CN110412192A - 一种激素性股骨头坏死血清标记物fga的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA的应用，该激素性股骨头坏死血清标记物FGA的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该分子称为FGA，FGA作为FGA1的一个片段，提示FGA是与SIONFH特异性相关的蛋白，酶联免疫法分析结果表明FGA在SIONFH患者中的表达水平高于正常对照组，两者之间具有显著性差异。因此，可以将其应用于激素性股骨头坏死的诊断筛查工作中。

Description

一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA的应用
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA的应用。
背景技术
激素性股骨头坏死(Steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SIONFH)是骨科常见病、多发病，其好发于青壮年，大约75％的患者发病年龄在30-60岁，如未采取有效措施，约80％的患者在发病1-4年内将出现骨质破坏并导致股骨头塌陷。SIONFH的治疗方法主要有药物治疗、物理治疗、髓芯减压、截骨术、全髋关节置换术等，但是由于发病机制不清，至今尚无有效的预防和治疗方法阻止疾病继续进展，这是骨科亟待解决的难题。因此，急需探索新的早期诊断和早期治疗的手段。
血清蛋白标记物的检测目前在肿瘤疾病中已得到广泛应用，如肺癌、胃癌及肝癌等。而SIONFH诊断的辅助检测目前只有x光片、CT及MR，急需寻找具有诊断价值的SIONFH血清蛋白标记物，利于SIONFH的早诊断及早治疗。
因此，提供在血清中能够特异高表达的蛋白标记物具有重要的诊断和治疗意义，本领域迫切需要开发可用于诊断SIONFH的血清蛋白标志物。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA在制备股骨头坏死血清诊断药物中的应用，所述激素性股骨头坏死血清标记物FGA的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
优选地，所述激素性股骨头坏死血清标记物FGA为纤维蛋白原α链前体亚型1的一个片段，分子量为1077道尔顿。
优选地，所述股骨头坏死血清诊断药物为通过ELISA检测股骨头坏死血清标志物的药物。
优选地，其血清中的检测参数为543±9.761ng/mL。
本发明还公开了与激素性股骨头坏死血清标记物FGA相结合的分子在制备股骨头坏死血清诊断药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA，首先应用液体蛋白芯片技术分离提取SIONFH患者和正常对照人群血清蛋白多肽，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术捕获SIONFH患者和正常对照人群蛋白多肽图谱，并且采用ClinProTools2.1软件对比分析SIONFH患者和正常人群血清蛋白多肽谱图差异，找出组间显著差异表达的蛋白多肽分值，在SIONFH患者血清中显著高表达的蛋白多肽峰值中筛出SIONFH血清蛋白标志物，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。该分子称为FGA，FGA作为FGA1的一个片段，提示FGA是与SIONFH特异性相关的蛋白，酶联免疫法分析结果表明FGA在SIONFH患者中的表达水平高于正常对照组，两者之间具有显著性差异。因此，可以将其应用于激素性股骨头坏死的诊断筛查工作中。
附图说明
图1为SIONFH患者血清样本的三次重复的蛋白多肽图谱(1KDa～10KDa)；
图2为蛋白多肽峰m/z:1077.84在SIONFH患者和正常对照组中的蛋白多肽表达差异；
图3为FGA的MS/MS质谱鉴定图谱；
图4ELISA验证FGA蛋白的表达水平。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明首先应用液体蛋白芯片技术分离提取SIONFH患者和正常对照人群血清蛋白多肽，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术捕获SIONFH患者和正常对照人群蛋白多肽图谱，并且采用ClinProTools2.1软件对比分析SIONFH患者和正常人群血清蛋白多肽谱图差异，找出组间显著差异表达的蛋白多肽分值，在SIONFH患者血清中显著高表达的蛋白多肽峰值中筛出SIONFH血清蛋白标志物。
对于所筛选的SIONFH血清蛋白诊断标志物的验证为：应用HPLC将SIONFH患者血清分离的蛋白多肽混合物分为20～30个组分，在对其进行二级质谱的鉴定，并且对鉴定出的蛋白多肽采用酶联免疫法(ELISA)进行血清回归分析，结果血清回归验证证明其在SIONFH患者血清中显著高表达，具有特异性，可以作为SIONFH患者血清筛查的生物标志物。
1.样本、试剂与仪器
1.1样本的采集与处理：
