MX2011003241A

MX2011003241A - Produccion de anticuerpos con alto titulo.

Info

Publication number: MX2011003241A
Application number: MX2011003241A
Authority: MX
Inventors: Rajesh Krishnan; Dennis Rendeiro; Sandeepa Sandadi
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-24
Publication date: 2011-04-21
Also published as: CA2737580A1; CN102224239A; BRPI0919034A8; JP2012503487A; CO6351809A2; IL211639A0; US20110229933A1; WO2010036767A1; EP2342318A1; AU2009296708A1; RU2011116319A; KR20110060911A; BRPI0919034A2; NZ591651A

Abstract

La presente invención proporciona, en parte, métodos para expresar proteínas de manera recombinante a un nivel alto, junto con el medio de cultivo celular para hacer lo mismo.

Description

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS CON ALTO TÍTULO Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. no. 61/100,450; presentada en Septiembre 26 del 2008, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, generalmente, con un método para producir grandes cantidades de una proteína, tales como un anticuerpo, en un cultivo celular; junto con el cultivo celular mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cultivo de células para la producción comercial de proteínas terapéuticas es un proceso costoso. El equipo requerido es caro y los costos de investigación y desarrollo y producción son altos. El desarrollo de procesos para el cultivo celular que maximicen la cantidad de la proteína terapéutica producida por litro de cultivo celular, reduciría al mínimo los recursos necesarios para producir una cantidad dada de la proteína. Por lo tanto, es deseable utilizar procesos comercialmente viables que produzcan grandes cantidades de proteínas.

Muchas proteínas naturales no producen grandes cantidades de proteínas deseadas, bajo condiciones de cultivo estándar. En su lugar, debe realizarse la investigación y desarrollo de los procesos del cultivo celular, que induzcan a las células en cultivo a generar grandes cantidades de la proteína terapéutica. Típicamente, la identificación de las condiciones óptimas del cultivo celular es difícil y requiere una cantidad significativa de aporte inventivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona, generalmente, métodos y composiciones para generar altas cantidades de proteína de células en cultivo, mediante el uso de varios suplementos del cultivo y otras alteraciones a las condiciones del cultivo.

