CN106686977A - Ph调整以改善细胞库的解冻复苏 - Google Patents

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Abstract

本文提供了冷冻用于储存的哺乳动物细胞或改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括在具有约6.7至约8.5的pH的冷冻培养基中冷冻哺乳动物细胞。

Description

PH调整以改善细胞库的解冻复苏
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年7月9日提交的美国临时申请序列号62/022,392的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及冷冻细胞(例如哺乳动物细胞)的方法，用于在冷冻细胞中使用的建库(banking)和冷冻介质。
背景技术
通过首先在分批/灌注细胞培养方法中积累细胞、然后收获细胞用于建库来产生细胞库。该方法包括三个阶段：细胞积累、收获和细胞浓缩、以及细胞建库。收获方法步骤用于浓缩最终的细胞培养液或使用离心从细胞培养液中提取细胞。随后的汇集和填充方法用于制备用于长期储存的细胞库安瓿。
这些传统方法可能导致选定细胞系解冻后不一致或差的生存力。细胞建库方法必要的是在解冻冷冻细胞后需要高的细胞生存力。因此，改进的用于细胞建库的冷冻细胞的方法是期待的。在建库后解冻时允许更大细胞生存力的用于冷冻细胞的细胞培养基将是有益的。
本文中出于所有目的引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
发明内容
一方面，本文提供了一种改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括在冷冻培养基中冷冻用于建库的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中所述冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5的pH或在冷冻之前已经调节至约6.7至约8.5的pH。
在另一方面，本文提供了冷冻用于储存的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)的方法，所述方法包括在冷冻培养基中冷冻细胞，其中冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中所述冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5的pH或在冷冻之前已经调节至约6.7至约8.5的pH。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.3、约6.8至约8.3、约6.9至约8.3、约7.0至约8.3、约7.1至约8.3、约7.2至约8.3、约7.3至约8.3、约7.4至约8.3、约7.5至约8.3、约7.2至约8.0、约7.2至约7.8或约7.5的pH。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，冷冻培养基的pH已经调节至约6.7至约8.5、约6.7至约8.3、约6.8至约8.3、约6.9至约8.3、约7.0至约8.3、约7.1至约8.3、约7.2至约8.3、约7.3至约8.3、约7.4至约8.3、约7.5至约8.3、约7.2至约8.0、约7.2至约7.8、或约7.5。在上文或本文所述方法的一些实施方案中，在pH调节之前和/或之后将细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)与冷冻培养基组合。在一些实施方案中，调节的pH是目标pH或测量pH。在一些实施方案中，目标pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。在一些实施方案中，测量pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。在上文或本文所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括在调节冷冻培养基的pH之前测量含有细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的冷冻培养基的初始pH的步骤。在上文或本文所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括测量调节的冷冻培养基的pH的步骤。在上文或本文所述方法的一些实施方案中，如果冷冻培养基的测量pH低于目标pH，则所述方法包括重复调节步骤和测量步骤，直到调节的冷冻培养基的pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。
在本文或上文所述方法的一些实施方案中，通过加入碱来调节pH。在一些实施方案中，碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)钠盐、氢氧化钠和氢氧化钾。在一些实施方案中，根据下式V碱＝C碱*Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碱调节冷冻培养基的pH，其中C碱是碱特异性系数，V碱是加入到冷冻培养基中的碱的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。在一些实施方案中，根据下式VNa2CO3＝0.0085Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碳酸钠调节冷冻培养基的pH，其中VNa2CO3是加入到冷冻培养基中的1M碳酸钠的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。在一些实施方案中，目标pH是介于约6.7至约8.5之间、约7.2至约8.3之间或本文所述的任何pH或任何pH范围内的pH。在一些实施方案中，目标pH为7.5。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，在细胞与冷冻培养基组合之前，细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)在pH约6.2至约6.6的培养基中。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，低温防护剂是DMSO(二甲基亚砜)、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其组合。在一些实施方案中，冷冻之前冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约12.5％，以体积计。在一些实施方案中，冷冻细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)之前冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约10％，以体积计。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，含有细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的冷冻培养基在冷冻前具有约8％至约28％的收集细胞体积(packed cell volume)(PCV)的细胞密度。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括在细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)与冷冻培养基组合之前、在细胞收获和浓缩过程中冷却细胞培养液的步骤。在一些实施方案中，将细胞培养液冷却至等于或低于约20℃的温度。在一些实施方案中，将细胞培养液冷却至等于或低于约10℃的温度。
在另一方面，本文提供了冷冻用于储存的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)或改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括(a)将含有细胞的冷冻培养基的pH调节至pH约6.7至约8.5，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂；和(b)冷冻细胞。
在一些实施方案中，将pH调节至约6.7至约8.3、约6.8至约8.3、约6.9至约8.3、约7.0至约8.3、约7.1至约8.3、约7.2至约8.3、约7.3至约8.3、约7.4至约8.3、约7.5至约8.3、约7.2至约8.0、约7.2至约7.8、或约7.5。在一些实施方案中，调节的pH是目标pH或测量pH。在一些实施方案中，目标pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。在一些实施方案中，目标pH为约7.5。在一些实施方案中，测量pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括在调节冷冻培养基的pH之前测量含有细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的冷冻培养基的初始pH的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括测量冷冻培养基的调节pH的步骤。在一些实施方案中，如果冷冻培养基的测量pH低于目标pH，则该方法包括重复调节步骤和测量步骤，直到冷冻培养基的调节pH为约6.7至约8.5、约7.2至约8.3、或本文所述的任何pH或任何pH范围。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，通过加入碱来调节pH。在一些实施方案中，碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES钠盐、氢氧化钠和氢氧化钾。在一些实施方案中，根据下式V碱＝C碱*Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碱调节冷冻培养基的pH，其中C碱是碱特异性系数，V碱是加入到冷冻培养基中的碱的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。在一些实施方案中，根据下式VNa2CO3＝0.0085Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碳酸钠调节冷冻培养基的pH，其中VNa2CO3是加入到冷冻培养基中的1M碳酸钠的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。在一些实施方案中，目标pH是约6.7至约8.5、或本文所述的任何pH或任何pH范围。在一些实施方案中，目标pH为约7.5。