样本采集自西安交通大学第二附属医院骨科确诊为SIONFH的患者(2011年-2018年)32例(男性20例；女性12例；平均年龄21-59岁)和正常对照人群24例(男性16例；女性8例；平均年龄29-60岁)。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黄帽、有隔离胶)采集全血5mL，室温静置30min；室温离心5min(3000g)，将上层血清分装成100μL/管，立即保存于-80℃，避免反复冻融。
1.2试剂与仪器
血清蛋白的提取采用德国布鲁克公司的磁珠试剂盒“弱阳离子型”(MB-WCX)，以及光谱纯(HPLC级)乙腈、三氟乙酸(德国Merck公司)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(美国Sigma公司)。
磁珠分离器、600/384AnchorChip靶板和AutoFlex III基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Timeof Flight MassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)(德国BrukerDaltonics公司)。
2、血清蛋白样本的制备
2.1血清蛋白的纯化
运用弱阳离子(MB-WCX)磁珠捕获血清蛋白多肽，具体操作步骤如下：
①用混匀器完全混匀磁珠悬浮液1min；
②加10μL MB-WCX结合液以及10μL MB-WCX磁珠至PCR管，混匀后加5μL血清，混匀至少5次，静置5min；
③将PCR管放入磁柱分离器，使磁珠贴壁1min，液体清澈后弃上清液；
④加100μL MB-WCX冲洗液，在磁柱分离器上前后移动10次PCR管，磁珠贴壁后弃上清液，重复步骤③、④两次；
⑤加5μL MB-WCX洗脱液洗涤贴壁的磁珠，并反复吹打10次，磁珠贴壁2min，将上清液移入干净的离心管；
⑥加5μL MB-WCX稳定液至离心管并混匀，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS检测或者冻存于-20℃冰箱24h之内质谱分析。
2.2质谱分析
将分离收集得到的蛋白样本1μL与10μL的基质α-氰基-4-羟基肉桂酸混匀，取1μL点在Anchorchip靶板上(德国Bruker公司)，每个样本分别点三个靶点以作三次重复。待室温干燥后将靶板放入质谱仪进行飞行时间质谱分析，采用FlexControl 2.0软件进行标准品校正后开始样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶(5次点靶，每次打靶2×30次)之后生成质谱图，获得由不同质核比(m/z)组成的蛋白多肽谱图。
采用ClinProTools2.1软件结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声；分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列，找出组间表达具有显著差异的蛋白多肽峰值(P<0.001)。
将SIONFH患者组和正常对照组血清样本采用磁珠分离系统处理后，经过MALDI-TOF-MS分析后，对SIONFH患者组和正常对照组的每个样本进行蛋白多肽图谱绘制，如图1所示，在分子量范围1000Da～10000Da共检测到39个蛋白多肽峰图，且每个样本的三次重复稳定性较高。采用ClinProTools 2.1软件对质谱捕获的SIONFH患者和正常对照组的血清蛋白多肽图谱进行分析，将SIONFH患者血清多肽谱图与正常人群进行比较分析，共检测到5个具有极显著差异的蛋白多肽峰图(P<0.001)，其中2个蛋白多肽在SIONFH患者中表达显著下调，其余3个蛋白多肽在SIONFH患者中表达显著上调，具体如表1所示。
表1差异蛋白肽段表达
对表1中的SIONFH患者血清中特异性高表达的3个蛋白多肽进行Flexanalysis软件分析，结果如图2所示，发现M/Z:1077.84的蛋白多肽峰图在SIONFH患者血清中均显著高表达，因此，对其进行序列鉴定并作为标志物的首选进一步鉴定。
3、SIONFH血清潜在标志物的序列鉴定
具体采用液相色谱分离与质谱联用的技术对SIONFH血清多肽标志物M/Z:1077.84进行鉴定，采用Waters公司Nano Acquity UPLC对经磁珠分离收集的质谱上样剩余的血清蛋白多肽进行二维凝胶色谱分离，收集15～30份肽段馏份：在收集液中检测到目的蛋白；再联用Thermo Fisher公司LTQ Orbitrap XL质谱系统对SIONFH患者血清中表达上调的蛋白多肽M/Z:1077.84进行序列鉴定。
具体的操作步骤为：
3.1样本前处理
合并提取后的蛋白样，1300转，10分钟，取上清液，冷冻干燥仪干燥，使终体积在50μL，得到液体A，用安捷伦ziptip萃取柱，浓缩处理液体A。处理方法：①ziptip柱子用100％乙腈吹打5次，活化柱子；②活化好的ziptip在液体1中，反复吹吸10次，尽量避免气泡产生；③50％ACN 0.1％TFA水溶液，洗涤3次ziptip柱子；④、ziptip柱子在0.1％TFA中反复吹吸，使样本洗脱，得到洗脱液2；⑤重复以上1-4步，30次；⑥合并30次的洗脱液2，冷冻干燥至10μL，用于质谱鉴定。
3.2色谱分离：
原始样品加10μL流动相A，转移至进样瓶中，共20μL。
一维超高效液相系统：Waters公司Nano Aquity UPLC(Waters Corporation,Milford,USA)。色谱柱：
捕集柱：C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquityTMColumn
