KR20110060911A - 고 역가 항체 생산 - Google Patents

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KR20110060911A KR20117006874A KR20117006874A KR20110060911A KR 20110060911 A KR20110060911 A KR 20110060911A KR 20117006874 A KR20117006874 A KR 20117006874A KR 20117006874 A KR20117006874 A KR 20117006874A KR 20110060911 A KR20110060911 A KR 20110060911A
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Abstract

본 발명은, 부분적으로는, 단백질을 높은 수준으로 재조합적으로 발현시키는 방법, 및 단백질을 높은 수준으로 재조합적으로 발현시키기 위한 세포 배양 배지를 제공한다.

Description

고 역가 항체 생산 {HIGH TITER ANTIBODY PRODUCTION}
본원은 2008년 9월 26일 출원된 미국 가특허 출원 제61/100,450호에 대한 혜택을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은, 일반적으로, 세포 배양물에서 다량의 단백질, 예컨대 항체를 생산하는 방법; 및 그와 더불어 상기 세포 배양물 자체에 관한 것이다.
치료학적 단백질의 상업적 생산을 위해 세포를 배양하는 것은 고비용의 방법이다. 그에 필요한 장비는 고가이며, 연구 및 개발 및 생산 비용도 높다. 세포 배양물 1 리터당 생산되는 치료학적 단백질의 양을 최대화하는 세포 배양 방법의 개발은 주어진 양의 단백질을 생산하는데 필요한 자원을 최소화할 것이다. 따라서, 다량의 단백질을 생산하는, 상업성 있는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
다수의 자연 발생적 세포는, 표준 배양 조건 하에서 목적하는 단백질을 다량으로 생산하지 않는다. 오히려, 배양물 중의 세포를 다량의 치료학적 단백질을 생성하도록 유도하는 세포 배양 방법에 대한 고비용의 연구 및 개발이 수행되어야 한다. 전형적으로, 최적의 세포 배양 조건을 규명하는 것은 어려우며, 상당한 창의성의 투입을 필요로 한다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로, 다양한 배양 보충물 및 배양 조건에 대한 여타의 변경을 이용하여 배양 중의 세포로부터 많은 양의 단백질을 생성하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은, 초기 포유동물 세포 성장 배지에 단백질을 발현하는 숙주 세포를 접종하는 단계, 및 이하에 개시된 것들을, 임의로는 대략 표시된 농도 (여타의 공급원으로부터의, 예컨대 초기 포유동물 세포 배양 배지로부터의 각 성분의 양은 포함하지 않음)로 포함하는 보충물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질의 생산 방법을 제공한다:
아데닌 술페이트: 1.632 mg/리터
아데노신: 17.6 mg/리터
암모늄 바나데이트: 0.00078 mg/리터
비오틴: 0.28 mg/리터
염화콜린: 50.2 mg/리터
염화코발트: 0.0025 mg/리터
황산제2구리: 0.0032 mg/리터
시티딘: 17.6 mg/리터
D-칼슘 판토테네이트: 23.8 mg/리터
에탄올아민 HCl: 4.4 mg/리터
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.05 mg/리터
엽산: 4.6 mg/리터
글리신: 72 mg/리터
구아노신: 17.6 mg/리터
히포크산틴: 11.8 mg/리터
i-이노시톨: 73.2 mg/리터
L-알라닌: 8.9 mg/리터
L-아르기닌: 312.4 mg/리터
L-아스파라긴: 842 mg/리터
L-아스파르트산: 97.6 mg/리터
L-시트룰린: 12.6 mg/리터
L-시스테인-HCl: 224 mg/리터
L-시스틴: 34 mg/리터
L-글루탐산: 155.4 mg/리터
L-히스티딘: 167 mg/리터
리포산: 0.52 mg/리터
L-이소류신: 422 mg/리터
L-류신: 384 mg/리터
L-리신: 365 mg/리터
L-메티오닌: 147.2 mg/리터
L-오르니틴-HCl: 25.6 mg/리터
L-페닐알라닌: 207 mg/리터
L-프롤린: 239 mg/리터
L-세린: 281 mg/리터
L-트레오닌: 211.6 mg/리터
L-트립토판: 109.2 mg/리터
L-티로신: 234 mg/리터
L-발린: 308.8 mg/리터
염화망간 사수화물: 0.0003 mg/리터
니아신: 31.4 mg/리터
이염화니켈 육수화물: 0.0004 mg/리터
프로게스테론: 0.015 mg/리터
푸트레신 2HCl: 0.4 mg/리터
피리독신 HCl: 3 mg/리터
리보플라빈: 1.86 mg/리터
몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.00016 mg/리터
일염기성 인산나트륨: 288.2 mg/리터
아셀렌산나트륨: 0.01426 mg/리터
티아민 HCl: 16 mg/리터
티미딘: 7.8 mg/리터
염화주석 탈수화물: 0.00008 mg/리터
우리딘: 17.6 mg/리터
비타민 B12: 3.4 mg/리터
비타민 E: 0.376 mg/리터
황산아연: 1.08 mg/리터
글루코스: 1.5 g/리터
L-글루타민: 150 mg/리터.
본 발명의 일 실시양태에서, 일부 보충물은 대략 이하의 농도의 아미노산을 포함하는 아미노산 공급물 스탁 (stock) 용액 (예를 들면, 5OX 스탁 용액)으로부터 첨가된다:
L-아르기닌: 6.32 g/리터
L-시스틴: 1.7 g/리터
L-히스티딘: 2.1 g/리터
L-이소류신: 2.6 g/리터
L-류신: 2.6 g/리터
L-리신: 3.6 g/리터
L-메티오닌: 0.76 g/리터
L-페닐알라닌: 1.65 g/리터
L-트레오닌: 2.38 g/리터
L-트립토판: 0.51 g/리터
L-티로신: 1.8 g/리터
L-발린: 2.34 g/리터.
본 발명의 일 실시양태에서는, 배양물 1 리터당 대략 20 ml의 아미노산 공급물 스탁 용액이 첨가된다. 본 발명의 일 실시양태에서는, 대략 이하의 농도의 아미노산을 포함하는 아미노산 공급물 스탁 용액 (예를 들면, 100X 스탁 용액)으로부터 이하의 보충물이 첨가된다:
L-알라닌: 0.89 g/리터
L-아스파라긴: 1.5 g/리터
L-아스파르트산: 1.33 g/리터
L-글루탐산: 1.47 g/리터
글리신: 0.75 g/리터
L-프롤린: 1.15 g/리터
L-세린: 1.05 g/리터.
본 발명의 일 실시양태에서, 아미노산 공급물 스탁 용액은 배양물 1 리터당 대략 10 ml 아미노산 공급물로 첨가된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 보충물의 일부는 보충물을 대략 이하의 농도로 포함하는 영양소 공급물 스탁 용액 (예를 들면, 5OX 스탁 용액)으로부터 첨가된다:
L-아스파라긴: 40.6 g/리터
L-프롤린: 10.81 g/리터
L-이소류신: 18.53 g/리터
L-시스테인-HCl: 11.19 g/리터
L-류신: 16.58 g/리터
L-트레오닌: 8.2 g/리터
L-티로신: 9.9 g/리터
L-아르기닌: 9.29 g/리터
L-아스파르트산: 3.56 g/리터
L-글루탐산: 6.28 g/리터
글리신: 2.83 g/리터
L-히스티딘: 6.23 g/리터
L-메티오닌: 6.58 g/리터
L-트립토판: 4.93 g/리터
L-리신: 14.66 g/리터
L-페닐알라닌: 8.64 g/리터
L-발린: 13.08 g/리터
L-세린: 13 g/리터
일염기성 인산나트륨: 14.41 g/리터
황산아연: 0.054 g/리터
황산제2구리: 0.00016 g/리터
암모늄 바나데이트: 0.000039 g/리터
염화코발트: 0.000125 g/리터
이염화니켈 육수화물: 0.00002 g/리터
몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.000008 g/리터
염화주석 탈수화물: 0.000004 g/리터
염화망간 사수화물: 0.000015 g/리터.
본 발명의 일 실시양태에서는, 배양물 1 리터당 대략 20 mL의 영양소 공급물 스탁 용액이 첨가된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 보충물의 일부는 보충물을 대략 이하의 농도로 포함하는 비타민/염 공급물 스탁 용액 (예를 들면, 50X 스탁 용액)으로부터 첨가된다:
아셀렌산나트륨: 7.13 X 10-4 g/리터
아데닌 술페이트: 0.0816 g/리터
아데노신: 0.88 g/리터
시티딘: 0.88 g/리터
구아노신: 0.88 g/리터
우리딘: 0.88 g/리터
히포크산틴: 0.59 g/리터
L-시트룰린: 0.63 g/리터
L-오르니틴-HCl: 1.28 g/리터
비오틴: 0.014 g/리터
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.0025 g/리터
엽산: 0.23 g/리터
리포산: 0.026 g/리터
니아신: 1.57 g/리터
피리독신 HCl: 0.15 g/리터
리보플라빈: 0.093 g/리터
티아민 HCl: 0.8 g/리터
비타민 E: 0.0188 g/리터
비타민 B12: 0.17 g/리터
염화콜린: 2.51 g/리터
에탄올아민 HCl: 0.22 g/리터
i-이노시톨: 3.66 g/리터
티미딘: 0.39 g/리터
푸트레신 2HCl: 0.02 g/리터
프로게스테론: 0.00075 g/리터
D-칼슘 판토테네이트: 1.19 g/리터.
본 발명의 일 실시양태에서는, 배양물 1 리터당 대략 20 ml의 비타민/염 공급물이 첨가된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 방법은 세포로부터 배양 배지를 수거하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 단백질은 상기 세포로부터 배지 내로 분비되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시양태에서, 배양 배지는 세포의 생존율이 대략 60% 미만일 때 세포로부터 수거된다. 배양 배지는 배지를 원심분리하고/거나 배지를 심층 여과 (depth filtering)하고/거나 배지를 0.2 마이크로미터 여과기로 여과함으로써 세포로부터 수거될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 발현되는 단백질은 임의의 단백질일 수 있는데, 예를 들면, 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 예컨대, IGF1R에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 예컨대, 서열 1, 3, -6, 13, 21 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 개시된 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄; 및 서열 2, 7-9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 또는 단편; 예를 들어, 서열 3, 4, 5, 또는 6의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 면역글로불린, 및 서열 8 또는 9의 아미노산 20 내지 137을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함하는 완전 항체인 항체 또는 단편, 예컨대, 경쇄 면역글로불린이 카파 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있고, 중쇄 면역글로불린이 감마-1 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있는 항체 또는 단편일 수 있다. 본 발명 일 실시양태에서, 보충물이 첨가되는 초기 포유동물 세포 성장 배지는 HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제를 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는다.