La presente invención proporciona un método para producir una proteína, que comprende inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial con células hospederas que expresan la proteína, y agregar suplementos que comprenden aquéllos expuestos a continuación, opcionalmente a las concentraciones indicadas aproximadas (no incluyendo la cantidad de cada componente de otras fuentes, tales como el medio de cultivo de células de mamífero inicial): Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Glicina: 72 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-arginina: 312.4 mg/litro L-asparagina: 842 mg/litro Ácido L-aspártico: 97.6 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro Ácido L-glutámico: 155.4 mg/litro L-histidina: 167 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro L-isoleucina: 422 mg/litro L-leucina: 384 mg/litro L-lisina: 365 mg/litro L-metionina: 147.2 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro L-fenilalanina: 207 mg/litro L-prolina: 239 mg/litro L-serina: 281 mg/litro L-treonina: 211.6 mg/litro L-triptófano: 109.2 mg/litro L-tirosina: 234 mg/litro L-valina: 308.8 mg/litro Tetrahidrato de cloruro de manganeso: 0.0003 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Dihidrato de cloruro de estaño: 0.00008 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Glucosa: 1.5 g/litro L-glutamina: 50 mg/litro En una modalidad de la invención, algunos suplementos se agregan de una solución madre de alimentación de aminoácidos (por ejemplo, una solución madre 50X), que comprende aminoácidos a aproximadamente las siguientes concentraciones: L-arginina: 6.32 g/litro L-cistina: 1.7 g/litro L-histidina: 2.1 g/litro L-isoleucina: 2.6 g/litro L-leucina: 2.6 g/litro L-lisina: 3.6 g/litro L-Metionina: 0.76 g/litro L-fenilalanina: 1.65 g/litro L-treonina: 2.38 g/litro L-triptófano: 0.51 g/litro L-tirosina: 1.8 g/litro L-valina: 2.34 g/litro En una modalidad de la invención, aproximadamente 20 mi de la solución madre de alimentación de aminoácidos se agregan por litro de cultivo. En una modalidad de la invención, los siguientes suplementos se agregan de una solución madre de alimentación de aminoácidos (por ejemplo, una solución madre 100X), que comprende aminoácidos a aproximadamente las siguientes concentraciones: L-alanina: 0.89 g/litro L-asparagina: 1.5 g/litro Ácido L-aspártico: 1.33 g/litro Ácido L-glutámico: 1.47 g/litro Glicina: 0.75 g/litro L-prolina: 1.15 g/litro L-serina: 1.05 g/litro En una modalidad de la invención, la solución madre de alimentación de aminoácidos se agrega a aproximadamente 10 mi de la alimentación de aminoácidos por litro de cultivo. En una modalidad de la invención, algunos de los suplementos se agregan de una solución madre de alimentación de nutrientes (por ejemplo, una solución madre 50X), que comprende suplementos a aproximadamente las siguientes concentraciones: L-asparagina: 40.6 g/litro L-prolina: 10.81 g/litro L-isoleucina: 18.53 g/litro L-cisteína-HCI: 11.19 g/litro L-leuc¡na 16.58 g/litro L-treonina 8.2 g/litro L-tirosina: 9.9 g/litro L-arginina: 9.29 g/litro Ácido L-aspártico: 3.56 g/litro Ácido L-glutámico: 6.28 g/litro Glicina 2.83 g/litro L-histidina: 6.23 g/litro L-metionina: 6.58 g/litro L-triptófano: 4.93 g/litro L-lisina: 14.66 g/litro L-fenilalanina: 8.64 g/litro L-valina: 13.08 g/litro L-serina: 13 g/litro Fosfato de sodio monobásico: 14.41 g/litro Sulfato de zinc: 0.054 g/litro Sulfato cúprico: 0.00016 g/litro Vanadato de amonio: 0.000039 g/litro Cloruro de cobalto: 0.000125 g/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.00002 g/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.000008 g/litro Dihidrato de cloruro de estaño: 0.000004 g/litro Tetrahidrato de cloruro de manganeso: 0.000015 g/litro En una modalidad de la invención, aproximadamente 20 mi de la solución madre de alimentación de nutrientes se agrega por litro de cultivo. En una modalidad de la invención, algunos de los suplementos se agregan de una solución madre de alimentación de vitaminas/sales (por ejemplo, una solución madre 50X), que comprende suplementos a aproximadamente las siguientes concentraciones: Selenito de sodio: 7.13 X 10" g/litro Sulfato de adenina: 0.0816 g/litro Adenosina: 0.88 g/litro Citidina: 0.88 g/litro Guanosina: 0.88 g/litro Uridina: 0.88 g/litro Hipoxantina: 0.59 g/litro L-citrulina: 0.63 g/litro L-ornitina-HCI: 1.28 g/litro Biotina: 0.014 g/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.0025 g/litro Ácido Fólico: 0.23 g/litro Ácido Lipoico: 0.026 g/litro Niacina: 1.57 g/litro Piridoxina HCI: 0.15 g/litro Riboflavina: 0.093 g/litro Tiamina HCI: 0.8 g/litro Vitamina E: 0.0188 g/litro Vitamina B12: 0.17 g/litro Cloruro de colina: 2.51 g/litro Etanolamina HCI: 0.22 g/litro i-lnositol: 3.66 g/litro Timidina: 0.39 g/litro Putrescina 2HCI: 0.02 g/litro Progesterona: 0.00075 g/litro Pantotenato de D-Calcio: 1.19 g/litro En una modalidad de la invención, aproximadamente 20 mi de la alimentación de vitamina/sal se agregan por litro de cultivo. En una modalidad de la invención, el método comprende además, cultivar el medio de cultivo de las células; en donde la proteína se secreta de las células en el medio. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, el medio de cultivo se recolecta de las células cuando la viabilidad de las células está por debajo de aproximadamente 60%. El medio de cultivo puede recolectarse de las células, por ejemplo, centrifugando el medio y/o con filtración profunda del medio y/o filtrando el medio a través de un filtro de 0.2 mieras. La proteína expresada utilizando el método de la invención, puede ser cualquier proteína, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno del mismo, por ejemplo, que se une de manera específica a la IGF1R, por ejemplo, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende una cadena pesada de ¡nmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID Nos: 1 , 3-6, 13, 21 y 26; o un fragmento maduro de la misma, o una o más CDR de la misma; y una cadena ligera de ¡nmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 7-9, 17 y 25, o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma; por ejemplo, en donde el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo completo que comprende una ¡nmunoglobulina de cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-128 de la SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ó 6, y una ¡nmunoglobulina de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de la SEQ ID NO: 8 ó 9, por ejemplo, en donde la ¡nmunoglobulina de cadena ligera está enlazada a una cadena de ¡nmunoglobulina constante kappa, y la ¡nmunoglobulina de cadena pesada está enlazada a una cadena de ¡nmunoglobulina constante gamma-1. En una modalidad de la invención, el medio de cultivo de células de mamífero inicial al cual se agregan los suplementos, comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y no comprenden L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales.

