CN109797211A - Mif在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MIF作为标记物在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用，所述MIF在激素性股骨头坏死生物学样品中表达下调。所述应用包括诊断激素性股骨头坏死的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测MIF的表达水平的试剂。利用该MIF基因检测激素性股骨头坏死不仅能够快速有效的做到早期检，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

MIF在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及MIF在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用。

背景技术

股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)又称股骨头缺血性坏死(avascular necrosis，AVN)，是一种好发于中青年人群的骨科常见且难治性疾病，致残率极高。韩国及日本的全国性流行病研究提示，股骨头坏死年发病率高达28.9/10万。在我国，每年需要治疗的ONFH患者数为500～750万，每年新发患者数为15～20万，患者多为37-45岁的青壮年，男性发病例数多于女性，我国男女发病比例为3.8:1。其中激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH)占非创伤性股骨头坏死的66.7％。类糖皮质激素能够通过抑制成骨细胞的分化及活性，促进成骨细胞和骨细胞凋亡，抑制骨形成；另一方面，促进破骨细胞的分化及活性，延长其生存周期，加强对骨质的吸收，从而使骨形成与骨吸收偶联机制失去平衡，导致SANFH。该病初发时并无明显临床表现，随着病情加重，最终导致髋关节坏死和塌陷。SANFH的研究一直是骨科研究中的热点，因其病因复杂，有关SANFH发病机制的假说也有很多种，如凝血功能紊乱学说、脂质代谢学说、股骨头内高压学说、血管内皮损伤学说、骨髓间充质干细胞功能紊乱学说等等，虽然这些研究有一些临床和实验研究依据,但均不能完全解释股骨头坏死的全部病理过程。

MicroRNAs(miRNAs)是一类长约19-23个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，大量的研究表明microRNA是一类重要的调控因子，通过与靶基因序列特异性相互作用在转录水平调节基因表达，参与多种生物学过程，进化过程保守。越来越多的研究表明，miRNA的表达具有时序特异性和组织特异性。每种miRNA针对的数个甚至上百个潜在靶基因，miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5’-UTR或者3’-UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程如生长发育、器官形成、造血、细胞增殖与凋亡、应激反应和肿瘤生成等。

因此，探索SANFH的发病机制，寻找相关的miRNA作为早期诊断激素性股骨头坏死的标志物，对激素性股骨头坏死的诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

为了实现激素性股骨头坏死的早期发现，早期干预，本发明的目的之一在于提供MIF作为标记物在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用。

具体地，所述MIF在激素性股骨头坏死生物学样品中表达下调

优选地，所述MIF包括SEQ ID NO.1所示的特异性核苷酸序列。

优选地，所述产品为能够定量检测MIF表达量的产品。

更优选地，所述产品为检测个体患有激素性股骨头坏死的试剂盒或芯片。所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miR-146a的部分或全部序列。再优选地，所述固相载体可采用基因芯片技术领域的各种常用材料，包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

进一步地，所述试剂盒包括检测生物样本中MIF表达情况的试剂。

更进一步地，所述检测生物样本中MIF表达情况的试剂包括特异性扩增MIF的引物。

再进一步地，所述引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。更优选地，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、Taq酶和SYBR Green荧光染料。

所述试剂盒通过检测受试者血液中MIF的表达水平，与未患激素性股骨头坏死的健康人的MIF的表达水平进行比较，若受试者血液中MIF的表达水平显著低于健康人的水平，则判断该受试者具有高风险患激素性股骨头坏死或已经患有激素性股骨头坏死。

本发明的目的之二，在于提供一种筛选治疗激素性股骨头坏死的潜在物质的方法，具体包括：用候选物质处理激素性股骨头坏死体系，如所述候选物质可促进MIF的表达或活性，则说明该候选物质可作为治疗激素性股骨头坏死的潜在物质。