본 발명의 영역에는, HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제는 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는, 대략 37℃로 미리 가온된 초기 포유동물 세포 성장 배지에 항체 경쇄 면역글로불린 및 중쇄 면역글로불린을 발현하는 CHO DXB11 숙주 세포를, 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하는 단계; 및, 상기 접종 전, 그와 동시 또는 그 직후에 상기 배지에 이하의 보충물을 첨가하는 단계:
대략 10 g/리터의 최종 농도로의 대두 가수분해물; 및
임의로, 대략 이하의 최종 농도로의 아미노산 (여타의 공급물, 예컨대 초기 포유동물 세포 성장 배지로부터의 상기 아미노산의 양은 포함하지 않음):
L-아르기닌: 126.4 mg/리터
L-시스틴: 34 mg/리터
L-히스티딘: 42 mg/리터
L-이소류신: 52 mg/리터
L-류신: 52 mg/리터
L-리신: 72 mg/리터
L-메티오닌: 15.2 mg/리터
L-페닐알라닌: 33 mg/리터
L-트레오닌: 47.6 mg/리터
L-트립토판: 10.2 mg/리터
L-티로신: 36 mg/리터
L-발린: 46.8 mg/리터
L-알라닌: 8.9 mg/리터
L-아스파라긴: 30 mg/리터
L-아스파르트산: 26.6 mg/리터
L-글루탐산: 29.4 mg/리터
글리신: 15 mg/리터
L-프롤린: 23 mg/리터
L-세린: 21 mg/리터; 및,
생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때, 상기 보충 공급물로부터의 성분 (여타의 공급물로부터의 각 성분의 양은 포함하지 않음)이 대략 이하에 개시된 최종 배양 농도에 도달하는 보충 공급물을 첨가하는 단계:
아셀렌산나트륨: 0.01426 mg/리터
아데닌 술페이트: 1.632 mg/리터
아데노신: 17.6 mg/리터
시티딘: 17.6 mg/리터
구아노신: 17.6 mg/리터
우리딘: 17.6 mg/리터
히포크산틴: 11.8 mg/리터
L-시트룰린: 12.6 mg/리터
L-오르니틴-HCl: 25.6 mg/리터
비오틴: 0.28 mg/리터
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.05 mg/리터
엽산: 4.6 mg/리터
리포산: 0.52 mg/리터
니아신: 31.4 mg/리터
피리독신 HCl: 3 mg/리터
리보플라빈: 1.86 mg/리터
티아민 HCl: 16 mg/리터
비타민 E: 0.376 mg/리터
비타민 B12: 3.4 mg/리터
염화콜린: 50.2 mg/리터
에탄올아민 HCl: 4.4 mg/리터
i-이노시톨: 73.2 mg/리터
티미딘: 7.8 mg/리터
푸트레신 2HCl: 0.4 mg/리터
프로게스테론: 0.015 mg/리터
D-칼슘 판토테네이트: 23.8 mg/리터
L-아스파라긴: 812 mg/리터
L-프롤린: 216 mg/리터
L-이소류신: 370 mg/리터
L-시스테인-HCl: 224 mg/리터
L-류신: 332 mg/리터
L-트레오닌: 164 mg/리터
L-티로신: 198 mg/리터
L-아르기닌: 186 mg/리터
L-아스파르트산: 71 mg/리터
L-글루탐산: 126 mg/리터
글리신: 57 mg/리터
L-히스티딘: 125 mg/리터
L-메티오닌: 132 mg/리터
L-트립토판: 99 mg/리터
L-리신: 293 mg/리터
L-페닐알라닌: 174 mg/리터
L-발린: 262 mg/리터
L-세린: 260 mg/리터
일염기성 인산나트륨: 288.2 mg/리터
황산아연: 1.08 mg/리터
황산제2구리: 0.0032 mg/리터
암모늄 바나데이트: 0.00078 mg/리터
염화코발트: 0.0025 mg/리터
이염화니켈 육수화물: 0.0004 mg/리터
몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.00016 mg/리터; 및,
세포 성장 동안, 글루코스 수준이 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어질 때 배지에 글루코스를 첨가하고, L-글루타민 수준이 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어질 때 L-글루타민을 첨가하는 단계; 및 세포 성장 동안 O2 농도를 대략 60%로, pH를 대략 6.8 ± 0.02로 및 온도를 대략 36.5℃ ± 0.5℃로 유지시키는 단계를 포함하는, 항체 (예컨대, 모노클로날, 재조합 및/또는 완전 인간)의 생산 방법이 포함된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 항체는, 서열 1, 3, -6, 13, 21 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 개시된 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄; 및 서열 2, 7-9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함하는데, 예컨대, 상기 항체는 서열 3, 4, 5, 또는 6의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 면역글로불린, 및 서열 8 또는 9의 아미노산 20 내지 137을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시양태에서, 경쇄 면역글로불린은 카파 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있고, 중쇄 면역글로불린은 감마-1 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있다. 상기 방법은 임의로 배지를 디스크-적층 (disk-stack) 원심분리하고, 배지를 심층 여과하고, 배지를 0.2 마이크로미터 공극 크기의 여과기로 여과함으로써 세포로부터 배양 배지를 회수하는 단계, 및 임의로, 컬럼 크로마토그래피 분획법에 의해 배지로부터 면역글로불린 쇄를 정제하는 추가의 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한,
대략 10 g/리터의 대두 가수분해물,
대략 1.5 g/리터의 글루코스,
대략 150 mg/리터의 L-글루타민,
대략 6.8 ± 0.02의 pH,
HEPES,
중탄산나트륨 완충액,
무기 염,
비-필수 아미노산,
재조합 인간 인슐린,
미량 원소,
계면활성제,
대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 아미노산 공급물:
L-아르기닌: 126.4 mg/리터
L-시스틴: 34 mg/리터
L-히스티딘: 42 mg/리터
L-이소류신: 52 mg/리터
L-류신: 52 mg/리터
L-리신: 72 mg/리터
L-메티오닌: 15.2 mg/리터
L-페닐알라닌: 33 mg/리터
L-트레오닌: 47.6 mg/리터
L-트립토판: 10.2 mg/리터
L-티로신: 36 mg/리터
L-발린: 46.8 mg/리터
L-알라닌: 8.9 mg/리터
L-아스파라긴: 30 mg/리터
L-아스파르트산: 26.6 mg/리터
L-글루탐산: 29.4 mg/리터
글리신: 15 mg/리터
L-프롤린: 23 mg/리터
L-세린: 21 mg/리터
을 포함하되, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는 수성 액체 세포 배양 배지를 제공한다. 나아가, 본 발명은 관심 면역글로불린을 발현하는 세포가 성장된 세포 배양물을 제공한다.
예를 들어, 본 발명은, HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제를 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는, 대략 37℃로 미리 가온된 초기 포유동물 세포 성장 배지에 항체 경쇄 면역글로불린 및 중쇄 면역글로불린을 발현하는 CHO DXB11 숙주 세포를, 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하는 단계; 및, 상기 접종 전, 그와 동시 또는 그 직후에 상기 배지에 이하의 보충물을 첨가하는 단계:
대략 10 g/리터의 최종 농도로의 대두 가수분해물; 및
임의로, 대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 아미노산 공급물:
L-아르기닌: 126.4 mg/리터
L-시스틴: 34 mg/리터
L-히스티딘: 42 mg/리터
L-이소류신: 52 mg/리터
L-류신: 52 mg/리터
L-리신: 72 mg/리터
L-메티오닌: 15.2 mg/리터
L-페닐알라닌: 33 mg/리터
L-트레오닌: 47.6 mg/리터
L-트립토판: 10.2 mg/리터
L-티로신: 36 mg/리터
L-발린: 46.8 mg/리터
L-알라닌: 8.9 mg/리터
L-아스파라긴: 30 mg/리터
L-아스파르트산: 26.6 mg/리터
L-글루탐산: 29.4 mg/리터
글리신: 15 mg/리터
L-프롤린: 23 mg/리터
L-세린: 21 mg/리터; 및,
생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때, 대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 보충 공급물을 첨가하는 단계:
아셀렌산나트륨: 0.01426 mg/리터
아데닌 술페이트: 1.632 mg/리터
아데노신: 17.6 mg/리터
시티딘: 17.6 mg/리터
구아노신: 17.6 mg/리터
우리딘: 17.6 mg/리터
히포크산틴: 11.8 mg/리터
L-시트룰린: 12.6 mg/리터
L-오르니틴-HCl: 25.6 mg/리터
비오틴: 0.28 mg/리터
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.05 mg/리터
엽산: 4.6 mg/리터
리포산: 0.52 mg/리터
니아신: 31.4 mg/리터
피리독신 HCl: 3 mg/리터
리보플라빈: 1.86 mg/리터
티아민 HCl: 16 mg/리터
비타민 E: 0.376 mg/리터
비타민 B12: 3.4 mg/리터
염화콜린: 50.2 mg/리터
에탄올아민 HCl: 4.4 mg/리터
i-이노시톨: 73.2 mg/리터
티미딘: 7.8 mg/리터
푸트레신 2HCl: 0.4 mg/리터
프로게스테론: 0.015 mg/리터
D-칼슘 판토테네이트: 23.8 mg/리터
L-아스파라긴: 812 mg/리터
L-프롤린: 216 mg/리터
L-이소류신: 370 mg/리터
L-시스테인-HCl: 224 mg/리터
L-류신: 332 mg/리터
L-트레오닌: 164 mg/리터
L-티로신: 198 mg/리터
L-아르기닌: 186 mg/리터
L-아스파르트산: 71 mg/리터
L-글루탐산: 126 mg/리터
글리신: 57 mg/리터
L-히스티딘: 125 mg/리터
L-메티오닌: 132 mg/리터
L-트립토판: 99 mg/리터
L-리신: 293 mg/리터
L-페닐알라닌: 174 mg/리터
L-발린: 262 mg/리터
L-세린: 260 mg/리터
일염기성 인산나트륨: 288.2 mg/리터
황산아연: 1.08 mg/리터
황산제2구리: 0.0032 mg/리터
암모늄 바나데이트: 0.00078 mg/리터
염화코발트: 0.0025 mg/리터
이염화니켈 육수화물: 0.0004 mg/리터
몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.00016 mg/리터; 및,
세포 성장 동안, 글루코스 수준이 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어질 때 배지에 글루코스를 첨가하고, L-글루타민 수준이 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어질 때 L-글루타민을 첨가하는 단계; 및 세포 성장 동안 O2 농도를 대략 60%로, pH를 대략 6.8 ± 0.02로 및 온도를 대략 36.5℃ ± 0.5℃로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 세포 생존율이 대략 60% 이하인 액체 배양 배지를 제공한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 배양 배지는 항체 또는 그의 항원-결합성 단편을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하고; 임의로는, 여기서 숙주 세포에 의해 분비된 항체 또는 단편이 배지 중에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시양태에서, 면역글로불린은 IGF1R에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 예컨대, 서열 1, 3, -6, 13, 21 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 개시된 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄; 및/또는 서열 2, 7-9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항체 또는 단편, 예컨대, 서열 3, 4, 5, 또는 6의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 면역글로불린; 및 서열 8 또는 9의 아미노산 20 내지 137을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체 또는 단편을 형성한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 경쇄 면역글로불린은 카파 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있고, 중쇄 면역글로불린은 감마-1 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있다. 예를 들면, 여기서 상기 숙주 세포는 항체 또는 그의 항원-결합성 단편의 면역글로불린을 코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 항체 또는 단편은 배지 내로 분비된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 숙주 세포 생존율은 대략 60% 이하이고/거나 세포 성장이 대략 14 내지 24일 (예컨대, 대략 14일, 대략 15일, 대략 16일, 대략 17일, 대략 18일, 대략 19일, 대략 20일, 대략 21일, 대략 22일, 대략 23일 또는 대략 24일) 동안 진행되었고, 예컨대, 배지 및 세포를 원심분리하여, 세포를 배지로부터 제거한다 (예컨대, 여기서 배지는 또한, 예를 들어, 원심분리 후, 심층 여과되고/거나 0.2 마이크로미터 여과기로 여과됨). 상기 개시한 바와 같이 생성된 배지의 특징을 포함하는 임의의 배지는, 해당 배지가 실제로 생성된 방법과 관계없이 본 발명의 일부를 형성한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 배양 배지를 포함하는 용기 (예컨대, 플라스크, 생물반응기, 탱크 (tank) 생물반응기, 백 (bag) 생물반응기 또는 1회용 생물반응기, 교반 탱크 생물반응기, 기포탑 (bubble column) 생물반응기, 공기 부양식 (air lift) 생물반응기, 유동층 생물반응기, 또는 충전층 (packed bed) 생물반응기)를 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 출원은 포유동물 세포, 예컨대 CHO (차이니즈 햄스터 난소) 세포로부터의 항체 (예컨대, 항-IGF1R) 생산 방법을 포함한다. 이 방법은 교반 탱크 생물반응기, 백 및 1회용 생물반응기, 및 진탕 플라스크를 비롯한 다양한 생물반응기 배양 시스템에서 실행된다. "레벨 3" 생산 방법은, 평균적으로, 대략 1.2 g/L의 항체 역가 및 대략 22 pg/세포/일의 배양 비생산성 (specific productivity)을 산출한다. 이 "강화된" 방법은, 평균적으로, 대략 2.3 g/L의 항체 역가, 및 대략 30 pg/세포/일의 비생산성을 산출한다. 두 방법 모두 배양 비생산성, 역가, 생물량 및 배양 생존율을 증가시키기 위해 접종 전에 또는 생산 과정 중의 공급물로서 생산용 생물반응기 배양물에 특정 보충물을 첨가하는 것을 수반한다. 레벨 3 방법에 있어서, 배양 비생산성을 증가시키기 위해 3가지 보충물이 첨가되는데, 밀 및/또는 대두 가수분해물 (가수분해물 공급물)이 첨가된다 (예를 들어, 200 g/L (수성) 용액으로서). 전형적으로는 두 가수분해물 모두 또는 대두 가수분해물 공급물 자체가 배양물에 첨가된다. 2가지 농축 아미노산 공급 용액 (아미노산 공급물)은 배양물 생물량을 증가시키고 제조 역가를 증가시키기 위해 첨가된다. 농축 비타민 및 염 용액 (비타민/염 공급물)은 배양 생존율을 안정화하고 생물량을 증가시키기 위해 첨가된다. 비타민 공급 용액은, 예를 들어, 비오틴, 프로게스테론, 이노시톨, 핵산, 시트룰린, 히포크산틴, 리포산, 리보플라빈, 티아민, 콜린, 에탄올아민, 엽산, 플라빈, 및 비타민 B12를 포함한다.
상기 강화된 방법을 위해, 공급 용액을, 추가의 농축 양액 (영양소 공급물)과 함께 첨가한다. 이 "영양소 공급물"은, 예를 들어, 아미노산, 황산아연, 황산제2구리, 암모늄 바나데이트, 염화코발트, 이염화니켈, 염화주석, 및 염화망간을 포함한다. 이는 제조 역가를 향상시키고 생존율을 증가시키기 위해 접종 전 또는 생산 과정 중의 공급물로서 첨가될 수 있다.
또한, 농축 염 용액, 대두 가수분해물 용액 또는 이산화탄소 및 수산화나트륨의 첨가에 의한 생산 과정 중 삼투질농도 이동 (400 내지 500 mOsm로의 이동)이 임의로 이용된다 (생물반응기에 대한 pH 조절의 일부로서). 삼투질농도 이동은 배양 비생산성을 증가시키고 수거 생존율을 향상시키기 위해 이용된다. 나아가, 배양 생존율을 높은 생존 세포 수로 안정화하기 위해 생산 과정 중 온도의 하향 이동 (대략 36℃ 내지 37℃에서 33 내지 35℃로의 이동)이 임의로 사용된다.
본 발명의 목적상, "생산 과정 중"이라는 용어는 초기 세포 접종 후 생산용 세포 배양물의 성장 동안 일어나는 사건을 지칭한다 (예컨대, 세포 증식, 예를 들어, 마스터 (master) 세포 은행 또는 제조용 (working) 세포 은행의 경우).
"생산용 세포 배양물"이란 최종 생성물, 예컨대 항체 (예컨대, 항-IGF1R 항체)를 단리시킬 예정인 세포 배양물을 지칭한다.
"증식용 세포 배양물"이란 생산용 세포 배양물의 초기 접종에 사용되는 세포 또는 세포 배양물을 지칭한다.