La presente invención incluye dentro de su alcance, un método para producir un anticuerpo (por ejemplo, monoclonal, recombinante y/o completamente humano), que comprende inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial, precalentado a aproximadamente 37°C; medio el cual comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y que no comprende L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales; con las células hospederas CHO DXB11 que expresan la inmunoglobulina de cadena ligera y la inmunoglobulina de cadena pesada del anticuerpo, a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml; y agregar los siguientes suplementos al medio antes, de manera simultánea o inmediatamente después de la inoculación: hidrolisado de soya a una concentración final de aproximadamente 10 g/litro; y opcionalmente, aminoácidos a aproximadamente las siguientes concentraciones finales (no incluyendo la cantidad de los aminoácidos de otras fuentes, tales como el medio de cultivo de células de mamífero inicial): L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina: 52 mg/litro L-leucina: 52 mg/litro L-lisina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalanina: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro Glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; y, cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1.2 X 106 células/ml, agregar alimentaciones de suplemento, en donde los componentes de las alimentaciones de suplemento (no incluyendo la cantidad de cada componente de otras alimentaciones), alcanzan una concentración del cultivo final aproximada expuesta a continuación: Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Dinudeótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro L-asparagina: 812 mg/litro L-prolina: 216 mg/litro L-isoleucina: 370 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-leuc¡na: 332 mg/litro L-treonina: 164 mg/litro L-tirosina: 198 mg/litro L-arg¡n¡na: 186 mg/litro Ácido L-aspártico: 71 mg/litro Ácido L-glutámico: 126 mg/litro Glicina: 57 mg/litro L-histidina: 125 mg/litro L-metionina: 132 mg/litro L-triptófano: 99 mg/litro L-lisina: 293 mg/litro L-fenilalanina: 74 mg/litro L-valina: 262 mg/litro L-serina: 260 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro; y, durante el cultivo celular, agregar glucosa al medio cuando los niveles de glucosa caen por debajo de aproximadamente 1.5 g/litro y agregar L-glutamina cuando los niveles de L-glutamina caen por debajo de aproximadamente 150 mg/litro; y durante el cultivo celular, mantener la concentración de 02 a aproximadamente 60%; el pH a aproximadamente 6.8 ± 0.02 y la temperatura a aproximadamente 36.5°C ± 0.5°C. En una modalidad de la invención, el anticuerpo comprende una cadena pesada de ¡nmunoglobulina, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NOs: 1 , 3-6, 13, 21 y 26; o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma; y una cadena ligera de ¡nmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 7-9, 17 y 25, o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma, por ejemplo, en donde el anticuerpo comprende una ¡nmunoglobulina de cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-128 de la SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ó 6; y una ¡nmunoglobulina de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de la SEQ ID NO: 8 ó 9. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, la ¡nmunoglobulina de cadena ligera está enlazada a una cadena de ¡nmunoglobulina constante kappa y la ¡nmunoglobulina de cadena pesada está enlazada a una cadena de ¡nmunoglobulina constante gamma-1. El método comprende además, opcionalmente, recuperar el medio de cultivo de las células, centrifugando el medio en una pila de discos, filtración profunda del medio y filtrando el medio a través de un filtro con un tamaño de poro de 0.2 mieras y, opcionalmente, el paso adicional de purificar las cadenas de inmunoglobulina del medio mediante fraccionación cromatográfica en columna.