具体地，所述激素性股骨头坏死体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了一种与激素性股骨头坏死相关的MIF基因，并证实MIF受miR-146a的调控，在激素性股骨头坏死组织中表达下调，影响骨形成和骨吸收的平衡，从而在激素性股骨头坏死的发生、发展、治疗和预后中发挥作用。因此利用MIF作为标志物检测激素性股骨头坏死不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1：SANFH患者外周血miR-146a表达水平；

图2A：SANFH患者外周血MIF基因的mRNA表达水平；图2B：SANFH患者外周血MIF蛋白表达水平；

图3：转染MIF抑制剂的MC3T3细胞与MC3T3细胞空白对照组(control)及阴性对照组(NC)的细胞增殖情况对比。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明涉及的MIF基因以及miR-146a都是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：

MIF基因Genbank登录号：Gene ID:4282来源于人类基因组。

miR-146a在miRBase的Accession：MIMAT0000449，来源人类基因组。

MIF既是一种前炎性细胞因子，又是一种源于垂体的激素，不属于目前已发现的任何细胞因子家族；MIF可由淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞、胰岛β细胞、脂肪细胞、垂体促肾上腺皮质细胞等多种细胞合成分泌，通过自分泌和旁分泌的方式维持并上调不同类型细胞的激活状态。

miR-146a是一种众所周知的抗炎miRNA，同时参与了机体炎症反应中的固有免疫和适应性免疫,发挥抗炎作用,但其具体作用机制尚不明确。

实施例1靶基因MIF的表达及其调控因子miR-146a的发现

发明人通过检测多例SANFH患者外周血巨噬细胞迁移抑制因子(macrop hagemigration inhibitory factor,MIF)，发现SANFH患者外周血MIF基因和蛋白表达水平显著低于正常。

为进一步探索MIF在SANFH患者外周血低表达，以及影响SANFH发生及发展机制，发明人通过软件检索可与MIF有相互作用的其他蛋白或者RNA。miRNA主要通过自身的种子序列(seed sequence)与靶基因3`UTR区域结合，降解靶基因RNA或抑制其翻译。有研究表明miRNA通过调控靶基因的表达，影响疾病的发生和发展，参与疾病调控的信号网络。借助TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)，共同预测到MIF可能是miR-451a/146a的靶基因。进一步，发明人的检测结果发现，在SANFH患者外周血中miR-146a的表达水平是显著高于正常对照的(如图1所示)，证明MIF可能受miR-146a调整在SANFH发生发展中发挥重要作用。

前人的研究表明，miR-146a可以抑制关节炎小鼠的破骨细胞形成、防止关节破坏，可作为类风湿关节炎骨破坏的新的治疗靶点(Nakasa,T.,et al.,The inhibitory effectof microRNA-146a expression on bone destruction in c ollagen-inducedarthritis.Arthritis Rheum,2011.63(6):p.1582-90.Ammari,M.,C.Jorgensen,andF.Apparailly,Impact of microRNAs on the underst anding and treatment ofrheumatoid arthritis.Curr Opin Rheumatol,2013.25(2):p.225-33.)；Yuan等人的研究进一步表明，在股骨头坏死患者组织中，miR-146a的表达是显著上调的(5倍)，可见，miR-146a与ONFH发生及发展密切相关(Yuan,H.F.,et al.,Analysis of altered microRNAexpressi on profile in the reparative interface of the femoral head withosteonecrosi s.Exp Mol Pathol,2015.98(2):p.158-63.)。同时，Wang和其同事的研究发现，在肺癌中miR-146a通过抑制MIF的表达，抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。

综上所述，发明人提出假说：MIF作为SANFH的新型关键分子，其编码蛋白在SANFH中低表达，其上游受miR-146a调控，影响骨形成和骨吸收的平衡，从而在SANFH的发生、发展、治疗和预后中发挥重要作用。

