。
本发明的另一目的是提供可用于诊断或辅助诊断引起脊柱或关节相关疼痛的病变的存在的生物标志物。
本发明的另一目的是提供诊断或辅助诊断引起脊柱或关节相关疼痛的病变的存在的方法。
本发明的另一目的是提供为经受脊柱或关节相关疼痛的个体确定合适疗法的生物标志物和方法。
本发明的另一目的是提供监测和评估脊柱或关节相关疼痛的治疗功效的生物标志物和方法。
本发明的另一目的是提供用于治疗脊柱或关节疼痛的组合物和方法。
另一目的是提供选择脊柱或关节中的治疗位点用于治疗以抑制或减少疼痛的方法和组合物。
发明概述
已经鉴定出脊柱和/或关节疼痛相关的生物标志物。生物标志物包括含有纤连蛋白和聚集蛋白聚糖多肽或它们的片段的复合物或聚集物。在一些实施方案中，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物包含聚集蛋白聚糖的G1、G2或G3结构域、上述结构域的纤连蛋白结合片段、或以上的组合。
还提供了通过检测脊柱或关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平来鉴定脊柱或关节中用于治疗疼痛的治疗位点的方法。在一些实施方案中，被鉴定为治疗位点的位点也是脊柱或关节疼痛的来源位点。可以通过任何合适的方法获得脊柱样品，包括但不限于，硬膜外灌洗、椎间盘间隙灌洗和小关节灌洗。使用常规方法可以获得关节样品，包括但不限于，经皮或切开抽吸、活组织检查或灌洗。可以使用任何合适的方法检测包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物，包括但不限于，色谱法、选择性结合测定、质谱法、分光光度法或以上的组合。在一个实施方案中，可以从脊柱样品、硬膜外间隙或脑脊液分离包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物。
可以用于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的选择性结合测定使用纤连蛋白、聚集蛋白聚糖、或片段、或复合物的选择性结合伴侣。可用的选择性结合伴侣包括已知是纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的体内结合伴侣的抗体和多肽。示例性的选择性结合测定包括Western印迹、免疫沉淀、ELISA和放射性免疫测定。特别优选的结合测定包括选择性地检测包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物而不会明显检测出不存在于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的测定。
还提供了用于在公开的检测测定中检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的阳性对照。所述阳性对照或参考标准通常是纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，其中所述纤连蛋白和聚集蛋白聚糖来自序列与人类序列同源的相同或不同的物种。
公开的检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的方法可用于诊断或辅助诊断脊柱或关节的解剖结构和生理功能相关的疼痛综合征。来自脊柱的特定位置的样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的检测可以用于诊断或辅助诊断神经根病、小关节疼痛、椎间盘性疼痛或关节疼痛。纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在还可以用于指示特定个体进行治疗、确定个体的预后、或监测个体中脊柱或关节疼痛的治疗功效。
还提供了治疗脊柱或关节疼痛的方法。所述方法包括对通过检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平而鉴定出的个体疼痛位点进行治疗。合适的治疗方法包括本领域内任何已知的方法，包括但不限于，脊柱减压的手术方法和使用甾类和非甾类抗炎剂的治疗。
治疗脊柱或关节疼痛的其它方法包括给予纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的拮抗剂。合适的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂抑制或减少纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的一种或多种生物活性、抑制或减少从纤连蛋白和聚集蛋白聚糖和/或它们的片段形成纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物、导致纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的解离、减少纤连蛋白和/或聚集蛋白聚糖的表达、或减少聚集蛋白聚糖从软骨的降解和分解。示例性的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂包括但不限于，抗体和其它多肽、模拟肽、小的有机分子和抑制性RNA，所述抑制性RNA例如核酶、三螺旋形成寡核苷酸、反义DNA、siRNA和miRNA。
附图简要说明
图1显示了有症状的人的样品的尺寸排阻色谱法(SEC)的结果。图中按照以分钟计的洗脱时间的函数表示了从SEC柱洗脱出的蛋白在215nm处的光密度。箭头标识出通过测定检测出的纤连蛋白/聚集蛋白聚糖G3片段的峰。其它高分子量峰含有纤连蛋白与聚集蛋白聚糖的其它片段或更大片段的复合物。
图2显示了无症状的人的样品的尺寸排阻色谱法(SEC)的结果。图中按照以分钟计的洗脱时间的函数表示了从SEC柱洗脱出的蛋白在215nm处的光密度。箭头标识出通过测定检测出的纤连蛋白/聚集蛋白聚糖G3片段的峰应该在的位置，但本图中不存在该峰。含有纤连蛋白与聚集蛋白聚糖的其它片段或更大片段的复合物的其它高分子量峰也不存在。
图3是显示纤连蛋白的阴性ELISA结果和与纯化的牛聚集蛋白聚糖G3片段体外预混的纤连蛋白的阳性ELISA结果的条形图。数据表示为相对单位的光密度。
图4是取自通过ELISA分析的标出的椎间盘节段的脊柱样品的Pfirrmann值和术中VAS值的条形图。
图5是显示了用抗聚集蛋白聚糖-G3抗体进行捕获和用抗纤连蛋白抗体进行检测的ELISA线性图。数据表示为450nm处的实际吸收值与450nm处的预计吸收值相对比。
图6是将来自单一人类个体的无症状对照膝部与有症状疼痛膝部的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)的异相ELISA(heterogeneous ELISA)测定的光密度(OD)进行比较的条形图。
发明的详细描述
I.定义
本文所用的术语“根性疼痛”、“神经根病”、“神经根性疼痛”和“坐骨神经痛”是指从脊柱根节段或“根(radic)”沿着一条或多条受刺激的腰部神经根的途径传出的肢体放射痛。就坐骨神经痛而言，这来源于组成坐骨神经的L4、L5和/或S1脊柱神经根。放射痛还可能来自L3、L2或L1区的上腰部椎间盘突出，或在颈部椎间盘突出、颈部神经根刺激或颈部椎间盘退变的情况下，放射痛可能来自任何颈部神经根。该疼痛不同于小关节或其它脊柱结构造成的被归类为“牵涉性”疼痛的疼痛。放射痛还可能来自L3、L2或L1区的上腰部椎间盘突出或颈部脊柱区。
本文所用的“椎间盘性疼痛”是指从椎间盘产生的脊柱相关疼痛。椎间盘经受与髓核水化作用丢失有关的功能性降低。功能性降低与纤维环的损伤同时发生。该弱化可以导致解剖学病变，例如凸起的、脱出的、挤压的或隔离的椎间盘。该弱化还可以导致由椎间盘内容物渗漏造成的可能的生化病变，这可以表现为背部疼痛或上述的化学性神经根病。
本文所用的“小关节疼痛”或“小关节性疼痛”是指从小关节产生的疼痛。“小关节”或“关节突间关节”是具有软骨、囊、半月形膜和滑膜特性的成对的真性滑液关节。
本文所用的术语“脊柱疼痛”或脊柱相关疼痛”包括椎间盘性疼痛、小关节性疼痛和神经根性疼痛。
本文所用的术语“急性疼痛”是指持续最多6个月的疼痛，例如，5个月、4个月、3个月、2个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天或更短。
本文所用的术语“慢性疼痛”是指持续时间长于6个月的疼痛。
本文所用的“生物样品”是指来自患者的细胞或细胞群体或一定量的组织或液体。这类样品通常来自人，但是包括从非人灵长类，啮齿类分离的组织，例如，小鼠、大鼠、羊、牛、犬、马和猫科动物。生物样品还可以包括组织切片，例如活组织检查样品、用于组织学用途的冷冻切片和灌洗样品。
本文所用的术语“脊柱样品”或“来自脊柱的样品”是指来自脊柱的组织或液体的样品，包括但不限于，“脊柱椎间盘样品”、“硬膜外样品”和“小关节样品”。通常地，这些样品也被称为“生物样品”。
本文所用的术语“关节”或“附肢骨骼关节”是指任何动关节。动关节也被称为滑液关节。因此，术语“关节”是指含有骨、关节软骨、关节囊、滑液组织衬膜和所述囊内部的润滑滑液的任何关节。术语“软骨的”是指关节的软骨组分。术语“半月板”或“半月板的”通常是指膝部的组分。
本文所用的术语“正常关节”或“对照关节”是指对于个体来说是无关紧要的疼痛来源的关节。正常关节中可以存在的疼痛水平通常不会将患者生命的机能或质量影响到患者会寻求医疗的程度。
本文所用的术语“关节样品”或“来自关节的样品”是指通过离体或体内方式来自关节的组织或液体的样品，包括但不限于，滑液样品和关节或组织灌洗液。通常，也将这些样品称为“生物样品”。
本文所用的短语生物样品中的“生物标志物的水平”或“纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平”或“纤连蛋白-聚集蛋白聚糖G3复合物的水平”是指生物样品中存在的生物标志物的量。不需要对“生物标志物的水平”或“纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平”或“纤连蛋白-聚集蛋白聚糖G3复合物的水平”进行定量，而是可以进行简单检测，例如由人进行主观的肉眼检查，可以与对照样品的水平或对照样品的预期水平进行比较或不进行比较。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可交替使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物、含有修饰过的残基的那些天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“试剂”或“治疗剂”用来描述具有或可能具有药学活性的化合物。试剂包括：已经是已知药物的化合物、已经鉴定出药学活性但正在进行进一步的治疗评估的化合物、和作为待筛查药学活性的集合和库的成员的化合物。所述术语包括有机或无机化学品，例如肽，包括抗体、蛋白和小分子和天然产物。
本文所用的术语“免疫测定”是指使用一种抗体或多种抗体特异性地结合抗原的测定。所述免疫测定特征为使用特定的一种抗体或多种抗体的特异性结合性质来检测、定量和/或靶向抗原。
诸如抗体的结合剂和诸如生物标志物的蛋白之间的“特异性结合”是指捕获剂或检测剂优先与诸如生物样品的混合物中存在的特定物质结合的能力。特异性结合还表示解离常数(KD)小于约10-6M、优选小于约10-8M、且更优选小于约10-9M。
短语与抗体“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)发生免疫反应”，当涉及蛋白或肽时，是指能确定蛋白的混杂群体和其它生物样品中蛋白是否存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，给定的抗体与特定蛋白或蛋白复合物的结合至少为背景的两倍，并且所述给定的抗体基本上不以显著的程度与样品中存在的其它蛋白结合。
本文所用的“标记”或“可检测部分”是可通过光谱学手段、光化学手段、生化手段、放射照相手段、免疫化学手段、化学手段或其它物理手段进行检测的组合物。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，常用于ELISA中)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白或可以例如通过将放射性标记并入肽中而变得可检测的其它实体或用于检测与肽发生特异性反应的抗体的其它实体。可以将标记在任何位置并入核酸、蛋白和抗体。可以利用本领域内已知的将抗体与标记结合的任何方法，例如，使用描述于Hermanson，Bioconjugate Techniques 1996，Academic Press，Inc.，San Diego中的方法。
本文所用的术语“抑制剂”或“拮抗剂”是指直接或间接地、部分地或全部地阻断靶生物标志物的活性，降低、阻止、延迟靶生物标志物的活化，使靶生物标志物的活性或表达失活、脱敏或下调的化合物或组合物。拮抗剂例如是诸如抗体的多肽和可溶性受体、以及诸如siRNA或反义RNA的核酸、以及包括小化学分子在内的天然存在的和合成的生物标志物拮抗剂。
II.脊柱或关节疼痛的生物标志物
指示脊柱或关节疼痛的生物标志物是凭经验确定的。在数个实施方案中，生物标志物包含纤连蛋白与聚集蛋白聚糖的复合物，优选从脊柱样品或关节样品分离的纤连蛋白与聚集蛋白聚糖的复合物。下面的实例表明包含纤连蛋白与聚集蛋白聚糖的复合物的生物标志物存在于来自经受脊柱或关节疼痛的个体的脊柱或关节的生物样品中。
