EP3729091A1 - Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems - Google Patents

Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems

Info

Publication number
EP3729091A1
EP3729091A1 EP18814627.8A EP18814627A EP3729091A1 EP 3729091 A1 EP3729091 A1 EP 3729091A1 EP 18814627 A EP18814627 A EP 18814627A EP 3729091 A1 EP3729091 A1 EP 3729091A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fragment
degradation product
detecting
osteoarthritis
autoantibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18814627.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas R. Klatt
Johannes Ruthard
Benedikt Ostendorf
Matthias Schneider
Georg Pongratz
Gabriele Hermes
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet zu Koeln
Original Assignee
Universitaet zu Koeln
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet zu Koeln filed Critical Universitaet zu Koeln
Publication of EP3729091A1 publication Critical patent/EP3729091A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/105—Osteoarthritis, e.g. cartilage alteration, hypertrophy of bone
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • Osteoarthritis is the most common degenerative joint disease worldwide. About two-thirds of people over the age of 65 are affected by the disease. The etiology of arthrosis is largely unknown. The most important risk factors for osteoarthritis include age, overwork and genetic predisposition. There is currently no disease modifying drug therapy and basic drug development problems are the unknown aetiology and the complex pathomechanisms of osteoarthritis.
  • Another problem with the development of a disease-modifying drug for osteoarthritis is the lack of sensitive biochemical markers that can be used to test the success of a therapy.
  • the diagnosis of arthrosis is currently based on anamnestic data, exclusion of other joint diseases, radiological examinations and atheroscopy.
  • the imaging studies lead to a burden on the patient, are associated with high costs and costs, but provide only a rough statement about the disease stage and can only represent the later stages of disease.
  • a therapy or follow-up and classification of the disease stage is hardly possible with the previous methods.
  • the identification and validation of a cartilage or bone specific molecule as a biochemical marker of osteoarthritis has not been successful. Thus, there are currently no valid biochemical markers for the diagnosis of osteoarthritis.
  • thrombospondin-4 as a component of articular cartilage.
  • the authors also have the concentration of thrombospondin-4 in the serum of
  • thrombospondin-4 concentration is not significantly different from healthy control subjects and therefore not a valid biomarker.
  • the present invention describes methods that permit the detection of osteoarthritis in an individual as well as the assessment of the stage and progress of osteoarthritis.
  • the present inventors have surprisingly discovered that osteoarthritis is associated with the formation of autoantibodies to components of cartilage or bone and their degradation products.
  • matrix components such as Thrombospondin-4 (TSP-4), COMP and CLEC3A.
  • TSP-4 Thrombospondin-4
  • COMP Thrombospondin-4
  • CLEC3A Since the cartilage tissue is presented only to the immune system, it can come in the course of the disease for the stimulation and formation of autoantibodies against components of cartilage or bone or against neoepitopes, which arise in the course of the disease in the proteolytic degradation of these components.
  • the inventors assume that it depends on the amount of release of cartilage matrix proteins, eg. As TSP-4, COMP and / or CLEC3A, comes to a formation of autoantibodies to these matrix proteins. Surprisingly, the present inventors were able to detect anti-TSP-4 autoantibodies in the serum of osteoarthritis patients. In addition, autoreactive bands were detected in the serum of other arthritis patients, the significantly smaller than full-length TSP-4. These are probably degradation products of TSP-4.
  • the present inventors have surprisingly been able to detect in the blood of osteoarthritis patients anti-COMP autoantibodies and / or anti-CLEC3A autoantibodies, with combined detection of anti-TSP-4 autoantibodies and anti-COMP autoantibodies and / or anti-CLEC3A autoantibodies resulted in an increased detection rate of osteoarthritis compared to single detection of autoantibodies.
  • no anti-TSP-4 and anti-CLEC3A autoantibodies could be detected and anti-COMP autoantibodies were detected at very low frequency.
  • the present inventors were also able to detect anti-TSP-4 autoantibodies or anti-COMP autoantibodies in the serum of patients with rheumatoid arthritis diagnosed by conventional methods, with some patients having extremely high concentrations compared to other RA patients.
  • anti-TSP-4 autoantibodies, anti-COMP autoantibodies or anti-CLEC3A autoantibodies or autoantibodies to other cartilage or bone components and degradation products or fragments thereof alone or in combination may be used as biochemical markers of osteoarthritis.
  • anti-TSP-4 autoantibodies or anti-COMP autoantibodies have also been detected in sera from RA patients, it is initially used in the diagnosis of osteoarthritis with detection of these autoantibodies required to exclude RA patients. Only then can a diagnosis of osteoarthritis be made according to the method of the present invention. The sensitivity of the detection can be further increased if the subject is tested for the presence of anti-collagen II autoantibodies.
  • the present invention relates in a 1.
  • a method of diagnosing osteoarthritis (including osteochondrosis) or the risk of developing osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis comprising detecting an autoantibody associated with osteoarthritis in a subject-derived sample ,
  • the present invention relates to this method, which method comprises excluding rheumatoid arthritis in the subject.
  • the present invention relates to this method, which method further comprises excluding the presence of an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof, preferably wherein said method comprises detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment More preferably, this method comprises detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof with a detection agent for detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention relates to this method, which method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or a fragment thereof or detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof.
  • TSP-4 thrombospondin-4
  • the present invention relates to this method of monitoring the course of osteoarthritis, comprising detecting the autoantibody at various times; or where the stage of osteoarthritis is diagnosed.
  • the present invention relates to this method, which method comprises detecting at least two autoantibodies, preferably wherein said method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or fragment thereof and detecting from an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof; or preferably wherein said method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or a fragment thereof and detecting an autoantibody against CLEC3A or a degradation product or a fragment thereof; more preferably, wherein said method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or fragment thereof, detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof and detecting an autoantibody against CLEC3A or a degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention relates to this method wherein the autoantibody is directed against a neoepitope of a degradation product of a protein against which the autoantibody is directed.
  • the present invention relates to this method, wherein the detection is with a detection agent, preferably wherein the detection agent is capable of binding to the antigen binding region of the autoantibody, more preferably wherein the detection agent is TSP-4 or a degradation product or a fragment thereof, COMP or a degradation product or a fragment thereof and / or CLEC3A or a degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention relates to this method wherein the sample is body fluid, preferably blood, serum, blood plasma, synovial fluid or urine, muscle or cartilage tissue, synovial membrane or tendon.
  • the term “comprising” means “comprising”, “comprising” etc. as used herein means including the disclosed features and other features that are not specifically mentioned.
  • the term “comprising” “comprising”, “comprising”, etc. is also understood in the sense of “consisting of” the disclosed features, other features than those disclosed are not included.
  • the method of the present invention may comprise further method steps, but may also consist only of the specified steps.
  • the kit of the present invention may comprise other ingredients, but may consist only of the specified ingredients.
  • Thrombospondin-4 is a protein encoded in humans by the TSP-4 gene.
  • the protein belongs to the thrombospondin protein family.
  • Thrombospondin family members are extracellular, adhesive glycosylated matrix proteins that are widely expressed in vertebrates (Lawler et al., 1995).
  • Five thrombospondin proteins, Thrombospondin-1 to Thrombospondin-4 and Oligomeric Cartilage Matrix Protein (COMP) are known.
  • Members of the thrombospondin family are activated during cell remodeling processes and mediate cell-to-cell and cell-to-matrix interactions.
  • Thrombospondin-4 a pentameric protein, plays a role in cellular migration, adhesion, and proliferation, allowing it to bind to fleparin and calcium. It is formed among other things in muscle and bone tissue.
  • TSP-4 has a length of 961 amino acids, with amino acids 1 to 26 forming the signal peptide and amino acids 27 to 961 the mature protein.
  • amino acid sequence of thrombospondin-4 which is disclosed herein as SEQ ID NO: 1.
  • the corresponding nucleotide and amino acid sequences are available from the NCBI (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, U.S.A., www.ncbi.nlm.nih.gov) under the accession number UniProtKB-P35443.2 (SEQ ID NO : 1) available.
  • COMP oligomeric cartilage matrix protein
  • ECM extracellular matrix
  • COMP occurs in the extracellular matrix surrounding cells that make up ligaments and tendons, and near cartilage-forming cells (chondrocytes).
  • the COMP protein is encoded by the COMP gene. Binding to other ECM proteins, such as collagen, appears to depend on divalent cations.
  • COMP is a marker for cartilage turnover. It seems to have a role in vascular wall modeling. In addition, it appears to play a role in cell growth and cell division and apoptosis as well as the regulation of cell movement and attachment.
  • the protein consists of five identical glycoprotein subunits, each with EGF-like and calcium-binding (thrombospondin-like) domains that bind strongly to calcium (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) ,
  • COMP has a length of 757 amino acids.
  • amino acid sequence of COMP disclosed herein as SEQ ID NO: 2.
  • the corresponding nucleotide and amino acid sequences are available from the NCBI (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, U.S.A., www.ncbi.nlm.nih.gov) under the accession number UniProtKB-P49747.2 (SEQ ID NO : 2) available.
  • C-type lectin domain family 3 member A is a cartilage-specific protein that is expressed more extensively in arthrotic cartilage. In addition to cartilage, it has so far only been detected in breast cancer tissue.
  • CLEC3A consists of three domains: a highly positively charged N-terminal domain, followed by an alpha-helical oligomerization domain and a C-terminal carbohydrate recognition domain (CRD).
  • CLEC3A binds to laminin and fibronectin and is cut by matrilysin (MMP-7) and other matrix proteases (Tsunezumi, 2009). Recently, more rapid activation of plasminogen by tissue plasminogen activator in the presence of CLEC3A has been demonstrated (10, 11, 12, 13).
  • CLEC3A has a length of 197 amino acids, with amino acids 1 to 22 forming the signal peptide and amino acids 23 to 197 the mature protein.
  • amino acid sequence of CLEC3A disclosed herein as SEQ ID NO: 3.
  • the corresponding nucleotide and amino acid sequences are available from the NCBI (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, U.S.A., www.ncbi.nlm.nih.gov) under the accession number UniProtKB-075596.1 SEQ ID NO: 3). available.
  • Collagen is a structural protein found mainly in connective tissue, more specifically the extracellular matrix, only in multicellular animals (including humans). Collagen consists of single, long collagen molecules that form a left-handed helix. Three of these helices each are arranged in a right-handed superhelix. The triple helix is stabilized by hydrogen bonding between the individual strands.
  • Type II collagen used in the present application for the diagnosis of osteoarthritis or the risk Osteoarthritis, which plays a role, occurs mainly in cartilage and acts as a structural protein of hyaline and elastic cartilage. Collagen II is recovered by isolation from cartilage according to the method of Vogel and Paulsson (1984) (14).
  • nucleotide and amino acid sequences are available from the NCBI (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, U.S.A., www.ncbi.nlm.nih.gov) under the accession number UniProtKB-P02458.3 (SEQ ID NO : 4) available.
  • TSP-4 any protein known as TSP-4, COMP, CLEC3A and collagen II, respectively.
  • the term also includes a protein having the same or similar functions as TSP-4, COMP, CLEC3A or collagen II, identified by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 , having.
  • the proteins may also be known under a different name.
  • TSP-4, COMP, CLEC3A or collagen II refers to any protein having an amino acid identity to the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 of at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.
  • TSP-4, COMP, CLEC3A or collagen II refers to any protein having an amino acid homology to the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 has at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100%.
  • TSP-4 forms pentamers and binds to heparin.
  • COMP also forms pentamers, binds to collagen II and is apparently involved in the fibrillogenesis of collagen II. Mutations in the COMP gene can cause PSACH (osteochondrodysplasias pseudoachondroplasia) and MED (multiple epiphyseal dysplasia).
  • CLEC3A leads to a faster activation of plasminogen by tissue plasminogen activator.
  • Collagen II is a structural component of the extracellular cartilage matrix, forms the cartilage framework and gives the cartilage its tensile strength.
  • TSP-4, COMP, CLEC3A or collagen II includes any proteins to which autoantibodies formed in subjects against TSP-4, COMP, CLEC3A and collagen II, respectively.
  • TSP-4 TSP-4
  • COMP COMP
  • CLEC3A collagen II
  • collagen II a fragment of TSP-4, COMP, CLEC3A and collagen II, respectively, as long as that fragment has the ability to bind to autoantibodies formed in subjects against TSP-4, COMP, CLEC3A and collagen II, respectively.
  • Such fragments preferably contain epitopes against which the autoantibodies are directed.
  • fragments of TSP-4, COMP, CLEC3A and collagen II have a length of at least 5 amino acids, more preferably a length of 5 to 100, even more preferably a length of 5 to 50, even more preferably a length of 10 to 50, more preferably a length of 15 to 50, even more preferably a length of 15 to 25 or 40 to 50, amino acids.
  • amino acid identity refers to the percentage of amino acid residues that are identical at corresponding positions in two optimally aligned sequences. It is constructed by comparing two optimally aligned sequences over a comparison window, wherein the fragment of the amino acid sequence in the comparison window may comprise additions or deletions (eg, gaps or overhangs) compared to the reference sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, which does not contain these additions or deletions, are determined for optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions where the identical amino acid residue occurs in both sequences by the same number Obtaining positions, dividing the number of equal positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result by 100.
  • Optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved by the homology algorithm of Smith and Waterman, 1981, by the homology alignment algorithm by Needleman and Wunsch, 1970, by the search for similarity methods of Pearson and Lipman, 1988, by the algorithm of Karlin and Altschul, 1990, modified by Karlin and Altschul, 1993, or by computer implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI). GAP and BESTFIT are preferably used to determine the optimal alignment. Typically, the default setting values of 5.00 are used for "gap weight” and 0.30 for "gap weight" length.
  • percent homology refers to the percentage of amino acid residues that are homologous at corresponding positions in two optimally aligned sequences.
  • the "percent homology” between two sequences is established in a manner substantially identical to what has been described above in relation to the determination of the "percentage of identity", except for the fact that homologous positions and not only identical positions are taken into account.
  • Two homologous amino acids are either two identical or two homologous amino acids.
  • Homologous amino acid residues have similar chemical and physical properties, for example, amino acids belonging to the same group: aromatic (Phe, Trp, Tyr), acidic (Glu, Asp), polar (Gin, Asn), basic (Lys, Arg, His ), aliphatic (Ala, Leu, lie, Val), with a
  • osteoarthritis refers to a non-inflammatory, associated with a change in state joint disease, short joint wear or joint wear.
  • the articular cartilage is usually chronically damaged over a longer period of time, which indicates osteoarthritis as a degenerative disease.
  • the disease also leaves its mark on neighboring tissue, the capsule, the bone and the muscles over time.
  • too Arthrosis deformans, osteoarthrosis, degenerative arthropathy or osteoarthritis are used which describe the same condition.
  • the prefix “Osteo” indicates that the joint bone is also involved in the disease.
  • the cause is an excess of stress (such as increased body weight), congenital or traumatic causes such as malalignment of the joints or bony deformity seen by bone diseases such as osteoporosis.
  • all joints can be affected by arthritic changes.
  • Secondary arthrosis is caused by mechanical overload (such as in hip dysplasia), inflammatory changes (such as in arthritis) or metabolic disorders (such as chondrocalcinosis).
  • Osteoarthritis may also be associated with overgrowth-related effusion (secondary inflammatory reaction) (activated osteoarthritis).
  • the term "osteoarthritis" includes osteochondrosis.
  • Osteoarthritis is classified into the Kellgren Lawrence scores 1 to 4 or the extent of cartilage damage in the Outerbridge Classifications I to IV, as determined by X-ray.
  • initial damage to the cartilage leads to changes in the bone.
  • stage I of the Outerbridge classification there is roughness and thinning of the cartilaginous layer, tangential fissures occur.
  • stage II hyaline cartilage is replaced by granulation tissue and inferior fibrocartilage. It forms pseudocysts from necrotic cartilage and bone tissue (rubble cyst).
  • stage III ulcerations already occur, the connective tissue and the chondrocytes proliferate.
  • stage IV the bone plate of a joint flattens out. To catch the pressure on the joint nevertheless, marginal ridges form on the bone (osteophytes).
  • Table 1 Overview of radiographic changes to determine Kellgren Lawrence scores. The respective applicable line determines the degree.
  • osteoarthritis The diagnosis of osteoarthritis is conventionally different depending on the joint involvement (hand, hip, knee).
  • the main criterion is joint pain (stress, onset, fatigue, permanent, night, end phase pain and pain radiation). Further criteria are typical radiographic findings (see Kellgren-Lawrence score), restricted mobility (eg restriction of internal rotation to below 15 ° in the hip), short phase of morning stiffness ( ⁇ 30 min knee, ⁇ 60 min hips), joint enlargement A / change without further clinical signs of inflammation, crepitations with palpation of the affected joints, older age (> 50 years), BSG ⁇ 40 mm / h, normal CRP ( ⁇ 5 mg / l), negative RF and anti-CCP.
  • osteoarthritis may be made if the main criterion and other clinical or serological criteria are met (for details see: https://www.hopkinsarthritis.org/physician-corner/education/arthritis-education- diagnostic-guidelines / (15- 17)).
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA Rheumatoid arthritis
  • the onset of the disease is often insidious and is associated with pain in the little finger or toe joints, but other joints may be affected, especially the hand, knee, shoulder, foot and hip joints.
  • the carpal bones, the metacarpophalangeal joints and the proximal interphalangeal joints are preferentially affected.
  • the affected joints swell and are overheated. Redness of the affected joints may be added. In the morning, these symptoms are usually most pronounced (morning stiffness). In the course of the disease, more and more joints are affected. Usually the disease progresses in batches; a boost typically lasts between a few weeks and months. Between the attacks, the complaints subsided. Diagnosis of RA is relatively safe and is done by laboratory diagnostics, clinical diagnostics, and imaging procedures according to the ACR / EULAR classification criteria (Aletaha et al., 2010).
  • Table 2 Diagnostic scheme according to the ACR / EULAR criteria. For each column, the highest score is awarded. The column points are summed. Rheumatoid arthritis is assured at> 6 points and assured synovitis in a typical joint (unless there is another cause of synovitis for the inflamed joint).
  • RF rheumatoid factor
  • anti-CCP-AK antibody to cyclic citrullinated peptides
  • CRP C-reactive protein
  • BSG erythrocyte sedimentation rate.
  • X-ray or MRI examinations are used in the imaging procedures in order to be able to estimate damage to the bones (erosions).
  • Typical radiological findings are subchondral osteoporosis, destruction of the surrounding bone, ankylosis and joint deformity (buttonhole deformity, gooseneck deformity, ulnar deviation).
  • soft tissue and bone scintigraphy With soft tissue and bone scintigraphy, the distribution pattern of the inflammatory activity of the various joints can be displayed quite well.