在一些实施方案中，在细胞与冷冻培养基组合之前，细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)在pH为约6.2至约6.6的培养基中。
在一些实施方案中，冷冻培养基中的低温防护剂是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其组合。在一些实施方案中，在冷冻之前含有细胞(例如，哺乳动物细胞或昆虫细胞)的冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约12.5％，以体积计。在一些实施方案中，在冷冻细胞之前，含有细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约10％，以体积计。
在一些实施方案中，含有细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的冷冻培养基在冷冻之前具有约8％至约28％收集细胞体积(PCV)的细胞密度。
在一些实施方案中，所述方法还包括在细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)与冷冻培养基组合之前、在细胞收获和浓缩过程中冷却细胞培养液的步骤。在一些实施方案中，将细胞培养液冷却至等于或低于约20℃，或等于或低于约10℃的温度。
在另一方面，本文提供了冷冻用于储存的真核细胞(例如，哺乳动物细胞，昆虫细胞等)或改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括(a)将冷冻培养基的pH调节至pH为约6.7至约8.5，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂；(b)将细胞与冷冻培养基组合以形成细胞池；和(c)冷冻细胞池中的细胞。
在一些实施方案中，将pH调节至约6.7至约8.3、约6.8至约8.3、约6.9至约8.3、约7.0至约8.3、约7.1至约8.3、约7.2至约8.3、约7.3至约8.3、约7.4至约8.3、约7.5至约8.3、约7.2至约8.0、约7.2至约7.8、或约7.5。在一些实施方案中，调节的pH是目标pH或测量pH。在一些实施方案中，目标pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。在一些实施方案中，测量pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。
在一些实施方案中，该方法还包括测量冷冻培养基的调节pH的步骤。在一些实施方案中，如果冷冻培养基的测量pH低于目标pH，则该方法还包括重复调节步骤和测量步骤，直到冷冻培养基的调节pH为约6.7至约8.5，或本文所述的任何pH或任何pH范围。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，通过加入碱来调节pH。在一些实施方案中，碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES钠盐、氢氧化钠和氢氧化钾。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，在细胞与冷冻培养基组合之前，细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)在具有pH为约6.2至约6.6的培养基中。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，冷冻培养基中的低温防护剂是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇、大分子、糖或其组合。在一些实施方案中，细胞池中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约12.5％，以体积计，或约5％至约10％，以体积计。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，细胞池含有细胞密度为约8％至约28％收集细胞体积(PCV)的细胞(例如，哺乳动物细胞或昆虫细胞)。
在上述或本文所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括在细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)与冷冻培养基组合之前、在细胞收获和浓缩过程中冷却细胞培养液的步骤。在一些实施方案中，将细胞培养液冷却至等于或低于约20℃的温度。在一些实施方案中，将细胞培养液冷却至等于或低于约10℃的温度。
在上文或本文所述方法的一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞，如High FiveTM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在上文或本文所述方法的一些实施方案中，细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)包含编码多肽的核酸。在一些实施方案中，多肽是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
在另一方面，本文提供用于冷冻细胞的真核细胞池(例如，哺乳动物细胞池或昆虫细胞池)，其包含缓冲溶液、低温防护剂和包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5或约7.2至约8.3的pH(或本文所述的任何pH或任何pH范围)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞，如High FiveTM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些实施方案中，细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)包含编码多肽的核酸。在一些实施方案中，多肽是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
另一方面，本文提供了包含多个容器的细胞库，每个容器含有(a)包含缓冲液和低温防护剂的冷冻介质，和(b)包含编码多肽的核酸的真核细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)，其中冷冻培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5或约7.2至约8.3的pH(或本文所述的任何pH或任何pH范围)。在一些实施方案中，容器是安瓿。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞，如High FiveTM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。在一些实施方案中，细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)包含编码多肽的核酸。在一些实施方案中，多肽是治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
应当理解，本文所述的各种实施方案的一种、一些或所有性质可以组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1显示了细胞建库方法流程的示例。
图2A-2B显示了在初始pH6.6或6.3的pH调节池中产生的细胞库的解冻传代第1天生存力(图2A)和第4天生长(PCV)(图2B)的结果。
图3A-3F显示了解冻传代第1天生存力(图3A、3C和3E)和PCV的整体生长率(图3B、3D和3F)相对建库pH，和将pH调节至一个目标pH范围对九个CHO细胞系(每个产生不同的抗体(抗体1-9))的影响。
图4A-4B显示了解冻传代活细胞密度(VCD)或活细胞计数(VCC)(图4A)和生存力(％)(图4B)趋势，其证明了从初始池pH 6.3调节pH至7.5相对无pH调节的影响。
图5显示了在合并过程中活收集细胞体积(VPCV)与活细胞计数(VCC)的比率，其是估计细胞大小的间接方法。数据显示了冷冻介质(FM)添加和pH调节至pH 7.3、7.6或8.0对细胞大小的影响。较大的比率表示较大的细胞大小。
图6A-6B显示了在t0(图6A)和t2(2小时)(图6B)时、在初始pH 6.4(目标6.2)或6.6(目标6.7)的pH调节池产生的细胞库的PCV解冻传代整体生长率结果。
详细说明
本文提供了改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括在冷冻培养基中冷冻用于建库的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中所述冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5的pH。