보충물의 "nX" 스탁 용액 (여기서, n은 50과 같은 숫자임)은, 스탁 용액이 배양물에 첨가될 때 1/n로 희석되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 5OX 스탁 용액은 보통, 배양물에 첨가될 때 1/50로 희석된다.
공급물
본 발명의 방법은 다양한 공급물을 초기 포유동물 세포 성장 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 공급물에는 가수분해물 공급물, 비타민/염 공급물, 아미노산 공급물 및 영양소 공급물이 포함된다. 공급물은 이용되는 세포 배양 방법의 유형 (레벨 3 방법 또는 강화된 방법)에 따라 다양한 시점에서 첨가될 수 있다.
"초기 포유동물 세포 성장 배지"는 당업계에 공지된 여러 유형의 수성 배지 중 임의의 것일 수 있고, 상기 용어의 의미는 당업계 통상의 기술을 가진 임의의 실무자가 쉽게 이해할 것이다. 그 예로는 EX-CELL ACF CHO 배지 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스; 이하에서 추가로 논의됨), DMEM, DMEM/F-12, F-10 영양소 혼합물, RPMI 배지 1640, F-12 영양소 혼합물, 배지 199, 이글 MEM (Eagle's MEM), RPMI 293 배지 및 이스코브 배지 (Iscove's Media)가 포함된다. 예를 들어, 이글 최소 필수 배지 (MEM)는 L-아르기닌 히드로클로라이드 (126 mg/l), L-시스틴 2HCl (31 mg/l), L-히스티딘 히드로클로라이드-H2O (42 mg/l), L-이소류신 (52 mg/l), L-류신 (52 mg/l), L-리신 히드로클로라이드 (73 mg/l), L-메티오닌 (15 mg/l), L-페닐알라닌 (32 mg/l), L-트레오닌 (48 mg/l), L-트립토판 (10 mg/l), L-티로신 이나트륨 염 탈수화물 (52 mg/l), L-발린 (46 mg/l), 염화콜린 (1 mg/l), D-칼슘 판토테네이트 (1 mg/l), 엽산 (1 mg/l), 니아신아미드 (1 mg/l), 피리독살 히드로클로라이드 (1 mg/l), 리보플라빈 (0.1 mg/l), 티아민 히드로클로라이드 (1 mg/l), i-이노시톨 (2 mg/l), 염화칼슘 (CaCl2) (무수물) (200 mg/l), 황산마그네슘 (MgSO4) (무수물) (97.67 mg/l), 염화칼륨 (KCl) (400 mg/l), 중탄산나트륨 (NaHCO3) (2200 mg/l), 염화나트륨 (NaCl) (6800 mg/l), 일염기성 인산나트륨 (NaH2PO4-H2O) (140 mg/l), D-글루코스 (덱스트로스) (1000 mg/l) 및 페놀 레드 (10 mg/l)를 포함한다.
개질 이글 배지 (MEM) (2X)는 L-아르기닌 히드로클로라이드 (504 mg/l), L-시스틴 (96 mg/l), L-글루타민 (870 mg/l), L-히스티딘 히드로클로라이드-H2O (168 mg/l), L-이소류신 (208 mg/l), L-류신 (208 mg/l), L-리신 히드로클로라이드 (290 mg/l), L-메티오닌 (60 mg/l), L-페닐알라닌 (128 mg/l), L-트레오닌 (192 mg/l), L-트립토판 (40 mg/l), L-티로신 이나트륨 염 탈수화물 (208 mg/l), L-발린 (155 mg/l), 염화콜린 (4 mg/l), D-칼슘 판토테네이트 (4 mg/l), 엽산 (4 mg/l), 니아신아미드 (4 mg/l), 피리독살 히드로클로라이드 (4 mg/l), 리보플라빈 (0.4 mg/l), 티아민 히드로클로라이드 (4 mg/l), i-이노시톨 (8 mg/l), 염화칼슘 (CaCl2) (무수물) (285 mg/l), 철 니트레이트 (Fe(NO3)3·9H2O) (1 mg/l), 황산마그네슘 (MgSO4) (무수물) (195 mg/l), 염화칼륨 (KCl) (800 mg/l), 중탄산나트륨 (NaHCO3) (8400 mg/l), 염화나트륨 (NaCl) (12800 mg/l), 일염기성 인산나트륨 (NaH2PO4-H2O) (250 mg/l) 및 D-글루코스 (덱스트로스) (9000 mg/l)를 포함한다.
RPMI 배지 1640 (1X)은 글리신 (10 mg/l), L-아르기닌 (200 mg/l), L-아스파라긴 (50 mg/l), L-아스파르트산 (20 mg/l), L-시스틴 2HCl (65 mg/l), L-글루탐산 (20 mg/l), L-글루타민 (300 mg/l), L-히스티딘 (15 mg/l), L-히드록시프롤린 (20 mg/l), L-이소류신 (50 mg/l), L-류신 (50 mg/l), L-리신 히드로클로라이드 (40 mg/l), L-메티오닌 (15 mg/l), L-페닐알라닌 (15 mg/l), L-프롤린 (20 mg/l), L-세린 (30 mg/l), L-트레오닌 (20 mg/l), L-트립토판 (5 mg/l), L-티로신 이나트륨 염 탈수화물 (29 mg/l), L-발린 (20 mg/l), 비오틴 (0.2 mg/l), 염화콜린 (3 mg/l), D-칼슘 판토테네이트 (0.25 mg/l), 엽산 (1 mg/l), 니아신아미드 (1 mg/l), 파라-아미노벤조산 (1 mg/l), 피리독신 히드로클로라이드 (1 mg/l), 리보플라빈 (0.2 mg/l), 티아민 히드로클로라이드 (1 mg/l), 비타민 B12 (0.005 mg/l), i-이노시톨 (35 mg/l), 질산칼슘 (Ca(NO3)2 ·4H2O) (100 mg/l), 황산마그네슘 (MgSO4) (무수물) (48.84 mg/l), 염화칼륨 (KCl) (400 mg/l), 중탄산나트륨 (NaHCO3) (2000 mg/l), 염화나트륨 (NaCl) (6000 mg/l), 이염기성 무수 인산나트륨 (Na2HPO4) (800 mg/l), D-글루코스 (덱스트로스) (2000 mg/l) 및 글루타티온 (환원) (1 mg/l)을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 목적을 위해, "가수분해물 공급물"은 밀 및/또는 대두 가수분해물을 포함한다. 일반적으로, 대두 또는 밀 가수분해물은 대두 또는 밀의 효소적 분해 생성물이며, 상업적으로 구매할 수 있다. 전형적으로, 가수분해물은 세포 배양 등급수 중에 포함되며, 멸균 상태이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 가수분해물은 200 g/리터 농도의 스탁 용액이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 가수분해물은 대략 10 g/리터의 최종 농도를 달성하도록 배양 배지에 첨가한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 레벨 3 방법 또는 강화된 방법을 이용하는 경우, 가수분해물은 초기에, 접종 전, 접종과 동시에 또는 접종 직후에, 또는 접종후 대략 3일차에, 또는 생존 세포 밀도가 대략 1 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때 배양 배지에 첨가한다.
"생존 세포 밀도"는 분석 배지 중 생존가능한 (예를 들어, (예를 들어, 액체 배양물 또는 고체 배양 배지의 접종에 사용되는 경우에) 성장 및 복제를 할 수 있거나, 염료 배제 검정에서 트립탄 블루 (tryptan blue), 에오신 또는 프로피듐과 같은 염료를 배제할 수 있는) 세포의 농도 (예를 들어, 세포 개수/ml)를 나타낸다. 이러한 검정법은 당업계에 흔히 알려져 있다.
일반적으로, 본 발명의 목적을 위해, "비타민/염 공급물"은 다음을 포함한다:
아셀렌산나트륨 예를 들어, 대략 7.13 X 10-4 g/리터의 농도
아데닌 술페이트 예를 들어, 대략 0.0816 g/리터의 농도
아데노신 예를 들어, 대략 0.88 g/리터의 농도
시티딘 예를 들어, 대략 0.88 g/리터의 농도
구아노신 예를 들어, 대략 0.88 g/리터의 농도
우리딘 예를 들어, 대략 0.88 g/리터의 농도
히포크산틴 예를 들어, 대략 0.59 g/리터의 농도
L-시트룰린 예를 들어, 대략 0.63 g/리터의 농도
L-오르니틴-HCl 예를 들어, 대략 1.28 g/리터의 농도
비오틴 예를 들어, 대략 0.014 g/리터의 농도
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 예를 들어, 대략 0.0025 g/리터의 농도
엽산 예를 들어, 대략 0.23 g/리터의 농도
리포산 예를 들어, 대략 0.026 g/리터의 농도
니아신 예를 들어, 대략 1.57 g/리터의 농도
피리독신 HCl 예를 들어, 대략 0.15 g/리터의 농도
리보플라빈 예를 들어, 대략 0.093 g/리터의 농도
티아민 HCl 예를 들어, 대략 0.8 g/리터의 농도
비타민 E 예를 들어, 대략 0.0188 g/리터의 농도
비타민 B12 예를 들어, 대략 0.17 g/리터의 농도
염화콜린 예를 들어, 대략 2.51 g/리터의 농도
에탄올아민 HCl 예를 들어, 대략 0.22 g/리터의 농도
i-이노시톨 예를 들어, 대략 3.66 g/리터의 농도
티미딘 예를 들어, 대략 0.39 g/리터의 농도
푸트레신 2HCl 예를 들어, 대략 0.02 g/리터의 농도
프로게스테론 예를 들어, 대략 0.00075 g/리터의 농도; 및
D-칼슘 판토테네이트 예를 들어, 대략 1.19 g/리터의 농도.
본 발명의 일 실시양태에서, 비타민/염 공급물은 5OX 스탁 용액이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 비타민/염 공급물은 대략 20 ml/리터의 최종 농도를 달성하도록 배양 배지에 첨가한다. 레벨 3 방법을 이용하는 경우, 비타민/염 공급물은 접종후 3일차 내지 5일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 1 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때 배양물에 첨가한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 강화된 방법을 이용하는 경우, 비타민/염 공급물은 접종후 3일차 내지 5일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때 배양물에 첨가한다.
일반적으로, 본 발명의 목적을 위해, "아미노산 공급물"은 다음을 포함한다:
L-아르기닌 예를 들어, 대략 6.32 g/리터의 농도
L-시스틴 예를 들어, 대략 1.7 g/리터의 농도
L-히스티딘 예를 들어, 대략 2.1 g/리터의 농도
L-이소류신 예를 들어, 대략 2.6 g/리터의 농도
L-류신 예를 들어, 대략 2.6 g/리터의 농도
L-리신 예를 들어, 대략 3.6 g/리터의 농도
L-메티오닌 예를 들어, 대략 0.76 g/리터의 농도
L-페닐알라닌 예를 들어, 대략 1.65 g/리터의 농도
L-트레오닌 예를 들어, 대략 2.38 g/리터의 농도
L-트립토판 예를 들어, 대략 0.51 g/리터의 농도
L-티로신 예를 들어, 대략 1.8 g/리터의 농도
L-발린 예를 들어, 대략 2.34 g/리터의 농도
L-알라닌 예를 들어, 대략 0.89 g/리터의 농도
L-아스파라긴 예를 들어, 대략 1.5 g/리터의 농도
L-아스파르트산 예를 들어, 대략 1.33 g/리터의 농도
L-글루탐산 예를 들어, 대략 1.47 g/리터의 농도
글리신 예를 들어, 대략 0.75 g/리터의 농도
L-프롤린 예를 들어, 대략 1.15 g/리터의 농도; 및
L-세린 예를 들어, 대략 1.05 g/리터의 농도.
본 발명의 일 실시양태에서, 다음과 같은 2종의 개별적인 아미노산 공급물 스탁 용액이 제조된다: 상기 농도의 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, 글리신, L-프롤린 및 L-세린을 포함하는 100X 스탁 용액; 및 상기 농도의 L-아르기닌, L-시스틴, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 포함하는 50X 용액. 이들 스탁 용액은 제조되어 배양 배지에 개별적으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 아미노산 스탁 용액은 세포 접종후 0일차, 세포 접종 전, 세포 접종과 함께, 또는 세포 접종 직후에 초기 배지에 첨가한다.
일반적으로, 본 발명의 목적을 위해, "영양소 공급물"은 다음을 포함한다:
L-아스파라긴 예를 들어, 대략 40.6 g/리터의 농도
L-프롤린 예를 들어, 대략 10.81의 농도
L-이소류신 예를 들어, 대략 18.53의 농도
L-시스테인-HCl 예를 들어, 대략 11.19의 농도
L-류신 예를 들어, 대략 16.58의 농도
L-트레오닌 예를 들어, 대략 8.2의 농도
L-티로신 예를 들어, 대략 9.9의 농도
L-아르기닌 예를 들어, 대략 9.29의 농도
L-아스파르트산 예를 들어, 대략 3.56의 농도
L-글루탐산 예를 들어, 대략 6.28의 농도
글리신 예를 들어, 대략 2.83의 농도
L-히스티딘 예를 들어, 대략 6.23의 농도
L-메티오닌 예를 들어, 대략 6.58의 농도
L-트립토판 예를 들어, 대략 4.93의 농도
L-리신 예를 들어, 대략 14.66의 농도
L-페닐알라닌 예를 들어, 대략 8.64의 농도
L-발린 예를 들어, 대략 13.08 g/리터의 농도
L-세린 예를 들어, 대략 13 g/리터의 농도
일염기성 인산나트륨 예를 들어, 대략 14.41 g/리터의 농도
황산아연 예를 들어, 대략 0.054 g/리터의 농도
황산제2구리 예를 들어, 대략 0.00016 g/리터의 농도
암모늄 바나데이트 예를 들어, 대략 0.000039 g/리터의 농도
염화코발트 예를 들어, 대략 0.000125 g/리터의 농도
이염화니켈 육수화물 예를 들어, 대략 0.00002 g/리터의 농도
몰리브덴산나트륨 탈수화물 예를 들어, 대략 0.000008 g/리터의 농도
염화주석 탈수화물 예를 들어, 대략 0.000004 g/리터의 농도 및
염화망간 사수화물 예를 들어, 대략 0.000015 g/리터의 농도.