  • RA must be excluded in this subject. This is done using techniques known in the art.
  • the term "the subject does not have rheumatoid arthritis" therefore means that the subject is examined for RA by common methods. If RA is not detected with these methods, then the subject does not have RA in the meaning of the invention and can be supplied to the method of the present invention for the diagnosis of osteoarthritis or for the diagnosis of the risk of developing arthrosis.
  • the exclusion of RA may occur before, during, or after the detection of autoantibodies associated with osteoarthritis, but is preferably done before the diagnosis of osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis is made.
  • Autoantibodies are antibodies produced by a subject in response to a native protein (autoantigen).
  • autoantigen a native protein
  • individuals do not produce an immune response to native proteins and therefore do not produce antibodies to them.
  • native proteins are recognized as antigens, whereupon B cells that produce such autoantibodies are stimulated and autoantibodies are produced. This can lead to various autoimmune diseases.
  • the poor presentation of bone and cartilage tissue to the immune system may be the cause of the formation of autoantibodies against components of cartilage or bone or against neoepitopes, which are newly formed in the proteolytic degradation of these components.
  • the detection of autoantibodies against extracellular matrix proteins, their degradation products or fragments thereof is used for the diagnosis of osteoarthritis or a degenerative disease of the skeletal system.
  • autoantibody associated with osteoarthritis refers to autoantibodies in subjects suffering from osteoarthritis or who will develop osteoarthritis, while such autoantibodies will develop in non-arthritic subjects or those that do not develop arthrosis, z. B. with the methods referred to here, for. B. an antibody-based test method, for. B. an immunoblot test, can not be detected.
  • autoantibodies associated with osteoarthritis are those which are resistant to proteins of the extracellular cartilage matrix, proteins of the subchondral Extracellular bone matrix, proteins of the capsule or proteins of the extracellular muscle and tendon matrix, thus all proteins that can be released in the context of degradation / inflammatory processes at the joint, are directed.
  • the autoantibodies are directed against cartilage matrix proteins other than collagen II, more preferably the autoantibodies are directed against TSP-4, COMP and / or CLEC3A.
  • Animal studies have shown that autoantibodies to cartilage matrix proteins such as COMP have a pathophysiological significance and can lead to severe chronic arthritis.
  • the presence of autoantibodies associated with osteoarthritis or autoantibodies associated with a degenerative disease of the skeletal system is indicative of a pathophysiological role of these autoantibodies in the development, production and progression of arthritis in a subject of the degenerative disease of the skeletal system.
  • an autoantibody includes one or more autoantibodies.
  • autoantibody detection encompasses the detection of one (1) specific autoantibody with, e.g. As one (1) detection agent as well as the detection of more than one (1) specific autoantibodies such as 2, 3, 4, 5 or more autoantibodies with z. B. more than one (1) detection agent such as 2, 3, 4, 5 or more detection agents.
  • Cartilage matrix proteins are proteins that occur in the cartilage matrix.
  • a cartilage matrix is the extracellular matrix (ECM) of the cartilaginous tissue located between the cartilage cells.
  • the cartilage matrix consists of an unstructured ground substance and an organized network of collagen fibers. It can be subdivided into two areas: the territorial matrix (cartilaginous artery) and the interterritorial matrix (inter-territorial, interterritorial zone). It consists of a dense network of collagen fibers and together with the chondrocytes forms the chondrons ("territories").
  • the territorial matrix surrounds the chondrocytes and encloses them.
  • Typical proteins of the cartilage matrix are collagens (collagen I, II and III), proteins of the thrombospondin family and CLEC3A.
  • degradation product refers to a fragment of a protein, eg, TSP-4, COMP, or CLEC3A naturally derived in a subject from degradation processes, eg, by the action of proteases, from the full-length protein. TSP-4, COMP and CLEC3A as well as other proteins of the extracellular matrix, the degradation by secreted or membrane-bound proteases at the cellular level.
  • a degradation product may comprise an epitope that is already present in the native protein and therefore recognized by an autoantibody that also recognizes the native protein due to the epitope.
  • a degradation product may comprise an epitope that is already present in the native protein and therefore recognized by an autoantibody that also recognizes the native protein due to the epitope.
  • a degradation product may comprise an epitope that is already present in the native protein and therefore recognized by an autoantibody that also recognizes the native protein due to the epitope.
  • a degradation product may comprise an epitope that is already present in the native protein and therefore recognized by an autoantibody that also recognize
  • Degradation product include a neoepitope, which is newly formed due to the degradation.
  • neoepitopes are not normally recognized by autoantibodies to the native full-length proteins, but can stimulate the production of new autoantibodies.
  • detection agent means any molecule, substance, or reagent that specifically binds to or interacts with the autoantibody.
  • the detection agent is capable of binding to the antigen binding region of the autoantibody.
  • the detection agent is the full length autoantigen against which the autoantibody is directed, or a fragment thereof.
  • the detection agent is the cartilage matrix protein (autoantigen) itself against which the autoantibody is directed.
  • the autoantibody against TSP-4 can be detected by using full-length TSP-4, against COMP using full-length COMP, or against CLEC3A using full-length CLEC3A.
  • the detection agent may also be a fragment of the full-length autoantigen, provided that the fragment is bound by the autoantibody (antigenic fragment).
  • a fragment may comprise at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 30, at least 35, at least 40, at least 45, at least 50 or more than 50 Consist of amino acid residues of full-length car antigen.
  • Such a fragment may also be a degradation product as defined above.
  • Such a degradation product may include a neoepitope which is newly formed by the degradation and is absent from the native protein.
  • the present invention comprises a detection agent as defined above that is specifically directed against anti-collagen II autoantibodies.
  • This may be a full-length collagen II protein or a fragment thereof, including a degradation product.
  • another detection agent is a protein or peptide having an epitope that has a Amino acid identity or amino acid homology to an epitope of a full length autoantigen of at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100%, provided that this epitope of the protein or peptide binds specifically to an autoantibody, to the the full length autoantigen (eg SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4) binds.
  • the autoantigen or an antigenic fragment thereof may be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, recombinant DNA techniques may be used wherein a DNA molecule encoding the autoantigen or a fragment thereof may be engineered into a suitable expression vector. It may also be advantageous to construct fusion proteins that facilitate the labeling, immobilization or detection of the antigen (see A Laboratory Manual (4th Edition), Cold Spring Flarbor Laboratory Press, 2012). Alternatively, the autoantigen or an antigenic fragment thereof can be purified from natural sources, e.g. using protein separation techniques well known in the art. Such
  • Purification techniques include, but are not limited to, molecular sieve chromatography and / or ion exchange chromatography.
  • the identification of antigenic fragments of the autoantigen can be accomplished by methods known in the art. For example, Degradation products recognized by autoantibodies can be identified, purified and sequenced by immunoblots. Since cartilage matrix proteins are known in the art, these proteins are also commercially available. For example, TSP-4 and COMP can be purchased from R & D Systems, CLEC3A DNA from Sino Biological, and Collagen II from Merck.
  • Detection of an autoantibody in a sample taken from a subject may be accomplished by a variety of ways known to those of skill in the art. Exemplary methods include, but are not limited to, antibody-based (immunoassay-based) assays, including Western blotting, immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich immunoassay, radioimmunoassay (RIA),
  • antibody-based (immunoassay-based) assays including Western blotting, immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich immunoassay, radioimmunoassay (RIA),
  • Immunodiffusion test immunoradiometric assay, protein A immunoassay, proteomics procedure, surface plasmon resonance (SPR), chemiluminescence, Fluorescence polarization, phosphorescence, immunohistochemistry, immunofluorescence, microcytometry, microscopy, fluorescence activated cell sorting (FACS), flow cytometry, protein microarrays, mass spectrometry based techniques (including liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), nano-LC -MS / MS, matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI-MS), matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, surface-enhanced laser desorption / ionization mass spectrometry (SELDI) MS), Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization Time of Flight (SELDI-TOF) Mass Spectrometry, Surface Enhanced Af
  • the detection is preferably carried out with the aid of a detection agent.
  • a sample from a subject is contacted with the antigen under conditions permitting an immunospecific antigen-antibody binding reaction.
  • the antigen may be in solution or may be immobilized on a support.
  • the autoantibody can be immobilized on a support. If autoantibodies are present in the subject's sample, binding to the antigen occurs.
  • the preferred detection method is an antibody-based test method, in particular an immunoblot method in which z. B. the matrix protein is separated in a gel, transferred to a membrane and detected with a detection agent and labeled anti-IgG antibody. Further preferred detection methods are immunoassays, slot / dot blot methods, line blot methods, fluorescence detection on cells or tissue, surface plasmon resonance methods or biochip / protein array methods.
  • the detection agent essentially binds only to the autoantibody to be detected or interacts with it, while not binding to other substances or not interacts or does so only to a small extent.
  • substantially or “minor extent” is meant that the detection agent binds to the other substance to less than 10, 5, 4, 3, 2 or 1% of the extent to which the detection agent specifically binds to the autoantibody.
  • the proof can be qualitative and / or quantitative. This may require the inclusion of a reference to determine if and / or at what concentration the autoantibody is present in a particular amount of sample. Such a reference may be the autoantibody of known concentration, e.g. B.
  • the detection of the autoantibody in the sample and the dilution series is carried out under the same conditions.
  • Such a reference may alternatively be the detection reagent, e.g. B. is in a dilution series and binds or interacts with autoantibodies of defined concentration (s) to determine the concentration of the autoantibody from the sample of the subject.
  • the present invention relates to the method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis of the present invention, wherein the course of osteoarthritis is monitored, comprising detecting the autoantibody at different times; or where the stage of osteoarthritis is diagnosed.
  • the course is characterized by the different rapid progression of the disease (chronic progressive) z. B. depending on the reduction of the risk factors or possibly in the future depending on the therapy with the disease course modifying drugs.
  • the disease stage can be subdivided by means of X-ray into arthrosis grade (Kellgren Lawrence score). Typically, during the course of his illness, the osteoarthritis patient undergoes Kellgren-Lawrence's stadiums in succession.
  • cartilage joint capsule, subchondral bone, muscle and tendon
  • proteins or their fragments are released into the synovium and the bloodstream through the degradation of the extracellular cartilage matrix and thus presented to the immune system, which depends on the concentration of proteins or fragments forms autoantibodies.
  • increasing levels of autoantibodies indicate progression of osteoarthritis, while decreasing levels of autoantibodies indicate slowed or stopped progression.
  • the present invention in a second aspect further relates to a method of diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system in a subject comprising detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or a fragment thereof or the
  • the present invention relates to this method of the second aspect, wherein the degenerative disease of the skeletal system comprises rheumatoid arthritis or osteoarthritis.
  • the present invention relates to this method of the second aspect, which method comprises detecting at least two autoantibodies; Preferably, this method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or a fragment thereof and the
  • Detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof or preferably wherein said method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a degradation product or a fragment thereof and detecting an autoantibody against CLEC3A or a degradation product or a fragment thereof; more preferably, wherein this method comprises detecting an autoantibody against thrombospondin-4 (TSP-4) or a
  • a degradation product or a fragment thereof detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or fragment thereof, and detecting or detecting an autoantibody against CLEC3A
  • the present invention relates to this method of the second aspect, wherein the autoantibody against a neoepitope of a
  • Degradation product of a matrix protein is directed.
  • the present invention relates to this method of the second aspect, wherein the detection is with a detection agent, preferably wherein the detection agent is capable of binding to the antigen binding region of the autoantibody, more preferably wherein the detection agent is TSP-4 or a degradation product or a fragment thereof, COMP or a degradation product or a fragment thereof and / or CLEC3A or a
  • the present invention relates to this method of the second aspect, wherein the sample comprises body fluid, preferably blood, serum, Blood plasma, synovial fluid or urine, muscle or cartilage tissue, synovial membrane or tendon.
  • body fluid preferably blood, serum, Blood plasma, synovial fluid or urine, muscle or cartilage tissue, synovial membrane or tendon.
  • degenerative disease is generally meant the disease associated with progressive degeneration.
  • Degeneration refers to functional and / or morphological alterations of a cell, tissue, organ or whole organism which, compared to the full physiological performance, are a deterioration, for example due to regression, deterioration, degradation or loss of function due to plant or chronic damage factors.
  • degenerative disease of the skeletal system as used herein is meant the degeneration of the spine and joints or their cartilage components, preferably RA or osteoarthritis.
  • the invention further relates, in a third aspect, to a method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject comprising excluding the presence of an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof, preferably wherein the method comprises Prove, ie the step of detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof, more preferably wherein the method comprises detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof with a detection agent for detecting an autoantibody against collagen II Degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention relates to this method of the third aspect, wherein the osteoarthritis is additionally diagnosed by conventional methods.
  • the invention relates to the above method of the third aspect for diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject comprising excluding the presence of an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof, wherein lack of detection of an autoantibody against collagen II, or a degradation product or a fragment thereof, the subject is diagnosed as having arthritis, whereas if an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof is detected, the subject is diagnosed as having no arthritis.
  • the above method comprising detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof, according to the present invention, can be used alone to detect the presence of osteoarthritis or the non-existence of osteoarthritis in a subject.
  • this method can be used in addition to conventional diagnostic methods of osteoarthritis or in addition to the method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis of the present invention by detecting an autoantibody associated with osteoarthritis.
  • the non-detection or detection of an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof can be considered as an additional indication that osteoarthritis (non-detection) or that there is no arthritis (detection) in the subject.
  • the present invention relates to this method of the third aspect, wherein the sample comprises body fluid, preferably blood, serum, blood plasma, synovial fluid or urine, muscle or cartilage tissue,
  • the present invention further relates to a kit for diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject, wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, comprising a detection reagent for detecting an autoantibody associated with osteoarthritis, preferably wherein the detection agent a detection agent for detecting an autoantibody against TSP-4 or a degradation product or a fragment thereof or a detection agent for detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention further relates to a kit for diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system in a subject comprising a detecting agent for detecting an autoantibody against TSP-4 or a degradation product or a fragment thereof or a detection agent for detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof, preferably wherein the degenerative disease of the skeletal system comprises rheumatoid arthritis or osteoarthritis (including osteochondrosis).
  • the present invention relates to the kit as described above, wherein the detection agent comprises at least two detection agents for detecting at least two autoantibodies, preferably wherein the detection agent is a detection agent for detecting an autoantibody against TSP-4 or a degradation product or a fragment and a detection agent comprising detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof; or preferably wherein the detection agent comprises a detection agent for detecting an autoantibody against TSP-4 or a degradation product or a fragment thereof and a detection agent detecting an autoantibody against CLEC3A or a degradation product or a fragment thereof; More preferably, the detection agent is a detection agent for detecting an autoantibody against TSP-4 or a degradation product or a fragment thereof, a detection agent for detecting an autoantibody against COMP or a degradation product or a fragment thereof and a detection agent for detecting an autoantibody against CLEC3A or a degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention relates to the kit, wherein the kit further comprises a detection agent for detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or a fragment thereof.
  • the present invention further relates to the use of the osteoarthritis diagnostic kit or the risk of developing osteoarthritis in a subject wherein the subject is free of rheumatoid arthritis; or for diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system in a subject, preferably wherein the degenerative disease of the skeletal system comprises rheumatoid arthritis or osteoarthritis (including osteochondrosis).
  • the kit may further comprise, for the detection agent, a solid support such as a membrane (eg PVDF membrane), a chip, a sensor, a microtiter plate, beads, flask, glass, ceramic or metal that is synthetic, glass, ceramic, synthetic Polymers and biopolymers, for example cross-linked dextran or agarose, nylon, polyethylene or polystyrene.
  • a solid support such as a membrane (eg PVDF membrane), a chip, a sensor, a microtiter plate, beads, flask, glass, ceramic or metal that is synthetic, glass, ceramic, synthetic Polymers and biopolymers, for example cross-linked dextran or agarose, nylon, polyethylene or polystyrene.
  • the detection agent may already be immobilized on the solid support, or support and detection agent are contained in separate containers and the Detecting Agent is applied to the solid support and immobilized prior to use.
  • the detection agent is preferably present in one or more defined amounts to allow the estimation of the amount of autoanti
  • the kit may further comprise components suitable for carrying out the method of the present invention, for example, wash solutions or solutions or devices to perform a particular detection method, eg, SELDI mass spectrometry probes such as ProteinChip® arrays or fiber-based sensing devices, etc.
  • a washing solution can be used to wash off any residual samples after their application to the solid support to which the detection agent is immobilized, or to wash away residues of the detection agent applied to a solid support for immobilization.
  • the kit may include more than one type of anti-autoantibody detection agent.
  • the kit may include multiple cartilage matrix proteins associated with osteoarthritis, or degradation products or fragments thereof, eg, combinations of TSP-4 and COMP, TSP-4 and CLEC3A, or TSP-4 and COMP and CLEC3A, optionally with collagen II, or Degradation products or fragments thereof, in separate or equal containers.
  • multiple cartilage matrix proteins associated with osteoarthritis eg, combinations of TSP-4 and COMP, TSP-4 and CLEC3A, or TSP-4 and COMP and CLEC3A, optionally with collagen II, or Degradation products or fragments thereof, in separate or equal containers.
  • the kit may include instructions for carrying out the method of the present invention and / or interpreting the results, eg, in the form of a leaflet or booklet.
  • the instructions may inform the consumer how to recover the sample, if necessary immobilize the detection agent on the solid support, wash the support, and / or apply the sample.
  • the kit may additionally contain reference detection agent of a defined amount or in several defined amounts, the reference detection agent allowing the estimation of the concentration of the autoantibody in the sample.
  • the reference detection agent is the same as the actual detection agent, eg TSP-4, TSP-4 and COMP, TSP-4 and CLEC3A or TSP-4 and COMP and CLEC3A, optionally with collagen II, or degradation products or fragments thereof.
  • the kit may additionally contain autoantibodies of one or more particular concentrations, which may be already immobilized on a solid support to allow comparison with the autoantibody from the subject's sample. Or the kit can also provide reference Containing autoantibodies of a certain amount or in several specific amounts, if necessary in an additional container or already immobilized on a solid support, wherein the autoantibody allows the estimation of the concentration of the autoantibody in the sample.
  • the reference autoantibody (s) are the same as the actual autoantibody (s), eg TSP-4, TSP-4 and COMP, TSP-4 and CLEC3A or TSP-4 and COMP and CLEC3A, and optionally against collagen II, or degradation products or fragments thereof.
  • the present invention further relates to an active ingredient for use in the treatment or prevention of autoimmune-associated osteoarthritis in a subject, preferably wherein the active ingredient is rituximab.
  • the subject is the subject diagnosed by the present method.
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs eg, ibuprofen, diclofenac, indomethacin and napropxen and coxibs
  • opioids may also be used in cases of severe pain.