La presente invención también proporciona un medio de cultivo de células líquido acuoso, que comprende: aproximadamente 10 g/litro de hidrolisado de soya, aproximadamente 1.5 g/litro de glucosa aproximadamente 150 mg/litro de L-glutam¡na, pH de aproximadamente 6.8 + 0.02, HEPES amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas, agentes tensoactivos, una alimentación de aminoácidos, en donde la concentración de los componentes agregados por la alimentación de los aminoácidos son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina 52 mg/litro L-leuc¡na: 52 mg/litro L-I¡sina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalan¡na: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro Glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; en donde el medio no comprende antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales. Además, la presente invención proporciona un cultivo celular en el cual, se ha cultivado una célula que expresa una inmunoglobulina de interés.

Por ejemplo, la presente invención proporciona un medio de cultivo líquido producido mediante un proceso que comprende inocular el medio de cultivo de células de mamífero inicial, precalentado a aproximadamente 37°C; con medio que comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y que no comprende L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales; con células hospederas CHO DXB11 que expresan la inmunoglobulina de cadena ligera y la inmunoglobulina de cadena pesada del anticuerpo, a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml; y, agregar los siguientes suplementos al medio antes, de manera simultánea o inmediatamente después de la inoculación: hidrolisado de soya a una concentración final de aproximadamente 10 g/litro; y, opcionalmente, una alimentación de aminoácidos, en donde la concentración de los componentes agregados por la alimentación de aminoácidos son aproximadamente aquellas expuestas a continuación: L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina: 52 mg/litro L-leucina: 52 mg/litro L-lisina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalanina: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro Glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; y, cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1.2 x 106 células/ml, agregar alimentaciones de suplemento, en donde la concentración de los componentes agregados por las alimentaciones de suplemento son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro L-asparagina: 812 mg/litro L-prolina: 216 mg/litro L-isoleucina: 370 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-leucina: 332 mg/litro L-treonina: 164 mg/litro L-tirosina: 198 mg/litro L-arginina: 186 mg/litro Ácido L-aspártico: 71 mg/litro Ácido L-glutámico: 126 mg/litro Glicina: 57 mg/litro L-histidina: 125 mg/litro L-metionina: 132 mg/litro L-triptófano: 99 mg/litro L-lisina: 293 mg/litro L-fenilalanina: 174 mg/litro L-valina: 262 mg/litro L-serina: 260 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro; y, durante el cultivo celular, agregar glucosa al medio cuando los niveles de glucosa caen por debajo de aproximadamente 1.5 g/litro y agregar L-glutamina cuando los niveles de L-glutamina caen por debajo de aproximadamente 150 mg/litro; y durante el cultivo celular, mantener la concentración de O2 a aproximadamente 60%; el pH a aproximadamente 6.8 ± 0.02 y la temperatura a aproximadamente 36.5°C ± 0.5°C; en donde la viabilidad celular es de aproximadamente 60% o menor. En una modalidad de la invención, el medio de cultivo incluye células hospederas que comprenden un vector que codifica un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno del mismo; opcionalmente, en donde el anticuerpo o fragmento secretado por la célula hospedera está en el medio. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, las inmunoglobulinas forman un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno del mismo, que se unen de manera específica a IGF1 R, por ejemplo, en donde el anticuerpo o el fragmento comprenden una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 , 3-6, 13, 21 y 26; o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma; y/o una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 7-9, 17 y 25, o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma, por ejemplo, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una inmunoglobulina de cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-128 de la SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ó 6; y una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de la SEQ ID NO: 8 ó 9. En una modalidad de la invención, la inmunoglobulina de cadena ligera está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante kappa y la inmunoglobulina de cadena pesada está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante gamma-1. Por ejemplo, en donde las células hospederas comprenden un vector que codifica las inmunoglobulinas de un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento se secretan en el medio. En una modalidad de la invención, la viabilidad de la célula hospedera es de aproximadamente 60% o menor, y/o en donde el cultivo celular ha procedido durante aproximadamente 14-24 días (por ejemplo, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 21 días, aproximadamente 22 días, aproximadamente 23 días o aproximadamente 24 días), por ejemplo, centrifugando el medio y las células y retirando las células del medio, por ejemplo, en donde el medio también se filtra a profundidad y/o se filtra a través de un filtro de 0.2 mieras, por ejemplo, después de la centrifugación. Cualquier medio que comprenda las características del medio generado como se expuso anteriormente, forma parte de la presente invención, sin importar el proceso mediante el cual se generó realmente el medio.