본 발명의 일 실시양태에서, 영양소 공급물은 5OX 스탁 용액이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 영양소 공급물은 대략 20 ml/리터의 최종 농도를 달성하도록 배양 배지에 첨가한다. 강화된 방법을 이용하는 경우, 영양소 공급물은 접종후 3일차 내지 5일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml에 도달할 때 배양물에 첨가한다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서, 레벨 3 방법 또는 강화된 방법을 이용하는 경우, (2.5 M 스탁 용액으로부터의) 글루코스 및 (0.2 M 스탁 용액으로부터의) L-글루타민을 임의의 시점에서, 예를 들어 영양소들의 농도가 글루코스 1.5 g/리터 및 L-글루타민 150 mg/리터 미만으로 떨어질 때 배양 배지에 첨가한다.
삼투질농도 및 온도 이동
본 발명은 또한, 배양물의 삼투질농도 및/또는 온도를 임의로 이동시키는 공정을 포함한다. 삼투질농도 또는 온도 이동은 생산 과정 중 임의의 시점에서 수행될 수 있다.
삼투질농도 이동은 세포 생존율뿐만 아니라 배양물의 비생산성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 전형적으로, 초기 포유동물 세포 성장 배지는 대략 300 mOsm의 출발 삼투질농도를 갖는다. 그러나, 본 발명의 "삼투질농도 이동"은 배양물 삼투질농도를 대략 400 mOsm 내지 대략 500 mOsm로 이동시키는 것을 포함한다.
삼투질농도는 용매 1 킬로그램 당 용질의 오스몰의 단위이다. 삼투질농도는 빙점 하락, 증기압 또는 비등점 상승과 같은 속일성을 측정하는 삼투압계를 이용하여 측정할 수 있다.
세포 배양물의 삼투질농도는 여러 수단 중 임의의 것에 의해 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 농축 염 용액 (예를 들어, 5 M NaCl 염 스탁 용액, 8 내지 12 mL/L 첨가됨), 대두 가수분해물 용액 (200 g/L 스탁 용액, 50 내지 80 mL/L 첨가됨) 또는 이산화탄소를 첨가할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 영양소 공급물을 배지에 첨가하면 삼투질농도가 이동한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 배양물의 온도는, 예를 들어 단계적 변화에 의해 대략 36.5℃ (± 0.5℃)로부터 대략 33℃ 내지 35℃로 임의로 이동시킨다.
단백질
본 발명은, 면역글로불린 쇄와 같은 단백질을 재조합적으로 생산하는 방법을 포함하는 실시양태를 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 면역글로불린은, 예를 들어 면역글로불린 불변 영역에 임의로 결합된 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-IGF1R 항체 (예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체) 또는 그의 항원-결합성 단편을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 발현시킬 단백질 (예를 들어, 항-IGF1R 항체 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린)이, 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 프로모터 (예컨대, CMV 프로모터)에 작동가능하게 결합된 플라스미드 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 방법을 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 경쇄 및 중쇄는 단일 플라스미드 벡터에 포함된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 면역글로불린 쇄는 아래 기재된 것들 중 임의의 것, 예를 들어 하기 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 중 임의의 것 및/또는 그의 CDR 중 임의의 것 (예를 들어, 단일 경쇄 또는 중쇄로부터의 3개 전부)을 코딩한다. 점선 밑줄의 유형은 신호 펩티드를 코딩한다. 실선 밑줄의 유형은 CDR을 코딩한다. 무표시 유형은 프레임워크 영역을 코딩한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 쇄는 숙주 세포로부터 분비시에 절단되어 쇄의 성숙 단편을 생성하는 신호 펩티드와 함께 발현된다.
이하의 표적 면역글로불린 아미노산 서열 또는 그의 성숙 단편 중 임의의 것을 생산하기 위한 방법 및 조성물은 본 발명의 일부를 형성한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본원에 그 전체내용이 포함되는 국제 출원 공보 제WO 2003/100008호를 참조한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
본 발명의 실시양태는, 면역글로불린이, 예를 들어 본원에 기재된 것들 중 임의의 것의 조합 (예를 들어, 중쇄 Ig. ＃1.0 및 경쇄 Ig. ＃1.0; 또는 LCC 및 HCA; 또는 LCF 및 HCA; 또는 LCC 및 HCB)으로 발현되는 실시양태들을 포함한다. 경쇄 및 중쇄가 쌍을 이루면, 항체 또는 그의 항원-결합성 단편이 생성될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 경쇄는 면역글로불린 불변 쇄, 예를 들어 카파 쇄에 융합된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 중쇄는 면역글로불린 불변 쇄, 예를 들어 감마-1, 감마-2, 감마-3 또는 감마-4 쇄에 융합된다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 발현시킬 수 있는 다른 관심 단백질에는 수용체, 리간드, 사이토킨, 케모카인, 성장 인자, 호르몬 및 효소가 포함된다.
생산 방법 및 물질
본 발명의 방법에 의해 발현되는 유전자를 포함하는 벡터, 예컨대 플라스미드는 당업계에 알려진 여러 방법 중 임의의 것에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham and Van der Eb, Virology, 52:546 (1978)]에 기재된 칼슘 포스페이트 침전 방법에 의해 형질전환이 이루어질 수 있다. 또한, 핵 주입 또는 원형질체 융합과 같이 DNA를 세포에 도입하는 다른 방법이 이용될 수 있다. 형질전환 방법에는 전기천공, 리포좀 형질전환 및 DEAE-덱스트란 형질전환도 포함된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)이다. CHO-K1 세포는 프롤린을 필요로 하며 디히드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 유전자의 2배체이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 세포주는 DXBH CHO 세포주 (문헌 [Urlaub et al. (1983) Cell 33:405-412)이다. 다른 세포주로는, 예를 들어 HEK293이 포함된다.
본 발명의 방법을 이용하여 발현시킬 유전자를 포함하는 숙주 세포를 선별 및 스크리닝하여, 표적 유전자 발현을 위해 필요한 특성을 갖는 클론을 확인할 수 있다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서, 최대 발현을 달성하기 위한 한 보편적인 접근법은 돌연변이 세포주의 사용, 및 수개월에 걸친 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)와 같은 동시-형질감염 선별 마커에 대한 선택압의 점차적 증가 (문헌 [Kaufman et al. (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621]; [Schimke et al. (1982) Natl. Cancer Inst. Monogr. 60:79-86])를 포함한다. 높은 생산성을 달성하기 위해, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 음성 세포주 (예를 들어, CHO 세포주) (문헌 [Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216-4220])를, 기능적 DHFR 유전자를 발현될 표적 유전자와 함께 함유하는 발현 벡터로 형질전환시킨다. 증가하는 양의 DHFR 길항제 메토트렉세이트 (MTX)를 배양 배지에 첨가하면, 벡터-삽입 표적 유전자의 증폭이 발생하고, 여러 카피의 재조합 유전자를 갖는 클론 또는 소집단이 생성되어 선별될 수 있다 (문헌 [Wurm (1990) Biologicals 18:159-164]). 유전자 증폭 과정은 전형적으로, 목적하는 단백질의 높은 생산성 및 높은 표적 유전자 카피수를 나타내는 안정적인 세포주가 얻어질 때까지 수개월 동안 수행된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 (예를 들어, CHO, CHO-K1, CHO DXB11) 염색체 DNA로 통합되거나 이소성 (ectopic)이고, 자가 복제한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 세포내에 세포 당 여러 카피수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20)로 존재한다. 안정성의 개선을 위해 발현 벡터가 숙주 세포의 게놈 DNA로 통합된 경우, 벡터 서열이 숙주 세포의 DNA에 통합된 후에 증폭된 세포주에 대해 선별함으로써 벡터 DNA의 카피수 및 그와 동시에, 발현될 수 있는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 통합된 유전자를 표준 방법에 의해 염색체 도입 DNA 및 상응하는 mRNA 및 폴리펩티드 합성의 존재 여부 및 상대량에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 원하는 통합물의 존재 여부는 DNA 서열분석, 서던 블로팅, 노던 블로팅 및/또는 웨스턴 블로팅과 같은 표준 절차에 의해 검출될 수 있다.
당업계에 공지된 여러 세포 배양 배지 중 임의의 것을 사용하여, 표적 유전자를 발현하는 세포를 증식시킬 수 있다. 여러 시판 배양 배지가 사용가능하다. 치료적으로 사용되는 단백질을 발현시키는 경우, 동물-생성물이 없는 배지 (예를 들어, 무혈청 배지 (SFM))가 바람직할 수 있다. 세포를 무혈청 배지에서의 성장에 적합화시킬 수 있는, 당업계에 공지된 여러 방법이 있다. 예를 들어, 직접 적합화는 세포를 혈청-보충 배지로부터 무혈청 배지로 단순 이동시키는 것을 포함한다. 순차 적합화 또는 이행 (weaning)은 세포를 혈청-보충 배지로부터 무혈청 배지로 여러 단계를 통해 이동시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 25％ SFM, 50％ SFM, 75％ SFM, 이어서 대략 3 계대 동안 90％ SFM, 이어서 100％ SFM). 순차 적합화는 직접 적합화의 경우보다 세포에 관해 덜 엄격한 경향이 있다. 일반적으로, 세포를 무혈청 배지에 적합화시키기 위해서는, 배양물이 중간 대수기에 있어야 하고, 생존률이 90％ 초과여야 하고, 직접 적합화 동안보다 높은 초기 세포 접종량으로 시딩되어야 한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 초기 포유동물 세포 성장 배지는 시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 시판되는 EX-CELL ACF CHO 배지이다. 이러한 배양물은 동물성-성분이 없고, HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산)를 함유하고, L-글루타민을 함유하지 않고, 액체이고, 멸균-여과 상태이고, 세포 배양물-시험된 물질이다. 배지는 또한, 무기 염, 중탄산나트륨 완충액, 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 재조합 인간 인슐린, 식물 가수분해물, 여타 유기 화합물, 미량 원소 및 계면활성제를 포함한다. 또한, 배지는 항생제, 항진균제 또는 트랜스페린을 함유하지 않으며, 동물-유래 단백질 또는 여타 성분도 함유하지 않는다. 전형적으로, 배지의 재구성을 위해, 실무자는 사용 전에 배지 1 리터 당 20 내지 40 mL의 200 mM L-글루타민 용액을 무균적으로 첨가해야 한다.
본 발명의 방법을 이용하여 발현시킬 유전자를 포함하는 숙주 세포를 함유하는 세포주는 또한, 마스터 세포 은행 (MCB) 및/또는 제조용 세포 은행 (WCB)에 저장될 수 있다. 전형적으로, 세포주가 다수의 제조 주기에 걸쳐 사용되는 경우, 마스터 세포 은행 또는 마스터 시드 은행 (MSB) 및 제조용 세포 은행으로 이루어진 2중 세포 은행 시스템이 마련될 수 있다. 세포주는 단일 숙주 세포 클론으로부터 마련되고, 이러한 세포주는 MCB를 구성하는 데 이용된다. 일반적으로, 상기 MCB는 특성 분석되어야 하며, 박테리아, 진균, 바이러스 및 마이코플라스마와 같은 오염물질에 대해 광범위하게 시험되어야 한다. MCB로부터의 세포의 샘플은 증식되어 WCB를 형성할 수 있으며, 이를 제조 공정에서 사용하기 전에 세포 생존율에 대해 분석한다. MCB 또는 WCB의 세포는 바이알 내에, 예를 들어 저온 (예를 들어, O℃ 이하, -2O℃ 또는 -8O℃)에서 저장될 수 있다.
전형적으로, 제조용 세포 은행은 저장 전에 여러 계대 동안 성장시킨 마스터 은행의 한 바이알로부터의 세포를 포함한다. 일반적으로, 미래 세포가 필요한 경우, 이들을 제조용 세포 은행으로부터 취하지만, 마스터 세포 은행은 필요한 경우에만 이용함으로써, 적은 계대수를 갖는 세포 스탁이 세포 배양물내에서 유전적 변이를 회피할 수 있게 된다.
본 발명은 세포를 성장시키고 단백질을 재조합적으로 생산하는 2가지 방법, 즉 "레벨 3 방법" 및 "강화된 방법"을 제공한다. 이들 두 방법은 높은 수준의 관심 단백질을 생성하지만, 강화된 방법이 특히 높은 수준으로 생성한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 단백질, 예컨대 항체 (예를 들어, 항-IGF1R)를 생산하는 레벨 3 방법은 다음 단계들을 포함한다.
1 - 표준 초기 포유동물 성장 배지 (예를 들어, L-글루타민 (4 mM)이 첨가된 시그마 CHO 배지)에서, 단백질을 발현하는 세포를 증식시키는 단계.
상기 증식은, 예를 들어 진탕 플라스크에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 대략 10 내지 30 계대 동안 대략 1-2 X 106개 세포/ml로의 성장, (예를 들어, 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 밀도로) 상기 세포의 샘플의 희석, 이어서 대략 1-2 X 106개 세포/ml로의 재성장을 통해 증식이 이루어진다.