  • phases of acute joint inflammation may be an intra-articular administration of z.
  • the present invention is directed to the detection of autoantibodies associated with osteoarthritis. Animal studies have shown that autoantibodies to cartilage matrix proteins such as COMP have a pathophysiological significance and can lead to severe chronic arthritis.
  • autoantibodies associated with osteoarthritis are an indication of a pathophysiological role of these autoantibodies in the development, presentation, and progression of osteoarthritis.
  • the pathophysiology of autoantibodies therefore, allows the use of a specific, personalized therapy (personalized therapy) that includes general immunotherapy to suppress the formation of autoantibodies as well as therapy to suppress the formation of specific autoantibodies associated with osteoarthritis.
  • a specific, personalized therapy personalized therapy
  • a targeted therapy in which a cytostatic agent is transported by specific binding of an antigen to the immune cell and this is killed.
  • any type of therapy that reduces the concentration of autoantibodies, e.g.
  • Immunotherapies are treatments in which the immune system is affected. Depending on the disease, modulating (stimulating and suppressing) or substituting (replacing) methods are used. In autoimmune diseases, there are generally suppressive methods which suppress immunological processes, e.g. As the use of immunosuppressive agents, used to inhibit unwanted reactions of the immune system. Common immunosuppressants are z. Ciclosporin A, tacrolimus, sirolimus, azathioprine and methotrexate.
  • Immunosuppressive methods are also used in the context of the present invention in the treatment of immune-associated arthritis.
  • a therapy used in the context of the present invention is directed to a reduction of the plasma or B cells, wherein the therapy is preferably carried out by an intra-articular or systemic, particularly preferably intra-articular, administration of an active substance, which can bring about such a reduction, such , Rituximab, ofatumumab, ocrelizumab and epratuzumab, preferably rituximab.
  • Another form of therapy is treatment with drugs such as antibodies that neutralize or inhibit B cell-stimulating cytokines, e.g.
  • Anakinra, infliximab, adalimumab etanercept, tocilizumab Another form of therapy is the inhibition of the activation and proliferation of B cells by inhibiting signal transduction by z. B. belimumab and atacicept.
  • An important role in the activation and proliferation of B cells is the Wnt signal transduction.
  • An effective inhibitor of the Wnt signal transduction cascade is SM04690, which has been shown in preclinical studies to have a disease-modifying drug (DMOAD) effect.
  • Another drug already approved is fluoxetine (approved for the treatment of depression), which inhibits the Wnt signal transduction cascade and thus the proliferation of B cells.
  • an "active ingredient for use in the treatment or prevention of autoimmune-associated arthritis” is an immunosuppressant, an agent for reducing plasma or B cells, e.g. , Rituximab, an agent such as an antibody that neutralizes or inhibits B cell-stimulating cytokines, and / or an agent that inhibits signal transduction that results in the activation and proliferation of B cells, e.g. B. an agent that inhibits Wnt signal transduction, eg. B. SM04690 or fluoxetine.
  • cortisone preparations stimulate T helper cells, including TH2 cells, which in turn cause B cell activation and proliferation.
  • the present invention further relates to a method for diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis, or for diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system according to the present invention, wherein the method is used for therapy selection becomes.
  • the affected subjects can be selected for a therapy in which the arthritis or the degenerative disease of the skeletal system is treated by reducing the concentration of autoantibodies or prevented.
  • therapy selection refers to the selection of subjects diagnosed with osteoarthritis or degenerative disease of the skeletal system according to the invention for a therapy in which the concentration of autoantibodies is reduced, as described above.
  • the therapy includes an active ingredient for use in the treatment or prevention of autoimmune-associated osteoarthritis in a subject, preferably wherein the active ingredient is an antibody to B cells (eg, rituximab) or a Wnt signaling inhibitor (eg, fluoxetine or SM04690).
  • the active ingredient is an antibody to B cells (eg, rituximab) or a Wnt signaling inhibitor (eg, fluoxetine or SM04690).
  • the treatment is preferably intraarticular.
  • the present invention is directed to a method for detecting an autoantibody associated with osteoarthritis, or for diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, the method comprising: a) obtaining a sample from the subject; and
  • detecting whether an autoantibody associated with osteoarthritis is present in the sample may comprise contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent.
  • the above method may further comprise the steps of:
  • detecting whether an autoantibody against collagen II or a degradation product or fragment thereof is present in the sample which detection may comprise contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent.
  • the present invention is also directed to a method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, which method may include;
  • the detection comprises contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent;
  • the above method may further comprise the steps of:
  • detecting whether an autoantibody against collagen II or a degradation product or fragment thereof is present in the sample which detection may comprise contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent; iii) diagnosing the subject that it has osteoarthritis or a risk of developing osteoarthritis if an autoantibody against collagen II or a degradation product or fragment thereof is not detected in the sample.
  • the present invention is also directed to a method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis and treating osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, the method comprising:
  • the above method may further comprise the steps of:
  • Degradation product or fragment thereof is not detected in the sample.
  • the present invention is also directed to a method of treating or preventing osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, the method comprising administering a treatment for osteoarthritis to a subject diagnosed in the present invention.
  • the present invention is also directed to the use of a drug for the production of a medicament for the treatment of autoimmune-associated osteoarthritis in a subject.
  • the treatment may include a treatment in which the concentration of autoantibodies associated with osteoarthritis is reduced.
  • the treatment includes an immunosuppressant (e.g., ciclosporin A, tacrolimus, sirolimus, azathioprine, and methotrexate), an agent for reducing plasma or B cells, e.g. , Rituximab, ofatumumab, ocrelizumab and epratuzumab, an agent such as an antibody that neutralizes or inhibits B-cell-stimulating cytokines, e.g.
  • an immunosuppressant e.g., ciclosporin A, tacrolimus, sirolimus, azathioprine, and methotrexate
  • an agent for reducing plasma or B cells e.g. , Rituximab, ofatumumab, ocrelizumab and epratuzumab
  • an agent such as an antibody that neutralizes or inhibits
  • Anakinra, infliximab, adalimumab etanercept, tocilizumab, and / or an agent that inhibits signal transduction leading to the activation and proliferation of B cells e.g. B. an agent that inhibits signal transduction, (eg Belimumab and Atacicept) such.
  • the present invention is directed to a method for detecting an autoantibody associated with a degenerative disease of the skeletal system, or for diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system, in a subject Method includes:
  • the present invention is also directed to a method of diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system in a subject, the method comprising:
  • detecting whether an autoantibody associated with a degenerative disease of the skeletal system is present in the sample which detection may comprise contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent;
  • the present invention is also directed to a method of diagnosing a degenerative disease of the skeletal system or the risk of developing a degenerative disease of the skeletal system and treating a degenerative disease of the skeletal system in a subject, the method comprising:
  • b) detecting whether an autoantibody associated with a degenerative disease of the skeletal system is present in the sample which detection may comprise contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent; c) diagnosing the subject as having a degenerative disease of the skeletal system or a risk of developing a degenerative disease of the skeletal system when an autoantibody associated with a degenerative disease of the skeletal system is detected in the sample; and d) administering treatment of the degenerative disease of the skeletal system to the diagnosed subject.
  • the present invention is also directed to a method of treating or preventing a degenerative disease of the skeletal system in a subject, the method comprising administering a treatment of the degenerative disease of the skeletal system to a subject diagnosed in the present invention.
  • a pharmaceutical composition comprises the active ingredient for the treatment of a disease and a pharmaceutically acceptable carrier known in the art.
  • the drug may be formulated for various administration forms, e.g. For local intra-articular or systemic administration (oral, intravenous, subcutaneous, intramuscular).
  • the active ingredient is administered in an effective amount which can be determined by one skilled in the art or is known to the person skilled in the art, wherein the amount of the active ingredient can be based on already known amounts of this active ingredient for the treatment of other diseases.
  • the effective amount depends on this different factors such as dosage form, age, body weight, sex, duration of treatment and similar factors.
  • the drug may be in the form of a solution, suspension, tablet, capsule or powder, further as a paste, ointment, oil, cream, lotion, foam, gel or suppository.
  • the treatment may include a treatment in which the concentration of autoantibodies associated with the degenerative disease of the skeletal system is reduced.
  • the treatment comprises an immunosuppressant, an agent for reducing plasma or B cells, e.g. , Rituximab, an agent such as an antibody that neutralizes or inhibits B cell-stimulating cytokines, and / or an agent that inhibits signal transduction that results in the activation and proliferation of B cells, e.g. B. an agent that inhibits Wnt signal transduction, eg. B.
  • RA RA
  • an autoantibody against TSP-4 or a degradation product or fragment thereof or against COMP or a degradation product or fragment thereof the treatment, as indicated above, ie with an immunosuppressant, a drug for the reduction of plasma or B cells, e.g. , Rituximab, a drug such as an antibody that neutralizes or inhibits B cell-stimulating cytokines, and / or an agent that inhibits signal transduction that results in the activation and proliferation of B cells, e.g. B. an agent that inhibits Wnt signal transduction, eg. B.
  • SM04690 or fluoxetine preferably with rituximab, over the current treatment with, in this order, is (1) methotrexate (MTX) as monotherapy or (2) in combination with or alternatively to the administration of biologicals (wholly or nearly with endogenous substances identical preparations) and (3) administration of rituximab is preferred, to avoid joint damage in the initial phase, to prefer.
  • MTX methotrexate
  • rituximab administration of rituximab is preferred, to avoid joint damage in the initial phase, to prefer.
  • the present invention is directed to a method for detecting an autoantibody against collagen II or a degradation product or fragment thereof or for diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis includes:
  • Degradation product or fragment thereof is present in the sample, the detection comprising contacting the sample with a detection agent and
  • Detecting the binding between the autoantibody and the detection agent can include.
  • the present invention is also directed to a method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, the method comprising:
  • Degradation product or fragment thereof is present in the sample, the detection comprising contacting the sample with a detection agent and
  • the present invention is also directed to a method of diagnosing osteoarthritis or the risk of developing osteoarthritis and treating osteoarthritis in a subject wherein the subject does not have rheumatoid arthritis, the method comprising:
  • detecting whether an autoantibody against collagen II or a degradation product or fragment thereof is present in the sample which detection may comprise contacting the sample with a detection agent and detecting the binding between the autoantibody and the detection agent;
  • the treatment is as described above and / or a conventional treatment for relieving the symptoms.
  • the research groups are either osteoarthritis or rheumatoid arthritis (RA) patients.
  • the inclusion criteria for the osteoarthritis group are clinically proven osteoarthritis (OA) of the large joints.
  • Exclusion criteria are indications of rheumatoid arthritis or other underlying autoimmune or malignant diseases.
  • Inclusion criteria for the RA group are a secured RA according to the ACR / EULAR classification criteria.
  • Exclusion criteria are osteoarthritis or other underlying autoimmune or malignant diseases.
  • Exclusion criteria are diagnostic evidence of osteoarthritis, RA, autoimmune or malignant underlying diseases.
  • the serum was examined in 10 osteoarthritis patients, 10 RA patients and 10 healthy controls. All samples were provided by our cooperation partner Prof. Pongratz, rheumatology of the University Hospital Dusseldorf.
  • the gene of human CLEC3A was cloned into a modified pCEP-Pu vector and transfected into HEK-293 EBNA cells.
  • the recombinant protein was purified by affinity chromatography from the supernatant of the cells.
  • Human collagen II was purified from human cartilage (PMID: 6439184).
  • Recombinant human TSP-4 (R & D) and recombinant human COMP (R & D) were ordered from the respective manufacturer.
  • the matrix proteins were separated by SDS-PAGE and detected by immunoblot.
  • the proteins (1 pgA / well each) were performed after SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris gel: 12 wells, 1 mm thickness, MOPS buffer, 200 V for 50 min).
  • TSP-4, CLEC3A, COMP and collagen II autoantibodies for the diagnosis of osteoarthritis -
  • OA osteoarthritis
  • RA rheumatoid arthritis
  • HD healthy volunteers
  • TSP4, CLEC3A, COMP and collagen II autoantibodies in the blood and / or in synovial fluid can be used for diagnostics, especially for early diagnosis, osteoarthritis or activated osteoarthritis as well as for the diagnosis, monitoring and therapy of a Arthrosis are used (Table 1).
  • Table 1 a Number of positive antibody reactivities against the various matrix proteins in comparison of OA and HD. Frequencies were given in relation to group strength. Significant differences are marked with * . (Source: http://www.socscistatistics.com/tests/fisher/Default2.aspx).
  • the diagnostic value can be significantly increased (Table 2).
  • Table 2 Number of positive antibody reactivities cumulatively against several proteins in the groups OA and HD. Frequencies were in each case in relation to Group strength specified. For the cumulative comparisons, the differences in the distribution of the absolute frequencies among the two groups are highly significant. Collagen II autoantibodies could only be detected in the HD group. OA patients did not show collagen II autoantibodies. The lack of detection of collagen II autoantibodies therefore serves as a positive result for OA.
  • TSP-4, CLEC3A and COMP Antibodies for Therapy Selection in Osteoarthritis Several studies have shown that it can be obtained by immunizing animals with collagen II (CIA, collagen ll-induced arthritis) or COMP (COMPIA) severe, chronic arthritis occurs in the animals. Antibodies against matrix proteins have a pathophysiological significance in these animal models (the RA). This shows that even human autoantibodies against matrix proteins can develop a pathophysiological effect and therefore patients with autoantibodies to matrix proteins are susceptible to immunosuppressive therapy. An important criterion for the pathogenicity seems to be the number of different autoantibodies and / or the autoantibody concentration (autoantibody titer) in the blood. In our study, two autoantibodies are present in two OA patients and the antibody intensities against the different antigens are different.
  • TGF-beta1 transforming growth factor beta
  • MMP-7 cleaves C-type lectin domain family 3 member A (CLEC3A) on tumor cell surface and modulates its cell adhesion activity. J Cell Biochem, 2009. 106 (4): p. 693-702.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose, umfassend das Nachweisen von einem Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, ein Verfahren zur Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems, umfassend das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 oder COMP, ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose, umfassend das Ausschließen des Vorliegens eines Autoantikörpers gegen Kollagen II, einen Kit zur Diagnose von Arthrose oder einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems, umfassend ein Nachweisagens für einen Autoantikörper, die Verwendung des Kits zur Diagnose von Arthrose bzw. einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems, einen Wirkstoff zur Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung einer autoimmun-assoziierten Arthrose und das Diagnoseverfahren zur Therapieauswahl von Subjekten.

Description

Nachweis von Autoantikörpern zur Diagnose von degenerativen Erkrankungen des Skelettsystems
Bei der Arthrose handelt es sich um die häufigste degenerative Gelenkerkrankung weltweit. Etwa zwei Drittel der Menschen über 65 Jahre sind von der Erkrankung betroffen. Die Ätiologie der Arthrose ist weitestgehend unbekannt. Zu den wichtigsten Risikofaktoren der Arthrose zählen Alter, Überbelastung und genetische Prädisposition. Derzeit existiert keine krankheitsmodifizierende, medikamentöse Therapie und grundlegende Probleme bei der Entwicklung von Medikamenten sind die unbekannte Ätiologie und die komplexen Pathomechanismen der Arthrose.
Ein weiteres Problem bei der Entwicklung eines krankheitsmodifizierenden Medikaments für die Arthrose ist das Fehlen sensitiver biochemischer Marker, mit denen der Erfolg einer Therapie geprüft werden kann. Die Diagnose der Arthrose erfolgt derzeit durch anamnestische Daten, Ausschluss anderer Gelenkerkrankungen, radiologische Untersuchungen und Athroskopie. Die bildgebenden Untersuchungen führen zu einer Belastung des Patienten, sind mit hohem Aufwand und Kosten verbunden, liefern jedoch nur eine grobe Aussage über das Erkrankungsstadium und können nur die späteren Krankheitsstadien darstellen. Eine Therapie- bzw. Verlaufskontrolle sowie Einteilung des Krankheitsstadiums ist mit den bisherigen Methoden kaum möglich. Die Identifikation und Validierung eines knorpel- oder knochenspezifischen Moleküls als biochemischen Marker der Arthrose ist bisher nicht gelungen. Somit existieren derzeit keine validen biochemischen Marker zur Diagnose der Arthrose.
Dean et al. (2014) beschreiben die Messung von Autoantikörper im präklinischen Stadium von rheumatoider Arthritis.
Stoll et al. (2011 ) beschreiben die Autoantikörper-Produktion bei juveniler idiopathischer Arthritis als Marker für den Krankheitsverlauf. Es wurden Autoantikörper gegen eine Vielzahl von Antigenen bestimmt, darunter auch Proteine der extrazellulären Matrix.
Jescke et al. beschreiben Thrombospondin-4 als Bestandteil von Gelenkknorpel. Die Autoren haben auch die Konzentration von Thrombospondin-4 im Serum von
Patienten mit Arthrose gemessen. Die Thrombospondin-4-Konzentration ist gegenüber gesunden Kontroll-Probanden nicht signifikant verschieden und daher kein valider Biomarker.
Somit ist im Stand der Technik die Bestimmung von Autoantikörpern zur Diagnose von rheumatoider Arthritis, nicht jedoch von Arthrose bekannt. Während es sich bei den klassischen Rheumafaktoren um Antikörper (meist der Klasse IgM) handelt, welche die Fc-Region anderer Antikörper erkennen, sind in letzter Zeit vermehrt Autoantikörper in den Fokus gerückt, die gegen Antigene gerichtet sind, welche im Laufe von Degenerationsprozessen von Proteinen freigesetzt werden. Flierzu gehören, wie in Stoll et al. (2011 ) beschrieben, auch Komponenten der extrazellulären Matrix. Die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung, nämlich die Bestimmung von Autoantikörper gegen Thrombospondin-4, COMP und/oder CLEC3A bei der Arthrose, sind jedoch nicht im Stand der Technik beschrieben.