La presente invención proporciona también un recipiente (por ejemplo, un matraz, un biorreactor, un biorreactor de tanque, un biorreactor de bolsa o un biorreactor desechable, biorreactor de tanque agitado, un biorreactor de columna de burbujas, un biorreactor de aire, un biorreactor de lecho fluidizado o un biorreactor de lecho empacado), que comprende cualquier medio de cultivo de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente solicitud incluye procesos para la producción de un anticuerpo (por ejemplo, anti-IGF1R) de células de mamífero tales como células CHO (Ovario de Hámster Chino). Los procesos se corren en una variedad de sistemas de cultivo de biorreactor, incluyendo biorreactores de tanque agitado, biorreactores de bolsa y desechables y matraces agitados. El proceso de producción "nivel 3" proporciona, en promedio, un título de aproximadamente 1.2 g/L de anticuerpo y una productividad específica del cultivo de aproximadamente 22 pg/célula/día. El proceso "mejorado" proporciona, en promedio, un título de aproximadamente 2.3 g/L de anticuerpo, con una productividad específica de aproximadamente 30 pg/célula/día. Ambos procesos involucran la adición de suplementos específicos al cultivo del biorreactor de producción, ya sea antes de la inoculación o como alimentaciones durante el proceso para incrementar la productividad específica del cultivo, el título, la biomasa y la viabilidad del cultivo. Para el proceso de nivel 3, se agregan tres suplementos, hidrolisados de trigo y/o soya (alimentaciones de hidrolisado) (por ejemplo, como soluciones de 200 g/L (acuosas)), para incrementar la productividad específica del cultivo. Ambos hidrolisados o la alimentación del hidrolisado de soya por sí mismo, se agregan típicamente al cultivo. Dos soluciones de alimentación concentradas de aminoácidos (alimentaciones de aminoácidos), se agregan para elevar la biomasa del cultivo e incrementar el título del proceso. Una solución concentrada de vitaminas y sales (alimentación de vitaminas/sales), se agrega para estabilizar la viabilidad del cultivo e incrementar la biomasa. La solución de alimentación de vitaminas incluye, por ejemplo, biotina, progesterona, inositol, ácidos nucleicos, citrulina, hipoxantina, ácido lipoico, riboflavina, tiamina, colina, etanolamina, ácido fólico, flavina y vitamina B12.

Para el proceso mejorado, las soluciones de alimentación se agregan junto con una solución de entrada de nutrientes adicional (alimentación de nutrientes). La "alimentación de nutrientes" incluye, por ejemplo, aminoácidos, sulfato de zinc, sulfato cúprico, vanadato de amonio, cloruro de cobalto, dicloruro de níquel, cloruro de estaño y cloruro de manganeso. Puede agregarse antes de la inoculación o como una alimentación durante el proceso para mejorar el título del proceso e incrementar la viabilidad.

Además, se emplea opcionalmente un cambio de la osmolalidad durante el proceso (a 400-500 mOsm), mediante la adición de una solución concentrada de sales, una solución de hidrolisado de soya o dióxido de carbono e hidróxido de sodio (como parte del control del pH del biorreactor). El cambio de la osmolalidad se emplea con el fin de incrementar la productividad específica del cultivo y mejorar la viabilidad de la recolección. Además, se utiliza opcionalmente un cambio de temperatura descendente durante el proceso, de aproximadamente 36°C a 37°C a 33-35°C, para estabilizar la viabilidad del cultivo a los altos conteos de células viables.