2 - 초기 포유동물 세포 성장 배지에 단계 (1)로부터의 증식된 세포를 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하고, 보충물을 배지에 첨가하는 단계. 보충물은 밀 및/또는 대두 가수분해물, 아미노산 공급물, 비타민/염 공급물, 글루코스 및 L-글루타민이다.
접종일은 "0일차"이고, 그 다음날은 "1일차"이고, 그 다음날은 "2일차"이고, 이와 같이 계속된다.
대두 또는 밀 가수분해물을, 예를 들어 0일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 106개 세포/ml 초과에 도달한 후에 첨가한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 가수분해물(들)을 3일차에 또는 생존 세포 밀도가 전형적으로 106개 세포/ml에 도달할 때 간단히 첨가한다.
아미노산 공급물 (상기 논의됨)을, 예를 들어 하기 대략의 최종 배양물 농도 (초기 포유동물 세포 성장 배지와 같은 다른 공급원으로부터의 임의의 표시 성분의 농도 미포함)를 달성하도록, 예를 들어 0일차에 첨가한다.
성분 배양물 중의 최종 농도 (mg/리터)
L-아르기닌 126.4
L-시스틴 34
L-히스티딘 42
L-이소류신 52
L-류신 52
L-리신 72
L-메티오닌 15.2
L-페닐알라닌 33
L-트레오닌 47.6
L-트립토판 10.2
L-티로신 36
L-발린 46.8
L-알라닌 8.9
L-아스파라긴 30
L-아스파르트산 26.6
L-글루탐산 29.4
글리신 15
L-프롤린 23
L-세린 21
본 발명의 일 실시양태에서, 아미노산 공급물은 배지에 첨가하지 않는다.
비타민/염 공급물 용액 (상기 논의됨)을, 예를 들어 하기 대략의 최종 배양물 농도 (초기 포유동물 세포 성장 배지와 같은 다른 공급원으로부터의 임의의 표시 성분의 농도 미포함)를 달성하도록, 예를 들어 3일차 내지 5일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 106개 세포/ml에 도달할 때 첨가한다.
성분 최종 배양물 농도 (mg/리터)
아셀렌산나트륨 0.01426
아데닌 술페이트 1.632
아데노신 17.6
시티딘 17.6
구아노신 17.6
우리딘 17.6
히포크산틴 11.8
L-시트룰린 12.6
L-오르니틴-HCl 25.6
비오틴 0.28
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 0.05
엽산 4.6
리포산 0.52
니아신 31.4
피리독신 HCl 3
리보플라빈 1.86
티아민 HCl 16
비타민 E 0.376
비타민 B12 3.4
염화콜린 50.2
에탄올아민 HCl 4.4
i-이노시톨 73.2
티미딘 7.8
푸트레신 2HCl 0.4
프로게스테론 0.015
D-칼슘 판토테네이트 23.8
글루코스는, 예를 들어 배양 배지 중의 글루코스 농도가 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어질 때 첨가하고, L-글루타민은, 예를 들어 배양 배지 중의 글루타민 농도가 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어질 때 첨가한다.
3 - 임의로, 예를 들어 생존율이 60％ 미만일 때, 배양 배지로부터 세포를 분리함으로써 (예를 들어, 세포의 온도를 대략 15℃로 낮추고, 나트륨-포스페이트 완충액을 첨가하여 pH를 대략 6.8에서 안정화시키고, 배양 배지를 원심분리하여 세포를 청정함으로써) 생산 세포 배양 배지로부터 세포를 수거하는 단계. 단백질이 분비되는 경우, 배지는 후속 공정을 위해 보존될 수 있고, 단백질이 분비되지 않는경우, 세포는 후속 공정을 위해 보존될 수 있다.
여러 방법 중 임의의 것을 이용하여, 예를 들어 원심분리 (예를 들어, 연속 디스크-적층 원심분리기 (예를 들어, 대략 9.27 X 10-7의 유속/시그마 (cm/sec))를 사용함)에 의해 배지로부터 세포를 분리할 수 있다.
또한, 예를 들어 원심분리기를 이용하거나 이용하지 않은 심층 여과에 의해 배지를 여과하여 세포를 분리할 수 있다. 예를 들어, 원심분리기를 이용하는 경우, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 방법은 8 ± 2 L 배양액/ft2 여과기 (예를 들어, 하전 셀룰로스 여과기)의 사용을 포함할 수 있고, 원심분리기를 이용하지 않는 경우, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 방법은 20 ± 3 L 배양액/ft2 여과기의 사용을 포함할 수 있다.
또한, 배지는, 예를 들어 0.2 마이크로미터 공극 크기를 갖는 미세 여과기 (예를 들어, PVDF 여과기)를 통해 여과될 수 있다.
4 - 임의로, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 단백질, 예를 들어 항체를 추가로 정제하는 단계.
본 발명의 일 실시양태에서, 단백질, 예컨대 항체 (예를 들어, 항-IGF1R)를 생산하는 강화된 방법은 다음 단계들을 포함한다.
1 - 표준 초기 포유동물 성장 배지에서, 단백질을 발현하는 세포를 증식시키는 단계.
상기 증식은, 예를 들어 진탕 플라스크에서 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 대략 10 내지 30 주기 동안 대략 1-2 X 106개 세포/ml로의 성장, (예를 들어, 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 밀도로) 상기 세포의 샘플의 희석, 이어서 대략 1-2 X 106개 세포/ml로의 재성장을 통해 증식이 이루어진다.
2 - 초기 포유동물 세포 성장 배지에 증식된 세포를 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하고, 보충물을 배지에 첨가하는 단계. 보충물은 대두 및/또는 밀 가수분해물, 아미노산 공급물, 비타민/염 공급물, 영양소 공급물, 글루코스 및 L-글루타민이다.
접종일은 "0일차"이고, 그 다음날은 "1일차"이고, 그 다음날은 "2일차"이고, 이와 같이 계속된다.
대두 및/또는 밀 가수분해물을, 예를 들어 0일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 106개 세포/ml 초과에 도달한 후에 첨가한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 가수분해물(들)을 3일차에 간단히 첨가한다.
아미노산 공급물 (상기 논의됨)을, 예를 들어 하기 대략의 최종 배양물 농도 (초기 포유동물 세포 성장 배지와 같은 다른 공급원으로부터의 임의의 표시 성분의 농도 미포함)를 달성하도록, 예를 들어 0일차에 첨가한다.
성분 배양물 중의 최종 농도 (mg/리터)
L-아르기닌 126.4
L-시스틴 34
L-히스티딘 42
L-이소류신 52
L-류신 52
L-리신 72
L-메티오닌 15.2
L-페닐알라닌 33
L-트레오닌 47.6
L-트립토판 10.2
L-티로신 36
L-발린 46.8
L-알라닌 8.9
L-아스파라긴 30
L-아스파르트산 26.6
L-글루탐산 29.4
글리신 15
L-프롤린 23
L-세린 21
본 발명의 일 실시양태에서, 아미노산 공급물은 배지에 첨가하지 않는다.
비타민/염 공급물 용액 (상기 논의됨)을, 예를 들어 하기 대략의 최종 배양물 농도 (초기 포유동물 세포 성장 배지와 같은 다른 공급원으로부터의 임의의 표시 성분의 농도 미포함)를 달성하도록, 예를 들어 3일차 내지 5일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml에 도달할 때 첨가한다.
성분 최종 배양물 농도 (mg/리터)
아셀렌산나트륨 0.01426
아데닌 술페이트 1.632
아데노신 17.6
시티딘 17.6
구아노신 17.6
우리딘 17.6
히포크산틴 11.8
L-시트룰린 12.6
L-오르니틴-HCl 25.6
비오틴 0.28
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 0.05
엽산 4.6
리포산 0.52
니아신 31.4
피리독신 HCl 3
리보플라빈 1.86
티아민 HCl 16
비타민 E 0.376
비타민 B12 3.4
염화콜린 50.2
에탄올아민 HCl 4.4
i-이노시톨 73.2
티미딘 7.8
푸트레신 2HCl 0.4
프로게스테론 0.015
D-칼슘 판토테네이트 23.8
비타민/염 공급물의 일부 성분은 아미노산 공급물과 같은 다른 공급물 중에도 존재한다. 이러한 최종 배양물 농도는 비타민/염 공급물로부터의 성분들의 농도이며, 아미노산 공급물 및 비타민/염 공급물로부터의 표시 성분들의 누적 농도를 반영하지 않는다.
영양소 공급물 (상기 논의됨)을, 예를 들어 하기 대략의 최종 배양물 농도 (초기 포유동물 세포 성장 배지 또는 아미노산 공급물과 같은 다른 공급원으로부터의 임의의 표시 성분의 농도 미포함)를 달성하도록, 예를 들어 3일차 내지 5일차에 또는 생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml에 도달할 때 첨가한다.
성분 최종 배양물 농도 (mg/리터)
L-아스파라긴 812 mg/리터
L-프롤린 216 mg/리터
L-이소류신 370 mg/리터
L-시스테인-HCl 224 mg/리터
L-류신 332 mg/리터
L-트레오닌 164 mg/리터
L-티로신 198 mg/리터
L-아르기닌 186 mg/리터
L-아스파르트산 71 mg/리터
L-글루탐산 126 mg/리터
글리신 57 mg/리터
L-히스티딘 125 mg/리터
L-메티오닌 132 mg/리터
L-트립토판 99 mg/리터
L-리신 293 mg/리터
L-페닐알라닌 174 mg/리터
L-발린 262 mg/리터
L-세린 260 mg/리터
일염기성 인산나트륨 288.2 mg/리터
황산아연 1.08 mg/리터
황산제2구리 0.0032 mg/리터
암모늄 바나데이트 0.00078 mg/리터
염화코발트 0.0025 mg/리터
이염화니켈 육수화물 0.0004 mg/리터
몰리브덴산나트륨 탈수화물 0.00016 mg/리터
염화주석 탈수화물 0.00008 mg/리터
염화망간 사수화물 0.0003 mg/리터
영양소 공급물의 일부 성분은 아미노산 공급물과 같은 다른 공급물 중에도 존재한다. 이러한 최종 배양물 농도는 영양소 공급물로부터의 성분들의 농도이며, 아미노산 공급물 및 영양소 공급물로부터의 표시 성분들의 누적 농도를 반영하지 않는다.
글루코스는, 예를 들어 배양 배지 중의 글루코스 농도가 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어질 때 첨가하고, L-글루타민은, 예를 들어 배양 배지 중의 글루타민 농도가 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어질 때 첨가한다.
3 - 임의로, 예를 들어 생존율이 60％ 미만일 때, 배양 배지로부터 세포를 분리함으로써 (예를 들어, 세포의 온도를 대략 15℃로 낮추고, 나트륨-포스페이트 완충액을 첨가하여 pH를 대략 6.8에서 안정화시키고, 배양 배지를 원심분리하여 세포를 청정함으로써) 생산 세포 배양 배지로부터 세포를 수거하는 단계. 단백질이 분비되는 경우, 배지는 후속 공정을 위해 보존될 수 있고, 단백질이 분비되지 않는경우, 세포는 후속 공정을 위해 보존될 수 있다.
여러 방법 중 임의의 것을 이용하여, 예를 들어 원심분리 (예를 들어, 연속 디스크-적층 원심분리기 (예를 들어, 대략 9.27 X 10-7의 유속/시그마 (cm/sec))를 사용함)에 의해 배지로부터 세포를 분리할 수 있다.
또한, 예를 들어 원심분리기를 이용하거나 이용하지 않은 심층 여과에 의해 배지를 여과하여 세포를 분리할 수 있다. 예를 들어, 원심분리기를 이용하는 경우, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 방법은 8 ± 2 L 배양액/ft2 여과기 (예를 들어, 하전 셀룰로스 여과기)의 사용을 포함할 수 있고, 원심분리기를 이용하지 않는 경우, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 방법은 20 ± 3 L 배양액/ft2 여과기의 사용을 포함할 수 있다.
또한, 배지는, 예를 들어 0.2 마이크로미터 공극 크기를 갖는 미세 여과기 (예를 들어, PVDF 여과기)를 통해 여과될 수 있다.
4 - 임의로, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 단백질, 예를 들어 항체를 추가로 정제하는 단계.
임의로, 레벨 3 방법 또는 강화된 방법을 이용하는 경우, 배양물의 삼투질농도를 대략 400 mOsm 내지 대략 500 mOsm으로 이동시킨다 (상기 논의됨). 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 이동은 세포의 밀도가 1 X 106개 세포/ml 이상일 때 수행된다.
임의로, 레벨 3 방법 또는 강화된 방법을 이용하는 경우, 배양물의 온도를 대략 33℃ 내지 대략 35℃로 이동시킨다 (상기 논의됨). 본 발명의 일 실시양태에서, 상기 이동은 본 발명의 일 실시양태에서 4일차 내지 8일차에, 예를 들어 24시간에 걸친 생존 세포 밀도 변화가 10％ 미만일 때 수행된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 레벨 3 방법 또는 강화된 방법을 이용하는 경우, 세포 성장 동안 세포 배양물 O2 농도, pH 및 온도 조건을 연속적으로 모니터링 및 조정한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 세포 성장 동안 O2 농도를 모니터링하여 대략 60％에서 유지시키고/거나, 세포 성장 동안 pH를 연속적으로 모니터링하여 대략 6.8 (예를 들어, ± 0.02)에서 유지시키고/거나, 세포 성장 동안 온도를 연속적으로 모니터링하여 대략 36.5℃ (예를 들어, 약 ± 0.5℃)에서 유지시킨다.