生物标志物可以包含成任何比例的纤连蛋白和聚集蛋白聚糖多肽。所述复合物可以包含全长的纤连蛋白和聚集蛋白聚糖多肽或可以包含纤连蛋白和/或聚集蛋白聚糖多肽的片段。术语“片段”是指多肽的任何子集，即全长蛋白的较短多肽。纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的示例性片段包括来自纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的、可以分别用抗纤连蛋白或抗聚集蛋白聚糖抗体进行检测的20、30、40、50或更多个氨基酸。聚集蛋白聚糖的其它示例性片段包括聚集蛋白聚糖多肽的部分，所述部分含有聚集蛋白聚糖的G1、IGD、G2、KS、CS1、CS2或G3结构域中的一个或多个，或上述结构域的片段或组合。在一个实施方案中，所述生物标志物包含纤连蛋白或纤连蛋白的片段与聚集蛋白聚糖的G3结构域或所述G3结构域的片段的复合物。在其它实施方案中，所述生物标志物包含纤连蛋白或纤连蛋白的片段与聚集蛋白聚糖的G1或G2结构域或所述G1或G2结构域的片段的复合物。
示例性的人纤连蛋白1序列可见于NCBI基因ID 2335(FN1；Ensembl：ENSG00000115414；HPRD：00626；MIM：135600)。本文所用的“纤连蛋白”还包括任何天然存在的纤连蛋白变体，包括与疾病和病症相关的约20种已知的剪接变体和由于不同细胞类型的不同剪接而产生的纤连蛋白变体。
聚集蛋白聚糖是硫酸软骨素蛋白聚糖家族的成员，所述硫酸软骨素蛋白聚糖家族还包括多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖和神经蛋白聚糖。示例性的聚集蛋白聚糖1序列可见于NCBI基因ID 176(ACAN；Ensembl：ENSG00000157766；HPRD：01123；MIM：155760)。示例性的多功能蛋白聚糖序列可见于NCBI基因ID(VCAN；Ensembl：ENSG00000038427；UniProtKB：P13611)。示例性的短小蛋白聚糖序列可见于NCBI基因ID(BCAN；Ensembl：ENSG00000132692；UniProtKB：Q96GW7)。示例性的神经蛋白聚糖序列可见于NCBI基因ID(NCAN；Ensembl：ENSG00000130287；UniProtKB：014594)。该基因家族是高度同源的并且表现出相似的蛋白功能，该基因家族包含具有大于50％氨基酸同一性的大量蛋白结构域。本文所用的“聚集蛋白聚糖”还包括聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖和神经蛋白聚糖的任何天然存在的变体或剪接变体，以及由于不同细胞类型的剪接而产生的聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖和神经蛋白聚糖的任何变体。
纤连蛋白或聚集蛋白聚糖多肽或它们的片段也可以是纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的变体或翻译后修饰的变体。本文所用的“变体”多肽包含相对于对应野生型多肽的氨基酸序列的至少一个氨基酸序列改变。氨基酸序列改变可以是例如一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。变体多肽可以具有氨基酸取代、缺失或插入的任何组合。在一个实施方案中，纤连蛋白或聚集蛋白聚糖变体多肽具有整数数目的氨基酸改变，使得它们的氨基酸序列与野生型纤连蛋白或聚集蛋白聚糖多肽的氨基酸序列共享至少60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5或100％的同一性。在优选的实施方案中，纤连蛋白和聚集蛋白聚糖变体多肽具有与野生型纤连蛋白或聚集蛋白聚糖多肽的氨基酸序列共享至少60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5或100％的同一性的氨基酸序列。
可以用计算机程序或直接的序列比较来计算序列同一性百分比。测定两个序列间同一性的优选的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包、FASTA、BLASTP和TBLASTN(参见例如，D.W.Mount，2001，Bioinformatics：Sequence and Genome Analysis(生物信息学：序列和基因组分析)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。公众可从NCBI和其它来源获得BLASTP和TBLASTN程序。公知的SmithWaterman算法也可以用来确定同一性。
用于氨基酸序列比较的示例性参数包括：1)Needleman and Wunsch的算法(J Mol Biol.，48：443-453(1970))；2)Hentikoff and Hentikoff的BLOSSUM62比较矩阵(Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.，89：10915-10919(1992))；3)空位罚分＝12；以及4)空位长度罚分＝4。公众可获得的利用这些参数的程序为“空位(gap)”程序(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)。上述参数是用于多肽比较的默认参数(没有末端空位罚分)。
可选择地，可以使用下面的方程计算多肽序列同一性：
％同一性＝(相同残基数)/(氨基酸残基的比对长度)*100。
对于该计算，比对长度包括内部空位但不包括末端空位。
III.鉴定用于治疗脊柱或关节疼痛的治疗位点的方法
公开了通过检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平来确定用于治疗脊柱疼痛或关节疼痛的治疗位点的方法。
A.脊柱疼痛
脊柱内位点处的纤连蛋白和聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平的检测可以用于将该位点鉴定为脊柱疼痛的需要治疗的位点。在一些实施方案中，基于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平而确定为治疗脊柱疼痛位点的位点也是疼痛来源位点。在一些实施方案中，提出的方法包括从怀疑为疼痛来源的脊柱节段获得一个或多个生物样品，并且检测和比较每个生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平。这在鉴定实际的疼痛位点而非放射痛位点中是有用的。适于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平的个体包括出现脊柱疼痛的任何个体。例如，个体可以正在经受怀疑为椎间盘性疼痛、小关节性疼痛或根性疼痛的疼痛。
公开的方法可用于确定脊柱中用于治疗脊柱疼痛的位置。这些位置还可以是脊柱中疼痛来源的位点。引起个体疼痛的位点的鉴定可用于诊断或辅助诊断个体中的病变或损伤。引起个体疼痛的位点的鉴定还可用于辅助确定受累个体的合适的治疗。
B.关节疼痛
关节内纤连蛋白和聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平的检测可以用于将该关节鉴定为用于治疗关节疼痛的位点。在一些实施方案中，基于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平而确定为治疗关节疼痛位点的位点也是疼痛来源位点。在一些实施方案中，提出的方法包括从怀疑为疼痛来源的关节获得一个或多个生物样品，并且检测生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平。适于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平的个体包括出现附肢骨骼关节疼痛的任何个体。例如，个体可以正在经受怀疑为骨关节炎、软骨形成的疼痛、或与半月板、腱或或韧带病变相关的疼痛。
公开的方法可用于确定用于治疗关节疼痛的治疗位点。这些位置还可以是疼痛来源的关节。引起个体疼痛的关节的鉴定可用于诊断或辅助诊断个体中的病变或损伤。引起个体疼痛的关节的鉴定还可用于辅助确定受累个体的合适的治疗。
C.个体
可以被选择进行纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的检测的个体包括出现脊柱或关节疼痛的任何个体。优选地，所述个体是人。个体可以正在经受脊柱相关的任何疼痛，包括但不限于椎间盘性疼痛、小关节性疼痛或神经根性疼痛。
合适的个体可以被怀疑为正在经受关节的任何解剖结构相关的疼痛，所述解剖结构包括但不限于骨、关节软骨或滑液组织衬膜。关节可以包括但不限于，大的动(滑液)关节(例如膝部、臀部、肩部)、小的动(滑液)关节(例如肘部、腕部、踝部、脊柱的关节突关节或小关节)以及微动关节(例如骶髂关节、胸锁关节、颞下颌关节(“TMJ”))。个体可以正在经受关节相关的急性疼痛或可以患关节相关的慢性疼痛。
在一个实施方案中，个体已经经受关节相关的疼痛或脊柱相关的疼痛持续30或25周或更短。在另一个实施方案中，个体已经经受关节相关的疼痛或脊柱相关的疼痛持续20、15、10、8或6周或更少。
个体可以为任何性别或任何年龄。个体可以正在经受急性或慢性疼痛。
D.纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的检测
1.从脊柱获得生物样品的方法
本领域内已知的诸多方法都可以用来从脊柱获得样品，以用于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物。这些方法包括但不限于，从硬膜外间隙、椎间盘间隙和小关节间隙获得样品的方法。合适的方法在下面有更详细的描述。
方法1：硬膜外间隙灌洗(经尾部)
1)将已用荧光镜检查确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)然后将导入针通过骶管裂孔插入，进行再一次的荧光镜检查确认；
3)然后使导管通过所述针进入硬膜外间隙，利用荧光镜检查，使导管到达病变节段；
4)在导管达到要求位置时，取出引导线；
5)将含有约3cc生理盐水(NS)的注射器连接到导管的远端；
6)然后将1/2cc增量的NS注射入硬膜外间隙，在每体积注射液时尝试抽吸，在每次注射之后、再抽吸之前，允许停留3-5秒；
7)然后将抽吸液置于含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中或使用任何其它快速冷冻的方法；
8)然后将样品转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中，直至分析。
方法2：硬膜外(尾部海绵)
1)将已用荧光透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)然后将导入针通过骶管裂孔插入，进行再一次的荧光检查确认；
3)然后使导管通过所述针进入硬膜外间隙，利用荧光镜检查，使导管到达病变的节段的最上方；
4)取出导入器的引导线，并导入带有吸收性材料的分析物线；
5)将含有1cc生理盐水(NS)的注射器连接到导入器口；
6)然后注射NS，将所述吸收性材料浸湿；
7)然后将导管拉回至病变的最下处，在损伤上方拉动吸收性材料；
8)然后取出分析物线；
9)然后将物质从吸收性材料洗入含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中或使用任何其它快速冷冻的方法；
10)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。可选择地，在步骤9时，可以利用集中的实验室分析或现场即时测定(point of care assay)立即分析样品。
方法3：经椎间孔(硬膜外方法的改动)
1)将已用荧光镜透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)然后将小口径针通过受累的椎间孔插入，进行再一次的荧光镜检查确认；
3)将含有约1.5cc生理盐水(NS)的注射器连接到针上；
4)然后将1/2cc增量的NS注射入硬膜外间隙，在每体积注射液时尝试抽吸，在每次注射之后、再抽吸之前，允许停留3-5秒；
5)然后将抽吸液置于含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中或使用任何其它快速冷冻的方法；
6)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。
方法4：经椎间孔(Ab/吸收性海绵)
1)将已用荧光镜透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)然后将针通过受累的椎间孔插入，进行再一次的荧光镜检查确认；
3)将带有吸收性材料的分析物线通过针导入；
4)将含有约1cc生理盐水(NS)的注射器连接到针上；
5)然后注射NS来浸湿吸收性材料；
6)然后取出分析物线；
7)然后将物质从吸收性材料洗入含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中或使用任何其它快速冷冻的方法；