实施例2 SANFH患者组织及外周血收集

1、SANFH纳入标准

1)签署知情同意书；2)术前有完整的临床资料和影像学资料；3)大剂量激素冲击治疗>3天或常规剂量激素治疗>3周；4)腹股沟疼痛向大腿侧放射性疼痛，缓慢进行性加重，夜间疼痛加重；5)药物治疗疼痛无缓解；6)Ⅱ期及其以上股骨头坏死患者影像学成像呈硬化带、囊性病变、股骨头坍陷、股骨软骨骨折及其斑点状硬化性病变；7)T1加权成像呈股骨头残留骨垢线，邻近骨垢线呈低信号区，T1加权成像呈双线征。8)同期选取接受激素治疗的非股骨头坏死患者作为正常对照组。

2、SANFH排除标准

1)股骨头坏死患者因自身免疫性疾病导致的髋关节病变(类风湿性关节炎、强直性脊柱炎髋关节病变等)酒精、镰状细胞贫血性、感染等原因导致的股骨头坏死；2)近3个月服用影响骨代谢、血脂药物，合并髋臼畸形，强直性脊柱炎、肿瘤骨转移、骨结核、肝肾功能异常、内分泌代谢疾病、长期卧床和精神性疾病患者；3)老年性骨质疏松骨折患者；4)其他(血友病髋关节病变、结核、化脓性感染、髋关节周围肿瘤等)；

3、正常对照的纳入排除标准

1)正常对照的采集来自近期接受过激素治疗的健康献血者或招募的健康志愿者，年龄、性别、籍贯和受教育程度与患者组匹配；2)术前有完整的临床资料和影像学资料，确诊为股骨头坏死；3)所有正常对照的资料经一位高年资骨科外科专科医生、一位风湿免疫科医生及一位影像科医生双盲法评估为非SANFH；4)无股骨头外伤史；5)无严重的器质性病变，目前未服用任何药物；6)采血前1周内未吸烟、饮酒、熬夜、服用刺激性食物等；

4、病例对照的纳入排除标准

1)病例对照的采集来自近期诊断为股骨头坏死的患者，年龄、性别、籍贯和受教育程度与SANFH组匹配；2)所有对照的资料经一位高年资骨科外科专科医生、一位风湿免疫科医生及一位影像科医生双盲法评估为非SANFH，而是其他类型的股骨头坏死；3)无严重的器质性病变，目前未服用任何药物；4)采血前1周内未吸烟、饮酒、熬夜、服用刺激性食物等；5)腹股沟疼痛向大腿侧放射性疼痛，缓慢进行性加重，夜间疼痛加重；6)药物治疗疼痛无缓解；7)Ⅱ期及其以上股骨头坏死患者影像学成像呈硬化带、囊性病变、股骨头坍陷、股骨软骨骨折及其斑点状硬化性病变；8)T1加权成像呈股骨头残留骨垢线，邻近骨垢线呈低信号区，T1加权成像呈双线征。

实施例3 qPCR检测MIF基因表达水平

1、RNA提取

1)RNA提取样本处理

根据实施例2中的标准收集于中国医学科学院北京协和医院骨科就诊患者的临床样本18例，其中正常人7例，SANFH患者11例。均已签署知情同意书。

将EDTA抗凝全血按1:1比例与Trizol混合，如短时间内不进行RNA提取，可将样本于液氮中速冻30s-1min后，放于-80℃短期保存。

2)RNA提取方法

2.1)氯仿、异丙醇、乙醇(均为化学分析纯)、小型台式离心机均需提前预冷(10-15min)。

2.2)步骤1)中保存样本，室温融化后，大力涡旋震荡，使其变为流动状态(血液与Trizol混合后液体较为粘稠，涡旋时间可适当延长)。

2.3)按每1mlTrizol中加200μl氯仿(三氯甲烷)的比例加入氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置5-10min。