세포 성장은 여러 시스템 중 임의의 것에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포 성장은 단순 플라스크, 예를 들어 유리 진탕 플라스크에서 수행될 수 있다. 다른 시스템에는 탱크 생물반응기, 백 생물반응기 및 1회용 생물반응기가 포함된다. 탱크 생물반응기에는 전형적으로, 세포가 액체 배지에서 성장하는 금속 용기 (예를 들어, 스테인레스 강 재킷 용기)가 포함된다. 탱크 생물반응기는 광범위한 배양물 부피 (예를 들어, 100 l, 150 l, 10000 l, 15000 l)를 위해 사용될 수 있다. 탱크 생물반응기는 종종, 세포 성장 조건의 제어를 위한 추가적인 특징부, 예를 들어 온도 제어, 배지 진탕, 살포 기체 농도의 제어, pH 제어, O2 농도 제어, 배지로부터 샘플 분리, 반응기 중량 표시 및 제어, 기기 세척, 기기 멸균, 모든 서비스를 전달하고, 배지를 첨가하고, pH를 제어하고, 용액을 제어하고, 기체를 제어하기 위한 파이프 또는 튜브의 설치, 멸균 유체를 성장 용기로 펌핑, 및 관리적 제어 및 데이타 수집을 위한 수단을 갖는다. 탱크 생물반응기의 분류에는, 반응기를 혼합하여 열 및 물질 (예컨대, 산소 및 기질)을 분배시키기 위한 기계적 교반기 (예를 들어, 임펠러)가 사용되는 교반 탱크 반응기가 포함된다. 기포탑 반응기는 오직 공기를 이용하여 내용물을 혼합하는 종장형 (tall) 반응기이다. 공기 부양식 반응기는 기포탑 반응기와 유사하나, 드래프트 튜브를 포함한다는 점에서 다르다. 드래프트 튜브는 전형적으로, 순환 및 산소 전달을 개선하고 반응기내 전단력을 균등화시키는 내부 튜브이다. 유동층 반응기의 경우, 세포는 유체와 함께 이동하는 작은 입자 상에 "고정"된다. 작은 입자는 세포가 점착되는 넓은 표면적을 생성하고, 산소 및 영양소가 세포에 높은 비율로 전달될 수 있게 한다. 충전층 반응기의 경우, 세포는 큰 입자 상에 고정된다. 이러한 입자는 액체와 함께 이동하지 않는다. 충전층 반응기는 구축 및 작동이 간단하나, 차단 및 불량한 산소 전달을 겪을 수 있다. 1회용 생물반응기는 1회용, 즉 1회 사용을 위한 생물반응기이다. 종종, 1회용 생물반응기는 비-1회용 생물반응기와 유사한 특징부 (예를 들어, 진탕 시스템, 살포기, 프로브, 포트 등)를 갖는다.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 임의의 액체 배양 배지, 예를 들어 대략 37℃로 미리 가온시킨 초기 포유동물 세포 성장 배지 (이 배지는 HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제를 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않음)에 항체 경쇄 면역글로불린 및 중쇄 면역글로불린을 발현하는 CHO DXB11 숙주 세포를 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하고, 상기 접종 전, 접종과 동시에 또는 접종 직후에 보충물, 즉 대두 가수분해물 (대략 10 g/리터의 최종 농도로) 및 임의로, 대략 이하에 개시된 농도의 성분들이 첨가되도록 하는 아미노산 공급물을 배지에 첨가하고,
L-아르기닌 126.4 mg/리터
L-시스틴 34 mg/리터
L-히스티딘 42 mg/리터
L-이소류신 52 mg/리터
L-류신 52 mg/리터
L-리신 72 mg/리터
L-메티오닌 15.2 mg/리터
L-페닐알라닌 33 mg/리터
L-트레오닌 47.6 mg/리터
L-트립토판 10.2 mg/리터
L-티로신 36 mg/리터
L-발린 46.8 mg/리터
L-알라닌 8.9 mg/리터
L-아스파라긴 30 mg/리터
L-아스파르트산 26.6 mg/리터
L-글루탐산 29.4 mg/리터
글리신 15 mg/리터
L-프롤린 23 mg/리터
L-세린 21 mg/리터
생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때, 대략 이하에 개시된 농도의 성분들이 첨가되도록 하는 보충 공급물을 첨가하고,
아셀렌산나트륨 0.01426 mg/리터
아데닌 술페이트 1.632 mg/리터
아데노신 17.6 mg/리터
시티딘 17.6 mg/리터
구아노신 17.6 mg/리터
우리딘 17.6 mg/리터
히포크산틴 11.8 mg/리터
L-시트룰린 12.6 mg/리터
L-오르니틴-HCl 25.6 mg/리터
비오틴 0.28 mg/리터
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 0.05 mg/리터
엽산 4.6 mg/리터
리포산 0.52 mg/리터
니아신 31.4 mg/리터
피리독신 HCl 3 mg/리터
리보플라빈 1.86 mg/리터
티아민 HCl 16 mg/리터
비타민 E 0.376 mg/리터
비타민 B12 3.4 mg/리터
염화콜린 50.2 mg/리터
에탄올아민 HCl 4.4 mg/리터
i-이노시톨 73.2 mg/리터
티미딘 7.8 mg/리터
푸트레신 2HCl 0.4 mg/리터
프로게스테론 0.015 mg/리터
D-칼슘 판토테네이트 23.8 mg/리터
L-아스파라긴 812 mg/리터
L-프롤린 216 mg/리터
L-이소류신 370 mg/리터
L-시스테인-HCl 224 mg/리터
L-류신 332 mg/리터
L-트레오닌 164 mg/리터
L-티로신 198 mg/리터
L-아르기닌 186 mg/리터
L-아스파르트산 71 mg/리터
L-글루탐산 126 mg/리터
글리신 57 mg/리터
L-히스티딘 125 mg/리터
L-메티오닌 132 mg/리터
L-트립토판 99 mg/리터
L-리신 293 mg/리터
L-페닐알라닌 174 mg/리터
L-발린 262 mg/리터
L-세린 260 mg/리터
일염기성 인산나트륨 288.2 mg/리터
황산아연 1.08 mg/리터
황산제2구리 0.0032 mg/리터
암모늄 바나데이트 0.00078 mg/리터
염화코발트 0.0025 mg/리터
이염화니켈 육수화물 0.0004 mg/리터
몰리브덴산나트륨 탈수화물 0.00016 mg/리터
세포 성장 동안, 글루코스 수준이 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어질 때 글루코스를 배지에 첨가하고, L-글루타민 수준이 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어질 때 L-글루타민을 첨가하고, 세포 성장 동안 O2 농도를 대략 60％에서, pH를 대략 6.8 ± 0.02에서, 온도를 대략 36.5℃ ± 0.5℃에서 유지시키는 방법에 의해 제조되며, 예를 들어 60％ 생존율에 도달한 세포를 포함하는 것인, 임의의 액체 배양 배지를 포함한다.
실시예
이하의 정보는 본 발명을 보다 명료하게 기술하기 위해 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 아래 기술된 모든 조성물 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범주 내에 있다.
실시예 1 : 레벨 3 방법 및 강화된 방법을 이용한 항-IGF1R의 발현
강화된 방법 및 레벨 3 방법을 이용한 수회의 시험을 수행하였다. 이들 시험에서는, 항-IGF1R LCF (카파) 및 HCA (감마-1) 쇄를 발현하는 CHO DXB11 세포를 성장시켰다. 보충물이 첨가된 초기 포유동물 세포 성장 배지는 EX-CELL ACF CHO 배지 (시그마-알드리치; 미국 미주리주 세인트 루이스)였다.
공급물의 첨가가 없는 (생산 과정 중 글루타민 및 글루코스는 제외) 일련의 유사 시험을 수행하였다. 이러한 조건 하에, 435 mg/L의 역가가 얻어졌다. 이 역가는 단백질 A에 특이적으로 부착된 생산 면역글로불린을 정량화함으로써 추정하였다. 이하의 레벨 3 방법 및 강화된 방법 시험에서 얻어진 역가는 역상 크로마토그래피 기질에 부착된 면역글로불린을 정량화함으로써 추정하였다. 공급물의 첨가가 없는 시험에서 대략 300 mg/L의 추정 역가가 얻어졌고, 이때 역상 정량화 방법이 이용되었다.
공급물의 첨가가 없는 시험에서 얻어진 역가에 비해, 레벨 3 방법 및 강화된 방법 (하기 논의됨)은 매우 우수한 역가를 생성한다.
강화된 방법
세포를, 37℃로 미리 가온시키고 pH 6.8로 조정한 EX-CELL ACF CHO 배지 (시그마-알드리치; 미국 미주리주 세인트 루이스)에 3-4 X 105개 세포/ml로 초기 접종하였다.
강화된 방법 시험을 위해 첨가된 공급물
뱃치 첨가된
공급물		 첨가된
시간대		 부피 비율
(공급물 부피/뱃치 부피)		 생산 과정 중 온도
하향이동
1 SHYS 공급물
CHO 공급물 1
CHO 공급물 2		 0일차
3일차
3일차		 0.05
0.02
0.02		 있음: 6일차,
37℃→34℃
2 SHYS 공급물
CHO 공급물 1
CHO 공급물 2		 0일차
3일차
3일차		 0.05
0.02
0.02		 있음: 6일차,
37℃→34℃
3 HYS 공급물
CHO 공급물 1
CHO 공급물 2		 0일차
3일차
3일차		 0.05
0.02
0.02		 있음: 6일차,
37℃→34℃
4 HYS 공급물
CHO 공급물 1
CHO 공급물 2		 0일차
3일차
3일차		 0.05
0.02
0.02		 있음: 6일차,
37℃→34℃
5 SHYS 공급물
50X 아미노산 공급물
100X 아미노산 공급물
CHO 공급물 1
CHO 공급물 2		 0일차
0일차
0일차
3일차
3일차		 0.05
0.02
0.01
0.02
0.02		 없음
SHYS 공급물: 200 g/L (수성) 대두 가수분해물 공급물 (DMV 인터내셔널 (DMV International, 네덜란드))
Hys 공급물: 200 g/L (수성) 대두 가수분해물 공급물 (케리 바이오사이언시스 (Kerry Biosciences))
CHO 공급물 1: 5OX 비타민/염 공급물
CHO 공급물 2: 5OX 영양소 공급물
5OX 아미노산 공급물
100X 아미노산 공급물
pH를 연속적으로 모니터링하여 6.8의 설정값으로 조정하였음.
산소 농도를 연속적으로 모니터링하여 60％의 설정값으로 조정하였음.
온도를 연속적으로 모니터링하여 37±1℃에서 유지시켰음. 34℃로의 생산 과정 중 온도 하향이동은 표시된 뱃치에서 수행하였음.
글루코스를, 예를 들어 배양 배지 중의 글루코스 농도가 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어졌을 때 첨가하였고, L-글루타민을, 예를 들어 배양 배지 중의 글루타민 농도가 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어졌을 때 첨가하였다. 영양소 공급물을 첨가하여 삼투질농도를 400 mOsm 초과로 이동시켰다. 21일차 내지 24일차에 세포를 수거하되, 뱃치 3 및 4의 경우에는 조기에 (14일차 내지 18일차) 수거하였다 (일반적으로, 세포 생존율이 대략 60％로 감소되었을 때).
강화된 방법 시험의 결과
뱃치 역가 비생산성
1 2.2 26
2 2.3 27
3* 1.9 30
4* 1.6 33
5 2.2 26
* 단축된 배치 시험
강화된 방법에서 영양소 공급물이 사용된 경우에는 아미노산 공급물의 첨가가 생략될 수 있다.
레벨 3 방법
세포를, 37℃로 미리 가온시키고 pH 6.8로 조정한 EX-CELL ACF CHO 배지 (시그마-알드리치; 미국 미주리주 세인트 루이스)에 3-4 X 105개 세포/ml로 초기 접종하였다.
레벨 3 방법을 위해 첨가된 공급물
뱃치 첨가된
공급물		 첨가된
시간대		 부피 비율
(공급물 부피/뱃치 부피)		 생산 과정 중 온도
하향이동
A SHYS 공급물
50X 아미노산 공급물
100X 아미노산 공급물
CHO 공급물 1		 0일차
0일차
0일차
3일차		 0.05
0.02
0.01
0.02		 없음
B SHYS 공급물
50X 아미노산 공급물
100X 아미노산 공급물
CHO 공급물 1		 0일차
0일차
0일차
3일차		 0.05
0.02
0.01
0.02		 없음
SHYS 공급물: 200 g/L (수성) 대두 가수분해물 공급물 (DMV 인터내셔널 (네덜란드))
CHO 공급물 1: 5OX 비타민/염 공급물
5OX 아미노산 공급물
100X 아미노산 공급물
pH를 연속적으로 모니터링하여 6.8±0.02에서 유지시켰음.
산소 농도를 연속적으로 모니터링하여 60％의 설정값으로 조정하였음.
온도를 연속적으로 모니터링하여 36.5±0.5℃에서 유지시켰음.
글루코스를, 예를 들어 배양 배지 중의 글루코스 농도가 대략 1.5 g/리터 미만으로 떨어졌을 때 첨가하였고, L-글루타민을, 예를 들어 배양 배지 중의 글루타민 농도가 대략 150 mg/리터 미만으로 떨어졌을 때 첨가하였다.
레벨 3 방법 시험의 결과
뱃치 역가 (g/L) 비생산성
A 1.4 19
B 1.2 22
사용된 공급물 및 각 공급물의 성분들의 최종 농도는 아래 기재되어 있다.