本文还提供了冷冻用于储存的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)的方法，所述方法包括在冷冻培养基中冷冻细胞，其中冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5的pH。
本文还提供了冷冻用于储存的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)或改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括(a)将含有细胞的冷冻培养基的pH调节至pH约6.7至约8.5，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂；和(b)冷冻细胞。
本文还提供了冷冻用于储存的真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)或改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括(a)将冷冻培养基的pH调节至pH约6.7至约8.5，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂；(b)将细胞与冷冻培养基组合以形成细胞池；和(c)在细胞池中冷冻细胞。
本文还提供了用于冷冻真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)的真核细胞池，其包含缓冲溶液、低温防护剂和包含编码多肽的核酸的真核细胞，其中所述培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5的pH。
本文还提供了包含多个容器的细胞库，每个容器包含(a)包含缓冲液和低温防护剂的冷冻培养基，和(b)包含编码多肽的核酸的真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞等)，其中所述冷冻培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5的pH。
定义
术语“培养基”和“细胞培养基”是指用于维持细胞的溶液。培养基可以进一步包含用于生长细胞的营养源。如本领域技术人员所理解的，营养源可以包含细胞用于生长和/或存活所需的成分，或者可以包含有助于细胞生长和/或存活的成分。维生素、必需或非必需氨基酸和微量元素是培养基组分的实例。
“基础营养培养基”是指包含细胞生长和存活所需的基本营养物的培养基。基础营养培养基的实例包Eagle氏最低必须培养基(Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM))和Dulbecco改良的Eagle氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))。
“化学上确定的细胞培养基”或“CDM”是具有确定组合物的培养基，其不含来源于动物或植物的产物，如，例如动物血清和植物蛋白胨。如本领域技术人员将理解的，CDM可以用于多肽生产过程，其中细胞与CDM接触并将多肽分泌到CDM中。因此，应当理解，组合物可以含有CDM和多肽产物，并且多肽产物的存在不会使CDM在化学上不确定。
“化学上不确定的细胞培养基”是指其化学组分不能被确定并且可以包含一种或多种源自动物或植物来源的产物的培养基，例如动物血清或植物蛋白胨。如本领域技术人员所理解的，化学上不确定的细胞培养基可以含有来源于动物或植物的产物作为营养源。
“冷冻培养基”、“细胞冷冻培养基”或“用于冷冻的细胞培养基”是指含有低温防护剂的缓冲溶液。冷冻培养基可用于冷冻包含在冷冻培养基中的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)。本文所用的“缓冲溶液”是指水基、等渗的pH缓冲盐溶液，其用于保持细胞膜的完整性，并用作一种或多种低温防护剂的载体。冷冻培养基还可以含有细胞培养基中存在的额外组分。缓冲液的实例可包括碳酸氢盐缓冲液、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)、TEST(TES/TRIS组合)、及其组合。培养基的实例可包括Eagle氏最低必须培养基(EMEM)和Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)。低温防护剂保护细胞免受冷冻损伤，并且可以分类为能够穿过质膜的“渗透型”(例如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇等)或“非渗透型”(例如大分子、糖等)。
“培养”细胞是指在适合细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。
“批次培养”是指在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应到培养容器中的培养。
本文所用的短语“补料批次细胞培养”是指批次培养，其中最初供应细胞和培养基到培养容器中，并且在培养终止之前、在培养过程中连续地或离散增量地向培养中补料额外的培养营养物，有或没有周期性细胞和/或产物收获。
“灌注培养”是通过例如过滤、包封、锚定到微载体上等将细胞限制在培养物中的培养，其中培养基连续或间歇地引入并从培养容器中取出。
“细胞建库”或“建库”是将细胞冷冻至低于零度(sub-zero)的温度(冷冻保存)以停止酶/化学反应、从而将细胞保持在活的状态用于以后使用的方法。冷冻细胞可以在低于约0℃(例如，-20℃、-70℃、-80℃或更低)下储存用于以后使用。例如，细胞可以储存在安瓿中，以气相放置在-196℃的包含液氮的冷冻器中。
“培养容器”是指用于培养细胞的容器。培养容器可以是任何大小，只要其可用于培养细胞。
本文所用的术语“滴度”是指通过细胞培养物产生的重组表达的多肽的总量除以给定量的培养基体积。效价通常以每毫升培养基的多肽毫克数为单位表示。
如本文可互换使用的“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。
“分离的核酸”是指在其通常环境之外或与之分离的并包括非天然存在的、重组的或天然存在的序列。分离的核酸分子不是其在自然界中存在的形式或设置。因此，分离的核酸分子不同于存在于天然细胞中的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括在通常表达蛋白质的细胞中包含的核酸分子，例如其中该核酸分子存在于与天然细胞不同的染色体位置。
“分离的”蛋白质(例如分离的抗体)是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的蛋白质。其天然环境的污染物组分是干扰蛋白质的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。分离的蛋白质包括重组细胞内的原位蛋白质，因为蛋白质天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。
“纯化的”多肽是指多肽的纯度已经提高，使得其以比在其天然环境中存在和/或在实验室条件下最初产生时和/或合成时和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语，并不一定意味着绝对纯度。
“污染物”是指不同于所需多肽产物的物质。污染物包括但不限于：宿主细胞材料，如宿主细胞蛋白；核酸；所需多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一种多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养介质组分等。污染物还可以包括通过纯化过程引入的物质，如过滤的蛋白A。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分的缀合。还包括在定义内的是，例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其它修饰。包含在本文定义内的多肽的实例包括哺乳动物蛋白，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；寻靶受体；地址素；调节蛋白；整合素如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受体；免疫粘附素；以及任何上述列出的蛋白质的片段和/或变体，以及与蛋白质(包括例如任何上述蛋白质)结合的抗体，包括抗体片段。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的生物活性。抗体可以是人、人源化的和/或亲和力成熟的。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即包含各抗体的群体是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被未被其它抗体污染的合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988)；Hammerling等人,在MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中)，在细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567))；噬菌体展示技术(参见例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)和用于在动物中产生人或人样抗体的技术，所述动物具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因(参见例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；和Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“药物制剂”是指这样形式的制剂，其允许活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有施用该制剂的受试者不可接受的毒性的额外成分。这样的制剂是无菌的。