2.4)离心，4℃、12000rpm、15min。

2.5)离心后液体分为三层，小心吸取最上层水相到新的EP管中(<500μl)，注意不要吸到分界层白膜。

2.6)每管加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后室温放置10min。

2.7)离心，4℃、12000rpm、10min。

2.8)弃上清，可见白色RNA沉淀，每管加入1ml 75％乙醇(预冷、DEPC水配制)，上下颠倒混匀后，低温离心。

2.9)离心，4℃、12000rpm、10min。

2.10)重复步骤2.8)和2.9)，小心去除上清，将每个EP管依次排列倒扣于干净卫生纸上，让液体自动下流到卫生纸上片刻，用枪头轻拨壁上液珠到管口，蘸干管口液体，敞盖置于冰上，使剩余乙醇挥发。

2.11)每管加入12μl DEPC水(或RNase free water)溶解RNA，加入1ul RNaseInhibitor。

2.12)每管吸出1-2μl RNA溶液，适当稀释后测定浓度，其余暂存于-80℃冰箱或立即进行后续反应。

2、RNA浓度与纯度的测定

1)RNA浓度：取RNA样品1-2μl，用分光光度计Genova Nano-53820对RNA在260nm下的吸光度进行定量。

2)RNA纯度的测定：用分光光度计Genova Nano-53820对RNA在260nm和280nm下的吸光度A260和A280进行定量，记录OD260/OD280，所有样本的比值要求在1.8＜OD260/OD280＜2.1低于此值表明其含有蛋白质杂质，用氯仿重新提纯。

3、反转录

以总RNA为模板，mRNA使用Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行cDNA的合成。取0.2ml DEPC处理的PCR管，在PCR管中配置下表中的反转录反应液，步骤在冰浴中进行。

加完各种试剂后，轻轻混匀，然后稍微离心使反应液聚集在PCR管底部。然后放到PCR仪上进行反转录反应。反应结束后，产物贮于-20℃备用。

3.1mRNA常规RT-PCR实验流程:

使用微量EP管，依次加入以下表1体系(20μl)

表1

Total RNA(50ng～5μg)	Xμl(x≤8)
		Random Primer(N9)(0.1μg/μl)	1μl
2xTS Reaction Mix	10μl
		RT/RI Enzyme Mix	1μl
RNase-free water	8-xμl

轻轻混匀，将混匀后的体系放入PCR仪中，扩增反应在生工公司的PCR仪上进行PCR反应，反应参数如表2所示：

表2

得到RNA逆转产物cDNA溶液放于-20℃短期保藏。

4、荧光定量PCR

4.1引物的设计与合成

从NCBI获得目的基因MIF的全长序列(NM_002415.2)以及从miRbase获得miR-146a的全长序列(MIMAT0000449)，利用Saccharomyces Genome Database设计引物序列。经过Blast分析，引物序列具有特异性。所用的引物如下表3所示。引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。

表3

4.2荧光定量PCR

在0.2mlPCR管内，按表4依次加入1μl反转录产物(RT产物)，各基因上游与下游引物各0.5μl，10μL PCR反应mix，用ddH₂O水补足体积至20μL。混匀后立即置PCR仪中按下列程序反应，反应结束后，样品保存于-20℃备用。

表4

组成	体积/μL	终浓度
			cDNA	1
primer f(20μM)	0.5	10μM
			primer r(20μM)	0.5	10μM
2×Mix	10	1×
			ddH<sub>2</sub>O	8
Total volum	20

注：所有Realtime PCR的扩增体系都是一样的。

PCR循环参数如表5所示：

表5

4.3熔解曲线制备

在7500fast荧光定量PCR仪上选定溶解曲线程序。在爬坡过程中连续收集样品的荧光信号以获取熔解曲线，熔解曲线通过定量PCR仪自带的分析软件获取，程序结束后进行分析。

5、统计学分析

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该286bp的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用Vector NTIadvance 10软件(Invitrogen公司)将该序列与MIF整个RNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为MIF基因的一部分序列，符合率为100％。根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt×100％。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，MIF在激素性股骨头坏死患者中表达水平明显低于正常对照，具体见图2A(剔除了部分异常点值)，以上结果验证了实施例1中提出的假说。