비타민/염 공급물
성분 공급물 중의 농도
(g/L)		 배양물 중의 최종 농도
(mg/L)
아셀렌산나트륨 7.13 X 10-4 0.01426
아데닌 술페이트 0.0816 1.632
아데노신 0.88 17.6
시티딘 0.88 17.6
구아노신 0.88 17.6
우리딘 0.88 17.6
히포크산틴 0.59 11.8
L-시트룰린 0.63 12.6
L-오르니틴-HCl 1.28 25.6
비오틴 0.014 0.28
플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 0.0025 0.05
엽산 0.23 4.6
리포산 0.026 0.52
니아신 1.57 31.4
피리독신 HCl 0.15 3
리보플라빈 0.093 1.86
티아민 HCl 0.8 16
비타민 E 0.0188 0.376
비타민 B12 0.17 3.4
염화콜린 2.51 50.2
에탄올아민 HCl 0.22 4.4
i-이노시톨 3.66 73.2
티미딘 0.39 7.8
푸트레신 2HCl 0.02 0.4
프로게스테론 0.00075 0.015
D-칼슘 판토테네이트 1.19 23.8
아미노산 공급물 #1 (50X)
성분 공급물 중의 농도
(g/L)		 배양물 중의 최종 농도
(mg/L)
L-아르기닌 6.32 126.4
L-시스틴 1.7 34
L-히스티딘 2.1 42
L-이소류신 2.6 52
L-류신 2.6 52
L-리신 3.6 72
L-메티오닌 0.76 15.2
L-페닐알라닌 1.65 33
L-트레오닌 2.38 47.6
L-트립토판 0.51 10.2
L-티로신 1.8 36
L-발린 2.34 46.8
아미노산 공급물 #2 (100X)
성분 공급물 중의 농도
(g/L)		 배양물 중의 최종 농도
(mg/L)
L-알라닌 0.89 8.9
L-아스파라긴 1.5 30
L-아스파르트산 1.33 26.6
L-글루탐산 1.47 29.4
글리신 0.75 15
L-프롤린 1.15 23
L-세린 1.05 21
영양소 공급물
성분 공급물 중의 농도
(g/L)		 배양물 중의 최종 농도
(mg/L)
L-아스파라긴 40.6 812
L-세린 13 260
L-프롤린 10.81 216
L-이소류신 18.53 370
L-시스테인-HCl 11.19 224
L-류신 16.58 332
L-트레오닌 8.2 164
L-티로신 9.9 198
L-아르기닌 9.29 186
L-아스파르트산 3.56 71
L-글루탐산 6.28 126
글리신 2.83 57
L-히스티딘 6.23 125
L-메티오닌 6.58 132
L-트립토판 4.93 99
L-리신 14.66 293
L-페닐알라닌 8.64 174
L-발린 13.08 262
일염기성 인산나트륨 14.41 288.2
황산아연 0.054 1.08
황산제2구리 0.00016 0.0032
암모늄 바나데이트 0.000039 0.00078
염화코발트 0.000125 0.0025
이염화니켈 육수화물 0.00002 0.0004
몰리브덴산나트륨 탈수화물 0.000008 0.00016
염화주석 탈수화물 0.000004 0.00008
염화망간 사수화물 0.000015 0.0003
***************************
본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 그 범주가 제한되지는 않는다. 실제로, 본 발명의 범주는 본원에 구체적으로 기술된 실시양태 및 본원에 구체적으로 기술되지 않은 다른 실시양태를 포함하며, 본원에 구체적으로 기술된 실시양태가 반드시 그 전부인 것은 아니다. 본원에 기재된 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 특허청구범위의 범주 내에 있다.
본원 전체에 걸쳐 인용된 특허, 특허 출원, 출판물, 제품 설명 및 프로토콜의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체내용이 본원에 포함된다.
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 9 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Gly Tyr Val 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Arg Ile Gly Val Ala Ala Ser Tyr Tyr 115 120 125 Phe Gly Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ile Arg Ile Gly Val Ala Ala Ser Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 13 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Val Leu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Met Pro Val Ala Gly Pro Gly Tyr Phe 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser 145 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Gly Met Pro Val Ala Gly Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 21 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Cys Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr 130 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 25 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 26 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Cys 85 90 95 Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (38)

  1. 초기 포유동물 세포 성장 배지에 단백질을 발현하는 숙주 세포를 접종하는 단계, 및 이 배지에
    글루코스;
    L-글루타민;
    대두 가수분해물 또는 밀 가수분해물 또는 둘 모두;
    아데닌 술페이트;
    아데노신;
    암모늄 바나데이트;
    비오틴;
    염화콜린;
    염화코발트;
    황산제2구리;
    시티딘;
    D-칼슘 판토테네이트;
    에탄올아민 HCl;
    플라빈 아데닌 디뉴클레오티드;
    엽산;
    글리신;
    구아노신;
    히포크산틴;
    i-이노시톨;
    L-알라닌;
    L-아르기닌;
    L-아스파라긴;
    L-아스파르트산;
    L-시트룰린;
    L-시스테인-HCl;
    L-시스틴;
    L-글루탐산;
    L-히스티딘;
    리포산;
    L-이소류신;
    L-류신;
    L-리신;
    L-메티오닌;
    L-오르니틴-HCl;
    L-페닐알라닌;
    L-프롤린;
    L-세린;
    L-트레오닌;
    L-트립토판;
    L-티로신;
    L-발린;
    염화망간 사수화물;
    니아신;
    이염화니켈 육수화물;
    프로게스테론;
    푸트레신 2HCl;
    피리독신 HCl;
    리보플라빈;
    몰리브덴산나트륨 탈수화물;
    일염기성 인산나트륨;
    아셀렌산나트륨;
    티아민 HCl;
    티미딘;
    염화주석 탈수화물;
    우리딘;
    비타민 B12;
    비타민 E; 및
    황산아연
    을 포함하는 보충물을 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 보충물로부터 배지로 첨가되는 성분의 최종 농도가 대략 이하에 개시된 농도인 방법:
    아데닌 술페이트: 1.632 mg/리터
    아데노신: 17.6 mg/리터
    암모늄 바나데이트: 0.00078 mg/리터
    비오틴: 0.28 mg/리터
    염화콜린: 50.2 mg/리터
    염화코발트: 0.0025 mg/리터
    황산제2구리: 0.0032 mg/리터
    시티딘: 17.6 mg/리터
    D-칼슘 판토테네이트: 23.8 mg/리터
    에탄올아민 HCl: 4.4 mg/리터
    플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.05 mg/리터
    엽산: 4.6 mg/리터
    글리신: 72 mg/리터
    구아노신: 17.6 mg/리터
    히포크산틴: 11.8 mg/리터
    i-이노시톨: 73.2 mg/리터
    L-알라닌: 8.9 mg/리터
    L-아르기닌: 312.4 mg/리터
    L-아스파라긴: 842 mg/리터
    L-아스파르트산: 97.6 mg/리터
    L-시트룰린: 12.6 mg/리터
    L-시스테인-HCl: 224 mg/리터
    L-시스틴: 34 mg/리터
    L-글루탐산: 155.4 mg/리터
    L-히스티딘: 167 mg/리터
    리포산: 0.52 mg/리터
    L-이소류신: 422 mg/리터
    L-류신: 384 mg/리터
    L-리신: 365 mg/리터
    L-메티오닌: 147.2 mg/리터
    L-오르니틴-HCl: 25.6 mg/리터
    L-페닐알라닌: 207 mg/리터
    L-프롤린: 239 mg/리터
    L-세린: 281 mg/리터
    L-트레오닌: 211.6 mg/리터
    L-트립토판: 109.2 mg/리터
    L-티로신: 234 mg/리터
    L-발린: 308.8 mg/리터
    염화망간 사수화물: 0.0003 mg/리터
    니아신: 31.4 mg/리터
    이염화니켈 육수화물: 0.0004 mg/리터
    프로게스테론: 0.015 mg/리터
    푸트레신 2HCl: 0.4 mg/리터
    피리독신 HCl: 3 mg/리터
    리보플라빈: 1.86 mg/리터
    몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.00016 mg/리터
    일염기성 인산나트륨: 288.2 mg/리터
    아셀렌산나트륨: 0.01426 mg/리터
    티아민 HCl: 16 mg/리터
    티미딘: 7.8 mg/리터
    염화주석 탈수화물: 0.00008 mg/리터
    우리딘: 17.6 mg/리터
    비타민 B12: 3.4 mg/리터
    비타민 E: 0.376 mg/리터
    황산아연: 1.08 mg/리터
    글루코스: 1.5 g/리터
    L-글루타민: 150 mg/리터.
  3. 제1항에 있어서, 보충물이 대략 이하의 농도의 아미노산을 포함하는 아미노산 공급물로부터 첨가되는 것인 방법:
    L-아르기닌: 6.32 g/리터
    L-시스틴: 1.7 g/리터
    L-히스티딘: 2.1 g/리터
    L-이소류신: 2.6 g/리터
    L-류신: 2.6 g/리터
    L-리신: 3.6 g/리터
    L-메티오닌: 0.76 g/리터
    L-페닐알라닌: 1.65 g/리터
    L-트레오닌: 2.38 g/리터
    L-트립토판: 0.51 g/리터
    L-티로신: 1.8 g/리터
    L-발린: 2.34 g/리터.
  4. 제3항에 있어서, 배양 배지 1 리터당 대략 20 ml의 아미노산 공급물이 첨가되는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 보충물이 대략 이하의 농도의 아미노산을 포함하는 아미노산 공급물로부터 첨가되는 것인 방법:
    L-알라닌: 0.89 g/리터
    L-아스파라긴: 1.5 g/리터
    L-아스파르트산: 1.33 g/리터
    L-글루탐산: 1.47 g/리터
    글리신: 0.75 g/리터
    L-프롤린: 1.15 g/리터
    L-세린: 1.05 g/리터.
  6. 제5항에 있어서, 배양 배지 1 리터당 대략 10 ml의 아미노산 공급물이 첨가되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 보충물이 대략 이하의 농도의 보충물을 포함하는 영양소 공급물로부터 첨가되는 것인 방법:
    L-아스파라긴: 40.6 g/리터
    L-프롤린: 10.81 g/리터
    L-이소류신: 18.53 g/리터
    L-시스테인-HCl: 11.19 g/리터
    L-류신: 16.58 g/리터
    L-트레오닌: 8.2 g/리터
    L-티로신: 9.9 g/리터
    L-아르기닌: 9.29 g/리터
    L-아스파르트산: 3.56 g/리터
    L-글루탐산: 6.28 g/리터
    글리신: 2.83 g/리터
    L-히스티딘: 6.23 g/리터
    L-메티오닌: 6.58 g/리터
    L-트립토판: 4.93 g/리터
    L-리신: 14.66 g/리터
    L-페닐알라닌: 8.64 g/리터
    L-발린: 13.08 g/리터
    L-세린: 13 g/리터
    일염기성 인산나트륨: 14.41 g/리터
    황산아연: 0.054 g/리터
    황산제2구리: 0.00016 g/리터
    암모늄 바나데이트: 0.000039 g/리터
    염화코발트: 0.000125 g/리터
    이염화니켈 육수화물: 0.00002 g/리터
    몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.000008 g/리터
    염화주석 탈수화물: 0.000004 g/리터
    염화망간 사수화물: 0.000015 g/리터.
  8. 제7항에 있어서, 배양 배지 1 리터당 대략 20 ml의 영양소 공급물이 첨가되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 보충물이 대략 이하의 농도의 보충물을 포함하는 비타민/염 공급물로부터 첨가되는 것인 방법:
    아셀렌산나트륨: 7.13 X 10-4 g/리터
    아데닌 술페이트: 0.0816 g/리터
    아데노신: 0.88 g/리터
    시티딘: 0.88 g/리터
    구아노신: 0.88 g/리터
    우리딘: 0.88 g/리터
    히포크산틴: 0.59 g/리터
    L-시트룰린: 0.63 g/리터
    L-오르니틴-HCl: 1.28 g/리터
    비오틴: 0.014 g/리터
    플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.0025 g/리터
    엽산: 0.23 g/리터
    리포산: 0.026 g/리터
    니아신: 1.57 g/리터
    피리독신 HCl: 0.15 g/리터
    리보플라빈: 0.093 g/리터
    티아민 HCl: 0.8 g/리터
    비타민 E: 0.0188 g/리터
    비타민 B12: 0.17 g/리터
    염화콜린: 2.51 g/리터
    에탄올아민 HCl: 0.22 g/리터
    i-이노시톨: 3.66 g/리터
    티미딘: 0.39 g/리터
    푸트레신 2HCl: 0.02 g/리터
    프로게스테론: 0.00075 g/리터
    D-칼슘 판토테네이트: 1.19 g/리터.
  10. 제9항에 있어서, 배양 배지 1 리터당 대략 20 ml의 비타민/염 공급물이 첨가되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 숙주 세포로부터 배지를 수거하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 단백질은 상기 세포로부터 배지 내로 분비되는 것인 방법.