Somit besteht ein Bedarf an Verfahren, die die Bestimmung von Arthrose bzw. von degenerativen Erkrankungen des Skelettsystems im Allgemeinen bei einem Subjekt erlauben. Weiterhin besteht ein Bedarf an Verfahren, die eine Beurteilung des Erkrankungsstadiums sowie eine Therapie- bzw. Verlaufskontrolle erlauben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren, die den Nachweis von Arthrose bei einem Individuum sowie die Beurteilung des Stadiums und Fortschritts der Arthrose erlauben. Die hier genannten Erfinder haben überraschenderweise entdeckt, dass Arthrose mit der Bildung von Autoantikörpern gegen Bestandteile von Knorpel oder Knochen und deren Degradationsprodukte assoziiert ist. Bei der Degeneration des Knorpels oder des Knochens kommt es zur kontinuierlichen Freisetzung von Matrixbestandteilen wie z. B. Thrombospondin-4 (TSP-4), COMP und CLEC3A. Da das Knorpelgewebe dem Immunsystem nur minder präsentiert wird, kann es im Verlauf der Erkrankung zur Stimulierung und Bildung von Autoantikörpern gegen Bestandteile von Knorpel oder Knochen bzw. gegen Neoepitope, die im Verlauf der Erkrankung bei der proteolytischen Degradation dieser Bestandteile entstehen, kommen. Dabei gehen die Erfinder davon aus, dass es in Abhängigkeit von der Menge der Freisetzung von Knorpelmatrixproteinen, z. B. TSP-4, COMP und/oder CLEC3A, zu einer Bildung von Autoantikörpern gegen diese Matrixproteine kommt. Die hier genannten Erfinder konnten im Serum von Arthrose-Patienten überraschenderweise anti-TSP-4-Autoantikörper nachweisen. Zudem wurden im Serum von weiteren Arthrose-Patienten autoreaktive Banden nachgewiesen, die deutlich kleiner als Volllängen-TSP-4 sind. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um Degradationsprodukte von TSP-4. Alternativ oder zusätzlich konnten die hier genannten Erfinder im Blut von Arthrose-Patienten überraschenderweise anti-COMP- Autoantikörper und/oder anti-CLEC3A-Autoantikörper nachweisen, wobei ein kombinierter Nachweis von anti-TSP-4-Autoantikörpern und anti-COMP- Autoantikörpern und/oder anti-CLEC3A-Autoantikörpern im Vergleich zu Einzelnachweisen der Autoantikörper zu einer erhöhten Nachweisrate von Arthrose führte. Bei gesunden Probanden konnten keine anti-TSP-4- und anti-CLEC3A- Autoantikörper nachgewiesen werden, und anti-COMP-Autoantikörper wurden mit sehr geringer Häufigkeit nachgewiesen. Darüber hinaus fanden die hier genannten Erfinder, dass bei keinem der Subjekte, bei denen Arthrose mit herkömmlichen Verfahren diagnostiziert worden war, anti-Kollagen Il-Autoantikörper nachgewiesen werden konnten, während bei Subjekten, bei denen Arthrose mit herkömmlichen Verfahren nicht diagnostiziert worden war, anti-Kollagen Il-Autoantikörper nachgewiesen werden konnten. Diese Befunde sind deswegen so überraschend, als bei Arthrose bisher kein Zusammenhang mit der Bildung von Autoantikörpern gefunden wurde und Autoantikörpern keine pathomechanistische Bedeutung zugemessen wurde.
Die hier genannten Erfinder konnten außerdem anti-TSP-4-Autoantikörper oder anti- COMP-Autoantikörper im Serum von Patienten mit durch herkömmliche Verfahren diagnostizierter rheumatoider Arthritis nachweisen, wobei manche Patienten extrem hohe Konzentrationen verglichen mit anderen RA-Patienten aufwiesen.
Somit können anti-TSP-4-Autoantikörper, anti-COMP-Autoantikörper oder anti- CLEC3A-Autoantikörper oder Autoantikörper gegen andere Bestanteile des Knorpels oder des Knochens sowie Degradationsprodukte oder Fragmente davon alleine oder in Kombination als biochemische Marker von Arthrose dienen. Der Nachweis von anti-TSP-4-Autoantikörpern, anti-COMP-Autoantikörpern oder anti-CLEC3A- Autoantikörpern oder Autoantikörpern gegen andere Bestandteile des Knorpels oder des Knochens oder von Degradationsprodukten davon alleine oder in Kombination sowie Autoantikörper-Titerbestimmungen in Proben eines Subjekts erlauben neben der Diagnose der Erkrankung eine Therapie- bzw. Verlaufskontrolle sowie eine Diagnose des Stadiums von Arthrose. Da anti-TSP-4-Autoantikörper oder anti- COMP-Autoantikörper auch in Seren von RA-Patienten nachgewiesen wurden, ist es bei der Diagnose von Arthrose unter Nachweis dieser Autoantikörper zunächst erforderlich, RA-Patienten auszuschließen. Erst dann kann eine Diagnose von Arthrose gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgen. Die Sensitivität des Nachweises kann noch erhöht werden, wenn das Subjekt auf das Vorhandensein von anti-Kollagen Il-Autoantikörpern getestet wird. Wurde bei dem Subjekt aufgrund des Vorhandenseins von anti-TSP-4-Autoantikörpern, anti-COMP- Autoantikörpern und/oder anti-CLEC3A-Autoantikörpern oder Autoantikörpern gegen andere Bestanteile des Knorpels oder des Knochens sowie Degradationsprodukten oder Fragmenten davon alleine oder in Kombination Arthrose diagnostiziert, so kann die Abwesenheit des Nachweises von anti-Kollagen Il-Autoantikörpern als weiteres Indiz gewertet werden, dass Arthrose vorliegt. Darüberhinaus kann das der Nachweis von anti-Kollagen Il-Autoantikörpern in einem Subjekt als Indiz gewertet werden, dass keine Arthrose oder kein Risiko, Arthrose zu entwickeln, bei dem Subjekt vorliegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem 1 . Aspekt ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose (inklusive Osteochondrose) oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, umfassend das Nachweisen eines Autoantikörpers, der mit Arthrose assoziiert ist, in einer von dem Subjekt stammenden Probe.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei das Verfahren das Ausschließen von rheumatoider Arthritis bei dem Subjekt umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei dieses Verfahren weiterhin das Ausschließen des Vorliegens eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst, bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst, stärker bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon mit einem Nachweisagens zum Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei der Verlauf von Arthrose überwacht wird, umfassend den Nachweis des Autoantikörpers zu verschiedenen Zeitpunkten; oder wobei das Stadium von Arthrose diagnostiziert wird.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei dieses Verfahren das Nachweisen von mindestens zwei Autoantikörpern umfasst, bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; oder bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; stärker bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei der Autoantikörper gegen ein Neoepitop eines Degradationsprodukts eines Proteins, gegen das der Autoantikörper gerichtet ist.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei das Nachweisen mit einem Nachweisagens erfolgt, bevorzugt wobei das Nachweisagens fähig ist, an die Antigenbindungsregion des Autoantikörpers zu binden, stärker bevorzugt wobei das Nachweisagens TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und/oder CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon ist. In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren, wobei die Probe Körperflüssigkeit, bevorzugt Blut, Serum, Blutplasma, Synovialflüssigkeit oder Urin, Muskel- oder Knorpelgewebe, Synovialmembran oder Sehne ist.
Der Begriff “umfasst”“umfassen”,“umfassend” etc., wie hierin verwendet, bedeutet das Einschließen der offenbarten Merkmale und weiterer Merkmale, die nicht spezifisch erwähnt sind. Der Begriff “umfasst” “umfassen”, “umfassend” etc. wird auch in dem Sinn von „bestehend aus“ den offenbarten Merkmalen verstanden, wobei weitere Merkmale als die offenbarten nicht eingeschlossen sind. So kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung weitere Verfahrensschritte umfassen, kann aber auch nur aus den spezifizierten Schritten bestehen. Auch der Kit der vorliegenden Erfindung kann weitere Bestandteile umfassen, kann aber auch nur aus den spezifizierten Bestandteilen bestehen.
Thrombospondin-4 ist ein Protein, das in Menschen von dem TSP-4-Gen codiert wird. Das Protein gehört zur Thrombospondin-Proteinfamilie. Thrombospondin- Familienmitglieder sind extrazelluläre, adhäsive glykosylierte Matrixproteine, die verbreitet in Vertebraten exprimiert werden (Lawler et al., 1995). Es sind fünf Thrombospondin-Proteine, Thrombospondin-1 bis Thrombospondin-4 und Oligomeres Knorpelmatrix-Protein (COMP), bekannt. Die Mitglieder der Thrombospondin-Familie werden während Zellumbauprozessen aktiviert und vermitteln Zell-zu-Zell- und Zell-zu-Matrix-lnteraktionen. Thrombospondin-4, eine pentameres Protein, spielt bei zellulärer Migration, Adhäsion sowie Proliferation eine Rolle, wobei es an Fleparin und Calcium binden kann. Es wird unter anderem in Muskel- und Knochengewebe gebildet.
TSP-4 hat eine Länge von 961 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren 1 bis 26 das Signalpeptid und die Aminosäuren 27 bis 961 das reife Protein bilden. Für veranschaulichende Zwecke, ohne darauf beschränkt zu sein, wird auf die Aminosäuresequenz von Thrombospondin-4 Bezug genommen, die hierin als SEQ ID NR: 1 offenbart ist. Die entsprechende Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind von der NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov) unter der Zugangsnummer UniProtKB - P35443.2 (SEQ ID NR: 1 ) erhältlich.
1 MLAPRGAAVL LLHLVLQRWL AAGAQATPQV FDLLPSSSQR LNPGALLPVL TDPALNDLYV
61 ISTFKLQTKS SATIFGLYSS TDNSKYFEFT VMGRLNKAIL RYLKNDGKVH LWFNNLQLA
121 DGRRHRILLR LSNLQRGAGS LELYLDCIQV DSVHNLPRAF AGPSQKPETI ELRTFQRKPQ 181 DFLEELKLW RGSLFQVASL QDCFLQQSEP LAATGTGDFN RQFLGQMTQL NQLLGEVKDL 241 LRQQVKETSF LRNTIAECQA CGPLKFQSPT PSTWPPAPP APPTRPPRRC DSNPCFRGVQ 301 CTDSRDGFQC GPCPEGYTGN GITCIDVDEC KYHPCYPGVH CINLSPGFRC DACPVGFTGP 361 MVQGVGISFA KSNKQVCTDI DECRNGACVP NSICVNTLGS YRCGPCKPGY TGDQIRGCKA 421 ERNCRNPELN PCSVNAQCIE ERQGDVTCVC GVGWAGDGYI CGKDVDIDSY PDEELPCSAR 481 NCKKDNCKYV PNSGQEDADR DGIGDACDED ADGDGILNEQ DNCVLIHNVD QRNSDKDIFG 541 DACDNCLSVL NNDQKDTDGD GRGDACDDDM DGDGIKNILD NCPKFPNRDQ RDKDGDGVGD 601 ACDSCPDVSN PNQSDVDNDL VGDSCDTNQD SDGDGHQDST DNCPTVINSA QLDTDKDGIG 661 DECDDDDDND GIPDLVPPGP DNCRLVPNPA QEDSNSDGVG DICESDFDQD QVIDRIDVCP 721 ENAEVTLTDF RAYQTWLDP EGDAQIDPNW WLNQGMEIV QTMNSDPGLA VGYTAFNGVD 781 FEGTFHVNTQ TDDDYAGFIF GYQDSSSFYV VMWKQTEQTY WQATPFRAVA EPGIQLKAVK 841 SKTGPGEHLR NSLWHTGDTS DQVRLLWKDS RNVGWKDKVS YRWFLQHRPQ VGYIRVRFYE 901 GSELVADSGV TIDTTMRGGR LGVFCFSQEN IIWSNLKYRC NDTIPEDFQE FQTQNFDRFD 961 N
(SEQ ID NR: 1 )
Ein anderes Protein der Thrombospondin-Proteinfamilie ist das Oligomere Knorpelmatrix-Protein (COMP), auch als Thrombospondin-5 bekannt. Es ist ein extrazelluläres Matrix (ECM)-Protein, das hauptsächlich im Knorpel vorkommt. Spezifisch kommt COMP in der extrazellulären Matrix, die Zellen umgibt, die Bänder und Sehnen ausmachen, und nahe Knorpel-bildenden Zellen (Chondrozyten) vor. Im Menschen wird das COMP-Protein von dem COMP-Ge n codiert. Bindung an andere ECM-Proteins wie Kollagen scheint von divalenten Kationen abzuhängen. COMP ist ein Marker für Knorpel-Turnover. Es scheint eine Rolle bei der vaskulären Wandummodellierung zu haben. Darüber hinaus scheint es eine Rolle bei Zellwachstum und Zellteilung und der Apoptose sowie der Regulierung von Zellbewegung und Zellanheftung zu spielen. Es kann die Interaktion von Chondrozyten mit extrazellulärer Knorpelmatrix durch Interaktion mit Zelloberflächen- Integrinrezeptoren vermitteln. Das Protein besteht aus fünf identischen Glykoprotein- Untereinheiten, jede mit EGF-ähnlichen und Calcium-bindenden (Thrombospondin- ähnlichen) Domänen, die stark an Calcium binden (1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9).
COMP hat eine Länge von 757 Aminosäuren. Für veranschaulichende Zwecke, ohne darauf beschränkt zu sein, wird auf die Aminosäuresequenz von COMP Bezug genommen, die hierin als SEQ ID NR: 2 offenbart ist. Die entsprechende Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind von der NCBI (National Center for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov) unter der Zugangsnummer UniProtKB - P49747.2 (SEQ ID NR: 2) erhältlich.
1 MVPDTACVLL LTLAALGASG QGQSPLGSDL GPQMLRELQE TNAALQDVRE LLRQQVREIT
61 FLKNTVMECD ACGMQQSVRT GLPSVRPLLH CAPGFCFPGV ACIQTESGAR CGPCPAGFTG
121 NGSHCTDVNE CNAHPCFPRV RCINTSPGFR CEACPPGYSG PTHQGVGLAF AKANKQVCTD
181 INECETGQHN CVPNSVCINT RGSFQCGPCQ PGFVGDQASG CQRRAQRFCP DGSPSECHEH
241 ADCVLERDGS RSCVCAVGWA GNGILCGRDT DLDGFPDEKL RCPERQCRKD NCVTVPNSGQ
301 EDVDRDGIGD ACDPDADGDG VPNEKDNCPL VRNPDQRNTD EDKWGDACDN CRSQKNDDQK 361 DTDQDGRGDA CDDDIDGDRI RNQADNCPRV PNSDQKDSDG DGIGDACDNC PQKSNPDQAD
421 VDHDFVGDAC DSDQDQDGDG HQDSRDNCPT VPNSAQEDSD HDGQGDACDD DDDNDGVPDS
481 RDNCRLVPNP GQEDADRDGV GDVCQDDFDA DKWDKIDVC PENAEVTLTD FRAFQTWLD
541 PEGDAQIDPN WWLNQGREI VQTMNSDPGL AVGYTAFNGV DFEGTFHVNT VTDDDYAGFI
601 FGYQDSSSFY WMWKQMEQT YWQANPFRAV AEPGIQLKAV KSSTGPGEQL RNALWHTGDT
661 ESQVRLLWKD PRNVGWKDKK SYRWFLQHRP QVGYIRVRFY EGPELVADSN WLDTTMRGG
721 RLGVFCFSQE NI IWANLRYR CNDTIPEDYE THQLRQA
(SEQ ID NR: 2)
C-Typ-Lektindomänen-Familie 3-Mitglied A (CLEC3A; englisch: C-type lectin domain family 3 member A) ist ein knorpelspezifisches Protein, welches in arthrotischem Knorpel verstärkt exprimiert wird. Neben Knorpel wurde es bisher nur in Brustkrebsgewebe nachgewiesen. CLEC3A besteht aus drei Domänen: einer stark positiv geladenen N-terminalen Domäne, gefolgt von einer alpha-helikalen Oligomerisierungsdomäne und einer C-terminalen Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne (CRD; englisch: Carbohydrate Recognition Domain). CLEC3A bindet an Laminin und Fibronektin und wird von Matrilysin (MMP-7) und anderen Matrixproteasen geschnitten (Tsunezumi, 2009). Vor kurzem wurde eine schnellere Aktivierung von Plasminogen durch tissue-Plasminogenaktivator in der Gegenwart von CLEC3A gezeigt (10, 11 , 12, 13).
CLEC3A hat eine Länge von 197 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren 1 bis 22 das Signalpeptid und die Aminosäuren 23 bis 197 das reife Protein bilden. Für veranschaulichende Zwecke, ohne darauf beschränkt zu sein, wird auf die Aminosäuresequenz von CLEC3A Bezug genommen, die hierin als SEQ ID NR: 3 offenbart ist. Die entsprechende Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind von der NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov) unter der Zugangsnummer UniProtKB - 075596.1 SEQ ID NR: 3) erhältlich.
1 MAKNGLVICI LVITLLLDQT TSHTSRLKAR KHSKRRVRDK DGDLKTQIEK LWTEVNALKE
61 IQALQTVCLR GTKVHKKCYL ASEGLKHFHE ANEDCISKGG ILVIPRNSDE INALQDYGKR
121 SLPGVNDFWL GINDMVTEGK FVDVNGIAIS FLNWDRAQPN GGKRENCVLF SQSAQGKWSD
181 EACRSSKRYI CEFTIPQ
(SEQ ID NR: 3)
Kollagen (Vorstufe Tropokollagen) ist ein nur bei vielzelligen Tieren (einschließlich Menschen) vorkommendes Strukturprotein hauptsächlich des Bindegewebes, genauer der extrazellulären Matrix). Kollagen besteht aus einzelnen, langen Kollagenmolekülen, die eine linksgängige Helix ausbilden. Jeweils drei dieser Helices sind in einer rechtsgängigen Superhelix arrangiert. Die Tripelhelix wird durch Wasserstoffbrücken zwischen den einzelnen Strängen stabilisiert. Kollagen Typ II, das in der vorliegenden Anmeldung für die Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, eine Rolle spielt, kommt hauptsächlich im Knorpel vor und fungiert als Strukturprotein des hyalinen und des elastischen Knorpels. Die Gewinnung von Kollagen II erfolgt durch Isolierung aus Knorpel nach dem Verfahren von Vogel und Paulsson (1984) (14). Die entsprechende Nukleotid- und Aminosäuresequenzen sind von der NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov) unter der Zugangsnummer UniProtKB - P02458.3 (SEQ ID NR: 4) erhältlich.