“药学上可接受的”载体、赋形剂或稳定剂是对以所采用的剂量和浓度暴露于其中的细胞或哺乳动物是无毒的那些载体、赋形剂或稳定剂(Remington's PharmaceuticalSciences(第20版)，A.Gennaro编辑，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。通常生理学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂，如TweenTM、聚乙二醇(PEG)和PluronicsTM。
如本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另有明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the(该)”包括复数指示物。因此，例如，提及“化合物(a compound)”任选地包括两种或更多种这样的化合物的组合等。
应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由...组成”和“基本上由...组成”的方面和实施方案。
本文中对“约”某值或某参数的引用包括(描述)涉及该值或该参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。数字范围包括限定该范围的数字。
在马库什组或其它替代物组的方面描述本发明的方面或实施方案时，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，还单独地包括该组的每个成员和主组的所有可能的亚组，还包括缺少一个或多个组成员的主组。本发明还设想在所要求保护的发明中明确排除任何组成员中的一个或多个。
II.本发明的方法和用途
本文提供在细胞冷冻培养基中冷冻用于培养或储存的细胞的方法。本文还提供改善细胞库的解冻复苏的方法。方法包括在冷冻培养基中冷冻细胞的步骤，其中冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中含有细胞的冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5或约6.7至约8.3的pH值。该方法可以进一步包括将冷冻培养基的pH调节至约6.7至约8.5或约6.7至约8.3的步骤。本文提供的方法可用于制备主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)。在一些实施方案中，本文所述的方法改善解冻后的细胞生存力和/或细胞生长。
用于冷冻和建库方法中的真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞等)可以通过本领域已知的方法包括细胞培养和浓缩方案制备。方法可以包括细胞建库之前的细胞积累、收获和细胞浓缩。细胞积累可通过几种方法发生。一个实例可以使用过程控制的生物反应器用于细胞积累；然而，也可以使用其它方法/培养容器(例如T-烧瓶、摇瓶、滚瓶、旋转容器等)。收获和细胞浓缩可以通过离心以及随后将细胞沉淀物重悬于冷冻培养基中进行。在另一个实例中，可以通过中空纤维过滤器(HFF)在单一步骤中收获和浓缩细胞。也可以通过使用替代性灌注膜/装置从细胞培养液中除去培养基实现细胞浓缩(例如漂浮灌注膜、细胞沉淀器、连续循环离心机等)。在本文所述方法的一些实施方案中，将收获和细胞浓缩过程或收获的细胞培养液冷却至等于或低于约20℃(例如，等于或低于约19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃和10℃)。
然后，在冷冻细胞之前，可以将沉淀或浓缩的细胞与冷冻培养基组合。在一些实施方案中，沉淀的细胞可以重悬于冷冻培养基中。在一些实施方案中，可将含有浓缩的低温防护剂的冷冻培养基加入到收获和浓缩的细胞中，或者可将收获和浓缩的细胞加入到含有浓缩的低温防护剂的冷冻培养基中用于细胞建库。冷冻培养基可以包含缓冲溶液和低温防护剂。在一些实施方案中，培养基中的缓冲液可以包含两性离子缓冲液。在一些实施方案中，培养基中的缓冲液可以包含选自碳酸氢盐缓冲液、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、TES(N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸)、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)、TEST(TES/TRIS组合)及其组合的缓冲液。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养中的缓冲液浓度为约10mM至约50mM。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约35mM碳酸氢钠(例如约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM或约35mM，包括在这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约50mM HEPES(例如约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM或约50mM，包括这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约12mM PBS(例如约10mM、约11mM或约12mM，包括这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约20mM MOPS(例如约10mM、约12mM、约15mM、约18mM或约20mM，包括这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约30mM TES(例如约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM，包括这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约30mM TRIS(例如约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM，包括这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，冷冻细胞之前冷冻培养基含有约10mM至约30mMTEST(例如约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM，包括这些值之间的任何浓度)。在一些实施方案中，低温防护剂是渗透剂或非渗透剂。在一些实施方案中，低温防护剂是选自甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇和糖的试剂。在一些实施方案中，添加到收获和浓缩细胞中的冷冻培养基是浓缩的冷冻培养基。在一些实施方案中，含有浓缩的低温防护剂的冷冻培养基可以含有20-30％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)或甘油。在一些实施方案中，将浓缩的冷冻培养基(例如，1份冷冻培养基(含有浓缩的低温防护剂)体积：3份细胞培养液)倒入收获和浓缩细胞中。在一些实施方案中，在冷冻细胞之前含有细胞的冷冻培养基含有约5％至约12.5％的DMSO或甘油。
在一些实施方案中，冷冻培养基可以进一步包含在细胞培养基中存在的额外组分。在一些实施方案中，冷冻培养基可以含有Eagle氏最低必须培养基(EMEM)或Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)。
在一些实施方案中，制备用于冷冻的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的方法可以进一步包括调节冷冻培养基或包含浓缩的低温防护剂的冷冻培养基的pH的步骤，其中在沉淀的细胞或浓缩的细胞与冷冻培养基或含有浓缩的低温防护剂的冷冻培养基组合之前，将pH调节至约6.7至约8.5。在一些实施方案中，制备用于冷冻的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)的方法还包括调节含有细胞的冷冻培养基的pH的步骤，其中冷冻培养基的pH调节至约6.7至约8.5。在一些实施方案中，调节的pH是目标pH或测量pH。
在某些实施方案中，在冷冻之前通过收集细胞体积(PCV)测量细胞密度。在一些实施方案中，包含待建库细胞的冷冻培养基在冷冻之前具有8％至28％(例如，约8％、10％、15％、20％、25％或28％中的任一)PCV的细胞密度。在一些实施方案中，冷冻之前冷冻培养基中的细胞密度可以为约21％PCV。
在一些实施方案中，冷冻培养基中的细胞在冷冻之前分配到安瓿或一次性袋中。在一个示例性实施方案中，该方法包括：使用高压灭菌自填充注射器将细胞悬液分配到置于湿冰上的高压灭菌的玻璃安瓿中，密封安瓿，进行完整性测试，并在速率控制的冷冻器中冷冻安瓿，然后将安瓿转移到液氮冷冻器中长期储存。
在一些实施方案中，通过使用本文所述的方法改善解冻后的细胞生存力。在一些实施方案中，与在pH 6.7或更低的冷冻培养基中冷冻和/或在收获过程和解冻期间不冷却收获细胞培养物的细胞生存力相比，细胞生存力增加至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或85％中的任意。
pH调节