实施例4 WB检测MIF蛋白表达水平

1、血液样本收集及处理

根据实施例2中的标准收集于中国医学科学院北京协和医院骨科就诊的患者临床全血样本18例，其中正常人7例，SANFH患者11例(与实施例3同批样本)。

直接把采血管放入台式离心机进行离心，2500rpm离心10min,离心后留取上层黄体，剩余部分舍弃。(注：如果出现溶血情况，照常分装处理，并在分装管上做好标记(溶血))。黄色液体按200μl/管分装至1.5ml EP管中，-20℃保存。

2、蛋白浓度测定

2.1血清样本稀释

将所有血清样本稀释200倍，取5μl蛋白原液和995μl PBS于离心管中，充分混匀。

2.2配制标准曲线溶液

取20μl标准品母液(5mg/ml)用PBS稀释至100μl，制备终浓度为1mg/ml的标准品工作液。

蛋白标准品(BSA)倍比稀释：

梯度：1—0.5—0.25—0.125—0.0625—0.03125—0

5mg/ml×V＝1mg/ml×100μl V＝20μl

即：第1EP管加入20μl BSA+80μl PBS，其他各取50μl PBS溶液加入EP梯度管内，第1管吸取50μl加入第2管，反复吹打充分混匀，再从第2管吸出50μl加入第3管，依次类推，直至倒数第二管。

2.3配制工作液

根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

2.4铺96孔板测定

96孔板每孔需加样本20μl，2个复孔。标准品孔和待测蛋白孔每孔加入BCA工作液200μl，充分混匀，37℃放置30分钟。

2.5酶标仪测定OD值并计算

用酶标仪测定A562吸光度值，并记录数值保存。

以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

根据标准曲线，代入蛋白样品吸光值，通过公式蛋白浓度x＝(吸光值y-b)/a计算出待测样品蛋白浓度，乘以样品稀释倍数10(2μl蛋白样品原液稀释至20μl，即稀释10倍)即为样品实际浓度(单位：μg/μl)。

2.6蛋白样品制备

根据实际测定的蛋白浓度，用PBS将各组蛋白稀释至统一浓度。

根据：蛋白原液浓度×V原液＝终末浓度n×需要的体积(需要的体积一般取3的倍数，如60/90等)得：取原液蛋白体积＝n×需要的体积/原液浓度稀释液体积＝需要的体积-V原液

4×Loading buffer量为：需要的体积/3

计算出最终电泳时加入的上样体积：上样质量/终末浓度×4/3(上样质量一般为20ug，有时需具体问题具体分析)

95℃金属浴5-10min，使蛋白变性。-20℃保存。

3、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.1制胶与灌胶

准备制胶板2块(根据样本量的体积选择相应厚度的制胶板)、匹配的梳子，自来水冲洗后—蒸馏水冲洗——吸干/吹干水分。将两版对合好置于制胶架上。

配置分离胶：根据分子量大小选择不同浓度的分离胶。分离胶配方试剂包括：蒸馏水、30％丙烯酰胺溶液、10％SDS、10％过硫酸铵(AP液)、1.5M Tris-Hcl(pH＝8.8)、TEMED(有毒)。配制好分离胶后充分混匀，将其加入两板之间，之后贴板缓慢均匀加蒸馏水覆盖分离胶(目的赶走分离胶造成的气泡、不能冲破分离胶)，静止20-30min，使胶固定。

配制浓缩胶：除1.0M Tris-Hcl(ph＝6.8)外，其他物品与分离胶一样。将分离胶上层水分倒掉，用吸水纸吸干水分，将配制好的浓缩胶缓慢加入，避免产生气泡，待浓缩胶加满后缓慢插入梳子，静置20min左右，让其凝固。

3.2加样与电泳

先配制1*电泳液(10*电泳液用蒸馏水稀释即可)，准备电泳槽，将配好的胶板取下，与另一空板对面置于电泳架上固定，根据电泳槽正负极对好，将配置好的电泳液倒入胶板间及槽内，观察是否漏液。提前打冰，样本从冰箱拿出融化后，轻甩，混匀，插在冰上。拔出梳子(缓慢无倾斜)。上样、盖槽盖，接电跑电泳，80v、30min，后改为160v、60min。