8)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。可选择地，在步骤7时，可以利用集中的实验室分析或现场即时测定立即分析样品。
方法5：经椎板
1)将导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)然后将针插入，利用椎板间途径到达硬膜外间隙。穿过黄韧带时“砰”的声响证实到达硬膜外间隙中的合适位置，可选择地，可以利用荧光镜检查确认；
3)将含有约3-5cc生理盐水(NS)的注射器连接到针上；
4)然后将约1cc增量的NS注射入硬膜外间隙，在每体积注射液时尝试抽吸，在每次注射之后、再抽吸之前，允许停留3-5秒；
5)然后将抽吸液置于含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中或使用任何其它快速冷冻的方法；
6)然后将样品转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。方法6：椎间盘间隙(灌洗)
1)将已用荧光镜透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)利用单针或双针技术，在荧光镜引导下插入椎间盘间隙；
3)将含有约1.5cc生理盐水(NS)的注射器连接到针上，并注射入椎间盘间隙；
4)约3秒之后，再抽吸椎间盘的灌洗液；
5)这可能需要重复，以获得足够的液体(约3/8cc)；
6)然后将抽吸液洗入含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中；
7)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。
方法7：椎间盘间隙(吸收性海绵)
1)将已用荧光镜透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)利用单针或双针技术，在荧光镜引导下插入椎间盘间隙；
3)取出导入器的引导线并导入带有吸收性材料的分析物线；
4)将含有约1cc生理盐水(NS)的注射器连接到导入器口；
5)然后注射NS来浸湿微离心管；
6)然后取出分析物线；
7)然后将物质从吸收性材料洗入含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中；
8)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。可选择地，在步骤7时，可以利用集中的实验室分析或现场即时测定立即分析样品。
方法8：小关节间隙(灌洗)
1)将已用荧光镜透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)利用单针或双针技术，在荧光镜引导下插入小关节；
3)将含有约1.5cc NS的注射器连接到针上，并注射入小关节间隙；
4)约3秒之后，再抽吸椎间盘的灌洗液；
5)这可能需要重复，以获得足够的液体(约3/8cc)；
6)然后将抽吸液洗入含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中；
7)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。
方法9：小关节间隙(ab/吸收性海绵)
1)将已用荧光镜透视确认的导入部位的皮肤和皮下组织进行浸润；
2)利用单针或双针技术，在荧光镜引导下插入小关节；
3)取出导入器的引导线并导入带有吸收性材料的分析物线；
4)将含有约1cc生理盐水(NS)的注射器连接到导入器口；
5)然后注射NS来浸湿吸收性材料；
6)然后取出分析物线；
7)然后将物质从吸收性材料洗入含有蛋白酶抑制剂混合溶液的微离心管中，并立即置于冰上或干冰上或浸入液氮中；以及
8)然后将微离心管转移至-20℃或更低温度的长期贮存库中直至分析。可选择地，在步骤7时，可以利用集中的实验室分析或现场即时测定立即分析样品。
优选的吸收性材料包括但不限于，海绵、泡沫材料、纱布、毛毡或布。吸收性材料是生物相容的，并且可以由天然的或合成的材料制成。天然的材料包括但不限于棉花。合成的材料包括但不限于聚合物，例如尼龙。
2.从关节获得样品的方法
本领域内已知的诸多方法都可以用来获得关节样品用于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物。合适的方法包括但不限于，经皮抽吸或切开抽吸、活组织检查或灌洗。
3.检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的方法
检测生物样品中多肽的存在的任何已知方法都可以用来定性地或定量地检测脊柱或关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在。合适的方法包括但不限于，色谱法、选择性结合测定、质谱法、分光光度法或以上的组合。
示例性的结合测定包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定。免疫测定可以用来定性地或定量地分析脊柱样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在。在很多容易获得的手册中可以找到可用技术的一般综述，例如，Harlow & Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验手册)(1999)。
a.选择性结合伴侣
在一些实施方案中，公开的方法和试剂盒利用纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的选择性结合伴侣来鉴定它们的存在或测定脊柱或关节的样品中它们的水平。所述选择性结合伴侣可以是与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖或它们的片段或复合物特异性结合的抗体或其它生物分子。
在一些实施方案中，使用单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是本领域内任何已知的抗体，包括可商购的抗体。本领域技术人员公知的是，应当根据使用抗体的测定来考虑待用抗体的类型、来源和其它方面。在一些情况下，在Western印迹上识别抗原靶标(例如，纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的一个表位或多个表位)的抗体可能不能用于所有的ELISA或ELISpot测定，反之亦然。
在一些实施方案中，可以用本领域内公知的制备单克隆抗体或多克隆抗体的技术来制备待用的抗体、抗体片段或单链抗体(参见例如，Coligan，Current Protocols in Immunology(现代免疫学实验技术)(1991)；Harlow & Lane，同上；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice(单克隆抗体：原理和应用)(第2版.1986)；以及Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)。这类技术包括通过从噬菌体或相似载体中的重组抗体库选择抗体来进行抗体制备，还包括通过免疫兔或小鼠来制备单克隆抗体或多克隆抗体(参见例如，Huse et al.，Science 246：1275-1281(1989)；Ward et al，Nature 341：544-546(1989))。
来自纤连蛋白或来自聚集蛋白聚糖的多个免疫原可以用来产生与纤连蛋白和聚集蛋白聚糖和它们的片段特异性反应的抗体。例如，使用本领域技术人员公知的方法可以分离重组纤连蛋白或聚集蛋白聚糖或它们的抗原性片段。可以在真核细胞或原核细胞中表达重组蛋白。重组蛋白是用于制备单克隆抗体或多克隆抗体的常用免疫原。可选择地，源于纤连蛋白和聚集蛋白聚糖已知序列并连至载体蛋白的合成的肽可以用作免疫原。也可以使用纯化形式或不纯形式的天然存在的蛋白。然后将产物注射入能产生抗体的动物中。可以产生单克隆抗体或多克隆抗体，随后用于免疫测定来测定蛋白。
在其它的实施方案中，与包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物特异性结合的抗体被用作特异性结合伴侣。在某些实施方案中，使用与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中存在的抗原特异性结合、但不与单独的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖结合的抗体。
在其它的实施方案中，非抗体多肽被用作特异性结合剂以用于检测纤连蛋白或聚集蛋白聚糖或它们的片段或复合物。与纤连蛋白特异性结合的多种蛋白在本领域内是已知的。可以用作纤连蛋白的选择性结合伴侣的示例性蛋白包括但不限于，细胞表面整联蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、凝集素和硫酸肝素。可以用作聚集蛋白聚糖的选择性结合伴侣的多肽包括但不限于，腱生蛋白-R、腱生蛋白-C、纤蛋白-1、纤蛋白-2和原纤蛋白-1。
b.测定
一旦获得选择性结合伴侣，可以通过包括免疫测定方法在内的各种选择性结合测定来检测每种具体生物标志物。免疫学和免疫测定程序的综述可参见Basic and Clinical Immunology(基础免疫学和临床免疫学)(Stites & Terr eds.，7th ed.1991)。此外，可以按照数种编排的任何一种进行公开的选择性结合测定。数种免疫测定编排在Enzyme Immunoassay((酶学免疫测定)，Maggio，ed.，1980)中有深入的论述
某些实施方案提供了使用纤连蛋白或聚集蛋白聚糖或它们的片段或复合物的特异性结合伴侣来检测脊柱或关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖的存在和/或测定脊柱或关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖的水平的方法。所述方法通常包括：
a)使脊柱或关节样品与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖或它们的片段或复合物的特异性结合伴侣接触；以及
b)检测所述特异性结合伴侣和样品分子之间的结合。
将特异性结合伴侣与样品分子的特异性结合的检测与合适的对照进行比较，可以指示所述样品中存在生物标志物。检测特异性蛋白相互作用的各种方法在本领域内是已知的，并且可用于本方法中。方法包括竞争性测定和非竞争性测定。
合适的方法包括但不限于，Western印迹、免疫沉淀、ELISA和放射性免疫测定。进行这些测定和其它合适测定的方法在本领域内是已知的。通常，直接地或间接地将用于检测生物标志物的特异性结合伴侣可检测地标记。可以将脊柱或关节样品与能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的固相支持物或载体接触并固定在其上，所述固相支持物或载体例如膜(即硝酸纤维素)或聚苯乙烯或磁珠。然后可以用合适的缓冲液洗涤所述支持物，随后与可检测地标记的选择性结合伴侣接触。
优选的方法包括，与不是存在于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖相比，能选择性地检测包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖多肽或它们的片段的复合物的那些方法。对于这样的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的选择性检测来说，合适的结合测定包括使用选择性结合伴侣的测定，所述选择性结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物结合，但不会检测不在该复合物中存在的纤连蛋白和/或聚集蛋白聚糖。用于这些测定中的合适的选择性结合伴侣包括这样的抗体：所述抗体识别纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中存在的、但是不存在于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖中不存在的表位。与非复合的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖相比，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的特异性表位可以部分由这些多肽中的每一个的氨基酸序列形成。以这种方式，每个多肽都对所述表位做出贡献。与非复合的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖相比，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的特异性表位可以存在的另一个原因是，由于复合物中这些多肽的构象差异，导致通常“被掩盖的”表位变得可被抗体或其它多肽结合。