根据本文所述的方法，可以调节冷冻培养基(含有或不含细胞)的pH，例如通过向培养基中加入碱。在一些实施方案中，将冷冻培养基的pH调节至高于约6.7的pH。在一些实施方案中，将冷冻培养基的pH调节至约6.7和约8.5之间的pH(目标pH或测量pH)。在一些实施方案中，将冷冻培养基的pH调节至约6.8至约8.3之间、约6.9至约8.3之间、约7.0至约8.3之间、约7.1至约8.3之间、约7.2至约8.3之间、约7.3至约8.3之间、约7.4至约8.3之间，约7.5至约8.3之间、约7.6至约8.3之间、约7.7至约8.3之间、或约7.8至约8.3之间。在一些实施方案中，冷冻培养基的pH调节至约7.2至约7.8之间的pH(目标pH或测量pH)。在一些实施方案中，目标pH或测量pH为约7.2至约8.3。在一些实施方案中，目标pH或测量pH为约7.2至约7.8(例如约7.5的pH)。在一些实施方案中，如果第一pH调节不足以将pH增加至目标pH范围(例如，pH为约7.3至约7.7)，则进行第二pH调节。在一些实施方案中，可以进行多于一次pH调节。
加入以调节pH的碱可以是本领域技术人员熟知的任何碱，但是在示例性实施方案中，碱是碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES钠盐、氢氧化钠或氢氧化钾。
可以在冷冻之前的任何点测量冷冻介质的pH，并且可以在冷冻之前的任何时间调节pH。在一些实施方案中，在与待建库的细胞组合之前测量和/或调节冷冻培养基的pH。在其它实施方案中，在与待建库的细胞组合之后测量和/或调节冷冻培养基的pH。在一些实施方案中，冷冻培养基的pH被测量和/或调节多于一次。在一些实施方案中，在冷冻之前测量和/或调节冷冻培养基的pH两次、三次或更多次。在其它实施方案中，在与待建库的细胞组合之前和之后测量和/或调节冷冻培养基的pH。在一些实施方案中，根据以下公式调节pH：V碱＝C碱*Vp(pHt-pHi)，其中C碱是碱特异性系数，V碱是加入到冷冻培养基的碱的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。如本文所用，初始pH是含有细胞的冷冻培养基的pH(即其与细胞组合之后)，但是在调节pH用于冷冻之前的pH。C碱表示取决于为了pH调节选择的碱的类型和浓度的特异性系数。可以根据碱的选择获得C碱系数。在示例性实施方案中，其中碱为1M碳酸钠，根据下式1进行pH调节：
公式1：计算用于pH值调节添加的碱的体积
VNa2CO3＝0.0085·Vp·(pHt-pHi)
其中VNa2CO3是添加到冷冻培养基中的1M碳酸钠的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。初始pH是含有细胞的冷冻培养基的pH(即其与细胞组合之后)，但在调节pH用于冷冻之前。冷冻培养基的目标pH可以是高于生理pH的pH，例如高于7.2的pH。在一些实施方案中，冷冻培养基的目标pH在7.2和8.3之间。在一些实施方案中，冷冻培养基的目标pH在7.2和7.8之间。在一些实施方案中，冷冻培养基的目标pH为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2和8.3中的任意。
可以使用本领域已知的方法测量冷冻培养基的pH。例如，培养基的pH可以在400(Nova Biomedical)或 FLEX(Nova Biomedical)分析仪上测量。如本文所用，本申请中对pH的所有提及，包括测量pH、目标pH、调节的pH和初始pH，是指在样品温度调节至约37℃(例如，36℃至38℃之间或35℃至39℃之间)时测量的pH。
III.冷冻介质
本文提供的细胞冷冻介质可用于方法(例如，冷冻真核细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞等)中；和/或改善包含真核细胞(例如，哺乳动物细胞或昆虫细胞)的细胞库的解冻复苏的方法和组合物(例如，包含缓冲溶液、低温防护剂和真核细胞(例如，哺乳动物细胞或昆虫细胞)的细胞池)中。
在一些实施方案中，本文所述的冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂。在一些实施方案中，缓冲液包含两性离子缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包括PBS、HEPES、TES、TRIS和TEST。
冷冻培养基可以包含本领域已知的和本文所述的任何低温防护剂，如DMSO、甘油、乙二醇、不渗透的大分子、糖等。在一些实施方案中，在与待建库的细胞组合之后在细胞冷冻培养基中DMSO或甘油的浓度为5％-12.5％(v/v)，以体积计。在一些实施方案中，可以通过将含有浓缩缓冲液和/或低温防护剂的冷冻培养基加入到浓缩细胞中来提供冷冻培养基。在一些实施方案中，冷冻培养基浓缩低温防护剂可以含有约20％至约30％(v/v)DMSO或甘油。
在一些实施方案中，冷冻培养基可以包含在细胞培养基中存在的额外组分。在一些实施方案中，可以向本文所述的冷冻培养基中加入适于培养哺乳动物细胞的Ham's F10(Sigma)、最低必需培养基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle氏培养基([DMEM]，Sigma)用于冷冻哺乳动物细胞。此外，可以如本文详述地补充或修饰在Ham和Wallace,Meth.Enz.,58:44(1979),Barnes和Sato,Anal.Biochem.,102:255(1980),Vijayasankaran等人,Biomacromolecules.,6:605:611(2005),Patkar等人,JBiotechnology,93:217-229(2002),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；美国专利号Re.30,985；或美国专利号5,122,469中描述的任何介质，所有这些专利的公开内容通过引用整体并入本文。
如本领域技术人员将理解的，本文详述的细胞冷冻培养基可以包含可用于细胞培养或冷冻的其它组分。例如，应当理解，培养基可以包含额外的组分，如氨基酸(例如谷氨酰胺、精氨酸或天冬酰胺)，维生素(包括但不限于B族维生素，如维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B7、维生素B9或维生素B12)，过渡金属(包括但不限于镍、铁(例如三价铁或亚铁)或锌)和其它介质组分。本文提供的任何介质也可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，离子(例如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸苷)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。在一些方面，本文提供的冷冻培养基含有源自植物或动物的蛋白质。在一些实施方案中，本文提供的冷冻培养基不含源自植物或动物的蛋白质。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必需的补充物。
如本文所述的细胞冷冻培养基(细胞池)可以进一步包含一个或多个待建库的细胞。在一个示例性实施方案中，这些细胞是哺乳动物细胞，如CHO细胞。可用于本文所述方法的示例性细胞类型包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞和杂交瘤。在另一个示例性实施方案中，这些细胞是昆虫细胞，如High FiveTM、S2(Schneider2)、Sf9和Sf21。在一些实施方案中，细胞是包含编码多肽(例如治疗性蛋白质)的异源核酸的重组细胞。如本领域技术人员将理解的，这些细胞可以进一步包含重组质粒或其它有用的生物化合物。在一些实施方案中，待建库的细胞可用于生产治疗性蛋白质和生物产品，如抗体、抗体片段、酶、受体融合蛋白或其片段。
IV.真核细胞和细胞库
本文还提供了包含多个容器的细胞库，每个容器含有包含真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞等)的冷冻培养基，所述真核细胞包含编码多肽的核酸(例如异源核酸)，其中所述培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5的pH。细胞库可以是前库(Prebank)、主细胞库(MCB)或工作细胞库(WCB)。前库(Prebank)可以包含含有产生特定多肽的细胞的冷冻(例如，储存在液氮冷冻器中)容器(例如，安瓿)，从其制备MCB。MCB可以包含含有衍生自Prebank次培养的细胞培养物的冷冻(例如，储存在液氮冷冻器中)容器(例如安瓿)，从其获得所有用于生产的后续细胞。MCB根据cGMP产生和储存，并可用于生产多肽产物。WCB可以包含含有源自MCB次培养的细胞培养物的冷冻(例如，储存在液氮冷冻器中)容器(例如安瓿)。WCB根据cGMP产生和储存，并可用于生产多肽产物。在一些实施方案中，容器是安瓿。
如本文所述可以在冷冻培养基中冷冻并保存的真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞等)可以包括可以培养和/或可用于产生多肽的任何真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞可包括但不限于DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))，例如 CRL-9096TM；和CHO-K1( CRL-61TM)。
哺乳动物细胞的其它实例包括但不限于由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养中生长，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括骨髓瘤细胞系，如NS0和Sp2/0。对于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)，第255-268页。
在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞系，如High FiveTM、S2(Schneider 2)、Sf9和Sf21。