1 MIRLGAPQTL VLLTLLVAAV LRCQGQDVQE AGSCVQDGQR YNDKDVWKPE PCRICVCDTG 61 TVLCDDI ICE DVKDCLSPEI PFGECCPICP TDLATASGQP GPKGQKGEPG DIKDIVGPKG 121 PPGPQGPAGE QGPRGDRGDK GEKGAPGPRG RDGEPGTPGN PGPPGPPGPP GPPGLGGNFA 181 AQMAGGFDEK AGGAQLGVMQ GPMGPMGPRG PPGPAGAPGP QGFQGNPGEP GEPGVSGPMG 241 PRGPPGPPGK PGDDGEAGKP GKAGERGPPG PQGARGFPGT PGLPGVKGHR GYPGLDGAKG 301 EAGAPGVKGE SGSPGENGSP GPMGPRGLPG ERGRTGPAGA AGARGNDGQP GPAGPPGPVG 361 PAGGPGFPGA PGAKGEAGPT GARGPEGAQG PRGEPGTPGS PGPAGASGNP GTDGIPGAKG
421 SAGAPGIAGA PGFPGPRGPP GPQGATGPLG PKGQTGEPGI AGFKGEQGPK GEPGPAGPQG 481 APGPAGEEGK RGARGEPGGV GPIGPPGERG APGNRGFPGQ DGLAGPKGAP GERGPSGLAG 541 PKGANGDPGR PGEPGLPGAR GLTGRPGDAG PQGKVGPSGA PGEDGRPGPP GPQGARGQPG 601 VMGFPGPKGA NGEPGKAGEK GLPGAPGLRG LPGKDGETGA AGPPGPAGPA GERGEQGAPG 661 PSGFQGLPGP PGPPGEGGKP GDQGVPGEAG APGLVGPRGE RGFPGERGSP GAQGLQGPRG 721 LPGTPGTDGP KGASGPAGPP GAQGPPGLQG MPGERGAAGI AGPKGDRGDV GEKGPEGAPG 781 KDGGRGLTGP IGPPGPAGAN GEKGEVGPPG PAGSAGARGA PGERGETGPP GPAGFAGPPG 841 ADGQPGAKGE QGEAGQKGDA GAPGPQGPSG APGPQGPTGV TGPKGARGAQ GPPGATGFPG 901 AAGRVGPPGS NGNPGPPGPP GPSGKDGPKG ARGDSGPPGR AGEPGLQGPA GPPGEKGEPG 961 DDGPSGAEGP PGPQGLAGQR GIVGLPGQRG ERGFPGLPGP SGEPGKQGAP GASGDRGPPG
1021 PVGPPGLTGP AGEPGREGSP GADGPPGRDG AAGVKGDRGE TGAVGAPGAP GPPGSPGPAG 1081 PTGKQGDRGE AGAQGPMGPS GPAGARGIQG PQGPRGDKGE AGEPGERGLK GHRGFTGLQG 1141 LPGPPGPSGD QGASGPAGPS GPRGPPGPVG PSGKDGANGI PGPIGPPGPR GRSGETGPAG 1201 PPGNPGPPGP PGPPGPGIDM SAFAGLGPRE KGPDPLQYMR ADQAAGGLRQ HDAEVDATLK 1261 SLNNQIESIR SPEGSRKNPA RTCRDLKLCH PEWKSGDYWI DPNQGCTLDA MKVFCNMETG
1321 ETCVYPNPAN VPKKNWWSSK SKEKKHIWFG ETINGGFHFS YGDDNLAPNT ANVQMTFLRL 1381 LSTEGSQNIT YHCKNSIAYL DEAAGNLKKA LLIQGSNDVE IRAEGNSRFT YTALKDGCTK 1441 HTGKWGKTVI EYRSQKTSRL PI IDIAPMDI GGPEQEFGVD IGPVCFL
(SEQ ID NR: 4)
Der Begriff„TSP-4“,„COMP“,„CLEC3A” oder„Kollagen II“, wie hierin verwendet, ist jegliches Protein, das als TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II bekannt ist. Der Begriff umfasst auch ein Protein, das gleiche oder ähnliche Funktionen wie TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II, identifiziert durch SEQ ID NR: 1 , SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4, aufweist. Dabei können die Proteine auch unter einem anderen Namen bekannt sein. Alternativ bezieht sich der Begriff TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II auf jedes Protein, das eine Aminosäureidentität zu der Sequenz von SEQ ID NR: 1 , SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% hat. Alternativ bezieht sich der Begriff TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II auf jedes Protein, das eine Aminosäurehomologie zu der Sequenz von SEQ ID NR: 1 , SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100% hat. Funktionen bzw. Eigenschaften von TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II sind: TSP-4 bildet Pentamere und bindet an Heparin. COMP bildet auch Pentamere, bindet an Kollagen II und ist offenbar an der Fibrillogenese von Kollagen II beteiligt. Mutationen im COMP-Gen können PSACH (osteochondrodysplasias pseudoachondroplasia) und MED (multiple epiphyseal dysplasia) verursachen. CLEC3A führt zu einer schnelleren Aktivierung von Plasminogen durch tissue-Plasminogenaktivator. Kollagen II ist Strukturbestandteil der extrazellulären Knorpelmatrix, bildet das Knorpelgrundgerüst und gibt dem Knorpel seine Zugfestigkeit. Unter den Begriff TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II fallen jegliche Proteine, an die Autoantikörper, die in Subjekten gegen TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II gebildet werden, binden.
Der Begriff „TSP-4“,„COMP“ ,„CLEC3A” oder„Kollagen II“, wie hierin verwendet, bezieht sich auch auf ein Fragment von TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II, solange dieses Fragment die Fähigkeit besitzt, an Autoantikörper, die in Subjekten gegen TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II gebildet werden, zu binden. Bevorzugt enthalten solche Fragmente Epitope, gegen die die Autoantikörper gerichtet sind. Stärker bevorzugt haben Fragmente von TSP-4, COMP, CLEC3A bzw. Kollagen II eine Länge von mindestens 5 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt eine Länge von 5 bis 100, noch stärker bevorzugt eine Länge von 5 bis 50, noch stärker bevorzugt eine Länge von 10 bis 50, noch stärker bevorzugt eine Länge von 15 bis 50 noch stärker bevorzugt eine Länge von 15 bis 25 oder 40 bis 50, Aminosäuren.
Der Prozentsatz der„Aminosäureidentität“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Prozentsatz von Aminosäureresten, die an entsprechenden Positionen in zwei optimal zueinander ausgerichteten Sequenzen identisch sind. Er wird durch Vergleich von zwei optimal zueinander ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster, wobei das Fragment der Aminosäuresequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (z. B. Lücken oder Überhänge) umfassen kann, im Vergleich zu der Referenzsequenz SEQ ID NR: 1 , SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4, die diese Additionen oder Deletionen nicht enthält, zur optimalen Ausrichtung der zwei Sequenzen bestimmt. Der Prozentsatz wird berechnet durch Bestimmen der Anzahl von Positionen, an denen der identische Aminosäurerest in beiden Sequenzen vorkommt, um die Anzahl an gleichen Positionen zu erhalten, Teilen der Anzahl der gleichen Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen in dem Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100. Optimale Ausrichtung der Sequenzen für den Vergleich kann durch den Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, 1981 , durch den Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman und Wunsch, 1970, durch die Suche nach Ähnlichkeitsverfahren von Pearson und Lipman, 1988, durch den Algorithmus von Karlin und Altschul, 1990, modifiziert durch Karlin und Altschul, 1993, oder durch Computerimplementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software-Packet, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl) durchgeführt werden. GAP und BESTFIT werden bevorzugt verwendet, um die optimale Ausrichtung zu bestimmen. Typischerweise werden die Standardeinstellungswerte von 5,00 für„gap weight“ und 0,30 für„gap weight“-Länge verwendet.
Der Begriff "Prozent Homologie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Prozentsatz von Aminosäureresten, die an entsprechenden Positionen in zwei optimal zueinander ausgerichteten Sequenzen homolog sind. Der "Prozent Homologie" zwischen zwei Sequenzen ist in einer Weise etabliert, die dem, was vorstehend in Bezug auf die Bestimmung des „Prozentsatzes an Identität“ beschrieben wurde, im Wesentlichen identisch ist, außer der Tatsache, dass bei der Berechnung auch homologe Positionen und nicht nur identische Positionen berücksichtigt werden. Zwei homologe Aminosäuren sind entweder zwei identische oder zwei homologe Amoinosäuren. Homologe Aminosäurereste haben ähnliche chemisch-physikalische Eigenschaften, zum Beispiel Aminosäuren, die zu der gleichen Gruppe gehören: aromatisch (Phe, Trp, Tyr), sauer (Glu, Asp), polar (Gin, Asn) , basisch (Lys, Arg, His), aliphatisch (Ala, Leu, lie, Val), mit einer
Hydroxylgruppe (Ser, Thr) oder mit einer kurzen Seitenkette (Gly, Ala, Ser, Thr, Met). Es wird erwartet, dass Substitutionen zwischen solchen homologen Aminosäuren den Proteinphänotyp nicht verändern (konservative Substitutionen).
Der Begriff „Arthrose“ bezeichnet eine nicht-entzündliche, mit einer Zustandsänderung verbundene Gelenkerkrankung, kurz Gelenkverschleiß oder Gelenkabnutzung. Dabei wird der Gelenkknorpel meistens über einen längeren Zeitraum chronisch geschädigt, was Arthrose als degenerative Erkrankung ausweist. Die Erkrankung hinterlässt mit der Zeit auch im benachbarten Gewebe, der Gelenkkapsel, dem Knochen und der Muskulatur Spuren. Oft werden auch die Ausdrücke Arthrosis deformans, Osteoarthrose, degenerative Arthropathie oder Osteoarthritis verwendet, die das gleiche Krankheitsbild beschreiben. Dabei weist die Vorsilbe„Osteo“ darauf hin, dass auch der Gelenkknochen an der Krankheit beteiligt ist. Als Ursache werden ein Übermaß an Belastung (etwa erhöhtes Körpergewicht), angeborene oder traumatisch bedingte Ursachen wie Fehlstellungen der Gelenke oder auch knöcherne Deformierung durch Knochenerkrankungen wie Osteoporose gesehen. Grundsätzlich können alle Gelenke von arthrotischen Veränderungen betroffen sein. Man unterscheidet mehrere Arten von Arthrose. Bei der primären Arthrose wird eine biologische Minderwertigkeit des Knorpelgewebes unklarer Ursache angenommen. Sekundäre Arthrosen entstehen durch mechanische Überlastung (etwa bei Hüftgelenksdysplasie), entzündliche Veränderungen (etwa bei Arthritiden) oder metabolische Störungen (etwa bei Chondrokalzinose). Die Arthrose kann auch mit überlastungsbedingter Ergussbildung (sekundäre Entzündungsreaktion) einhergehen (aktivierte Arthrose). In dem Begriff„Arthrose“ ist Osteochondrose eingeschlossen.
Die Arthrose wird nach dem Röntgenbefund in die Kellgren-Lawrence-Scores 1 bis 4 oder nach dem Ausmaß der Knorpelschädigung in die Outerbridge-Klassifikationen I bis IV eingeteilt. Bei der Arthrose führt eine anfängliche Knorpelschädigung im weiteren Verlauf zu Veränderungen am Knochen. Im Stadium I der Outerbridge- Klassifikation kommt es zu Rauigkeiten und Ausdünnung der Knorpelschicht, tangentiale Fissuren treten auf. Im Stadium II wird hyaliner Knorpel durch Granulationsgewebe und minderwertigere Faserknorpel ersetzt. Es bilden sich Pseudozysten aus nekrotischem Knorpel- und Knochengewebe (Geröllzyste). Im Stadium III treten bereits Ulcerationen auf, das Bindegewebe und die Chondrozyten proliferieren. Im Stadium IV flacht die Knochenplatte eines Gelenkes ab. Um den Druck auf dem Gelenk dennoch abzufangen, bilden sich Randwülste am Knochen (Osteophyten).
Tabelle 1 : Übersicht über röntgenologische Veränderungen zur Bestimmung der Kellgren-Lawrence-Scores. Die jeweils zutreffende Zeile bestimmt den Grad.
Die Diagnose der Arthrose erfolgt herkömmlicherweise abhängig vom Gelenkbefall (Hand, Hüfte, Knie) unterschiedlich. Hauptkriterium ist der Gelenkschmerz (Belastungs-, Anlauf-, Ermüdungs-, Dauer-, Nacht-, Endphasenschmerz und Schmerzausstrahlung). Weitere Kriterien sind typische Röntgenbefunde (siehe Kellgren-Lawrence-Score), Bewegungseinschränkungen (z.B. Einschränkung der Innenrotation auf unter 15° in der Hüfte), kurze Phase der Morgensteifigkeit (< 30 min Knie, < 60 min Hüfte), GelenkvergrößerungA/eränderung ohne weitere klinischen Entzündungszeichen, Krepitationen unter Palpation der befallenen Gelenke, höheres Alter (> 50 Jahre), BSG < 40 mm/h, normales CRP (< 5 mg/l), negativer RF und Anti- CCP. Die Diagnose Arthrose darf gestellt werden, wenn das Hauptkriterium und weitere klinische oder serologische Kriterien erfüllt sind (für Details siehe: https://www.hopkinsarthritis.org/physician-corner/education/arthritis-education- diagnostic-guidelines/(15-17)).
Die „rheumatoide Arthritis“ (RA) ist die häufigste entzündliche Erkrankung der Gelenke. Sie kommt bei ca. 1 % der erwachsenen Bevölkerung vor. Der Krankheitsbeginn ist oft schleichend und geht mit Schmerzen in den kleinen Finger- oder Zehengelenken einher, wobei aber auch andere Gelenke betroffen sein können, insbesondere Hand-, Knie-, Schulter, Fuß- und Hüftgelenke. Typischerweise werden bevorzugt die Handwurzelknochen, die Fingergrundgelenke und die proximalen Interphalangealgelenke befallen. Die betroffenen Gelenke schwellen an und sind überwärmt. Eine Rötung der betroffenen Gelenke kann hinzukommen. Morgens sind diese Symptome meist am stärksten ausgeprägt (Morgensteifigkeit). Im Krankheitsverlauf werden immer mehr Gelenke befallen. Meist verläuft die Krankheit schubweise; ein Schub dauert typischerweise zwischen einigen Wochen und Monaten an. Zwischen den einzelnen Schüben lassen die Beschwerden nach. Die Diagnose von RA ist relativ sicher und erfolgt durch Labordiagnostik, Klinikdiagnostik und bildgebende Verfahren entsprechend der ACR/EULAR- Klassifikationskriterien (Aletaha et al ., 2010)
Tabelle 2: Diagnoseschema nach den ACR/EULAR-Kriterien. Pro Spalte wird der höchste erreichte Punktwert vergeben. Die Spaltenpunkte werden summiert. Eine Rheumatoide Arthritis ist gesichert bei >6 Punkte und gesicherter Synovitis in einem typischen Gelenk (sofern für das entzündete Gelenk keine andere Ursache für die Synovitis vorliegt). RF=Rheuma Faktor, Anti-CCP-AK=Antikörper gegen cyclisch- citrullinierte Peptide, CRP=C-Reaktives Protein, BSG=Blutsenkungsgeschwindigkeit.
Bei den bildgebenden Verfahren werden Röntgen- oder MRT-Untersuchungen verwendet, um Schädigungen der Knochen (Erosionen) abschätzen zu können. Typische radiologische Befunde sind subchondrale Osteoporose, Destruktionen des umliegenden Knochens, Ankylosen und Gelenkfehlstellungen (Knopflochdeformität, Schwanenhalsdeformität, Ulnardeviation). Mit der Weichteil- und Knochenszintigraphie kann das Verteilungsmuster der Entzündungsaktivität der verschiedenen Gelenke recht gut dargestellt werden. Um gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Arthrose oder das Risiko, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt zu diagnostizieren, muss RA bei diesem Subjekt ausgeschlossen werden. Dies erfolgt unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren. Der Begriff „wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist“ bedeutet deshalb, dass das Subjekt mit den gängigen Methoden auf RA untersucht wird. Wenn mit diesen Methoden RA nicht festgestellt wird, dann weist das Subjekt im Sinne der Erfindung keine RA auf und kann dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Diagnose von Arthrose oder zur Diagnose des Risikos, Arthrose zu entwickeln, zugeführt werden. Der Ausschluss von RA kann vor, während oder nach dem Nachweis von Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, erfolgen, erfolgt bevorzugt aber, bevor die Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, durchgeführt wird.
Autoantikörper sind Antikörper, die von einem Subjekt in Reaktion auf ein natives Protein (Autoantigen) erzeugt werden. In der Regel erzeugen Individuen keine Immunantwort auf native Proteine und produzieren deshalb keine Antikörper gegen sie. Doch in seltenen Fällen werden die eigenen nativen Proteine als Antigene erkannt, woraufhin B-Zellen, die solche Autoantikörper bilden, stimuliert und Autoantikörper produziert werden. Dies kann zu verschiedenen Autoimmunerkrankungen führen. Die geringe Präsentation von Knochen- und Knorpelgewebe gegenüber dem Immunsystem kann der Grund für die Bildung von Autoantikörpern gegen Bestandteile von Knorpel oder Knochen bzw. gegen Neoepitope, die bei der proteolytischen Degradation dieser Bestandteile neu entstehen, sein. In der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis von Autoantikörper gegen extrazelluläre Matrixproteine, deren Degradationsprodukte oder Fragmente davon zur Diagnose von Arthrose oder einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems verwendet.
Der Begriff „Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Autoantikörper in Subjekten, die an einer Arthrose leiden oder die eine Arthrose entwickeln werden, während ein solcher Autoantikörper in Subjekten ohne Arthrose oder die keine Arthrose entwickeln werden, z. B. mit den hier in Bezug genommenen Verfahren, z. B. einem Antikörper-basiertem Testverfahren, z. B. einem Immunblottest, nicht nachgewiesen werden kann. Autoantikörper, die mit Arthrose assoziiert sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche, die gegen Proteine der extrazellulären Knorpelmatrix, Proteine der subchondralen extrazellulären Knochenmatrix, Proteine der Gelenkkapsel oder Proteine der extrazellulären Muskel und Sehnenmatrix, folglich alle Proteine, die im Rahmen der Degradations/Enzündungsprozesse am Gelenk freigesetzt werden können, gerichtet sind. Bevorzugt sind die Autoantikörper gegen Knorpelmatrixproteine außer Kollagen II gerichtet, wobei stärker bevorzugt die Autoantikörper gegen TSP-4, COMP und/oder CLEC3A gerichtet sind. Im Tierversuch wurde nachgewiesen, dass Autoantikörper gegen Knorpelmatrixproteine wie COMP eine pathophysiologische Bedeutung haben und zu schwerer chronischer Arthritis führen können. Somit ist das Vorliegen von Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, oder von Autoantikörpern, die mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert sind, bei einem Subjekt ein Hinweis auf eine pathophysiologische Rolle dieser Autoantikörper beim Entstehen, beim Aufweisen und bei der Progression von Arthrose bzw. der degenerativen Erkrankung des Skelettsystems.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „ein Autoantikörper“ ein oder mehrere Autoantikörper. Somit umfasst der Begriff „Nachweisen eines Autoantikörpers“ das Nachweisen von einem (1 ) spezifischen Autoantikörper mit z. B. einem (1 ) Nachweisagens als auch das Nachweisen von mehr als einem (1 ) spezifischen Autoantikörper wie 2, 3, 4, 5 oder mehr Autoantikörpern mit z. B. mehr als einem (1 ) Nachweisagens wie 2, 3, 4, 5 bzw. mehr Nachweisagentien.