其它合适的测定包括联合使用纤连蛋白和聚集蛋白聚糖中每一种的特异性结合伴侣来检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的那些测定。免疫共沉淀和异相ELISA测定是这些测定类型的示例。在这些测定中，第一多肽的第一特异性结合伴侣用来“捕获”复合物，第二多肽的第二选择性结合伴侣用来检测所述复合物。通过异相ELISA和通过免疫共沉淀、随后通过Western印迹来检测多肽复合物的方法在本领域内是已知的。下面的实例展示了异相ELISA系统的应用，其中使用抗纤连蛋白抗体和抗聚集蛋白聚糖抗体来检测人样品中的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物。
在所有的特异性结合测定中，将发生的非特异性结合的量降至最低是理想的，尤其是当特异性结合伴侣附着于基底时。降低这些非特异性结合的方法是本领域技术人员所公知的。通常，该技术涉及用蛋白质组合物包被基底。具体而言，诸如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶的蛋白组合物被广泛使用。除蛋白质材料之外或代替蛋白质材料，可以将各种去垢剂和/或盐用于免疫测定以最小化非特异性相互作用。在测定的全过程中，在每次试剂结合之后，可能需要孵育和/或洗涤步骤。孵育和洗涤时间取决于数种因素，包括测定形式、特异性结合伴侣对于生物标志物的亲和力、溶液体积、浓度。
一个实施方案提供了可以用在检测测定中的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的阳性对照，例如用于使检测测定标准化。在某些实施方案中，纤连蛋白和聚集蛋白聚糖来自不同的来源，例如来自不同的物种。纤连蛋白可以是人纤连蛋白而聚集蛋白聚糖可以是牛、猪或马聚集蛋白聚糖。可选择地，纤连蛋白可以是牛、猪或马的而聚集蛋白聚糖可以是人的。应当理解，可以使用任何组合，只要纤连蛋白和聚集蛋白聚糖来自与人序列具有序列同源性的相同或不同物种。纤连蛋白和聚集蛋白聚糖可以是重组的、天然的或其组合。
c.可检测的标记
包括免疫测定在内的特异性结合测定通常使用标记剂来特异性地结合由特异性结合伴侣与被检测的分析物形成的复合物，并允许检测所述复合物。标记剂可以是用于检测分析物的特异性结合伴侣的一部分。可选择地，标记剂可以是第三部分，例如与特异性结合伴侣和被检测的分析物所形成的复合物特异性结合的二抗。能特异地结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白也可以用作标记剂，例如蛋白A或蛋白G。这些蛋白表现出对来自多种物种的免疫球蛋白恒定区的强亲和力(参见例如，Kronval etal.，J.Immunol.111：1401-1406(1973)；Akerstrom et al.，J.Immunol.135：2589-2542(1985))。可以用诸如生物素的可检测部分修饰标记剂，诸如抗生物素蛋白链菌素的另一个分子可以与所述可检测部分特异性地结合。各种可检测的部分是本领域技术人员所公知的。
可检测的标记可以是具有可检测的物理或化学特性的任何材料。很多有用的可检测的标记在本领域内是已知的，且包括可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、放射照相，电学、光学或化学手段检测的任何标记。标记的选择可取决于所需的敏感度、与化合物缀合的容易程度、稳定性要求、可用的器械和配置供给。有用的标记包括磁珠(例如，DYNABEADS)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA中的其它酶)以及诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)的比色标记。
通常，通过间接的方式连接非放射性标记。通常，将配体分子(例如，生物素)与分子共价结合。然后，所述配体与另一分子(例如，抗生物素蛋白链菌素)结合，所述另一分子是固有可检测的或与信号系统共价结合，所述信号系统例如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。配体及其靶标可以与识别生物标志物的抗体或识别生物标志物的抗体的二抗以任何合适的方式组合使用。
也可以将分子与产生信号的化合物直接缀合，例如，通过与酶或荧光团缀合。可以用作标记的酶主要是水解酶，尤其是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶，尤其是过氧化物酶。示例性的荧光化合物包括但不限于，荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰和伞形酮。示例性的化学发光化合物包括但不限于，虫荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)。检测标记的方法是本领域技术人员所公知的。
E.诊断和预后
检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物从而鉴定脊柱或关节中疼痛来源位点的方法可以用来诊断或辅助诊断患有与脊柱或关节的解剖结构和生理功能相关的疼痛综合征的个体。
1.脊柱疼痛的诊断和预后
例如，硬膜外间隙、椎间盘或小关节中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的鉴定可以用来诊断或辅助诊断神经根病、小关节疼痛或椎间盘性疼痛。
能够将脊柱中的特定位置指示为特定个体的疼痛来源的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的量取决于多种因素，包括但不限于，患者的年龄、性别、病史等，提取生物样品的位点以及用于检测生物标志物的测定形式。在一些实施方案中，不对生物样品中的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平进行定量或与对照样品直接比较，而是相对于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”进行检测，其中“诊断存在”是指能指示获取样品的位置处引起疼痛的病变或损伤的存在或存在的可能性的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的量。在一些实施方案中，在简单的测定中可检测“诊断存在”，从而给出阳性或阴性结果，其中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”的阳性“检测”表明获取样品的位置处存在引起疼痛的病变或损伤。
对于待检测的“诊断存在”，不需要对纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平进行定量。然而，可以使用确定纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平是否高于正常或对照的水平的任何方法。此外，“诊断存在”并非指纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的任何绝对量，而是指根据生物样品、测定条件、患者的疾病状态等足以将受累患者中的水平与正常或对照患者的水平区分开的量。
无论具体对照样品中是否正常存在或者预计存在纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，都可以使用所公开的方法。例如，使用特定的测定在某些正常脊柱样品(例如，椎间盘间隙内或硬膜外间隙灌洗液)中可能无法检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，这导致对照生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物完全不存在。对于这类生物样品，“诊断存在”是指使用相同测定时纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的任何可检测的量。然而，在其它情况下，正常或对照样品中可能存在可检测水平的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，则“诊断存在”代表高于正常水平的水平，优选代表统计学上显著高于正常水平的增加。在一些实施方案中，生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”高于对照样品至少约1.5、2、5、10、100、200、500、1000倍或更多倍。对照样品可以是取自未经受脊柱疼痛的一个个体或一组个体的样品。可选择地，对照样品可以获自未怀疑为疼痛来源的脊柱节段。例如，在经受椎间盘性疼痛的个体中，对照样品可以获自同一患者的未受累的或无症状的椎间盘间隙。
脊柱特定节段中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平可以用来诊断或辅助诊断脊柱疼痛的具体类型，例如椎间盘性疼痛、小关节性疼痛或神经根性疼痛。此外或可选择地，脊柱样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平可以用来将脊柱病变或损伤导致的疼痛与起源于诸如肌肉疼痛的另一来源的疼痛区分开。
在一些实施方案中，沿着脊柱的特定位置处的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平指示该特定位置处的病变或损伤。例如，如果在L5椎间盘灌洗液中检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，则患者在L5处有损伤或病变。此外，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在可以用来诊断特定位置的损伤和在特定位置实施治疗，无论用诸如MRI的其它的方法是否可检测到损伤。通常，通过将治疗剂给予损伤或病变的位点，即纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物存在的位点，来对患者进行治疗。
生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平可以用来将患者指定为特定治疗的候选者。分析获自患者的脊柱样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物是否存在。如果在脊柱样品中检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，则选择该患者进行治疗。然后，可以根据纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平所确定的疾病状况的严重程度，调整治疗类型，例如抗炎剂或外科手术，。
特定位点存在的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平也可用于确定受试个体的预后。例如，脊柱样品中存在的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平可以表明脊柱急性损伤的程度，并且可以辅助从业者确定损伤或病变成功修复或康复所达到的程度。
2.关节疼痛的诊断和预后
检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物从而鉴定作为治疗关节相关疼痛的位点的关节的方法可以用来诊断或辅助诊断患有与附肢骨骼的滑液关节的解剖结构和生理功能相关的疼痛综合征的个体。例如，关节中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的鉴定可以用来诊断或辅助诊断骨关节炎、半月板病变、肩袖撕裂、腱或韧带病变、软骨溶解或肌筋膜疼痛。
能指示作为治疗特定个体的关节相关疼痛的位点的关节的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的量取决于多种因素，包括但不限于，患者的年龄、性别、病史等，提取生物样品的位点以及用于检测生物标志物的测定形式。在一些实施方案中，不对生物样品中的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平进行定量或与对照样品直接比较，而是相对于纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”进行检测，其中“诊断存在”是指能指示获取样品的位置处引起疼痛的病变或损伤的存在或存在的可能性的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的量。在一些实施方案中，在简单的测定中可检测“诊断存在”，从而给出阳性或阴性结果，其中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”的阳性“检测”表明获取样品的位置处存在引起疼痛的病变或损伤。
对于待检测的“诊断存在”，不需要对纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平进行定量。然而，可以使用确定纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平是否高于正常或对照的水平的任何方法。此外，“诊断存在”并非指纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的任何绝对量，而是指根据生物样品、测定条件、患者的疾病状态等足以将受累患者中的水平与正常或对照患者的水平区分开的量。