在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)包含编码多肽的核酸(例如异源核酸)，并且所述细胞可用于产生多肽。在一些实施方案中，将核酸引入细胞中。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞中的任何方法。例如，可以用包含一种或多种编码多肽的核酸的载体(例如，表达载体)转化细胞。在一些实施方案中，细胞是稳定的细胞系。在一些实施方案中，多肽选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
多肽的实例包括哺乳动物蛋白，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3，-4，-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-1(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3，CD4，CD8，CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；寻靶受体；地址素；调节蛋白；整合素如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2，HER3或HER4受体；免疫粘附素；以及任何上述列出的蛋白质的片段和/或变体，以及与蛋白质(包括例如任何上述蛋白质)结合的抗体，包括抗体片段。
在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)包含编码抗体的核酸。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。修饰语“单克隆”表示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤方法(例如,Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等人,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第二版 1988)；Hammerling等人,在Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中),重组DNA方法(参见,例如美国专利号4,816,567),噬菌体展示技术(参见，例如,Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004),和在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和 5,661,016；Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体、嵌合抗体、人抗体、源自文库的抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是其抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；直连抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fab片段含有重链和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同在于通过在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为Fab'片段对产生，在Fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。“Fv”是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述，参见，例如，Pluckthün，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol 113，Rosenburg and Moore编辑，(Springer-Verlag，New York，1994)，第269-315页中。用于纯化上述抗体的许多方法可以适合于纯化抗原结合抗体片段。
在一些实施方案中，由细胞(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞)中的核酸编码的抗体，包括治疗性和诊断性抗体。在本发明范围内的抗体包括但不限于：抗HER2抗体，包括曲妥珠单抗(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利号5,725,856)；抗-CD20抗体，如美国专利号5,736,137中的嵌合抗-CD20“C2B8”如美国专利号5,721,108B1中的2H7抗体的嵌合或人源化变体，或Tositumomab抗IL-8(St John等人，Chest，103：932(1993)和国际公开号WO 95/23865)；抗-VEGF抗体，包括人源化和/或亲和力成熟的抗-VEGF抗体，如人源化抗-VEGF抗体huA4.6.1(Kim等人,Growth Factors,7:53-64(1992)，国际公开号WO 96/30046和WO 98/45331，1998年10月15日公开)；抗-PSCA抗体(WO01/40309)；抗-CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；抗-CD11a(美国专利号5,622,700，WO98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)和Hourmant等人，Transplantation58：377-380(1994))；抗-IgE(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)和国际公开号WO 95/19181)；抗-CD18(1997年4月22日发布的美国专利5,622,700，或1997年7月31日公开的WO 97/26912)；抗-IgE(包括E25，E26和E27；1998年2月3日发布的美国专利号5,714,338或1992年2月25日发布的美国专利号5,091,313，1993年3月4日公开的WO 93/04173，或1998年6月30日提交的国际申请号PCT/US98/13410，美国专利号5,714,338)；抗-Apo-2受体抗体(1998年11月19日公开的WO 98/51793)；抗-TNF-α抗体，包括cA2CDP571和MAK-195(参见1997年9月30日公布的美国专利号5,672,347，Lorenz等人，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)和Dhainaut等人，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗组织因子(TF)(1994年11月9日授权的欧洲专利号0 420 937B1)；抗人α4β7整联蛋白(1998年2月19日公开的WO 98/06248)；抗-EGFR(如1996年12月19日公开的WO 96/40210中的嵌合或人源化225抗体)；抗-CD3抗体如OKT3(1985年5月7日发布的美国专利号4,515,893)；抗-CD25或抗-tac抗体如CHI-621和(参见1997年12月2日发布的美国专利号5,693,762)；抗-CD4抗体如cM-7412抗体(Choy等人，Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；抗-CD52抗体如CAMPATH-1H(Riechmann等人，Nature 332：323-337(1988))；抗-Fc受体抗体，如Graziano等人，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的针对Fc.gamma.RI的M22抗体；抗癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995))；针对乳腺上皮细胞的抗体，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人，Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体如C242(Litton等人，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗-CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等人，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗-CD33抗体如Hu M195(Jurcic等人，CancerRes 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗体如LL2或LymphoCide(Juweid等人，Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗-EpCAM抗体如17-1A抗-GpIIb/IIIa抗体如abciximab或c7E3Fab抗RSV抗体如MEDI-493抗-CMV抗体如抗-HIV抗体如PRO542；抗肝炎抗体如抗-Hep B抗体抗-CA 125抗体OvaRex；抗独特型GD3表位抗体BEC2；抗αvβ3抗体抗人肾细胞癌抗体如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。本文抗体的优选靶抗原是：HER2受体、VEGF、IgE、CD20、CD11a和CD40。
提供以下实施例以说明而非限制本发明。
实施例
实施例1：池pH、保持温度和保持时间对解冻的细胞生存力的影响
碱添加方法控制建库pH(小规模研究#1)
进行研究以测量从最坏情况进行简单的pH调节和典型池条件(目标初始pH分别为6.2和6.7)增强解冻复苏的可行性。研究了几个pH调节目标以确定最佳的建库pH。使用400(Nova Biomedical)仪器，温度设置为37℃测量pH。类似地，使用公式1的pH计算基于37℃的样品温度。