Knorpelmatrixproteine sind Proteine, die in der Knorpelmatrix Vorkommen. Als Knorpelmatrix bezeichnet man die zwischen den Knorpelzellen gelegene extrazelluläre Matrix (EZM) des Knorpelgewebes. Die Knorpelmatrix besteht aus einer unstrukturierten Grundsubstanz und einem organisierten Netz aus Kollagenfasern. Sie kann in zwei Bereiche unterteilt werden: die territoriale Matrix (Knorpelhof) und die interterritoriale Matrix (Interterritorien, Interterritorialzone). Sie besteht aus einem dichten Netzwerk von Kollagenfasern und bildet zusammen mit den Chondrozyten die Chondrone ("Territorien"). Die territoriale Matrix umgibt die Chondrozyten und schließt sie dadurch ein. Typische Proteine der Knorpelmatrix sind Kollagene (Kollagen I, II und III), Proteine der Thrombospondinfamilie und CLEC3A.
Der Begriff “Degradationsprodukt”, wie hierin verwendet, bezeichnet ein Fragment eines Proteins, z.B. TSP-4, COMP oder CLEC3A, das auf natürliche Weise in einem Subjekt durch Abbauprozesse, z.B. unter Einwirkung von Proteasen, aus dem Volllängenprotein hervorgegangen ist. TSP-4, COMP und CLEC3A unterliegen dabei, wie auch andere Proteine der extrazellulären Matrix, dem Abbau durch sezernierte oder membranständige Proteasen auf zellulärer Ebene. Ein Degradationsprodukt kann ein Epitop umfassen, das bei dem nativen Protein bereits vorhanden ist und deshalb von einem Autoantikörper erkannt wird, der auch das native Protein aufgrund des Epitops erkennt. Alternativ kann ein
Degradationsprodukt ein Neoepitop umfassen, das aufgrund der Degradation neu gebildet wird. Solche Neoepitope werden normalerweise nicht durch Autoantikörper gegen die nativen Volllängenproteine erkannt, sondern können die Bildung neuer Autoantikörper stimulieren.
Wie hierin verwendet, versteht man unter„Nachweisagens“ ein beliebiges Molekül, eine beliebige Substanz oder ein beliebiges Reagenz, das/die spezifisch an den Autoantikörper bindet oder mit ihm interagiert. Bevorzugt ist das Nachweisagens fähig, an die Antigenbindungsregion des Autoantikörpers zu binden. Folglich ist in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Nachweisagens das Volllängen-Autoantigen, gegen das der Autoantikörper gerichtet ist, oder ein Fragment davon. Zum Beispiel ist das Nachweisagens das Knorpelmatrixprotein (Autoantigen) selbst, gegen das der Autoantikörper gerichtet ist. So kann der Autoantikörper gegen TSP-4 durch Verwendung von Volllängen-TSP-4, gegen COMP durch Verwendung von Volllängen-COMP oder gegen CLEC3A durch Verwendung von Volllängen-CLEC3A detektiert werden. Das Nachweisagens kann auch ein Fragment des Volllängen-Autoantigens sein, sofern das Fragment von dem Autoantikörper gebunden wird (antigenes Fragment). Ein solches Fragment kann aus mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 30, mindestens 35, mindestens 40, mindestens 45, mindestens 50 oder mehr als 50 Aminosäureresten des Volllängenautoantigens bestehen. Ein solches Fragment kann auch ein Degradationsprodukt sein, wie vorstehend definiert. Ein solches Degradationsprodukt kann ein Neoepitop umfassen, das durch die Degradation neu gebildet wird und bei dem nativen Protein nicht vorhanden ist. Zum Nachweis von anti-Kollagen II- Autoantikörpern umfasst die vorliegende Erfindung ein Nachweisagens, wie vorstehend definiert, das spezifisch gegen anti-Kollagen Il-Autoantikörper gerichtet ist. Dieses kann ein Volllängen-Kollagen Il-Protein oder ein Fragment davon, einschließlich eines Degradationsprodukts, sein. Alternativ ist ein weiteres Nachweisagens ein Protein oder Peptid mit einem Epitop, das eine Aminosäureidentität oder Aminosäurehomologie zu einem Epitop eines Volllängenautoantigens von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100% aufweist, sofern dieses Epitop des Proteins oder Peptids spezifisch an einen Autoantikörper bindet, an den das Volllängenautoantigen (z. B. SEQ ID NR: 1 , 2, 3 oder 4) bindet.
Das Autoantigen oder ein antigenes Fragment davon kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können rekombinante DNA- Techniken verwendet werden, wobei ein DNA-Molekül, das das Autoantigen oder ein Fragment davon kodiert, gentechnisch in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden kann. Es kann auch vorteilhaft sein, Fusionsproteine zu konstruieren, die die Markierung, Immobilisierung oder Detektion des Antigens erleichtern (vgl. A Laboratory Manual (4. Auflage), Cold Spring Flarbor Laboratory Press, 2012). Alternativ kann das Autoantigen oder ein antigenes Fragment davon aus natürlichen Quellen gereinigt werden, z.B. unter Verwendung von Proteintrennungstechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Solche
Reinigungstechniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Molekularsiebchromatographie und/oder lonenaustauschchromatographie. Die Identifikation von antigenen Fragmenten des Autoantigens kann durch Verfahren erfolgen, die im Stand der Technik bekannt sind. Z.B. können Degradationsprodukte, die durch Autoantikörper erkannt werden, durch Immunblots identifiziert, gereinigt und sequenziert werden. Da Knorpelmatrixproteine im Stand der Technik bekannt sind, sind diese Proteine auch kommerziell erhältlich. Z.B. können TSP-4 und COMP von R & D Systems, CLEC3A DNA von Sino Biological und Kollagen II von Merck erworben werden.
Der Nachweis von einem Autoantikörper in einer Probe, die einem Subjekt entnommen wurde, kann durch eine Vielzahl von Arten erreicht werden, wie sie einem Fachmann bekannt sind. Beispielhafte Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper-basierte (Immuntest-basierte) Testverfahren, einschließlich Western-Blot-Verfahren, Immunblot-Verfahren, Enzym-verknüpften Immunsorptionstest (ELISA), Sandwich-Immuntest, Radioimmuntest (RIA),
Immunpräzipitations- und Dissoziations-verstärkten Lanthanidfluor-Immuntest (DELFIA), Präzipitin-Reaktion, Geldiffusions-Präzipitin-Reaktion,
Immundiffusionstest, immunradiometrischen Test, Protein-A-Immuntest, Proteomics- Verfahren, Oberflächenplasmonresonanz (SPR), Chemilumineszenz, Fluoreszenzpolarisation, Phosphoreszenz, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Mikrocytometrie, Mikroskopie, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), Durchflusszytometrie, Protein-Mikroarrays, Massenspektrometrie-basierten Techniken (einschließlich Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS), Nano-LC-MS/MS, Matrix-unterstützte Laser- Desorption/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS), Matrix-unterstützte Laser- Desorption/Ionisation-Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie, oberflächenverstärkte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (SELDI- MS), oberflächenverstärkte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit (SELDI-TOF)- Massenspektrometrie, oberflächenverstärktes Affinitätseinfangen (SEAC), oberflächenverstärkte Reindesorption (SEND) oder oberflächenverstärkte photolabile Anheftungs- und Freisetzungs (SEPAR)-Massenspektrometrie.
Bevorzugt wird der Nachweis mit Hilfe eines Nachweisagens durchgeführt. Dabei wird eine Probe von einem Subjekt mit dem Antigen unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine immunspezifische Antigen-Antikörper-Bindungsreaktion erlauben. Das Antigen kann in Lösung sein oder kann auf einem Träger immobilisiert sein. Umgekehrt kann der Autoantikörper auf einem Träger immobilisert sein. Falls in der Probe des Subjekts Autoantikörper vorhanden sind, erfolgt eine Bindung an das Antigen. Das bevorzugte Nachweisverfahren ist dabei ein Antikörper-basiertes Testverfahren, insbesondere ein Immunblot-Verfahren, bei dem z. B. das Matrixprotein in einem Gel aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit einem Nachweisagens und markiertem anti-lgG-Antikörper detektiert wird. Weitere bevorzugte Nachweisverfahren sind Immunoassays,, Slot/Dotblot-Verfahren, Lineblot-Verfahren, Fluoreszenznachweis auf Zellen oder Gewebe, Oberflächenplasmonresonanz-Verfahren oder Biochip/Proteinarray-Verfahren.
Unter„spezifisch bindet“ oder„spezifisch interagiert“ oder„immunspezifisch“ wird hierin verstanden, dass das Nachweisagens im Wesentlichen nur an den Autoantikörper bindet, der nachgewiesen werden soll, oder mit ihm interagiert, während es an andere Substanzen nicht bindet oder nicht mit ihnen interagiert oder dies nur in geringem Ausmaß tut. „Im Wesentlichen“ oder „geringes Ausmaß“ bedeutet, dass das Nachweisagens an die andere Substanz zu weniger als 10, 5, 4, 3, 2 oder 1 % des Ausmaßes bindet, mit dem das Nachweisagens spezifisch an den Autoantikörper bindet. Der Nachweis kann qualitativ und/oder quantitativ erfolgen. Dies kann die Hinzuziehung einer Referenz erfordern, um zu bestimmen, ob und/oder in welcher Konzentration der Autoantikörper in einer bestimmten Probenmenge vorliegt. Eine solche Referenz kann der Autoantikörper von bekannter Konzentration sein, der z. B. in einer Verdünnungsreihe vorliegt. Um die Konzentration des Autoantikörpers in einer Probe von einem Subjekt messen zu können, wird der Nachweis des Autoantikörpers in der Probe und der Verdünnungsreihe unter gleichen Bedingungen durchgeführt. Eine solche Referenz kann alternativ das Nachweisreagenz sein, das z. B. in einer Verdünnungsreihe vorliegt und mit Autoantikörpern definierter Konzentration/en bindet oder interagiert, um die Konzentration des Autoantikörpers von der Probe des Subjekts zu bestimmen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung das Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, der vorliegenden Erfindung, wobei der Verlauf von Arthrose überwacht wird, umfassend den Nachweis des Autoantikörpers zu verschiedenen Zeitpunkten; oder wobei das Stadium von Arthrose diagnostiziert wird. Der Verlauf ist gekennzeichnet durch das unterschiedlich schnelle Voranschreiten der Erkrankung (chronisch progredient) z. B. in Abhängigkeit von der Reduktion der Risikofaktoren oder ggf. in Zukunft in Abhängigkeit von der Therapie mit den Krankheitsverlauf modifizierenden Medikamenten. Das Krankheitsstadium kann mittels Röntgen in Arthrose-Grade (Kellgren-Lawrence-Score) untergliedert werden. Typischerweise durchläuft der Arthrose-Patient im Verlauf seiner Erkrankung die Stadien nach Kellgren-Lawrence nacheinander.
Bei der Progression der Arthrose werden durch die Degradation der extrazellulären Knorpelmatrix Knorpel (Gelenkkapsel-, subchondrale Knochen-, Muskel- und Sehnen)-Proteine bzw. ihre Fragmente in die Synovia und den Blutkreislauf freigesetzt und somit dem Immunsystem präsentiert, welches abhängig von der Konzentration der Proteine oder Fragmente Autoantikörper bildet. Folglich deuten ansteigende Konzentrationen von Autoantikörpern auf eine Progression der Arthrose hin, während abnehmende Konzentrationen von Autoantikörpern eine verlangsamte oder gestoppte Progression anzeigen.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem 2. Aspekt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder das
Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon in einer von dem Subjekt stammenden Probe.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 2. Aspekts, wobei die degenerative Erkrankung des Skelettsystems rheumatoide Arthritis oder Arthrose umfasst. In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 2. Aspekts, wobei dieses Verfahren das Nachweisen von mindestens zwei Autoantikörpern umfasst; bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das
Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; oder bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; stärker bevorzugt wobei dieses Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 2. Aspekts, wobei der Autoantikörper gegen ein Neoepitop eines
Degradationsprodukts eines Matrixproteins gerichtet ist.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 2. Aspekts, wobei das Nachweisen mit einem Nachweisagens erfolgt, bevorzugt wobei das Nachweisagens fähig ist, an die Antigenbindungsregion des Autoantikörpers zu binden, stärker bevorzugt wobei das Nachweisagens TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und/oder CLEC3A oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon ist.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 2. Aspekts, wobei die Probe Körperflüssigkeit, bevorzugt Blut, Serum, Blutplasma, Synovialflüssigkeit oder Urin, Muskel- oder Knorpelgewebe, Synovialmembran oder Sehne ist.
Unter „degenerativer Erkrankung“ versteht man allgemein die mit einer fortschreitenden Degeneration einhergehende Erkrankung. Degeneration bezeichnet funktionelle und/oder morphologische Veränderungen einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder des gesamten Organismus, die im Vergleich zur vollen physiologischen Leistungsfähigkeit eine Verschlechterung zum Beispiel durch Rückbildung, Verfall, Abbau oder Funktionsverlust anlagebedingt oder aufgrund von chronischen Schädigungsfaktoren darstellen. Unter„degenerativer Erkrankung des Skelettsystems“, wie hierin verwendet, versteht man die Degeneration der Wirbelsäule und der Gelenke bzw. ihrer Knorpelbestandteile, bevorzugt RA oder Arthrose.
Die Erfindung betrifft in einem 3. Aspekt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend das Ausschließen des Vorliegens eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen, d.h. den Schritt des Nachweisens, eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst, stärker bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon mit einem Nachweisagens zum Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 3. Aspekts, wobei die Arthrose zusätzlich durch herkömmliche Methoden diagnostiziert wird.
In einer Ausführungsform davon betrifft die Erfindung das vorstehende Verfahren des 3. Aspekts zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend das Ausschließen des Vorliegens eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, wobei bei fehlendem Nachweis eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon das Subjekt diagnostiziert wird, dass es Arthrose aufweist, während bei Nachweis eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon das Subjekt diagnostiziert wird, dass es keine Arthrose aufweist. Das vorstehende Verfahren, umfassend den Nachweis eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, kann gemäß der vorliegenden Erfindung alleine verwendet werden, um das Vorliegen von Arthrose oder das Nicht-Vorliegen von Arthrose bei einem Subjekt nachzuweisen. Alternativ kann dieses Verfahren zusätzlich zu herkömmlichen Diagnoseverfahren von Arthrose oder zusätzlich zu dem Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, der vorliegenden Erfindung unter Nachweis eines Autoantikörpers, der mit Arthrose assoziiert ist, verwendet werden. Dabei kann der Nicht-Nachweis oder der Nachweis eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon als zusätzliches Indiz gewertet werden, dass Arthrose (Nicht-Nachweis) bzw. dass keine Arthrose (Nachweis) bei dem Subjekt vorliegt.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung dieses Verfahren des 3. Aspekts, wobei die Probe Körperflüssigkeit, bevorzugt Blut, Serum, Blutplasma, Synovialflüssigkeit oder Urin, Muskel- oder Knorpelgewebe,
Synovialmembran oder Sehne ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, umfassend ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Kit zur Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst, bevorzugt wobei die degenerative Erkrankung des Skelettsystems rheumatoide Arthritis oder Arthrose (inklusive Osteochondrose) umfasst. In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung den Kit, wie vorstehend beschrieben, wobei das Nachweisagens mindestens zwei Nachweisagentien zum Nachweisen von mindestens zwei Autoantikörpern umfasst, bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und ein Nachweisagens das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; oder bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und ein Nachweisagens das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; stärker bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
In einer Ausführungsform davon betrifft die vorliegende Erfindung den Kit, wobei der Kit weiterhin ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Kits zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist; oder zur Diagnose von einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt, bevorzugt wobei die degenerative Erkrankung des Skelettsystems rheumatoide Arthritis oder Arthrose (inklusive Osteochondrose) umfasst.
Der Kit kann weiterhin zu dem Nachweisagens einen festen Träger wie eine Membran (z.B. PVDF-Membran), einen Chip, einen Sensor, eine Mikrotiterplatte, Kügelchen, Flarz, Glas, Keramik oder Metall, das mit einem synthetischen Polymer, Glas, Keramik, synthetischen Polymeren und Biopolymeren beschichtet ist, z.B. quervernetztem Dextran oder Agarose, Nylon, Polyethylen oder Polystyrol umfassen. Das Nachweisagens kann bereits auf dem festen Träger immobilisiert sein, oder Träger und Nachweisagens sind in getrennten Behältern enthalten und das Nachweisagens wird vor der Verwendung auf den festen Träger aufgetragen und immobilisiert. Das Nachweisagens liegt bevorzugt in einer oder mehreren definierten Mengen vor, um die Abschätzung der Menge des Autoantikörpers in der Subjektprobe zu erlauben. Der Kit kann weiterhin Bestandteile umfassen, die zum Ausführen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beispielsweise Waschlösungen oder Lösungen oder Vorrichtungen, um ein bestimmtes Nachweisverfahren auszuführen, z.B. Massenspektrometriesonden für SELDI wie ProteinChip®-Arrays oder auf Faser basierende Sensorvorrichtungen, etc. Eine Waschlösung kann zum Abwaschen von Probenresten nach deren Aufträgen auf den festen Träger, an den das Nachweisagens immobilisiert wird, oder zum Abwaschen von Resten des Nachweisagens, das zur Immobilisierung auf einen festen Träger aufgebracht wird, verwendet werden. Der Kit kann mehr als eine Art von Nachweisagens gegen verschiedene Autoantikörper umfassen. Z. B. kann der Kit mehrere Knorpelmatrixproteine, die mit Arthrose assoziiert sind, oder Degradationsprodukte oder Fragmente davon, z.B. Kombinationen von TSP-4 und COMP, von TSP-4 und CLEC3A oder von TSP-4 und COMP und CLEC3A, gegebenenfalls mit Kollagen II, oder Degradationsprodukte oder Fragmente davon, in getrennten oder gleichen Behältern umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Kit Anweisungen für die Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung und/oder die Interpretation der Ergebnisse umfassen, z.B. in Form eines Beipackzettels oder einer Broschüre. Zum Beispiel können die Anweisungen den Verbraucher informieren, wie die Probe zu gewinnen, ggf. das Nachweisagens auf dem festen Träger zu immobilisieren, der Träger zu waschen und/oder die Probe aufzutragen ist. Der Kit kann zusätzlich Referenz- Nachweisagens einer definierten Menge oder in mehreren definierten Mengen enthalten, wobei das Referenz-Nachweisagens die Abschätzung der Konzentration des Autoantikörpers in der Probe erlaubt. Das Referenz-Nachweisagens ist dabei dasselbe wie das eigentliche Nachweisagens, z.B. TSP-4, TSP-4 und COMP, TSP-4 und CLEC3A oder TSP-4 und COMP und CLEC3A, gegebenenfalls mit Kollagen II, oder Degradationsprodukte oder Fragmente davon. Wenn die Referenz ein Referenz-Nachweisagens ist, kann der Kit zusätzlich Autoantikörper einer oder mehrerer bestimmten Konzentrationen enthalten, die ggf. bereits auf einem festen Träger immobilisiert sein können, um den Vergleich mit dem Autoantikörper von der Probe des Subjekts zu erlauben. Oder der Kit kann zusätzlich Referenz- Autoantikörper einer bestimmten Menge oder in mehreren bestimmten Mengen enthalten, ggf. in einem zusätzlichen Behältnis oder bereits auf einem festen Träger immobilisiert, wobei der Autoantikörper die Abschätzung der Konzentration des Autoantikörpers in der Probe erlaubt. Der/die Referenz-Autoantikörper ist/sind dabei derselbe/dieselben wie der/die eigentliche/n Autoantikörper, z.B. gegen TSP-4, TSP- 4 und COMP, TSP-4 und CLEC3A oder TSP-4 und COMP und CLEC3A, und gegebenenfalls gegen Kollagen II, oder Degradationsprodukte oder Fragmente davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Wirkstoff zur Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung einer autoimmun-assoziierten Arthrose bei einem Subjekt, bevorzugt wobei der Wirkstoff Rituximab ist. Das Subjekt ist dabei das durch das vorliegende Verfahren diagnostizierte Subjekt.