无论具体对照样品中是否正常存在或者预计存在纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，都可以使用所公开的方法。例如，使用特定的测定在某些正常关节样品(例如，滑液样品)中可能无法检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，这导致对照生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物完全不存在。对于这类生物样品，“诊断存在”是指使用相同测定时纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的任何可检测的量。然而，在其它情况下，正常或对照样品中可能存在可检测水平的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，则“诊断存在”代表高于正常水平的水平，优选代表统计学上显著高于正常水平的增加。在一些实施方案中，生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”高于对照样品至少约1.5、2、5、10、100、200、500、1000倍或更多倍。对照样品可以是取自未经受关节相关疼痛的一个个体或一组个体的样品。可选择地，对照样品可以获自受试个体的未受累的或无症状的关节。尤其适于获得对照样品的关节是被检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的诊断存在的关节的对侧未受累的或无症状的关节。例如，在经受左膝疼痛的个体中，对照样品可以获自同一个体的右膝，只要右膝是未受累的或无症状的。
特定关节中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平可以用来诊断或辅助诊断关节相关疼痛的具体类型，包括但不限于，骨关节炎、半月板病变、肩袖撕裂、腱或韧带病变、软骨溶解或肌筋膜疼痛。在一些实施方案中，关节中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平指示该特定关节的病变或损伤。此外或可选择地，关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平可以用来将关节相关疼痛与来自诸如脊柱的另一解剖或生理来源的疼痛区分开。例如，与对照样品相比，关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或升高的水平可以用来将关节相关疼痛与神经根性疼痛区分开。
纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的检测可以单独使用或与其它诊断方法联合使用来诊断关节相关疼痛。示例性的诊断方法包括但不限于，病史和物理检查、X射线照相、MRI和关节内注射。然而，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在可以用来诊断特定位置的损伤和在特定位置实施治疗，无论用诸如MRI的其它方法是否可检测到损伤。通常，通过将治疗剂给予损伤或病变的位点，即纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物存在的位点，来对患者进行治疗。
生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平可以用来将患者指定为特定治疗的候选者。然后，可以根据纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在或水平所确定的疾病状况的严重程度，调整治疗类型，例如给予抗炎剂或外科手术。
特定位点存在的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平也可用于确定受试个体的预后。例如，关节样品中存在的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平可以表明关节急性损伤的程度，并且可以辅助从业者确定损伤或病变成功修复或康复所达到的程度
D.监测治疗功效
所公开的方法也可以用来评估治疗或疗程的功效。例如，在指示神经根病的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”为检测阳性的神经根病患者中，可以随着时间监测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平来评估抗炎治疗的功效。将取自治疗后患者的生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平与取自治疗前或治疗早期的同一患者的样品中的水平进行比较，水平的降低表明有效的治疗。
在关节样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的“诊断存在”为检测阳性的关节相关疼痛患者中，可以随着时间监测治疗的关节中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平来评估抗炎治疗的功效。例如，将取自治疗后患者的生物样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的水平与取自治疗前或治疗早期的个体的样品中的水平进行比较，水平的降低表明有效的治疗。
IV.治疗疼痛的方法
一旦通过纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的存在鉴定出疼痛来源的位点，可以使用本领域内已知的任何方法来治疗疼痛或治疗引起疼痛的病变。例如，如果诊断为神经根病或椎间盘性疼痛或小关节性疼痛，可以应用本领域内已知的用于治疗脊柱疼痛诸多方法来治疗患者。合适的方法包括但不限于，椎板切开术、椎板切除术、椎间盘摘除术、微创椎间盘摘除术、经皮椎间盘摘除术、内窥镜椎间盘摘除术、激光椎间盘摘除术、椎间孔切开术、融合术、增生疗法、其它的手术减压、使用或使不用器械的融合术进行的减压、
也可以通过标准非手术方法来治疗脊柱疼痛，包括给予甾类或非甾类抗炎剂。非甾类抗炎剂(NSAID)在本领内是公知的。可以使用非甾类试剂，所述非甾类试剂包括NSAID，例如布洛芬、阿司匹林或扑热息痛。诸如糖皮质激素的甾类化合物也可以用于治疗，甾类化合物通过与皮质甾醇受体结合来减少炎症。
本领域内已知的治疗关节相关疼痛的诸多方法可以用来治疗患者。合适的方法包括手术和非手术方法，包括但不限于，关节镜清理术或给予甾类或非甾类抗炎剂。
A.生物标志物拮抗剂
在一些实施方案中，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的一种或多种拮抗剂可以用来治疗脊柱或关节疼痛。合适的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂可以直接或间接抑制或降低纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的生物活性。其它合适的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂抑制或减少从纤连蛋白和聚集蛋白聚糖单体形成纤连蛋白和聚集蛋白聚糖复合物，或导致含有纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的已有复合物的解离。其它合适的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂抑制或降低纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的表达。
1.抗体
在一个实施方案中，纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂是抗体。与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖特异性结合的抗体或抗体片段可以用来抑制或减少纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的形成、解离已有的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物和/或抑制或降低纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的生物活性。产生抗体的方法是公知的并且在本领域技术人员的能力之内，在下面有更详细的描述。
本文公开的抗体与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖多肽或它们的片段特异性地结合，并且能减少或抑制纤连蛋白与聚集蛋白聚糖的结合，或纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物与介导引起疼痛的信号转导的生物靶标的结合。其它合适的抗体与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物特异性地结合，而不与这些多肽中的任一个单独结合。这些抗体是特别有用的，因为它们并不干扰纤连蛋白和聚集蛋白聚糖在复合物中的功能之外的功能。
将公开的抗体称为“阻断性”“功能阻断性”或“拮抗性”抗体。用来产生抗体的免疫原可以是纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的任何免疫原性部分。在一个实施方案中，用来产生抗聚集蛋白聚糖抗体的免疫原是聚集蛋白聚糖的G3结构域。用本领域内已知的各种方法产生免疫原，例如，使用常规重组方法进行的克隆基因的表达、合成肽复合物、从来源细胞、表达高水平的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的细胞群体中进行分离。在另一个实施方案中，免疫原包含纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物。可以从来自个体的生物样品分离复合物，或可以通过从纤连蛋白和聚集蛋白聚糖单体体外形成复合物来产生复合物。
抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可以是异种的、同种异体的、同基因的或以上的修饰过的形式，例如人源化抗体或嵌合抗体。抗体也可以是抗独特型抗体。本文所用的抗体还包括抗体片段和制备为单链抗体或scFv而不是正常多聚体结构的抗体，所述抗体片段包括Fab和F(ab)2片段。抗体可以是诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的IgG或IgM、IgA、IgE或IgD同种型。可以根据所需的效应功能来选择抗体重链恒定结构域。轻链恒定结构域可以是κ或λ恒定结构域。
可以使用与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖结合的可商购的或本领域内已知的其它抗体。例如，与纤连蛋白结合的人源化抗体在美国专利第6,329,511号和第7,183,390号中描述。
2.其它多肽
在另一个实施方案中，生物标志物拮抗剂是多肽，但并不是与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖或它们的复合物结合的抗体。纤连蛋白结合多肽或聚集蛋白聚糖结合多肽可以用来减少或抑制包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物的形成和/或抑制或降低纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的生物活性。产生多肽的方法在本领域内是公知的。
在一些实施方案中，所述多肽是纤连蛋白受体或聚集蛋白聚糖受体的可溶性片段。示例性的纤连蛋白受体包括纤连蛋白受体1和2。其它合适的可溶性多肽包括已知与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖结合的病毒蛋白。例如，可以使用与各种纤连蛋白结合的嵌合病毒受体。
3.小分子和其它拮抗剂
应当理解，可以筛查具有拮抗活性的其它生物活性剂。在一个实施方案中，筛查候选生物活性剂的抑制或减少包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物的形成或解离已有复合物的能力。在另一个实施方案中，筛查候选生物活性剂的减少纤连蛋白和聚集蛋白聚糖复合物与生物靶标的结合的能力或抑制或降低纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的生物活性的能力。
本文所用的术语“候选生物活性剂”是指任何分子，例如蛋白、小有机分子、小无机分子、有机金属分子、碳水化合物(包括多糖)、多核苷酸、脂质等。通常，平行地检测不同试剂浓度的多个测定混合物，以获得对各种浓度的差异性反应。通常，这些浓度中的一个充当阴性对照，即在零浓度或在检测水平以下。此外，可以使用阳性对照，即使用已知与纤连蛋白或聚集蛋白聚糖结合的试剂。