通过离心使细胞沉淀。通过将细胞在消耗培养基(spent media)中重悬浮至100×106个细胞/mL，为每个测试条件产生细胞池。将细胞池在37℃下搅拌，具有或不具有用于CO2/O2交换的气体渗透膜，以将pH驱动至初始pH条件(6.2或6.7)。在达到初始pH目标时，将池快速冷却至<10℃，并加入20％(v/v)DMSO冷冻介质(1:3份细胞培养液)。使用公式1计算所需的将pH调节到目标pH 6.9、7.1和7.3的1M碳酸钠的体积，并进行最终离线pH测量以确认在模拟库生成之前pH的适当增加(实际建库pH为6.9、7.1/7.2和7.5)。
解冻结果显示出高达68％的第1天生存力的显着改善(对于从pH6.2调整至7.5，从24％至92％)(图2A)，并且第4天PCV的改善高达0.64％(对于从pH 6.2调整至7.5，从0.17％至0.81％)(图2B)。
公式1：计算为了pH调节添加的碱体积
VNa2CO3＝0.0085·Vp·(pHt-pHi)
其中VNa2CO3＝加入的1M碳酸钠的体积，Vp＝池的体积，
pHt＝目标pH，pHi＝初始pH，
碱添加方法控制建库pH(附加的小规模pH研究)
按照上述类似步骤，进行几个研究以研究pH调节对其它细胞系的影响。
选择涵盖多种细胞类型(DP12，CHO-K1)的总共9个CHO细胞系。在建库之前的几天，根据标准方案维持细胞。通过离心使细胞沉淀，对于每个测试条件通过在消耗培养基中重悬至28％收集细胞体积(PCV)，产生约60-90mL的模拟池。在37℃下搅拌池，具有或不具有用于CO2/O2交换的气体渗透膜，以将pH驱动至初始pH条件(6.2或6.7)。选择这两个初始pH设定点以模拟在中空纤维过滤器浓缩期间和之后经历的潜在最坏情况和典型条件。在达到初始pH目标时，将池快速冷却至<10℃，并加入20％(v/v)DMSO冷冻介质(1:3份细胞培养液)，达到21％的最终PCV。在使用公式1计算调整至pH 7.0、7.3、7.6或8.0所需加入的1M碳酸钠的体积之后，进行pH调整。进行最终离线pH测量以确认在细胞库产生之前pH的适当增加。
所有情况一式两份解冻，一个安瓿解冻到每个容器中。结果表明，之前暴露于较低pH的所有细胞类型在建库前调节至高于7.3的pH值时可以恢复。每个细胞系表现出对建库pH的不同敏感性。在大多数情况下，调节至约7.5的pH导致第1天解冻生存力高于80％(图3A-3F和图4A-4B)。解冻后的生长率仅在所测试的pH范围的较低端受到影响。有趣的是，测试的pH范围的较高端(接近8.0-8.2)没有负面影响解冻复苏，尽管其显著大于正常生理pH。
扩大研究(测试CHO-K1细胞类型)以获得关于长期暴露于高pH的更多信息。这些研究测试了在(t0)pH调节之后即刻冷冻的模拟建库(类似于所有以前的小规模测试情况)和在两个小时后的第二时间点(t2)冷冻的模拟建库。在保持2小时的期间，将微型池(每个情况约10mL)保持在浸没于湿冰中的管中。在保持步骤中存在轻微的pH漂移，导致高达0.2pH单位的变化。这些研究结果表明，在本研究中暴露于测试的pH范围两小时没有影响(图6A-6B中显示了一个实例)。
收获期间冷冻细胞培养液的方法
采用“慢泵收获”方法与冷却热交换器组合以将冷却能力引入传统的细胞建库方法中。具体来说，“慢泵收获”方法需要将典型的收获流速从约4L/分钟降低到600mL/分钟以匹配对于传统细胞建库生产运行所记录的收获速率。将冷却热交换器管线，大小15'长度的15号铂固化硅胶管完全浸没在湿冰中，插入收获流路中。在用水模拟运行期间获得的温度趋势表明“冷却收获方法”能够在中空纤维过滤器浓缩之前的最初30分钟内将培养温度降低至约12℃。基于10℃的数据，这种冷却能力可能暂停细胞代谢并防止低pH漂移。
方法确认研究结果
细胞建库方法。通过首先在批次/灌注细胞培养过程中积累悬浮-适应的CHO细胞、然后收获细胞用于建库来产生细胞库。细胞的初始来源是来自MCB(用于WCB代)。该方法包括三个阶段：细胞积累、收获和细胞浓缩、以及细胞建库。细胞积累步骤的目的是在单一批次中产生生产全尺寸MCB或WCB(分别为420×1mL或10mL安瓿)所需的细胞数。在初始放大期间和在摇摆生物反应器过程期间，在选择性接种培养介质中培养细胞。收获过程步骤用于通过中空纤维过滤器(HFF)将最终细胞培养液浓缩至用于建库所需的细胞密度。随后的汇集和填充过程用于制备细胞库安瓿用于长期储存。汇集过程保持在湿冰上，使得保持一定的温度范围(约5-10℃)。该过程的处理流程如图1所示。
使用中空纤维滤筒进行收获和细胞浓缩过程。离线pH趋势显示“冷却收获方法”在细胞浓缩过程中有效降低pH下降约0.35pH单位(对于原始和“冷冻”过程分别从至6.66)。在pH调节后，在早(0分钟)和晚(120分钟)时间点产生冷却的细胞库，以检查细胞池保持pH的瞬时影响。
评估所得细胞库在原代培养中的性能。使用系列1:250稀释(1:10，然后1:25)将细胞库安瓿解冻至摇瓶而不是生物反应器中。解冻结果成功地证明了目前的方法(冷却收获和pH调节)能够递送具有可接受的解冻性能的库。然而，从原始过程产生的细胞库经历了生存力的下降，这些新的细胞库是一致的，并且在第1天生存力范围为79.1-85.3％(约65％改善)。当细胞随时间保持在升高的pH下时，没有观察到不利影响。
分析显示来自调节至较高pH的池的细胞尺寸较小(图5)。这种观察到的尺寸改变可能指示较高的pH引起细胞脱水(可能来自增加的渗透压或允许细胞收缩的增加的细胞膜弹性，或两者)。
结论
确定建库pH对解冻后性能是最关键的，影响第1天解冻生存力高达65％。因此，设计对收获和建库步骤有促进作用的方法以减缓细胞暴露于低pH并改善对建库pH的控制。最终，对该方法引入了两种促进作用，包括：1)在收获期间用硅胶管热交换器冷却细胞培养液；和2)使用pH调节步骤增加建库pH至7.5。

Claims (81)

1.一种改善细胞库的解冻复苏的方法，所述方法包括在冷冻培养基中冷冻用于建库的哺乳动物细胞，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中所述冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5的pH。
2.一种冷冻用于储存的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括在冷冻培养基中冷冻哺乳动物细胞，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂，并且其中所述冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.5的pH。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中冷冻培养基在冷冻之前具有约6.7至约8.3、约7.2至约7.8或约7.5的pH。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述冷冻培养基的pH已调节至约6.7至约8.5的pH。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述冷冻培养基的pH已调节至约6.7至约8.3或约7.2至约7.8的pH。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述冷冻培养基的pH已调节至约7.5的pH。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中在pH调节之前和/或之后将细胞与冷冻培养基组合。
8.如权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述调节的pH是目标pH或测量pH。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述目标pH为约6.7至约8.3。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述测量pH为约6.7至约8.3。
11.如权利要求4-10中任一项所述的方法，所述方法还包括在调节冷冻培养基的pH之前测量包含细胞的冷冻培养基的初始pH的步骤。
12.如权利要求4-11中任一项所述的方法，所述方法还包括测量冷冻培养基的调节pH的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其中如果冷冻培养基的测量pH低于目标pH，重复调节步骤和测量步骤，直到冷冻培养基的调节pH为约6.7至约8.3。
14.如权利要求4-13中任一项所述的方法，其中通过加入碱调节pH。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES钠盐、氢氧化钠和氢氧化钾。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中根据下式V碱＝C碱*Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碱调节冷冻培养基的pH，其中C碱是碱特异性系数，V碱是加入到冷冻培养基中的碱的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。
17.如权利要求16所述的方法，其中根据下式VNa2CO3＝0.0085Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碳酸钠调节冷冻培养基的pH，其中VNa2CO3是加入到冷冻培养基中的1M碳酸钠的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中目标pH为6.7至8.3、7.2至7.8或7.5。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在哺乳动物细胞与冷冻培养基组合之前，哺乳动物细胞在具有pH为约6.2至约6.6的培养基中。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中低温防护剂是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇或糖。