分析柱：C18,3.5μm,75μm×150mm,nanoAcquityTMColumn
流动相A：5％乙腈，0.1％甲酸的水溶液
流动相B:95％乙腈，0.1％甲酸的水溶液；所有溶液均为HPLC级。
捕集流速15μl/min，捕集时间3min，分析流速400nl/min；分析时间60min，色谱柱温度35℃；Partial Loop模式进样，进样体积18μl。
梯度洗脱程序如下表2所示：
表2
时间 流速 流动相A％ 流动相B％
40.0 0.400 95.0 5.0
41.0 0.400 55.0 45.0
45.0 0.400 20.0 80.0
45.50 0.400 95.0 5.0
60.00 0.400 95.0 5.0
捕集流速15μl/min，捕集时间3min，分析流速400nl/min；分析时间60min，色谱柱温度35℃；Partial Loop模式进样，进样体积18μl。
3.3 LTQ-Orbitrap XL质谱分析：
使用Thermo Fisher公司LTQ Obitrap XL质谱分析系统。Nano离子源(MichromBioresources,Auburn,USA)，喷雾电压1.8kV；质谱扫描时间60min；实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion),在10秒内对母离子进行2次串级之后加入到排除列表内90秒；扫描范围400-2000m/z；一级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为100000；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除，不作为母离子)。
数据分析：使用数据分析软件Bioworks Browser 3.3.1SP1进行SequestTM检索。母离子误差设定为100ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切，可变修饰为M(Methionine)甲硫氨酸氧化。检索结果参数设定为deltacn>＝0.10。
检索结果为：m/z:1077.84Da.；IPI:IPI00021885；Gene Symbol＝Isoform1ofFibrinogen alpha chain precursor；序列为GDFLAEGGGVR(SEQ.ID.NO.1所示)。所分离的M/Z:1077.84Da称为FGA，如图3所示，为纤维蛋白原α链前体亚型1(FGA1)的一个片段。
FGA作为FGA1的一个片段，提示FGA是与SIONFH特异性相关的蛋白，进一步通过ELISA检测来进行验证。
4、SIONFH血清FGA表达的ELISA血清验证分析：
1)血清样本：收集SIONFH患者血清45例，正常对照人群血清15例进行ELISA的血清验证分析。所有血清样本均来自西安交通大学第二附属医院，采集时间2011年～2018年。
2)检测方法：采用酶联免疫法(ELISA)检测SIONFH患者及正常对照组的血清FGA的表达水平，试剂盒购自艾莱萨生物科技(上海)有限公司。实验步骤如下：
(1)设置标准品孔、样品孔，在对应的孔位置分别加入标准品和样本；
(2)在各孔中加入HRP标记的检测抗体，37度温育60min，并彻底洗涤；
(3)每孔加入底物A、B各50μL，37度避光孵育15min；
(4)每孔加终止液50μL，15min内，在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
3)统计方法：采用GraphPad.Prism.v5.01软件进行非配对T检验。
4)结果分析：酶联免疫法分析结果表明FGA在SIONFH患者中的表达水平高于正常对照组，两者之间具有显著性差异，具体结果如表3及图4所示。
表3ELISA检测血清FGA表达水平
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 西安交通大学医学院第二附属医院
<120> 一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA的应用
<141> 2019-07-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1 5 10

Claims (5)

1.一种激素性股骨头坏死血清标记物FGA在制备股骨头坏死血清诊断药物中的应用，其特征在于，所述激素性股骨头坏死血清标记物FGA的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激素性股骨头坏死血清标记物FGA为纤维蛋白原α链前体亚型1的一个片段，分子量为1077道尔顿。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述股骨头坏死血清诊断药物为通过ELISA检测股骨头坏死血清标志物的药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其血清中的检测参数为543±9.761ng/mL。
5.与激素性股骨头坏死血清标记物FGA相结合的分子在制备股骨头坏死血清诊断药物中的应用。
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