候选试剂包括有机的、无机的、有机金属的、合成的、半合成的和天然存在的小分子。候选试剂包括诸多化学种类，但通常是有机分子，优选为分子量大于100且小于约2,500道尔顿的小有机化合物，更优选为100-2000，更优选为约100-约1250，更优选为约100-约1000，更优选为约100-约750，更优选为约200-约500道尔顿。候选试剂包含与蛋白结构上相互作用、特别是形成氢键所必需的官能团，通常包括至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选包括所述化学官能团中的至少两个。候选试剂通常包含被一个或多个上述官能团取代的环形碳或杂环结构和/或芳香结构或多芳香结构。在生物分子中也发现了候选试剂，所述生物分子包括肽、糖、脂肪酸、甾类、嘌呤、吡咯烷、以上的衍生物、结构类似物或组合。特别优选的是肽，例如，模拟肽。例如，可以按照WO 98156401所述制备模拟肽。
从多种来源获得候选试剂，包括合成化合物或天然化合物的库。例如，多种手段可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸的表达。可选择地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库是可获得的或容易制备的。此外，通过常规的化学、物理和生化手段可容易地对天然的库或通过合成产生的库和化合物进行修饰。可以将已知的药学试剂用于定向的或随机的化学修饰以产生结构类似物，所述化学修饰例如酰化、烷化、酯化、酰胺化。在优选的实施方案中，候选生物活性剂是有机化学部分或小分子化学组合物，在本领域内可获得很多这样的有机化学部分或小分子化学组合物。
4.降低或抑制纤连蛋白或聚集蛋白聚糖表达的拮抗剂
在另一个实施方案中，拮抗剂降低或抑制纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的表达。降低或抑制纤连蛋白或聚集蛋白聚糖表达的拮抗剂包括抑制性核酸，包括但不限于，编码纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的核酸的特异性的核酶、三链形成寡核苷酸(TFO)、反义DNA、siRNA和微RNA。
有用的抑制性核酸包括与对照相比将编码纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的RNA的表达降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的那些核酸。通过本领域技术人员公知的方法可以检测纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的表达，包括northern印迹和定量聚合酶链式反应(PCR)。
抑制性核酸及其制备方法是本领域内所公知的。例如可在http://i.cs.hku.hk/～sirna/software/sirna.php获得siRNA设计软件。核酸的合成是公知的，例如参见Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)(Sambrook and Russel eds.第三版)Cold Spring Harbor，NewYork(2001)。术语“siRNA”表示小干扰RNA，其是无毒性的、短长度的、双链RNA。通常，对siRNA的长度没有特别的限制，只要它不表现出毒性。“siRNA”的长度可以是，例如15-49bp，优选15-35bp且更优选21-30bp。可选择地，待表达的siRNA的最终转录产物的双链RNA部分的长度可以是，例如15-49bp，优选15-35bp，且更优选21-30bp。siRNA中两条RNA链配对的双链RNA部分并非限制于完全匹配，并且由于错配(对应的核苷酸不是互补的)和凸起(一条链上缺少对应的互补核苷酸)可以含有非配对的部分。含有的非配对部分的程度应使得它们不干扰siRNA形成。本文所用的“凸起”优选包含1-2个非配对核苷酸，且siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区优选包含1-7个，更优选1-5个凸起。此外，siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区中包含的本文所用的“错配”的数量优选为1-7个，更优选为1-5个。在优选的错配中，其中一个核苷酸是鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。这样的错配是由于在编码有义RNA的DNA中的从C至T、从G至A的突变或以上突变的组合，但并非特别局限于此。此外，siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区可以包含凸起和错配，它们的总数优选为1-7个，更优选1-5个。
siRNA的末端结构可以是平的或粘性的(悬突)，只要由于该siRNA的RNAi效应，其能沉默、降低或抑制靶基因表达。粘性(悬突)末端结构不仅限于3′悬突，也可以包括5′悬突结构，只要它能诱导RNAi效应。此外，悬突核苷酸的数量不限于已有报道的2或3个，可以为任何数量，只要该悬突能诱导RNAi效应。例如，悬突由1-8个，优选2-4个核苷酸组成。在本文中，将具有粘性末端结构的siRNA的总长度表示为配对的双链部分的长度和包含两端的悬突单链的对的长度之和。例如，对于在两端具有4个核苷酸悬突的19bp双链RNA部分，总长度表示为23bp。此外，由于该悬突序列与靶基因具有低特异性，所以它不必与靶基因序列互补(反义)或相同(有义)。此外，只要siRNA能保持其对靶基因的基因沉默效应，siRNA可以，例如在它一端的悬突部分中含有低分子量RNA(可以是诸如tRNA、rRNA或病毒RNA的天然RNA分子，或人工RNA分子)。
此外，siRNA的末端结构未必如上文所述在两端为截断结构，而可以具有茎-环结构，其中双链RNA的一侧末端由连接子RNA连接。例如，双链RNA区(茎-环部分)的长度可以是15-49bp，优选15-35bp，且更优选21-30bp。可选择地，例如，待表达的siRNA的最终转录产物的双链RNA区的长度是15-49bp，优选15-35bp，且更优选21-30bp。此外，对连接子的长度没有特别的限制，只要它的长度不会阻碍茎部分的配对。例如，为了茎部分的稳定配对和抑制编码该部分的DNA之间的重组，连接子部分可以具有苜蓿叶状tRNA结构。例如，即使连接子的长度阻碍茎部分的配对，但是也可以构建包含内含子的连接子部分，使得在前体RNA加工成成熟RNA的过程中该内含子被切除，进而允许茎部分的配对。对于茎-环siRNA，RNA中没有环结构的任一端(头或尾)可以具有低分子量RNA。如上述，该低分子量RNA可以是诸如tRNA、rRNA或病毒RNA的天然RNA分子、或人工RNA分子。
通过Dicer样酶对短的茎-环前体的切割来产生miRNA；而通过长的双链RNA分子的切割来产生siRNA。miRNAs是单链的，而siRNA是双链的。
制备siRNA的方法在本领域内是已知的。因为纤连蛋白或聚集蛋白聚糖的序列是已知的，所以本领域技术人员使用公众可获得的信息可容易地制备能下调纤连蛋白或聚集蛋白聚糖表达的siRNA。
5.负责纤连蛋白和/或聚集蛋白聚糖降解的聚集蛋白聚糖酶和基质金属蛋白酶(MMP′s)的抑制剂
在一个实施方案中，可以将已知的抑制剂，例如已知的聚集蛋白聚糖酶或MMP′s的螯合剂，以能有效抑制或减缓聚集蛋白聚糖片段的释放的量给予有需要的个体，这将有效减少或消除纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的形成，进而减轻个体的疼痛。
B.药物组合物
提供了包含纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂的药物组合物。包含肽或多肽的药物组合物可以用于通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、经皮(被动经皮或使用离子电渗法或电穿孔法)或经粘膜(鼻腔、阴道、直肠或舌下)途径进行给药。还可以使用可生物消化的插入物来给予组合物，并且可以将组合物直接递送至诸如椎间盘、硬膜外间隙和小关节的脊柱结构或递送至动关节。可以将组合物配制成适于每种给药途径的剂量形式。还可以将包含不是肽或多肽的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂的组合物配制成用于经肠给药。
将本文所公开的拮抗剂以治疗有效量给予个体。本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”表示足以治疗、抑制或缓解有需要的个体的脊柱疼痛的剂量。根据各种因素，精确的剂量会改变，例如取决于个体的可变因素(例如，年龄等)、被治疗的损伤或病变、以及正实行的治疗。
对于本文公开的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂，当进行进一步的研究时，关于治疗不同患者的不同疾病状态的合适剂量水平的信息会显现出来，并且本领域技术人员在考虑接受者的治疗背景、年龄和一般健康状况的情况下能确定合适的剂量。所选的剂量取决于给药途径和所需的治疗持续时间。通常，给予哺乳动物的剂量水平为每天0.001-10mg/kg体重。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以更低。
在一个实施方案中，将纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂的水性溶液通过肠胃外注射、椎间盘内注射、小关节内注射、鞘内注射、硬膜外注射或关节注射进行给药，所述拮抗剂包括含有肽和多肽的那些拮抗剂。在优选的实施方案中，将纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂直接给予个体中疼痛来源的脊柱区域内。例如，当在硬膜外间隙中检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物时，可以将纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂通过直接注射入硬膜外间隙中而进行给药。可选择地，当在椎间盘间隙、小关节或动关节检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物时，可以将纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂通过直接注射入这些间隙中而进行给药。
制剂也可以为悬液或乳液形式。通常，提供的药物组合物包含有效量的肽或多肽，且任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这类组合物包含稀释剂，无菌水、具有不同缓冲容量的(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水；并且任选地包含诸如去垢剂和增溶剂(例如，吐温
Figure BPA00001387910200331
20、吐温
Figure BPA00001387910200332
80、聚山梨醇酯80)的添加剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)以及防腐剂(例如，Thimersol、苯甲醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露醇)。非水性溶剂或介质的实例是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油和玉米油的植物油、明胶以及诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。还可以将制剂冻干，在即将使用前进行再溶解/再悬浮。例如，通过使制剂通过细菌截留滤器进行过滤、通过将灭菌剂掺入组合物、通过对组合物进行照射或通过加热组合物可以将制剂灭菌。
也可以将纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂以控释制剂进行给药，所述拮抗剂包括含有肽和多肽的那些拮抗剂。可以制备控释聚合物装置，用于在植入聚合物装置(杆、圆柱体、薄膜、盘)或注射(微颗粒)之后的系统性长期释放。基质可以为诸如微球的微颗粒形式，其中肽分散在固体聚合物基质或微胶囊中，其中核心是不同于聚合物壳的材料，且所述肽分散或悬浮于所述核心中，所述核心的性质可以为液体或固体。除非本文具体定义，微颗粒、微球和微胶囊可交换使用。可选择地，聚合物可以被铸为范围从纳米至4厘米的薄板或薄膜、可以是通过研磨或其它标准技术产生的粉末或者甚至可以是诸如水凝胶的凝胶。
非生物可降解的或生物可降解的基质都可以用于递送纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物拮抗剂，但是优选生物可降解的基质。这些基质可以是天然的或合成的聚合物，但是优选合成的聚合物，这是由于对合成的聚合物的降解和释放性质可以更好地表征。基于所需的释放时间来选择聚合物。在一些情况下，线性释放是最有用的，而在其它情况下，脉冲释放或“集中释放(bulk release)”可提供更有效的结果。聚合物可以为水凝胶形式(通常吸收以重量计多至约90％的水)，且可任选地与多价离子或聚合物交联。