Aktuell existiert keine medikamentöse Therapie, welche die Progression der Arthrose beeinflusst. Allerdings kommen nicht steroidale Antirheumatika (z. B. Ibuprofen, Diclofenac, Indometacin und Napropxen und Coxibe) zur Linderung der Beschwerden zum Einsatz, ggf. bei starken Schmerzen auch Opioide. In Phasen der akuten Gelenkentzündung kommt ggf. eine intraartikuläre Gabe von z. B. Triamcinolonhexacetonid (Glukocorticoid) in Frage. Die vorliegende Erfindung ist auf den Nachweis von Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, gerichtet. Im Tierversuch wurde nachgewiesen, dass Autoantikörper gegen Knorpelmatrixproteine wie COMP eine pathophysiologische Bedeutung haben und zu schwerer chronischer Arthritis führen können. Somit ist das Vorliegen von Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, bei einem Subjekt ein Hinweis auf eine pathophysiologische Rolle dieser Autoantikörper beim Entstehen, beim Aufweisen und bei der Progression von Arthrose. Die Pathophysiologie der Autoantikörper erlaubt deshalb die Anwendung einer spezifischen, individuellen Therapie (personalisierte Therapie), die eine allgemeine Immuntherapie zur Unterdrückung der Bildung von Autoantikörpern als auch eine Therapie zur Unterdrückung der Bildung von spezifischen Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, einschließt. Vorstellbar wäre eine „targeted- Therapie“, bei welcher ein Zytostatikum durch spezifische Bindung eines Antigens zur Immunzelle transportiert wird und diese dabei abgetötet wird. Folglich ist bei Patienten, bei denen Autoantikörper, die mit Arthrose assoziiert sind, nachgewiesen werden, jede Art von Therapie wirksam, die die Konzentration der Autoantikörper reduziert, z. B. indem sie die Bildung neuer Autoantikörper hemmt. Deshalb ist eine Form von Therapie im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Immuntherapie bzw. die Autoimmuntherapie, da sie gegen Autoantikörper gerichtet ist. Immuntherapien sind Behandlungsformen, bei denen das Immunsystem beeinflusst wird. Hierbei kommen in Abhängigkeit von der Erkrankung modulierende (stimulierende und supprimierende) oder substituierende (ersetzende) Verfahren zur Anwendung. Bei Autoimmunkrankheiten kommen im Allgemeinen supprimierende Verfahren, die immunologische Prozesse unterdrücken, z. B. die Gabe von Immunsuppressiva, zur Anwendung, um unerwünschte Reaktionen des Immunsystems zu hemmen. Gängige Immunsuppressiva sind z. B. Ciclosporin A, Tacrolimus, Sirolimus, Azathioprin und Methotrexat. Immunsuppressive Verfahren finden auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von immun-assoziierter Arthrose Anwendung. Bevorzugt ist eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Therapie auf eine Reduktion der Plasma- oder B-Zellen ausgerichtet, wobei die Therapie bevorzugt durch eine intraartikuläre oder systemische, besonders bevorzugt intraartikuläre, Gabe eines Wirkstoffs erfolgt, der eine solche Reduktion bewirken kann, wie z. B. Rituximab, Ofatumumab, Ocrelizumab und Epratuzumab bevorzugt Rituximab. Eine andere Form der Therapie ist eine Behandlung mit Wirkstoffen wie Antikörper, die B-Zell-stimulierende Zytokine neutraliseren oder hemmen, z. B. Anakinra, Infliximab, Adalimumab Etanercept, Tocilizumab. Eine weitere Form der Therapie ist die Inhibierung der Aktivierung und Proliferation von B- Zellen durch Inhibierung der Signaltransduktion durch z. B. Belimumab und Atacicept. Eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Proliferation von B-Zellen kommt dabei der Wnt-Signaltransduktion zu. Ein wirksamer Inhibitor der Wnt- Signaltransduktionskaskade ist SM04690, von dem in präklinischen Studien gezeigt wurde, dass er eine Wirkung als„disease-modifying drug“ (DMOAD) aufweist. Ein weiteres, bereits zugelassenes Medikament ist Fluoxetin (zugelassen zur Behandlung von Depressionen), welches die Wnt-Siganltransduktionskaskade und damit auch die Proliferation von B-Zellen inhibiert. Folglich ist ein „Wirkstoff zur Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung einer autoimmun-assoziierten Arthrose“ ein Immunsuppressivum, ein Wirkstoff zur Reduktion von Plasma- oder B- Zellen, z. B. Rituximab, ein Wirkstoff wie ein Antikörper, der B-Zell-stimulierende Zytokine neutralisert oder hemmt, und/oder ein Wirkstoff, der die Signaltransduktion hemmt, die zur Aktivierung und Proliferation von B-Zellen führt, z. B. ein Wirkstoff, der die Wnt-Signaltransduktion hemmt, z. B. SM04690 oder Fluoxetin. Bei einer aktivierten Arthrose kommt es nicht selten zur intraartikulären Applikation von Cortisonpräparaten. Cortisonpräparate sorgen für eine Stimulation der T-Helfer- Zellen, u.a. der TH2-Zellen, welche wiederum zur Aktivierung und Proliferation von B-Zellen führen. Daher wäre bei Patienten mit Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, oder mit mehreren Autoantikörpern, die mit Arthrose assoziiert sind, die Gabe von Cortisonpräparaten eher nachteilig. Subjekte, die von einer Wirkstoffbehandlung profitieren, sind solche, bei denen mit den Diagnoseverfahren der vorliegenden Erfindung Autoantikörper, die mit Arthrose assoziiert sind, nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, oder zur Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren zur Therapieauswahl eingesetzt wird. Wenn in dem Verfahren der Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, oder der Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, ein Autoantikörper nachgewiesen wird, der mit Arthrose bzw. der degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, können die betroffenen Subjekte für eine Therapie ausgewählt werden, bei der die Arthrose oder die degenerative Erkrankung des Skelettsystems durch Reduktion der Konzentration der Autoantikörper behandelt oder ihr vorgebeugt wird. Somit bezieht sich der Begriff „Therapieauswahl“ auf die Auswahl von Subjekten, bei denen eine Arthrose oder degenerative Erkrankung des Skelettsystems gemäß der Erfindung diagnostiziert wurde, für eine Therapie, bei der die Konzentration der Autoantikörper reduziert wird, wie vorstehend beschrieben. Insbesondere beinhaltet die Therapie einen Wirkstoff zur Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung einer autoimmun-assoziierten Arthrose bei einem Subjekt, bevorzugt wobei der Wirkstoff ein Antikörper gegen B-Zellen (z.B. Rituximab) oder ein Wnt-Signalisierungs-Inhibitor (z.B. Fluoxetin oder SM04690) ist. Die Behandlung erfolgt bevorzugt intraartikulär.
Weitere Aspekte der Erfindung sind:
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Nachweis eines Autoantikörpers, der mit Arthrose assoziiert ist, oder zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren umfasst: a) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt; und
b) Nachweisen, ob ein Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann.
Das vorstehende Verfahren kann weiterhin die Schritte umfassen:
i) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
ii) Nachweisen, ob ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren umfassen kann;
a) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
b) Nachweisen, ob ein Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis durch Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfasst; und
c) Diagnostizieren des Subjekts, dass es Arthrose oder ein Risiko, Arthrose zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, in der Probe nachgewiesen wird.
Das vorstehende Verfahren kann weiterhin die Schritte umfassen:
i) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
ii) Nachweisen, ob ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann; iii) Diagnostizieren des Subjekts, dass es Arthrose oder ein Risiko, Arthrose zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe nicht nachgewiesen wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, und Behandlung von Arthrose bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
a) Gewinnen einer Probe von einem Subjekt;
b) Nachweisen, ob ein Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, in der Probe vorhanden ist;
c) Diagnostizieren des Subjekts, dass es Arthrose oder ein Risiko, Arthrose zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist, in der Probe nachgewiesen wird; und
d) Verabreichen einer Behandlung von Arthrose an das diagnostizierte Subjekt. Das vorstehende Verfahren kann weiterhin die Schritte umfassen:
i) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
ii) Nachweisen, ob ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe vorhanden ist;
iii) Diagnostizieren des Subjekts, dass es Arthrose oder ein Risiko, Arthrose zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein
Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe nicht nachgewiesen wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Arthrose bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Behandlung von Arthrose an ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung diagnostiziertes Subjekt umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Verwendung eines Wirkstoffs zur Fierstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer autoimmun-assoziierten Arthrose bei einem Subjekt gerichtet.
Die Behandlung kann dabei eine Behandlung umfassen, bei der die Konzentration der Autoantikörper, die mit Arthrose assoziiert sind, reduziert wird. Zum Beispiel umfasst die Behandlung ein Immunsuppressivum (z. B. Ciclosporin A, Tacrolimus, Sirolimus, Azathioprin und Methotrexat), einen Wirkstoff zur Reduktion von Plasma- oder B-Zellen, z. B. Rituximab, Ofatumumab, Ocrelizumab und Epratuzumab, einen Wirkstoff wie einen Antikörper, der B-Zell-stimulierende Zytokine neutralisert oder hemmt, z. B. Anakinra, Infliximab, Adalimumab Etanercept, Tocilizumab, und/oder einen Wirkstoff, der die Signaltransduktion hemmt, die zur Aktivierung und Proliferation von B-Zellen führt, z. B. einen Wirkstoff, der die Signaltransduktion hemmt, (z.B. Belimumab und Atacicept) wie z. B. einen Wirkstoff, der die Wnt- Signaltransduktion hemmt, z. B. SM04690 oder Fluoxetin.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Nachweis eines Autoantikörpers, der mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, oder zur Diagnose von einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
a) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt; und
b) Nachweisen, ob ein Autoantikörper, der mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann. Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Diagnose von einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
a) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
b) Nachweisen, ob ein Autoantikörper, der mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann; und
c) Diagnostizieren des Subjekts, dass es eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems oder ein Risiko, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper, der mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, in der Probe nachgewiesen wird. Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Diagnose von einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, und Behandlung von einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems bei einem Subjekt gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
a) Gewinnen einer Probe von einem Subjekt;
b) Nachweisen, ob ein Autoantikörper, der mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann; c) Diagnostizieren des Subjekts, dass es eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems oder ein Risiko, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper, der mit einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert ist, in der Probe nachgewiesen wird; und d) Verabreichen einer Behandlung der degenerativen Erkrankung des Skelettsystems an das diagnostizierte Subjekt.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung von oder Vorbeugung einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems bei einem Subjekt gerichtet, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Behandlung der degenerativen Erkrankung des Skelettsystems an ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung diagnostiziertes Subjekt umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Verwendung eines Wirkstoffs zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems bei einem Subjekt gerichtet. Ein Arzneimittel umfasst den Wirkstoff zur Behandlung einer Krankheit und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der im Fachgebiet bekannt ist. Das Arzneimittel kann für verschiedene Verabreichungsformen formuliert sein, z. B. für eine lokale intraartikuläre oder systemische Gabe (oral, intravenös, subkutan, intramuskulär). Der Wirkstoff wird in einer wirksamen Menge verabreicht, die vom Fachmann bestimmt werden kann oder dem Fachmann bekannt ist, wobei sich die Menge des Wirkstoffs an bereits bekannten Mengen dieses Wirkstoffs zur Behandlung anderer Krankheiten orientieren kann. Dabei hängt die wirksame Menge von verschiedenen Faktoren wie Dosierungsform, Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Dauer der Behandlung und ähnlichen Faktoren ab. Das Arzneimittel kann als Lösung, Suspension, Tablette, Kapseln oder Pulver, desweiteren noch als Paste, Salbe, Öl, Creme, Lotion, Schaum, Gel oder Zäpfchen, vorliegen. Die Behandlung kann dabei eine Behandlung umfassen, bei der die Konzentration der Autoantikörper, die mit der degenerativen Erkrankung des Skelettsystems assoziiert sind, reduziert wird. Zum Beispiel umfasst die Behandlung ein Immunsuppressivum, einen Wirkstoff zur Reduktion von Plasma- oder B-Zellen, z. B. Rituximab, einen Wirkstoff wie einen Antikörper, der B-Zell-stimulierende Zytokine neutralisert oder hemmt, und/oder einen Wirkstoff, der die Signaltransduktion hemmt, die zur Aktivierung und Proliferation von B-Zellen führt, z. B. einen Wirkstoff, der die Wnt-Signaltransduktion hemmt, z. B. SM04690 oder Fluoxetin. Diese Art der Behandlung ist insbesondere für die Behandlung von Arthrose wirksam. Auch im Falle von RA erfolgt gemäß der Erfindung bei Nachweis eines Autoantikörpers gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon oder gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon die Behandlung, wie vorstehend aufgezeigt, also mit einem Immunsuppressivum, einem Wirkstoff zur Reduktion von Plasma- oder B-Zellen, z. B. Rituximab, einem Wirkstoff wie einen Antikörper, der B- Zell-stimulierende Zytokine neutralisert oder hemmt, und/oder einem Wirkstoff, der die Signaltransduktion hemmt, die zur Aktivierung und Proliferation von B-Zellen führt, z. B. einen Wirkstoff, der die Wnt-Signaltransduktion hemmt, z. B. SM04690 oder Fluoxetin. Dabei ist eine solche Behandlung, bevorzugt mit Rituximab, gegenüber der gegenwärtigen Behandlung mit, in dieser Reihenfolge, (1 ) Methotrexat (MTX) als Monotherapie oder (2) in Kombination mit oder alternativ zu der Gabe von Biologicals (völlig oder nahezu mit körpereigenen Substanzen identische Präparate) und (3) Gabe von Rituximab bevorzugt, um Gelenkschäden in der Initialphase zu vermeiden, zu bevorzugen.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Nachweis eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon oder zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
i) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt; ii) Nachweisen, ob ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein
Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und
Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
i) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
ii) Nachweisen, ob ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein
Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und
Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann;
iii) Diagnostizieren des Subjekts, dass es Arthrose oder ein Risiko, Arthrose zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe nicht nachgewiesen wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, und Behandlung von Arthrose bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, gerichtet, wobei das Verfahren umfasst:
i) Gewinnen einer Probe von dem Subjekt;
ii) Nachweisen, ob ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe vorhanden ist, wobei der Nachweis das Inkontaktbringen der Probe mit einem Nachweisagens und Nachweisen der Bindung zwischen dem Autoantikörper und dem Nachweisagens umfassen kann;
iii) Diagnostizieren des Subjekts, dass es Arthrose oder ein Risiko, Arthrose zu entwickeln, aufweist, wenn ein Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder Fragment davon in der Probe nicht nachgewiesen wird; iv) Verabreichen einer Behandlung von Arthrose an das Subjekt. Die Behandlung ist, wie vorstehend beschrieben, und/oder eine herkömmliche Behandlung zur Linderung der Beschwerden.
MATERIAL UND METHODEN
Patienten und Kontrollgruppenselektion
Die Studienpopulation setzt sich aus zwei Patientengruppen und einer gesunden Kontrollgruppe (HD = healthy donors) zusammen. Bei den Untersuchungsgruppen handelt es sich entweder um Arthrose- oder rheumatoide Arthritis (RA)-Patienten. Die Einschlusskriterien für die Arthrose-Gruppe sind eine klinisch gesicherte Osteoarthritis (OA) der großen Gelenke. Ausschlusskriterien sind Hinweise auf eine rheumatoide Gelenkerkrankung oder andere autoimmune oder maligne Grunderkrankungen. Einschlusskriterien für die RA-Gruppe sind eine gesicherte RA entsprechend der ACR/EULAR-Klassifikationskriterien. Ausschlusskriterien sind eine Arthrose oder andere autoimmune oder maligne Grunderkrankungen. Zum Einschluss in die Kontrollgruppe müssen die Probanden artikular symptomfrei sein. Ausschlusskriterien sind diagnostische Hinweise auf eine Arthrose, RA, autoimmune oder maligne Grunderkrankungen. Untersucht wurde das Serum von 10 Arthrose- Patienten, 10 RA-Patienten und 10 gesunden Kontrollen. Alle Proben wurden von unserem Kooperationspartner Prof. Pongratz, Rheumatologie der Universitätsklinik Düsseldorf, zur Verfügung gestellt.