3.3转膜

提前制备1*转膜液(提前预冷)，以配制1L为例：

10*转膜液100ml+无水甲醇200ml+700ml蒸馏水＝1L(1L中转模液10％、甲醇20％加蒸馏水稀释)。

将海绵、滤纸浸泡于转膜液内，盖上盖以防甲醇挥发，置于冰盒中预冷。准备甲醇(用于活化PVDF膜)、PVDF膜。

电泳结束后，取下胶板，用撬胶板将胶体取出，首先将上层浓缩胶裁去，再根据样本分子量大小裁取胶的大小。

取滤纸夹板，将黑色一面向下置于准备好盛有转膜液的容器里里；黑板—海绵—2-3层滤纸—裁剪好的胶带(反方向放置胶体带，即A—B变为B—A)—PVDF膜(已被甲醇活化)—2层滤纸—海绵—白板，并卡牢在夹板上。将配置好的电转液倒入电泳转膜槽内。夹板黑面对应槽内黑面，白对红，倒入配置好的转膜液，淹没夹板，将盛有冰块小槽放于电泳转膜槽内(吸收热量)，盖盖，将槽埋于冰内以吸热，通电。

转膜条件：小分子量(250mA/75min)、大分子量(250mA/90min)。

3.4封闭

封闭液：5％脱脂奶粉(奶粉+1*TBST液体)

5％脱脂奶粉＝质量/体积(为TBST液体的体积)

TBST液体配置：1*TBST＝10*TBS—1*TBS+1/1000Tween-20

摇床封闭1h。

3.5免疫反应

孵育一抗：购自Abcam公司的一抗Anti-MIF-antibody(ab187064)稀释液为5％脱脂奶粉，根据抗体说明书的比例配制相应的抗体。

取下转膜好的夹板，取出胶体带与PVDF膜(勿分开)裁剪多余PVDF膜边缘，取下PVDF膜并在最先上样一侧做一标记(剪个小角)。根据目的蛋白分子量大小进行裁膜，同样做好标记，每条条带都标记上目的蛋白的名称，以免混淆。分别装于薄膜纸内，三边封闭一边留空加入相应抗体，再封口。旋转器上旋转4℃过夜或37℃、1h。

洗膜：每条带放于抗体孵育盒内，加入1*TBST将膜覆盖，摇床上洗三次，每次5min-10min。

孵育二抗：准备二抗(5％脱脂牛奶或者1*TBST稀释)，二抗购自CST公司(GoatAnti-Rabbit IgG，HRP-linked Antibody#7074)。根据膜条带大小及多少配置对应的体积，一般2-3ml每张膜。二抗的选择是根据一抗的来源决定。常温摇床孵育1h。

洗膜：同前洗膜步骤。

显影：显影液配制：A.B显影液等体积混合(每条带按200μl左右来配制)。

条带放于显影板上，加入显影液混合液，发光成像。

4、灰度分析

用Quantity One分析软件分析电泳生成图像，计算灰度值，进而得出反应蛋白亚基表达量，以Transferrin作为内参比较不同细胞中MIF蛋白的表达水平，SANFH患者外周血MIF蛋白表达量与正常人蛋白表达量对比见图2B(剔除了部分异常点值)。

实施例5 MIF抑制剂对细胞增殖能力的影响

实验分组：空白对照组(control)，阴性对照组(NC)，转染MIF干扰序列实验组(siMIF-1、siMIF-3)。

主要实验材料：MC3T3细胞(购自国家实验细胞资源共享服务平台)。

所用MIF的干扰序列如表6所示：

表6

名称	序列	编号
			si-m-Mif_001	CGGACCAGCTCATGACTTT	SEQ ID NO.8
si-m-Mif_003	CACAGTACATCGCAGTGCA	SEQ ID NO.9