Para el propósito de la presente invención, el término "durante el proceso", se refiere a un evento que ocurre durante el cultivo de la producción de un cultivo celular, después de una inoculación de la célula inicial (por ejemplo, de células expandidas, por ejemplo, para un banco de células maestro o un banco de células de trabajo).

Un "cultivo de células de producción" se refiere a un cultivo de células del cual se va a aislar un producto final, tal como un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-IGF1 R).

Un "cultivo de células de expansión" se refiere a células o un cultivo de células para utilizarse para la inoculación inicial de un cultivo de células de producción.

Una solución madre "nX" de suplementos (en donde n es un número, tal como 50), indica que la solución patrón está diluida por 1/n cuando se agrega al cultivo. Por ejemplo, una solución madre 50X se diluye normalmente a 1/50 cuando se agrega al cultivo.

Alimentaciones Los procesos de la presente invención incluyen pasos en donde varias alimentaciones se agregan a un medio de cultivo de células de mamífero inicial. Estas alimentaciones incluyen alimentación de hidrolisado, alimentación de vitaminas/sales, alimentación de aminoácidos y alimentación de nutrientes. Dependiendo del tipo de procesos de cultivo celular que se está utilizando, el proceso nivel 3 o el proceso mejorado, las alimentaciones pueden agregarse en diferentes puntos.

El "medio de cultivo de células de mamífero inicial" puede ser cualquiera de va os tipos de medios acuosos conocidos en la técnica; y el significado de este término sería fácilmente conocido por cualquier practicante de experiencia ordinaria en la técnica. Los ejemplos incluyen medios EX-CELL ACF CHO (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); discutido a continuación), DMEM, DMEM/F-12, Mezcla Nutriente F-10, Medio RPMI 1640, Mezcla Nutriente F-12, Medio 199, MEM de Eagle, RPMI, medio 293 y Medio de Iscove. Por ejemplo, el medio esencial mínimo de Eagle (MEM) comprende clorhidrato de L-Arginina (126 mg/l), L-Cistina 2HCI (31 mg/l), clorhidrato de L-Histidina-H20 (42 mg/l), L-lsoleucina (52 mg/l), L-Leucina (52 mg/l), clorhidrato de L-Lisina (73 mg/l), L-Metionina (15 mg/l), L-Fenilalanina (32 mg/l), L-Treonina (48 mg/l), L-Triptófano (10 mg/l), dihidrato de sal disódica de L-Tirosina (52 mg/l), L-Valina (46 mg/l), cloruro de Colina (1 mg/l), pantotenato de D-Calcio (1 mg/l), Ácido Fólico (1 mg/l), Niacinamida (1 mg/l), clorhidrato de Piridoxal (1 mg/l), Riboflavina (0.1 mg/l), clorhidrato de Tiamina (1 mg/l), i-Inositol (2 mg/l), Cloruro de Calcio (CaCI2) (anhidro) (200 mg/l), Sulfato de Magnesio (MgS04) (anhidro) (97.67 mg/l), Cloruro de Potasio (KCI) (400 mg/l), Bicarbonato de Sodio (NaHC03) (2200 mg/l), Cloruro de Sodio (NaCI) (6800 mg/l), Fosfato de Sodio monobásico (NaH2P04-H20) (140 mg/l), D-Glucosa (Dextrosa) (1000 mg/l) y Rojo de Fenol (10 mg/l).