可以通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂提取和本领技术人员已知的其它方法形成基质。可以使用开发用于制备药物递送微球的任何方法来制备可生物消化的微球，例如，如Mathiowitz and Langer，J controlledledRelease，5：13-22(1987)；Mathiowitz，et al.，Reactive Polymers，6：275-283(1987)；以及Mathiowitz，et al.，J Appl.Polymers Sci，35：755-774(1988)中所描述。
可以将所述装置制成用于治疗植入或注射区域的局部释放或制成用于系统性递送，所述局部释放递送的剂量通常远小于全身治疗的剂量。可以将这些装置皮下植入或注射入肌肉、脂肪，或可以吞服这些装置。
V.试剂盒
利用诸如免疫测定的特异性结合测定的检测方法特别适于对患者进行现场医疗应用。这类方法允许对患者进行立即诊断和/或预后评价。
还提供了用于上述诊断、研究和治疗应用的试剂盒。在诊断和研究应用中，这类试剂盒可以包括以下中的任何一种或全部：测定试剂、缓冲液和用于公开的生物标志物的选择性结合伴侣，以上所有都可以装入适于运输的容器中。选择性结合伴侣可以包括与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物选择性地结合的抗体，或用于联合使用的与这些组分的每一种单独结合的抗体。在一些实施方案中，试剂盒包括位于连续固体表面上的选择性结合伴侣。
示例性的试剂盒包括具有检测结合伴侣和用于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的阳性对照的容器。所述阳性对照可以是纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物或用于产生纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的组分。纤连蛋白和聚集蛋白聚糖序列可以是人的序列或聚集蛋白聚糖和纤连蛋白与人的序列同源的任何其它物种。纤连蛋白和聚集蛋白聚糖两者可以来自相同的物种或不同的物种。可以从天然来源纯化纤连蛋白和/或聚集蛋白聚糖片段，或通过固相方法合成或通过重组方法方法产生纤连蛋白和/或聚集蛋白聚糖片段。试剂盒还可以包括被结合在基底上的捕获结合伴侣，所述基底例如连续的固体表面。捕获结合伴侣通常与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的聚集蛋白聚糖结合，检测结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白结合，但是应当理解，捕获结合伴侣可以与纤连蛋白结合，检测结合伴侣可以与聚集蛋白聚糖结合。
在一些实施方案中，用于提取生物样品的装置也包括在试剂盒中。在一些实施方案中，诸如注射器、针和导管的提取装置，可以直接地将生物样品从可能受累的椎间盘或硬膜外间隙或关节提取至含有生物标志物选择性结合伴侣的小室中。因此，在某些情况下，试剂盒允许对生物标志物的存在和/或水平进行立即评价。这些试剂盒类型特别适于现场医疗应用。现场医疗诊断系统的实例在美国专利第6,267,722号中描述。其它装置的设计也可以进行调整而用于本发明的试剂盒，例如美国专利第7,198,522号和第6,818,455号中描述的装置。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于从脊柱或关节提取生物样品的溶液。包括在试剂盒中的该溶液可以是例如，生理溶液，例如盐水。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种治疗剂，可以通过与提取样品所用的相同的装置或通过不同的装置给予所述治疗剂。
此外，试剂盒可以包括带有如何使用试剂盒提供的材料的指导(即，流程)的说明性材料。说明性材料通常包括书面或印刷材料，但也可以将它们提供为能存储这类操作说明并能将它们与终端用户联系起来的任何媒介。合适的媒介包括但不限于，电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)和光学介质(例如，CD ROM)。所述介质可以包括提供说明性材料的互联网网址。
实施例
实施例1.应用色谱法从人的样品中纯化纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物
为了从椎间盘灌洗样品或滑液中纯化纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，进行尺寸排阻色谱法(SEC)，随后进行阴离子交换色谱法。使用配备有BioLogic QuadTec
Figure BPA00001387910200361
UV/VIS检测器和传导性监测器的Bio-RadBioLogic DuoFlow计算机控制的HPLC系统进行SEC和阴离子交换色谱法。
使用串联的两个Bio-Rad
Figure BPA00001387910200363
SEC-400-5柱进行SEC，其中使用pH8.0的50mM Tris/HCl、100mM NaCl进行等度洗脱。分析得到的流分的总蛋白含量(A280nm和A215nm)和发现的由聚集蛋白聚糖片段和纤连蛋白复合物组成的生物标志物的存在。图1显示了有症状样品的SEC-HPLC洗脱谱(A215nm)，图2显示了相同条件下的无症状样品的SEC-HPLC洗脱谱。随后的实验表明流分14和15是仅有的含有通过成熟的测定可检测到纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物水平的流分。基于该柱的分子量标准，推测流分14和15中洗脱的蛋白的分子量为250Kda-700Kda。
可以用阴离子交换色谱法对纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物进行进一步的纯化。将所述复合物与柱结合，用pH 8.0的50mM Tris/HCl、150mMNaCl平衡，并用Tris/HCl缓冲液中的150mM NaCl-230mM NaCl的线性盐梯度从柱上洗脱复合物。
还可以用阳离子交换色谱法对纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物进行纯化。将所述复合物与柱结合，用pH 6.0的50mM醋酸钠、100mM NaCl平衡，并用醋酸盐缓冲液中的100mM NaCl-300mM NaCl的线性盐梯度从柱上洗脱复合物。
实施例2.银染和使用抗纤连蛋白和抗聚集蛋白聚糖(G3结构域)的特异性抗体的Western印迹分析
实施例1说明了通过SEC-HPLC对人的样品进行流分分离。将来自SEC分析的流分14和15进行SDS-PAGE分离，随后进行银染或Western印迹，以确定流分中蛋白的大小并探测它们的一致性。使用抗纤连蛋白单克隆特异性抗体(DiaPharma Group，Inc.来自DPGR028A纤连蛋白ELISA试剂盒的检测抗体)和抗聚集蛋白聚糖单克隆特异性抗体(G3结构域)(Santa Cruz Biotechnology，聚集蛋白聚糖C20，sc-16493)，利用标准方法进行Western印迹。
银染分析证实两个流分中都存在大于250Kd范围的蛋白。使用抗纤连蛋白单克隆抗体和抗聚集蛋白聚糖单克隆抗体(G3结构域)的Western印迹显示出400-600Kd分子量范围的免疫反应条带，这表明蛋白共同迁移通过聚丙烯酰胺凝胶。数据表明蛋白复合物的存在，该蛋白复合物与抗纤连蛋白抗体和抗聚集蛋白聚糖抗体(G3)都发生免疫反应。
实施例3.与纤连蛋白共同迁移通过聚丙烯酰胺凝胶的聚集蛋白聚糖结构域的分析
如实施例1所述，对单个人类样品进行尺寸排阻色谱，将来自SEC的洗脱流分8-20进行SDS-PAGE分离，然后转移至膜，用于使用多克隆抗聚集蛋白聚糖G1抗体(Santa Cruz Biotechnology，聚集蛋白聚糖D20，sc-16492)、抗聚集蛋白聚糖G2抗体(Santa Cruz Biotechnology，聚集蛋白聚糖E12，sc-67513)或抗聚集蛋白聚糖G3抗体(Santa Cruz Biotechnology，聚集蛋白聚糖C20，sc-16493)进行的Western印迹。
使用抗聚集蛋白聚糖G3结构域抗体的Western印迹显示出流分8-20中不同分子大小的免疫反应条带，这些条带对应于聚集蛋白聚糖的含有G3结构域的不同蛋白水解片段。使用抗聚集蛋白聚糖G1结构域抗体的Western印迹显示出流分8-20中的免疫反应条带，这些条带表现出的条带模式不同于用抗聚集蛋白聚糖G3结构域抗体时所观察到的。使用抗聚集蛋白聚糖G2结构域抗体的Western印迹显示出流分8-20中的免疫反应条带，这些条带表现出的条带模式不同于用抗聚集蛋白聚糖G1或G3结构域抗体时所观察到的。对使用抗聚集蛋白聚糖G1、G2和G3抗体所获得的条带模式的分析提示聚集蛋白聚糖的G1、G2和G3结构域存在于与纤连蛋白或纤连蛋白片段形成的不同的复合物中。
实施例4.纤连蛋白-聚集蛋白聚糖蛋白复合物的异相ELISA分析
前面的实施例提示人类样品中存在纤连蛋白和聚集蛋白聚糖(G3)复合物。为了进一步证实该复合物的存在，开发和使用了异相ELISA夹心测定。
材料和方法：
如实施例1所述，对单个人类样品进行尺寸排阻色谱，并将流分14和15用于进一步的分析。
将抗纤连蛋白单克隆抗体(DiaPharma Group，Inc.来自DPGR028A纤连蛋白ELISA试剂盒的检测抗体)固定于聚苯乙烯平板上来发挥捕获抗体的功能。然后，将来自人类样品SEC的流分14和15等分到含有纤连蛋白捕获抗体的平板上。孵育之后，弃去样品，洗涤平板，并将平板与作为检测抗体的抗聚集蛋白聚糖G3结构域多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，聚集蛋白聚糖C20，sc-16493)孵育。洗涤平板，使用HRP标记的二抗和然后进行的光学检测来检测纤连蛋白与聚集蛋白聚糖G3结构域的复合物的存在。还进行了其它的实验，其中将抗聚集蛋白聚糖G3结构域抗体用作捕获抗体，将抗纤连蛋白抗体用作检测抗体。
流分14显示了最高的光密度，流分15也是阳性的但光密度较低。这些结果表明在SEC流分中存在相互作用的纤连蛋白和聚集蛋白聚糖(G3结构域)不均一复合物，该复合物与相互作用的蛋白复合物的分子量一致，无论哪种抗体用于捕获和哪种抗体用于检测。
实施例5.用加热和还原剂将纤连蛋白和聚集蛋白聚糖(G3)复合物解离
为了进一步证实含有纤连蛋白和聚集蛋白聚糖G3结构域的复合物的存在，测试了加热和还原剂对Western印迹上条带迁移的作用。
材料和方法：
如实施例1所述，对单个人类样品进行尺寸排阻色谱，并将洗脱的流分14和15用于进一步的分析。在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上将来自流分14和15的蛋白分离。对样品不进行处理，或在沸水浴中加热3分钟处理样品，或在还原剂DTT存在下在沸水浴中加热3分钟处理样品。然后如上面的实施例所述，将蛋白转移到膜上，用于使用抗聚集蛋白聚糖G3结构域单克隆抗体或抗纤连蛋白单克隆抗体的Western印迹。
结果：
当没有通过加热或用还原剂处理样品时，Western印迹显示了与抗纤连蛋白单克隆抗体和抗聚集蛋白聚糖(G3)单克隆抗体免疫反应的单一条带。
当通过在沸水浴中加热3分钟处理样品时，随后的Western印迹显示了单一的抗纤连蛋白和抗聚集蛋白聚糖(G3)免疫阳性条带被分成多个较低分子量的条带。这与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3结构域)复合物的二聚体形式被部分解离为纤连蛋白单体和聚集蛋白聚糖(G3结构域)复合物是一致的。
当在DTT存在下在沸水浴中加热3分钟处理样品时，随后的Western印迹显示了单一的抗纤连蛋白和抗聚集蛋白聚糖(G3)免疫阳性条带被分成多个较低分子量的条带。这与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3结构域)复合物被解离为分别的纤连蛋白和聚集蛋白聚糖(G3结构域)亚单元是一致的。此外，纤连蛋白被分解为由二硫键保持在一起的数个肽。
本实施例表明纤连蛋白和聚集蛋白聚糖(G3结构域)阳性条带的凝胶迁移特性可以受加热和还原的影响，这与蛋白-蛋白复合物的解离是一致的。
实施例6.纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物作为人椎间盘疼痛的生物标志物的研究
对通过临床和放射照相特征而被诊断为腰部髓核突出(HNP)的45岁女性通过椎间盘造影术进行进一步的评估。通过使用Phirrmann评级的放射照相评估确定椎间盘退变的程度。还对个体进行疼痛的直观类比评级(VAS)，患者报告的VAS值为5。VAS为1-10级，1相当于无疼痛而10相当于最强烈的疼痛。在进行椎间盘造影术之前，用椎间盘间隙灌洗法(方法6)对人椎间盘的椎间盘内间隙进行取样。在椎间盘造影术进行期间，获得每个腰椎间盘节段的术中VAS值。如表1所示，在表现出退变的最大程度的放射照相测量值以及强烈的术中疼痛测量值的两个腰椎间盘节段中，生物标志物复合物ELISA都是阳性的。
表1：经受MRI和椎间盘造影术程序的患有疼痛的同一名自愿者不同腰部水平的特征。
Figure BPA00001387910200401
本实施例表明：人类个体椎间盘内间隙中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖蛋白复合物的存在与临床疼痛、一致的椎间盘造影术和MRI相关。这些数据以图的形式呈现在图4中。
实施例7：ELISA试剂盒的阳性对照