Klonierung, rekombinante Expression und Proteinaufreinigung
Das Gen von humanem CLEC3A wurde in einen modifizierten pCEP-Pu-Vektor kloniert und in HEK-293 EBNA Zellen transfiziert. Das rekombinante Protein wurde affinitätschromatographisch aus dem Überstand der Zellen aufgereinigt. Humanes Kollagen II wurde aus humanem Knorpel aufgereinigt (PMID: 6439184). Rekombinantes humanes TSP-4 (R&D) und rekombinantes humanes COMP (R&D) wurden beim jeweiligen Hersteller bestellt.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunblot
Zum Nachweis von Autoantikörpern im Serum der Probanden wurden die Matrixproteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunblot nachgewiesen. Hierfür wurden die Proteine (je 1 pgA/ertiefung) nach Durchführung der SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris-Gels: 12 Vertiefungen, 1 mm Dicke, MOPS Puffer, 200 V für 50 min) auf eine PVDF-Membran transferiert (0,45 miti, Invitrogen), freie Bindungsstellen mit 5% Milchpulver und 1 % bovinem Serumalbumin in TBS-T (Tris-gepufferte Salzlösung, 0,1 % Tween) abgesättigt, nacheinander mit 50 mI Patientenserum in 10 ml Blockierungs-Lösung, über Nacht bei 4°C) und einem HRP (Meerrettich- Peroxidase)-konjugiertem anti-human-lgG-Antikörper (SantaCruz, 1 :200.000 in Blocking für 1 h Raumtemperatur) inkubiert. Als Referenz wurde Serum einer gesunden Person verwendet. Die Konzentration von IgG im Serum wurde bestimmt und es wurde jeweils 0,3, 3 oder 30 ng IgG pro Referenzspur auf das SDS-PAGE aufgetragen. Signale wurden nach Inkubation mit ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech) mit dem ChemiDoc XRS+ (BioRad) Westernblot-Imager detektiert und die Bildsequenzen mit der ImageLab (BioRad)-Software ausgewertet.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Nachweis von TSP-4-, CLEC3A-, COMP- und Kollagen Il-Autoantikörper zur Diagnostik einer Arthrose - In unsere Studie haben wir mittels SDS-PAGE und Immunblot das Serum von 10 Arthrose (OA)-Patienten, 10 Rheumatoide-Arthritis (RA)-Patienten und 10 gesunden Probanden (Healthy Donors, HD) auf IgG-lsotyp- Antikörper gegen TSP-4, CLEC3A, COMP und Kollagen II untersucht (Tabelle 1 ). Der Nachweis von TSP4-, CLEC3A-, COMP- und Kollagen-Il-Autoantikörpern im Blut und/oder in Synovialflüssigkeit kann zur Diagnostik, speziell auch zu einer frühen Diagnostik, einer Arthrose oder einer aktivierten Arthrose sowie zur Stadiendiagnose, Verlaufs- und Therapiekontrolle einer Arthrose genutzt werden (Tabelle 1 ).
Tabelle 1 a: Anzahl der positiven Antikörper-Reaktivitäten gegen die verschiedenen Matrixproteine im Vergleich von OA und HD. Häufigkeiten wurden jeweils in Relation zur Gruppenstärke angegeben. Signifikante Unterschiede sind mit * markiert. (Quelle: http://www.socscistatistics.com/tests/fisher/Default2.aspx).
Tabelle 1 b: Individuelle Antikörperintensitäten gegen verschiedene Antigene. Patienten 1 bis 10 repräsentieren die OA-Gruppe, Patienten 11 bis 20 die gesunde Kontrollgruppe. Die Mittelwerte und Standardabweichungen wurden für die entsprechende Gruppe berechnet, in denen für das respektive Antigen > zwei Werte Vorlagen. Signale des Immunblots wurden densitometrisch ausgewertet und im Verhältnis zur zugehörigen 0,3 ng-lgG-Referenzbande (=1 ) quantifiziert (x-fach IgG) oder im Verhältnis zum Gruppenmittelwert (x-fach MW) angegeben. Wenn in einem Kästchen keine Werte eingetragen wurden, konnte im Immunblot keine Bande nachgewiesen werden. MW = Mittelwert, StdAbw = Standardabweichung.
Durch die Kombination der Antikörper kann die diagnostische Aussagekraft noch deutlich erhöht werden (Tabelle 2).
Tabelle 2: Anzahl positiver Antikörper-Reaktivitäten, kumuliert gegen mehrere Proteine in den Gruppen OA und HD. Häufigkeiten wurden jeweils in Relation zur Gruppenstärke angegeben. Für die kumulativen Vergleiche sind die Unterschiede in der Verteilung der absoluten Häufigkeiten auf die zwei Gruppen hochsignifikant. Kollagen Il-Autoantikörper konnten nur in der HD-Gruppe nachgewiesen werden. OA-Patienten zeigten keine Kollagen Il-Autoantikörper. Der fehlende Nachweis von Kollagen Il-Autoantikörpern dient daher als positives Ergebnis für OA.
Nachweis von TSP-4-, CLEC3A- und COMP-Antikörpern zur Therapieauswahl bei Arthrose - In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass es durch die Immunisierung von Tieren mit Kollagen II (CIA, Collagen ll-induced arthritis) oder COMP (COMPIA) zu einer schweren, chronischen Arthritis bei den Tieren kommt. Antikörper gegen Matrixproteine haben in diesen Tiermodellen (der RA) eine pathophysiologische Bedeutung. Dies zeigt, dass auch humane Autoantikörper gegen Matrixproteine eine pathophysiologische Wirkung entfalten können und deshalb Patienten mit Autoantikörpern gegen Matrixproteine einer immunsuppressiven Therapie zugänglich sind. Dabei scheint ein wichtiges Kriterium für die Pathogenität die Anzahl von verschiedenen Autoantikörpern und/oder die Autoantikörperkonzentration (Autoantikörpertiter) im Blut zu sein. In unserer Studie liegen bei zwei OA-Patienten mehrere Autoantikörper vor und auch die Antikörperintensitäten gegen die verschiedenen Antigene sind unterschiedlich.
Nachweis von anti-TSP-4- und anti-COMP-Antikörpern bei rheumatoider Arthritis - In unserem Studienkollektiv fanden wir bei drei RA-Patienten um den Faktor 30-fach bis 130-fach höhere Konzentrationen von TSP-4- und COMP- Autoantikörpern (RA-Patient Nr. 21 , 22, 29), verglichen mit den Intensitäten der anderen RA-Patienten (Tabelle 3).
Tabelle 3: Mittelwerte der Antikörperintensitäten in der RA-Gruppe. Zur Mittelwertberechnung wurden Patienten 21 , 22, 29 ausgeschlossen, da sie statistisch gesehen (Ausreißertest nach Grubbs) signifikante Ausreißer waren. MW = Mittelwert, StdAbw = Standardabweichung. Signale des Immunblots wurden densitometrisch ausgewertet und im Verhältnis zur zugehörigen 0,3 ng-lgG-Referenzbande (=1 ) quantifiziert (x-fach IgG) oder im Verhältnis zum Gruppenmittelwert (x-fach MW) angegeben.
REFERENZEN
Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al 2010 Rheumatoid arthritis Classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative Annals of the Rheumatic Diseases 2010, 69, 1580-1588 Deane KD., Curr Rheumatol Rep. 2014, 16, 419 Jescke A, et al. Deficiency of thrombospondin-4 in mice does not affect skeletal growth or bone mass acquisition, but causes a transient reduction of articular cartilage thickness. PLOS ONE 2015; DOI 10.1371
Karlin S. und Altschul S.F., PNAS, 1990, 87, 2264-2268
Karlin S. und Altschul S.F., PNAS, 1993, 90, 5873-5877
Lawler J, McFlenry K, Duquette M, Derick L (Mar 1995). "Characterization of human thrombospondin-4". J Biol Chem. 270 (6): 2809-14. doi :10.1074/jbc.270.6.2809. PMID 7852353
Needleman S.B. und Wunsch C. D., J Mol Biol, 1970, 48, 443-453
Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 3833-3837; und Winter-und Milstein, 1991 , Nature 349: 293-299
Pearson W.R. und Lipman D. J., PNAS, 1988, 85, 2444-2448
Smith T.F. und Waterman M.S., Add APL Math, 1981 , 2, 482-489
Stoll ML, Li QZ, Zhou J, Punaro M, Olsen NJ. Elevated IgG autoantibody production in oligoarticular juvenile idiopathic arthritis may predict a refractory course. Clin Exp Rheumatol. 2011 ; 29: 736-742.
1. Newton, G., et al., Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics, 1994. 24(3): p. 435-9.
2. DiCesare, P.E., et al., Cartilage oligomeric matrix protein: Isolation and characterization from human articular cartilage. J Orthop Res, 1995. 13(3): p.
422-8.
3. Acharya, C., et al., Cartilage oligomeric matrix protein and its binding Partners in the cartilage extracellular matrix: interaction, regulation and role in chondrogenesis. Matrix Biol, 2014. 37: p. 102-11.
4. Halasz, K., et al., COMP acts as a catalyst in Collagen fibrillogenesis. J Biol
Chem, 2007. 282(43): p. 31166-73.
5. Haudenschild, D.R., et al., Enhanced activity of transforming growth factor betal (TGF-beta1 ) bound to cartilage oligomeric matrix protein. J Biol Chem, 2011. 286(50): p. 43250-8.
6. Ishida, K., et al., Cartilage oligomeric matrix protein enhances Osteogenesis by directly binding and activating bone morphogenetic protein-2. Bone, 2013. 55(1 ): p. 23-35. 7. Rosenberg, K., et al Cartilage oligomeric matrix protein shows high affinity zinc-dependent interaction with triple helical Collagen. J Biol Chem, 1998. 273(32): p. 20397-403.
8. Kleerekoper, Q., J.T. Hecht, and J.A. Putkey, Disease-causing mutations in cartilage oligomeric matrix protein cause an unstructured Ca2+ binding domain. J Biol Chem, 2002. 277(12): p. 10581-9.
9. Kvansakul, M., J.C. Adams, and E. Hohenester, Structure of a thrombospondin C-terminal fragment reveals a novel calcium core in the type 3 repeats. EMBO J, 2004. 23(6): p. 1223-33.
10. Lau, D., et al., The cartilage-specific lectin C-type lectin domain family 3 member A (CLEC3A) enhances tissue plasminogen activator-mediated plasminogen activation. J Biol Chem, 2017.
11. Karlsson, C., et al., Genome-wide expression profiling reveals new candidate genes associated with Osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage, 2010. 18(4): p. 581 -92.
12. Tsunezumi, J., S. Higashi, and K. Miyazaki, Matrilysin (MMP-7) cleaves C-type lectin domain family 3 member A (CLEC3A) on tumor cell surface and modulates its cell adhesion activity. J Cell Biochem, 2009. 106(4): p. 693-702.
13. Neame, P.J., H. Tapp, and D.R. Grimm, The cartilage-derived, C-type lectin (CLECSF1 ): structure of the gene and chromosomal location. Biochim
Biophys Acta, 1999. 1446(3): p. 193-202.
14. Vogel, K.G., M. Paulsson, and D. Heinegard, Specific Inhibition of type I and type II Collagen fibrillogenesis by the small proteoglycan of tendon. Biochem J, 1984. 223(3): p. 587-97.
15. Altman, R.D. Classification of disease: Osteoarthritis in Seminars in arthritis and rheumatism. 1991. Elsevier.
16. Altman, R., et al., Development of criteria for the Classification and reporting of Osteoarthritis. Classification of Osteoarthritis of the knee. Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism Association. Arthritis Rheum, 1986. 29(8): p. 1039-49.
17. Altman, R., et al., The American College of Rheumatology criteria for the Classification and reporting of Osteoarthritis of the hand. Arthritis Rheum, 1990. 33(11 ): p. 1601 -10.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, umfassend das Nachweisen eines Autoantikörpers, der mit Arthrose assoziiert ist, in einer von dem Subjekt stammenden Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Verfahren das Ausschließen von
rheumatoider Arthritis bei dem Subjekt umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend das Ausschließen des Vorliegens eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon,
bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst, stärker bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon mit einem Nachweisagens zum Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren das
Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Verlauf von Arthrose überwacht wird, umfassend den Nachweis des Autoantikörpers zu verschiedenen Zeitpunkten; oder
wobei das Stadium von Arthrose diagnostiziert wird.
6. Verfahren zur Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend das Nachweisen von einem
Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon in einer von dem Subjekt stammenden Probe,
bevorzugt wobei die degenerative Erkrankung des Skelettsystems rheumatoide Arthritis oder Arthrose umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren das Nachweisen von mindestens zwei Autoantikörpern umfasst;
bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; oder bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst;
stärker bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Autoantikörper gegen ein Neoepitop eines Degradationsprodukts eines Proteins, gegen das der Autoantikörper gerichtet ist, gerichtet ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Nachweisen mit einem Nachweisagens erfolgt, bevorzugt wobei das Nachweisagens fähig ist, an die Antigenbindungsregion des Autoantikörpers zu binden,
stärker bevorzugt wobei das Nachweisagens TSP-4 oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, COMP oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und/oder CLEC3A oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon ist.
10. Verfahren zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend das Ausschließen des Vorliegens eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon in einer von dem Subjekt stammenden Probe;
bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; stärker bevorzugt wobei das Verfahren das Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon mit einem Nachweisagens zum Nachweisen eines Autoantikörpers gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Arthrose zusätzlich durch herkömmliche Methoden diagnostiziert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , wobei die Probe Körperflüssigkeit, bevorzugt Blut, Serum, Blutplasma, Synovialflüssigkeit, Urin, Muskel- oder Knorpelgewebe, Synovialmembran oder Sehne ist.
13. Kit zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist, umfassend ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper, der mit Arthrose assoziiert ist,
bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen TSP-4 oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem
Autoantikörper gegen COMP oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; oder Kit zur Diagnose einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt, umfassend ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon oder ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst,
bevorzugt wobei die degenerative Erkrankung des Skelettsystems rheumatoide Arthritis oder Arthrose umfasst.
14. Kit nach Anspruch 13, wobei das Nachweisagens mindestens zwei
Nachweisagentien zum Nachweisen von mindestens zwei Autoantikörpern umfasst,
bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und ein Nachweisagens das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst; oder
bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und ein Nachweisagens das Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst;
stärker bevorzugt wobei das Nachweisagens ein Nachweisagens zum
Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Thrombospondin-4 (TSP-4) oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon, ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen COMP oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon und ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen CLEC3A oder ein
Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
15. Kit nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Kit weiterhin ein Nachweisagens zum Nachweisen von einem Autoantikörper gegen Kollagen II oder ein Degradationsprodukt oder ein Fragment davon umfasst.
16. Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Diagnose von Arthrose oder des Risikos, Arthrose zu entwickeln, bei einem Subjekt, wobei das Subjekt keine rheumatoide Arthritis aufweist; oder
zur Diagnose von einer degenerativen Erkrankung des Skelettsystems oder des
Risikos, eine degenerative Erkrankung des Skelettsystems zu entwickeln, bei einem Subjekt,
bevorzugt wobei die degenerative Erkrankung rheumatoide Arthritis oder Arthrose umfasst.
17. Wirkstoff zur Verwendung zur Behandlung oder Vorbeugung einer autoimmun- assoziierten Arthrose bei einem Subjekt, bevorzugt wobei der Wirkstoff ein Antikörper gegen B-Zellen, stärker bevorzugt Rituximab, oder ein Wnt- Signalisierungs-Inhibitor, stärker bevorzugt Fluoxetin oder SM04690, ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Verfahren zur Therapieauswahl eingesetzt wird.
EP18814627.8A 2017-12-21 2018-12-12 Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems Pending EP3729091A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17209795.8A EP3502696A1 (de) 2017-12-21 2017-12-21 Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems
PCT/EP2018/084451 WO2019121187A1 (de) 2017-12-21 2018-12-12 Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP3729091A1 true EP3729091A1 (de) 2020-10-28

Family

ID=60942855

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP17209795.8A Withdrawn EP3502696A1 (de) 2017-12-21 2017-12-21 Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems
EP18814627.8A Pending EP3729091A1 (de) 2017-12-21 2018-12-12 Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP17209795.8A Withdrawn EP3502696A1 (de) 2017-12-21 2017-12-21 Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11609231B2 (de)
EP (2) EP3502696A1 (de)
WO (1) WO2019121187A1 (de)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2228970A1 (en) * 1995-08-18 1997-02-27 Donald W. Landry Detection of organic compounds through regulation of antibody-catalyzed reactions
JP2004117160A (ja) * 2002-09-26 2004-04-15 St Marianna Univ School Of Medicine 変形性関節症の検定方法及び検定キット
JP2004279334A (ja) * 2003-03-18 2004-10-07 St Marianna Univ School Of Medicine 変形性関節症の検定方法
WO2010122231A1 (en) * 2009-04-23 2010-10-28 Wallac Oy Methods for determining maternal health risks
GB201213012D0 (en) * 2012-07-23 2012-09-05 Univ Warwick Diagnostic for determining skelektal health

Also Published As

Publication number Publication date
US11609231B2 (en) 2023-03-21
US20210109097A1 (en) 2021-04-15
WO2019121187A1 (de) 2019-06-27
EP3502696A1 (de) 2019-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Engdahl et al. Periarticular bone loss in arthritis is induced by autoantibodies against citrullinated vimentin
Isgro et al. The CC motif chemokine ligands CCL5, CCL11, and CCL24 induce the migration of circulating fibrocytes from patients with severe asthma
DE602004010432T2 (de) Verfahren zur beurteilung rheumatoider arthritis durch messen von anti-ccp und interleukin 6
Grimsholm et al. BDNF in RA: downregulated in plasma following anti-TNF treatment but no correlation with inflammatory parameters
Wang et al. The role of angiopoietin-2 in nucleus pulposus cells during human intervertebral disc degeneration
US8841079B2 (en) Fibronectin aggrecan biomarker for the identification of spinal and joint source of pain
JP2012505887A5 (de)
EP3729091A1 (de) Nachweis von autoantikörpern zur diagnose von degenerativen erkrankungen des skelettsystems
EP2791686B1 (de) Biomarker und verwendung davon
KR102596937B1 (ko) 류마티스 관절염의 판누스 진단용 바이오마커 및 이의 이용
Çakırca et al. The relationship between bone mineral density and levels of RANKL, osteoprotegerin and cathepsin-K in patients with rheumatoid arthritis.
US11090310B2 (en) Methods and compositions for treating hypertriglyceridemia
WO2016100431A1 (en) Methods for treating inflammatory arthritis
Zayed et al. Association Of Cellular Communication Network Factor 3 (CCN3) With Rheumatoid Arthritis Disease And It's Severity (Case-Control Study)
EP2764370B1 (de) Myosinbindendes protein-c zur verwendung bei verfahren im zusammenhang mit diastolischer herzinsuffizienz
EP1555531B1 (de) Verfahren zur Auswertung des Knorpelgewebeabbau
US20130115633A1 (en) Methods &amp; Devices for Diagnosing Cardiac Disorders
WO2023170317A1 (en) Diagnostic markers of parkinson&#39;s disease
JP2002372530A (ja) 皮膚刺激作用の検出方法
Ong et al. AB0553 Prevalence of Autoimmune Thyroid Disease in Malaysian SLE Patients
EP2153229A1 (de) Verwendung von autoantikörpern gegen cd28 als prognostischer marker beim malignen melanom
Organizers, 1st Eular Workshop on Cartilage and Bone Research 1st Eular Workshop on Cartilage and Bone Research: Leuven, 19–21 september 1991

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: UNKNOWN

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20200625

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAV Request for validation of the european patent (deleted)
DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20231116