  12. 제13항에 있어서, 세포의 생존율이 대략 60% 미만일 때 숙주 세포로부터 배양 배지를 수거하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 배지를 원심분리하고/거나 배지를 심층 여과 (depth filtering)하고/거나 배지를 0.2 마이크로미터 여과기로 여과함으로써 세포로부터 배양 배지를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단백질이 항체 또는 그의 항원-결합성 단편의 하나 이상의 면역글로불린 쇄인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항체 또는 단편이 IGF1R에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항체 또는 단편이 서열 1, 3, -6, 13, 21 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 개시된 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄; 및/또는 서열 2, 7-9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 숙주 세포로부터 분비된 항체 또는 단편이 서열 3, 4, 5, 또는 6의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 면역글로불린; 및 서열 8 또는 9의 아미노산 20 내지 137을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 경쇄 면역글로불린이 카파 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있고, 중쇄 면역글로불린이 감마-1 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 보충물이 첨가되는 초기 포유동물 세포 성장 배지가 HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제를 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는 것인 방법.
  20. HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제는 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는, 대략 37℃로 미리 가온된 초기 포유동물 세포 성장 배지에 항체 경쇄 면역글로불린 및 중쇄 면역글로불린을 발현하는 CHO DXB11 숙주 세포를, 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하는 단계; 상기 접종 전, 그와 동시 또는 그 직후에 상기 배지에 이하의 보충물을 첨가하는 단계:
    대략 10 g/리터의 최종 농도로의 대두 가수분해물; 및
    임의로, 대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 아미노산 공급물:
    L-아르기닌: 126.4 mg/리터
    L-시스틴: 34 mg/리터
    L-히스티딘: 42 mg/리터
    L-이소류신: 52 mg/리터
    L-류신: 52 mg/리터
    L-리신: 72 mg/리터
    L-메티오닌: 15.2 mg/리터
    L-페닐알라닌: 33 mg/리터
    L-트레오닌: 47.6 mg/리터
    L-트립토판: 10.2 mg/리터
    L-티로신: 36 mg/리터
    L-발린: 46.8 mg/리터
    L-알라닌: 8.9 mg/리터
    L-아스파라긴: 30 mg/리터
    L-아스파르트산: 26.6 mg/리터
    L-글루탐산: 29.4 mg/리터
    글리신: 15 mg/리터
    L-프롤린: 23 mg/리터
    L-세린: 21 mg/리터;
    생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때, 대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 보충 공급물을 첨가하는 단계:
    아셀렌산나트륨: 0.01426 mg/리터
    아데닌 술페이트: 1.632 mg/리터
    아데노신: 17.6 mg/리터
    시티딘: 17.6 mg/리터
    구아노신: 17.6 mg/리터
    우리딘: 17.6 mg/리터
    히포크산틴: 11.8 mg/리터
    L-시트룰린: 12.6 mg/리터
    L-오르니틴-HCl: 25.6 mg/리터
    비오틴: 0.28 mg/리터
    플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.05 mg/리터
    엽산: 4.6 mg/리터
    리포산: 0.52 mg/리터
    니아신: 31.4 mg/리터
    피리독신 HCl: 3 mg/리터
    리보플라빈: 1.86 mg/리터
    티아민 HCl: 16 mg/리터
    비타민 E: 0.376 mg/리터
    비타민 B12: 3.4 mg/리터
    염화콜린: 50.2 mg/리터
    에탄올아민 HCl: 4.4 mg/리터
    i-이노시톨: 73.2 mg/리터
    티미딘: 7.8 mg/리터
    푸트레신 2HCl: 0.4 mg/리터
    프로게스테론: 0.015 mg/리터
    D-칼슘 판토테네이트: 23.8 mg/리터
    L-아스파라긴: 812 mg/리터
    L-프롤린: 216 mg/리터
    L-이소류신: 370 mg/리터
    L-시스테인-HCl: 224 mg/리터
    L-류신: 332 mg/리터
    L-트레오닌: 164 mg/리터
    L-티로신: 198 mg/리터
    L-아르기닌: 186 mg/리터
    L-아스파르트산: 71 mg/리터
    L-글루탐산: 126 mg/리터
    글리신: 57 mg/리터
    L-히스티딘: 125 mg/리터
    L-메티오닌: 132 mg/리터
    L-트립토판: 99 mg/리터
    L-리신: 293 mg/리터
    L-페닐알라닌: 174 mg/리터
    L-발린: 262 mg/리터
    L-세린: 260 mg/리터
    일염기성 인산나트륨: 288.2 mg/리터
    황산아연: 1.08 mg/리터
    황산제2구리: 0.0032 mg/리터
    암모늄 바나데이트: 0.00078 mg/리터
    염화코발트: 0.0025 mg/리터
    이염화니켈 육수화물: 0.0004 mg/리터
    몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.00016 mg/리터;
    배지 내 글루코스 농도를 대략 1.5 g/리터로 유지시키고, 배지 내 L-글루타민 농도를 대략 150 mg/리터로 유지시키는 단계; 세포 성장 동안 O2 농도를 대략 60%로, pH를 대략 6.8 ± 0.02로 및 온도를 대략 36.5℃ ± 0.5℃로 유지시키는 단계; 및, 임의로, 세포 생존율이 대략 60% 미만일 때 배지로부터 숙주 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 항체의 생산 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항체가 서열 1, 3, -6, 13, 21 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 개시된 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄; 및/또는 서열 2, 7-9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항체 또는 단편이 서열 3, 4, 5, 또는 6의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 면역글로불린, 및 서열 8 또는 9의 아미노산 20 내지 137을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함하는, 숙주 세포로부터 분비된 항체를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 경쇄 면역글로불린은 카파 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있고, 중쇄 면역글로불린은 감마-1 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 배지를 디스크-적층 (disk-stack) 원심분리하고, 배지를 심층 여과하고, 배지를 대략 0.2 마이크로미터 공극 크기의 여과기로 여과함으로써 세포로부터 배양 배지를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 컬럼 크로마토그래피 분획법에 의해 배지로부터 면역글로불린을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 대략 10 g/리터의 대두 가수분해물,
    대략 1.5 g/리터의 글루코스,
    대략 150 mg/리터의 L-글루타민,
    대략 6.8 ± 0.02의 pH,
    HEPES,
    중탄산나트륨 완충액,
    무기 염,
    비-필수 아미노산,
    재조합 인간 인슐린,
    미량 원소,
    계면활성제,
    대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 아미노산 공급물:
    L-아르기닌: 126.4 mg/리터
    L-시스틴: 34 mg/리터
    L-히스티딘: 42 mg/리터
    L-이소류신: 52 mg/리터
    L-류신: 52 mg/리터
    L-리신: 72 mg/리터
    L-메티오닌: 15.2 mg/리터
    L-페닐알라닌: 33 mg/리터
    L-트레오닌: 47.6 mg/리터
    L-트립토판: 10.2 mg/리터
    L-티로신: 36 mg/리터
    L-발린: 46.8 mg/리터
    L-알라닌: 8.9 mg/리터
    L-아스파라긴: 30 mg/리터
    L-아스파르트산: 26.6 mg/리터
    L-글루탐산: 29.4 mg/리터
    글리신: 15 mg/리터
    L-프롤린: 23 mg/리터
    L-세린: 21 mg/리터;
    을 포함하고, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는, 수성 액체 세포 배양 배지.
  27. HEPES, 중탄산나트륨 완충액, 무기 염, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 인슐린, 미량 원소 및 계면활성제를 포함하되, L-글루타민, 항생제, 항진균제 또는 동물-유래 성분은 포함하지 않는, 대략 37℃로 미리 가온된 초기 포유동물 세포 성장 배지에 항체 경쇄 면역글로불린 및 중쇄 면역글로불린을 발현하는 CHO DXB11 숙주 세포를, 대략 2.5-5 X 105개 세포/ml의 세포 밀도로 접종하는 단계; 상기 접종 전, 그와 동시 또는 그 직후에, 상기 배지에 이하의 보충물을 첨가하는 단계:
    대략 10 g/리터의 최종 농도로의 대두 가수분해물; 및
    임의로, 대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 아미노산 공급물:
    L-아르기닌: 126.4 mg/리터
    L-시스틴: 34 mg/리터
    L-히스티딘: 42 mg/리터
    L-이소류신: 52 mg/리터
    L-류신: 52 mg/리터
    L-리신: 72 mg/리터
    L-메티오닌: 15.2 mg/리터
    L-페닐알라닌: 33 mg/리터
    L-트레오닌: 47.6 mg/리터
    L-트립토판: 10.2 mg/리터
    L-티로신: 36 mg/리터
    L-발린: 46.8 mg/리터
    L-알라닌: 8.9 mg/리터
    L-아스파라긴: 30 mg/리터
    L-아스파르트산: 26.6 mg/리터
    L-글루탐산: 29.4 mg/리터
    글리신: 15 mg/리터
    L-프롤린: 23 mg/리터
    L-세린: 21 mg/리터;
    생존 세포 밀도가 대략 1.2 X 106개 세포/ml 초과에 도달할 때, 대략 이하에 개시된 농도의 성분이 첨가되도록 하는 보충 공급물을 첨가하는 단계:
    아셀렌산나트륨: 0.01426 mg/리터
    아데닌 술페이트: 1.632 mg/리터
    아데노신: 17.6 mg/리터
    시티딘: 17.6 mg/리터
    구아노신: 17.6 mg/리터
    우리딘: 17.6 mg/리터
    히포크산틴: 11.8 mg/리터
    L-시트룰린: 12.6 mg/리터
    L-오르니틴-HCl: 25.6 mg/리터
    비오틴: 0.28 mg/리터
    플라빈 아데닌 디뉴클레오티드: 0.05 mg/리터
    엽산: 4.6 mg/리터
    리포산: 0.52 mg/리터
    니아신: 31.4 mg/리터
    피리독신 HCl: 3 mg/리터
    리보플라빈: 1.86 mg/리터
    티아민 HCl: 16 mg/리터
    비타민 E: 0.376 mg/리터
    비타민 B12: 3.4 mg/리터
    염화콜린: 50.2 mg/리터
    에탄올아민 HCl: 4.4 mg/리터
    i-이노시톨: 73.2 mg/리터
    티미딘: 7.8 mg/리터
    푸트레신 2HCl: 0.4 mg/리터
    프로게스테론: 0.015 mg/리터
    D-칼슘 판토테네이트: 23.8 mg/리터
    L-아스파라긴: 812 mg/리터
    L-프롤린: 216 mg/리터
    L-이소류신: 370 mg/리터
    L-시스테인-HCl: 224 mg/리터
    L-류신: 332 mg/리터
    L-트레오닌: 164 mg/리터
    L-티로신: 198 mg/리터
    L-아르기닌: 186 mg/리터
    L-아스파르트산: 71 mg/리터
    L-글루탐산: 126 mg/리터
    글리신: 57 mg/리터
    L-히스티딘: 125 mg/리터
    L-메티오닌: 132 mg/리터
    L-트립토판: 99 mg/리터
    L-리신: 293 mg/리터
    L-페닐알라닌: 174 mg/리터
    L-발린: 262 mg/리터
    L-세린: 260 mg/리터
    일염기성 인산나트륨: 288.2 mg/리터
    황산아연: 1.08 mg/리터
    황산제2구리: 0.0032 mg/리터
    암모늄 바나데이트: 0.00078 mg/리터
    염화코발트: 0.0025 mg/리터
    이염화니켈 육수화물: 0.0004 mg/리터
    몰리브덴산나트륨 탈수화물: 0.00016 mg/리터;
    배지 내 글루코스 농도를 대략 1.5 g/리터로 유지시키고, 배지 내 L-글루타민 농도를 대략 150 mg/리터로 유지시키는 단계; 및, 세포 성장 동안 O2 농도를 대략 60%로, pH를 대략 6.8 ± 0.02로 및 온도를 대략 36.5℃ ± 0.5℃로 유지시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 수성 액체 배양 배지.
  28. 제27항에 있어서, 숙주 세포가 상기 항체의 면역글로불린을 코딩하는 벡터를 포함하고, 여기서 항체는 배지 내로 분비되는 것인 수성 액체 배양 배지.
  29. 제28항에 있어서, 숙주 세포 생존율이 대략 60% 이하이고/거나 숙주 세포 성장이 대략 14일 내지 24일 동안 진행된 것인 수성 액체 배양 배지.
  30. 제29항에 있어서, 숙주 세포가 배지로부터 제거되는 것인 수성 액체 배양 배지.
  31. 제30항에 있어서, 배지를 원심분리하고/거나 배지를 심층 여과하고/거나 배지를 0.2 마이크로미터 여과기로 여과함으로써 숙주 세포가 배지로부터 제거되는 것인, 수성 액체 배양 배지.
  32. 제31항에 있어서, 항체가 IGF1R에 특이적으로 결합하는 것인 수성 액체 배양 배지.
  33. 제32항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 1, 3,-6, 13, 21 및 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원에 개시된 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 2, 7-9, 17 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 그의 성숙 단편 또는 그로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 것인 수성 액체 배양 배지.
  34. 제33항에 있어서, 항체 또는 단편이 서열 3, 4, 5, 또는 6의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 면역글로불린 및 서열 8 또는 9의 아미노산 20 내지 137을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함하는, 숙주 세포로부터 분비된 항체인, 수성 액체 배양 배지.
  35. 제34항에 있어서, 경쇄 면역글로불린이 카파 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있고, 중쇄 면역글로불린이 감마-1 불변 면역글로불린 쇄에 연결되어 있는 것인 수성 액체 배양 배지.
  36. 제27항의 수성 액체 배양 배지를 포함하는 용기.
  37. 제36항에 있어서, 플라스크, 생물반응기, 탱크 (tank) 생물반응기, 백 (bag) 생물반응기 또는 1회용 생물반응기인 용기.
  38. 제37항에 있어서, 생물반응기가 교반 탱크 생물반응기, 기포탑 (bubble column) 생물반응기, 공기 부양식 (air lift) 생물반응기, 유동층 생물반응기 또는 충전층 (packed bed) 생물반응기인 용기.
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