为了建立ELISA试剂盒的阳性对照，研究了牛聚集蛋白聚糖。由于牛聚集蛋白聚糖与人聚集蛋白聚糖的高度序列同源性，按照公开的方法从软骨中纯化牛聚集蛋白聚糖。然后，将纯化的聚集蛋白聚糖用MMP-9消化，MMP-9是负责体内降解聚集蛋白聚糖的基质金属蛋白酶。通过使用固定于Sepharose树脂上的抗聚集蛋白聚糖G3结构域的亲和层析纯化G3及其片段。将洗脱的聚集蛋白聚糖G3结构域与人纤连蛋白混合而形成复合物。用成熟的ELISA检测人纤连蛋白和牛聚集蛋白聚糖G3体外组装的复合物(图3)。同样的原理应用于也具有高度同源性的牛和人纤连蛋白。
单独的纤连蛋白或聚集蛋白聚糖G3结构域在ELISA测定中都不产生阳性信号，因此两者都可以用作阴性对照。
图5显示了使用用于捕获的抗聚集蛋白聚糖G3抗体和用于检测的抗纤连蛋白抗体进行的ELISA的线性图。在本实验中使用来自疼痛患者的阳性样品。通过复合物ELISA检测450nm处的初始O.D。在线性研究中使用该样品的连续稀释液。根据初始检测值和稀释因子计算预期O.D。在理想的条件下，该线性图的斜率应该为1、y轴截距应该为0、R2＝1。所获得的值为斜率＝1.09、y轴截距＝-0.09、R2＝0.99。
应当理解，用于捕获的抗体可以是抗纤连蛋白，用于检测的抗体可以是抗聚集蛋白聚糖。
实施例8.来自经历关节镜清理术的疼痛膝部与无症状对照膝部的滑液样品的比较
为了比较纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物作为滑液关节中存在疼痛的生物标志物的功效，将经历关节镜检查的患者疼痛膝部的滑液与来自无症状自愿者膝部的滑液进行比较。
材料和方法：
在获得伦理审查委员会批准之后，在病例对照系列设计的研究中招募个体。所有个体提供了参与的知情同意书。从私人诊所的一位膝部外科医生的执业中招募经历关节镜手术的具有疼痛膝部的个体。入选标准包括年龄范围30-69、活动相关的膝部疼痛、失败的保守处理(注射，治疗)、机械性症状的存在(卡住(locking)、牵绊(catching)、打软(giving way))以及半月板撕裂的MRI阳性。排除标准包括存在高能量创伤或骨折、关节炎性皮疹、韧带损伤或手术日期的3个月之内口服甾类/关节内注射甾类。
从没有膝部疼痛但人口统计学上年龄匹配的无症状志愿者中招募单独的个体组。入选标准包括年龄范围30-69岁且不存在膝部疼痛或不存在间歇性膝部疼痛史。排除标准包括关节炎性皮疹、口服甾类/关节内注射甾类、存在渗出、膝部外科手术史或身体检查中膝部对齐和稳定性在正常限度范围之外。
对于每个个体，按下述收集关节内样品。用三重葡萄糖酸氯己定制剂准备抽吸位点，并用无菌的10cc注射器和21号×1.5英寸的针头从前部或直接侧部入口进行抽吸。用10cc 0.9％的生理盐水对膝部进行灌洗，然后将抽吸液抽进注射器。将抽吸液等分入含有蛋白酶抑制剂混合物的eppendorf管中，然后置于冰上直至运输。
在以1∶5比例稀释之后，对每个样品进行纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物是否存在的异相ELISA测定(即如实施例4所述)。
结果：
按照方案，测定12个有症状的膝部和10个无症状的膝部。有症状组的平均光密度(OD)(±标准差)是1.82(±0.50)，无症状对照组的平均光密度(OD)(±标准差)是-0.12(±0.07)。通过t-检验，该差异是统计学上显著的(p＜0.001)。图6给出每个有症状患者和无症状对照的结果。
本实施例表明：可以从膝关节滑液测定纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物，并将其用作生物标志物来预测关节内紊乱的存在，如同通过病史、身体检查和MRI扫描进行诊断。
实施例9.来自同一人类个体中的一侧疼痛膝部与对侧无症状膝部的滑液样品的比较
为了比较纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物作为滑液关节中疼痛存在的生物标志物的功效，将疼痛膝部的滑液与来自同一人类个体的对侧无症状膝部的滑液进行比较。该配对比较消除了不匹配的病例对照研究中的个体间差异。
材料和方法：
在获得伦理审查委员会批准之后，在匹配病例对照设计的研究中招募了一个个体。他提供了参与的知情同意书。该个体是47岁男性，一侧膝部具有活动相关疼痛。他经历失败的保守处理(注射，治疗)，并且半月板撕裂为MRI阳性。两侧膝部都没有骨折，没有关节炎性皮疹、韧带损伤，并且疼痛膝部的外科手术日期的3个月之内未口服甾类/关节内注射甾类。对侧无症状膝部无明显疼痛或间歇性疼痛史或外科手术史。对无症状膝部的检查是正常的，并且之前没有外科手术史。
如实施例6所述收集两份关节内样品：一份来自疼痛膝部，一份来自无症状膝部。将抽吸液等分入含有蛋白酶抑制剂混合物的eppendorf管中，然后置于冰上直至运输。在以1∶10比例稀释之后，对每个样品进行纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物是否存在的异相ELISA测定(即如实施例4所述)。
结果：
450纳米(nm)波长处的疼痛膝部的光密度是22.68。450纳米(nm)波长处的无疼痛膝部的光密度是0.00，该值为减去空白值之后精确到两位小数。图6以条形图形式给出结果。
本实施例表明：可以从膝关节滑液测定纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物，并将其用作生物标志物来预测关节内紊乱的存在，如同通过病史、身体检查和MRI扫描进行诊断，即使是通过测定同一人类个体对侧膝部来在实验性上控制差异时。
实施例10.来自经历全踝关节成形术的疼痛踝部与无症状对照踝部的滑液样品的比较
为了比较纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物作为滑液关节中疼痛存在的生物标志物的功效，将经历全踝关节成形术的患者中疼痛踝部的滑液与无症状自愿者的踝部滑液进行比较。
材料和方法：
在获得伦理审查委员会批准之后，在病例对照系列设计的研究中招募个体。所有个体都提供了参与的知情同意书。从私人诊所的一位足部和踝部外科医生的执业中招募经历全踝关节成形术的具有疼痛踝部的个体。入选标准包括年龄范围40-70岁、活动相关的踝部疼痛、失败的保守处理(注射，治疗)，退行性关节疾病和骨关节炎的X射线平片为阳性。排除标准包括存在急性骨折、关节炎性皮疹(例如风湿性关节炎)或外科手术日期的3个月之内口服甾类/关节内注射甾类。
从没有踝部疼痛但人口统计学上年龄匹配的无症状志愿者招募单独的个体组。入选标准包括年龄范围30-69岁且不存在踝部疼痛或间歇性踝部疼痛史。排除标准包括关节炎性皮疹、口服甾类/关节内注射甾类、或身体检查中踝部对齐和稳定性在正常限度范围之外。
对于每个个体，按下述收集关节内样品。用三重葡萄糖酸氯己定制剂准备抽吸位点，并用无菌的10cc注射器和21号×1.5英寸的针头从前部入口进行抽吸。用2cc 0.9％的生理盐水对踝部进行灌洗，然后将抽吸液抽进注射器。将抽吸液等分入eppendorf管中，然后置于冰上直至运输。
在以1∶5比例稀释之后，对每个样品进行纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物是否存在的异相ELISA测定(即如实施例4所述)。
结果：
按照方案，测定4个有症状踝部和1个无症状踝部。有症状组的平均光密度(OD)(±标准差)是8.4(±5.1)，无症状自愿者的平均光密度(OD)(±标准差)是0.0。
本实施例表明可以从踝关节滑液测定纤连蛋白-聚集蛋白聚糖(G3)复合物，并将其用作生物标志物来预测关节内紊乱退行性关节疾病的存在，如同通过病史、身体检查和X射线平片扫描进行诊断。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科技术语都具有与本公开发明所属领域的技术人员所通常理解的相同含义。通过引用将本文引用的出版物和引用的材料特别并入本文。

Claims (18)

1.分离的纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物，其中从脊柱样品或关节样品分离所述复合物，联合使用纤连蛋白和聚集蛋白聚糖中每一种的特异性结合伴侣来检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物。
2.如权利要求1所述的复合物，其中所述复合物包含聚集蛋白聚糖的G1、G2或G3结构域、或包含纤连蛋白或其片段、或包含聚集蛋白聚糖的G1、G2或G3结构域与纤连蛋白或其片段。
3.如权利要求1所述的复合物，其中所述纤连蛋白和聚集蛋白聚糖是重组的、天然的或合成的或以上的组合。
4.用于检测样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的试剂盒，所述试剂盒包括
包含与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物结合的检测结合伴侣和捕获结合伴侣的容器，其中所述捕获结合伴侣被结合在基底上；和
用于检测纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的阳性对照，其中所述阳性对照包含权利要求1所述的复合物；
其中所述捕获结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的聚集蛋白聚糖结合，且所述检测结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白结合，或者
所述捕获结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白结合，且所述检测结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的聚集蛋白聚糖结合。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述捕获结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的聚集蛋白聚糖结合，且所述检测结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白结合。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述捕获结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的纤连蛋白结合，且所述检测结合伴侣与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物中的聚集蛋白聚糖结合。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其含有阳性对照或参考标准，所述阳性对照或参考标准包含来自与人序列具有序列同源性的相同或不同物种的纤连蛋白和聚集蛋白聚糖或它们的片段的复合物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中第一物种是人。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中第二物种选自牛、猪和马或纤连蛋白或聚集蛋白聚糖序列与人同源的任何哺乳动物。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其中第一物种是人且第二物种是牛。
11.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述复合物包含聚集蛋白聚糖的G1、G2或G3结构域、上述结构域的纤连蛋白结合片段、或以上的组合。
12.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述纤连蛋白和聚集蛋白聚糖是重组的、天然的或合成的或以上的组合。
13.如权利要求4所述的试剂盒，还包括用于从个体获得生物样品的装置。
14.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述检测结合伴侣不与单独的纤连蛋白或单独的聚集蛋白聚糖可检测地结合。
15.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述捕获结合伴侣和所述检测结合伴侣选自：抗体或其抗原结合片段、纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物受体或所述受体的能与纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物结合的片段、或以上的组合。
16.分离的复合物，其包含纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物，所述分离的复合物用作检测样品中纤连蛋白-聚集蛋白聚糖复合物的阳性对照。
17.如权利要求16所述的复合物，其中所述纤连蛋白和聚集蛋白聚糖的复合物包含聚集蛋白聚糖的G1、G2或G3结构域、或包含纤连蛋白或其片段、或包含聚集蛋白聚糖的G1、G2或G3结构域和纤连蛋白或其片段。
18.如权利要求16所述的复合物，其中所述纤连蛋白和聚集蛋白聚糖是重组的、天然的或合成的或以上的组合。
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