21.如权利要求20所述的方法，其中低温防护剂是DMSO或甘油，并且在冷冻之前冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约12.5％，以体积计。
22.如权利要求21所述的方法，其中在冷冻细胞之前，冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约10％，以体积计。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中含有哺乳动物细胞的冷冻培养基在冷冻之前具有约8％至约28％收集细胞体积(PCV)的细胞密度。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，所述方法还包括在哺乳动物细胞与冷冻培养基组合之前、在细胞收获和浓缩过程中冷却细胞培养液的步骤。
25.如权利要求24所述的方法，其中将细胞培养液冷却至等于或低于约20℃的温度。
26.如权利要求24所述的方法，其中将细胞培养液冷却至等于或低于约10℃的温度。
27.一种冷冻用于储存的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括(a)将含有哺乳动物细胞的冷冻培养基的pH调节至约6.7至约8.5的pH，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂；和(b)冷冻哺乳动物细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其中将pH调节至约6.7至约8.3或约7.2至约7.8的pH。
29.如权利要求27所述的方法，其中将pH调节至约7.5的pH。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中调节的pH是目标pH或测量pH。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述目标pH为约6.7至约8.3。
32.如权利要求30所述的方法，其中测量pH为约6.7至约8.3。
33.如权利要求27所述的方法，所述方法在调节所述冷冻培养基的pH之前还包括测量包含细胞的冷冻培养基的初始pH的步骤。
34.如权利要求27-33中任一项所述的方法，所述方法还包括测量冷冻培养基的调节pH的步骤。
35.如权利要求34所述的方法，其中如果冷冻培养基的测量pH低于目标pH，则重复调节步骤和测量步骤直到冷冻培养基的调节pH为约6.7至约8.5。
36.如权利要求27-35中任一项所述的方法，其中通过加入碱调节pH。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES钠盐、氢氧化钠和氢氧化钾。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中根据下式V碱＝C碱*Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碱调节冷冻培养基的pH，其中C碱是碱特异性系数，V碱是加入到冷冻培养基中的碱的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。
39.如权利要求36或37所述的方法，其中根据下式VNa2CO3＝0.0085Vp(pHt-pHi)通过向冷冻培养基中加入碳酸钠调节冷冻培养基的pH，其中VNa2CO3是加入到冷冻培养基中的1M碳酸钠的体积，Vp是冷冻培养基的体积，pHt是目标pH，pHi是初始pH。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中目标pH为6.7至8.3、7.2至7.8或7.5。
41.如权利要求27-40中任一项所述的方法，其中在哺乳动物细胞与冷冻培养基组合之前，哺乳动物细胞在具有pH为约6.2至约6.6的培养基中。
42.如权利要求27-41中任一项所述的方法，其中所述低温防护剂是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇或糖。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述低温防护剂是DMSO或甘油，并且在冷冻之前含有哺乳动物细胞的冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约12.5％，以体积计。
44.如权利要求所述43的方法，其中在冷冻细胞之前含有哺乳动物细胞的冷冻培养基中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约10％，以体积计。
45.如权利要求27-44中任一项所述的方法，其中含有哺乳动物细胞的冷冻培养基在冷冻之前具有8％至28％收集细胞体积(PCV)的细胞密度。
46.如权利要求27-45中任一项所述的方法，所述方法还包括在哺乳动物细胞与冷冻培养基组合之前、在细胞收获和浓缩过程中冷却细胞培养液的步骤。
47.如权利要求46所述的方法，其中将细胞培养液冷却至等于或低于约20℃的温度。
48.如权利要求46所述的方法，其中将细胞培养液冷却至等于或低于约10℃的温度。
49.一种冷冻用于储存的哺乳动物细胞的方法，包括(a)将冷冻培养基的pH调节至约6.7至约8.5的pH，其中所述冷冻培养基包含缓冲溶液和低温防护剂；(b)将哺乳动物细胞与所述冷冻培养基组合以形成细胞池；和(c)冷冻所述细胞池中的哺乳动物细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中将pH调节至约6.7至约8.3或约7.2至约7.8的pH。
51.如权利要求49所述的方法，其中将pH调节至约7.5的pH。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中调节的pH是目标pH或测量pH。
53.如权利要求52所述的方法，其中目标pH为约6.7至约8.3。
54.如权利要求52所述的方法，其中测量pH为约6.7至约8.3。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，所述方法还包括测量冷冻培养基的调节pH的步骤。
56.如权利要求49所述的方法，其中如果所测量的冷冻培养基的pH低于目标pH，则重复调节步骤和测量步骤，直到冷冻培养基的调节pH为约6.7至约8.5。
57.如权利要求49-56中任一项所述的方法，其中通过加入碱调节pH。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、HEPES钠盐、氢氧化钠和氢氧化钾。
59.如权利要求49-58中任一项所述的方法，其中在哺乳动物细胞与冷冻培养基组合之前，所述哺乳动物细胞在具有pH为约6.2至约6.6的培养基中。
60.如权利要求49-59中任一项所述的方法，其中所述低温防护剂是DMSO、甘油、丙二醇、乙二醇或糖。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述低温防护剂是DMSO或甘油，并且细胞池中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约12.5％，以体积计。
62.如权利要求61所述的方法，其中细胞池中的DMSO或甘油的浓度为约5％至约10％，以体积计。
63.如权利要求49-62中任一项所述的方法，其中细胞池含有约8％至约28％收集细胞体积(PCV)的细胞密度的哺乳动物细胞。
64.如权利要求49-63中任一项所述的方法，所述方法还包括在哺乳动物细胞与冷冻培养基组合之前、在细胞收获和浓缩过程中冷却细胞培养液的步骤。
65.如权利要求64所述的方法，其中将细胞培养液冷却至等于或低于约20℃的温度。
66.如权利要求64所述的方法，其中将细胞培养液冷却至等于或低于约10℃的温度。
67.如权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或杂交瘤。
68.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含编码多肽的核酸。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述多肽是治疗性蛋白。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
71.一种用于冷冻哺乳动物细胞的哺乳动物细胞池，其包含缓冲溶液、低温防护剂和包含编码多肽的核酸的哺乳动物细胞，其中培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5的pH。
72.如权利要求71所述的细胞池，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或杂交瘤。
73.如权利要求71或72所述的细胞库，其中所述哺乳动物细胞包含编码多肽的核酸。
74.如权利要求73所述的细胞池，其中所述多肽是治疗性蛋白质。
75.如权利要求74所述的细胞库，其中所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
76.一种包含多个容器的细胞库，每个容器含有(a)包含缓冲溶液和低温防护剂的冷冻培养基，和(b)包含编码多肽的核酸的哺乳动物细胞，其中所述冷冻培养基在冷冻细胞之前具有约6.7至约8.5的pH。
77.如权利要求76所述的细胞库，其中所述容器是安瓿。
78.如权利要求76或77所述的细胞库，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或杂交瘤。
79.如权利要求76-78中任一项所述的细胞库，其中所述哺乳动物细胞包含编码多肽的核酸。
80.如权利要求79所述的细胞库，其中所述多肽是治疗性蛋白质。
81.如权利要求80所述的细胞库，其中所述治疗性蛋白质选自抗体、抗体片段、酶和受体融合蛋白。
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