具体实验步骤：

1、细胞铺板

所有细胞均铺于六孔板中。MC3T3细胞均匀铺4×10⁵/孔，培养24h后进行转染，使转染时的细胞密度能够达到30～50％，转染时间为48h。

2、细胞转染

2.1转染浓度

siRNA初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为48h。

2.2转染步骤

以riboFECT^TM CP Reagent转染siRNA于六孔板，转染浓度为50nM。

产品以冻干粉的形式，常温运输。使用前请瞬时离心，用RNase-free Water配制成20μM储存液，分装保存于-20℃～-80℃，避免反复冻融(不超过5次)。

(1)稀释siRNA：用120μl 1X riboFECTTMCP Buffer(v2)稀释5μl 20μM siRNA储存液(v3)，轻轻混匀。

(2)混合液制备：加入12μl riboFECT^TM CP Reagent(v4)，轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min，制备成转染复合物。注：①请勿振荡，溶液可能会有浑浊，但不会影响转染；②混合液可室温放置一段时间，但不宜超过24h。

将riboFECT^TMCP转染复合物加入到1863μl无双抗完全培养基(v1)中，轻轻混匀。

3、转染后铺板

将六孔板中转染后细胞计数后接种到96孔板中，根据合适的细胞数铺板(约5×10³/孔)，同样的样本可做3-4个重复，共铺4个96孔板。

4、细胞培养

将96孔板放入37℃培养箱中培养，细胞接种贴壁后根据所需时间(24h、48h、72h、96h)加入cck-8待测。

5、CCK-8法测定

将96孔板每孔加入10μl CCK-8溶液(根据需要更换培养液后再加入CCK-8溶液)，注意避光操作。

加完后继续放入37℃培养箱中培养1-1.5h左右，观察有显色后在酶标仪上测定450nm吸光度。

结果如图3显示，与对照组相比较，阴性对照组细胞增殖无显著差异，而经转染MIF干扰序列后MC3T3细胞，其细胞增殖能力显著下降(P<0.05)。

实施例6激素性股骨头坏死检测试剂盒

基于实施例3中4.1的引物组，组装用于激素性股骨头坏死检测的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增MIF的cDNA的引物对，如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mMKCL，2.5mM MgCL₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

通过对引物浓度和退火温度的优化，确定最佳反应体系如表7所示：

表7

最佳反应条件为：

95℃预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> MIF在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用

<130> P18045

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 286

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cgatgttcat cgtaaacacc aacgtgcccc gcgcctccgt gccggacggg ttcctctccg 60

agctcaccca gcagctggcg caggccaccg gcaagccccc ccagtacatc gcggtgcacg 120

tggtcccgga ccagctcatg gccttcggcg gctccagcga gccgtgcgcg ctctgcagcc 180

tgcacagcat cggcaagatc ggcggcgcgc agaaccgctc ctacagcaag ctgctgtgcg 240

gcctgctggc cgagcgcctg cgcatcagcc cggacagggt ctacat 286

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

cgatgttcat cgtaaacacc aa 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgtagaccc tgtccgggct 20

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

acactccagc tgggtgagaa ctgaattcca 30

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaacc catg 44

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gaacgggaag ctcactgg 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gcctgcttca ccaccttct 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

cggaccagct catgacttt 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

cacagtacat cgcagtgca 19

Claims (10)

1.MIF作为标记物在制备诊断激素性股骨头坏死产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MIF在激素性股骨头坏死生物学样品中表达下调。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MIF包括SEQ ID NO.1所示的特异性核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为能够定量检测MIF表达量的产品。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品为检测个体患有激素性股骨头坏死的试剂盒或芯片。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测生物样本中MIF表达情况的试剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测生物样本中MIF表达情况的试剂包括特异性扩增MIF的引物。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

9.一种筛选治疗激素性股骨头坏死的潜在物质的方法，其特征在于，包括：用候选物质处理激素性股骨头坏死体系，如所述候选物质可促进MIF的表达或活性，则说明该候选物质可作为治疗激素性股骨头坏死的潜在物质。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述激素性股骨头坏死体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。