El Medio de Eagle Modificado (MEM) (2X) comprende clorhidrato de L-Arginina (504 mg/l), L-Cistina (96 mg/l), L-Glutamina (870 mg/l), clorhidrato de L-Histidina-H20 (168 mg/l), L- Isoleucina (208 mg/l), L-Leucina (208 mg/l), clorhidrato de L-Lisina (290 mg/l), L-Metionina (60 mg/l), L-Fenilalanina (128 mg/l), L-Treonina (192 mg/l), L-Triptófano (40 mg/l), dihidrato de sal disódica de L-tirosina (208 mg/l), L-Val¡na (155 mg/l), cloruro de Colina (4 mg/l), pantotenato de D-Calcio (4 mg/l), Ácido Fólico (4 mg/l), Niacinamida (4 mg/l), clorhidrato de Piridoxal (4 mg/l), Riboflavina (0.4 mg/l), clorhidrato de Tiamina (4 mg/l), i-lnositol (8 mg/l), Cloruro de Calcio (CaCI2) (anhidro) (285 mg/l), Nitrato Férrico (Fe(N03)3"9H20) (1 mg/l), Sulfato de Magnesio (MgS04) (anhidro) (195 mg/l), Cloruro de Potasio (KCI) (800 mg/l), Bicarbonato de Sodio (NaHC03) (8400 mg/l), Cloruro de Sodio (NaCI) (12800 mg/l), Fosfato de Sodio monobásico (NaH2P04-H20) (250 mg/l) y D- Glucosa (Dextrosa) (9000 mg/l).

El Medio RPMI 1640 (1X) comprende Glicina (10 mg/l), L-Arginina (200 mg/l), L-Asparagina (50 mg/l), L-Ácido Aspártico (20 mg/l), L-Cistina 2HCI (65 mg/l), L-Ácido Glutámico (20 mg/l), L-Glutamina (300 mg/l), L-Histidina (15 mg/l), L-Hidroxiprolina (20 mg/l), L-lsoleucina (50 mg/l), L-Leucina (50 mg/l), clorhidrato de L-Lisina (40 mg/l), L-Metionina (15 mg/l), L-Fenilalanina (15 mg/l), L-Prolina (20 mg/l), L-Serina (30 mg/l), L-Treonina (20 mg/l), L-Triptófano (5 mg/l), dihidrato de sal disódica de L-Tirosina (29 mg/l), L-Valina (20), Biotina (0.2 mg/l), cloruro de Colina (3 mg/l), pantotenato de D-Calcio (0.25 mg/l), Ácido Fólico (1 mg/l), Niacinamida (1 mg/l), Ácido para-Aminobenzoico (1 mg/l), clorhidrato de Piridoxina (1 mg/l), Riboflavina (0.2 mg/l), clorhidrato de Tiamina (1 mg/l), Vitamina B12 (0.005 mg/l), i-lnositol (35 mg/l), nitrato de Calcio (Ca(N03)2 4H20) (100 mg/l), Sulfato de Magnesio (MgS04) (anhidro) (48.84 mg/l), Cloruro de Potasio (KCI) (400 mg/l), Bicarbonato de Sodio (NaHC03) (2000 mg/l), Cloruro de Sodio (NaCI) (6000 mg/l), Fosfato de Sodio dibásico (Na2HP04) anhidro (800 mg/l), D-Glucosa (Dextrosa) (2000 mg/l) y Glutationa (reducida) (1 mg/l).

Generalmente, para los propósitos de la presente invención, una "alimentación de hidrolisado" incluye hidrolisados de trigo y/o de soya. Generalmente, un hidrolisado de soya o trigo es el producto de un digesto enzimático de soya o trigo, y puede comprarse comercialmente. Típicamente, el hidrolisado está en agua grado cultivo celular y es estéril. En una modalidad de la invención, el hidrolisado es una solución madre a 200 g/litro. En una modalidad de la invención, el hidrolisado se agrega al medio de cultivo para alcanzar una concentración final de aproximadamente 10 g/litro. En una modalidad de la invención, cuando se utiliza el proceso nivel 3 o el proceso mejorado, el hidrolisado se agrega al medio de cultivo ya sea inicialmente, antes, con o inmediatamente después de la inoculación o a aproximadamente 3 días después de la inoculación, o cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1 x 106 células/ml.

"Densidad celular viable", se refiere a la concentración de células en el medio que se está analizando (por ejemplo, células/ml) que son viables, por ejemplo, capaces de crecer y de replicarse (por ejemplo, cuando se utilizan para inocular un cultivo líquido o un medio de cultivo sólido), o capaces de excluir un tinte tal como azul de triptano, eosina o propidio en un ensayo de exclusión del tinte. Tales ensayos son conocidos comúnmente en la técnica.

Generalmente, para los propósitos de la presente invención, una "alimentación de vitaminas/sales" incluye: Selenito de sodio: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 7.13 X 10~4 g/litro Sulfato de adenina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.0816 g/litro Adenosina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.88 g/litro Citidina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.88 g/litro Guanosina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.88 g/litro Uridina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.88 g/litro Hipoxantina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.59 g/litro L-citrulina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.63 g/litro L-ornitina-HCI: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.28 g/litro Biotina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.014 g/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.0025 g/litro Ácido Fólico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.23 g/litro Ácido Lipoico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.026 g/litro Niacina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.57 g/litro Piridoxina HCI: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.15 g/litro Riboflavina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.093 g/litro Tiamina HCI: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.8 g/litro Vitamina E: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.0188 g/litro Vitamina B12: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.17 g/litro Cloruro de colina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.51 g/litro Etanolamina HCI: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.22 g/litro i-lnositol: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 3.66 g/litro Timidina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.39 g/litro Putrescina 2HCI: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.02 g/litro Progesterona: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.00075 g/litro; y Pantotenato de D-Calcio: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.19 g/litro.

En una modalidad de la invención, la alimentación de vitaminas/sales es una solución madre 50X. En una modalidad de la invención, la alimentación de vitaminas/sales se agrega al medio de cultivo para alcanzar una concentración final de aproximadamente 20 ml/litro. Cuando se emplea el proceso de nivel 3, la alimentación de vitaminas/sales se agrega al cultivo entre 3 y 5 días postinoculación, o cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1 X 106 células/ml. En una modalidad de la invención, cuando se emplea el proceso mejorado, la alimentación de vitaminas/sales se agrega al cultivo entre los días 3 y 5 postinoculación, o cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1.2 X 106 células/ml.

Generalmente, para los propósitos de la presente invención, una "alimentación de aminoácidos" incluye: L-arginina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 6.32 g/litro L-cistina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.7 g/litro L-histidina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.1 g/litro L-isoleucina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.6 g/litro L-leucina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.6 g/litro L-lisina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 3.6 g/litro L-Metionina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.76 g/litro L-fenilalanina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.65 g/litro L-treonina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.38 g/litro L-triptófano: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.51 g/litro L-tirosina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.8 g/litro L-valina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.34 g/litro L-alanina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.89 g/litro L-asparagina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente .5 g/litro Ácido L-aspártico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.33 g/litro Ácido L-glutámico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente .47 g/litro Glicina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.75 g/litro L-prolina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.15 g/litro; y L-serina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1.05 g/litro En una modalidad de la invención, se preparan dos soluciones madre de alimentación de aminoácidos separadas: una solución madre 100X que incluye L-alanina, L-asparagina, Ácido L-aspártico, ácido L-glutámico, glicina, L-prolina y L-serina a las concentraciones expuestas anteriormente; y una solución 50X que incluye L-arginina, L-cistina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L- etionina, L-fenilalanina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina y L-valina a las concentraciones expuestas anteriormente. Estas soluciones madre pueden hacerse y agregarse de manera separada al medio de cultivo. En una modalidad de la invención, la solución madre de aminoácidos se agrega al medio inicial en el día 0, antes, con o inmediatamente después de la inoculación de las células.

Generalmente, para los propósitos de la presente invención, una "alimentación de nutrientes" incluye: L-asparagina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 40.6 g/litro L-prolina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 10.81 L-isoleucina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 18.53 L-cisteína-HCI: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 11.19 L-leucina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 16.58 L-treonina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 8.2 L-tirosina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 9.9 L-arginina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 9.29 Ácido L-aspártico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 3.56 Ácido L-glutámico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 6.28 Glicina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2.83 L-histidina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 6.23 L-metionina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 6.58 L-triptófano: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 4.93 L-lisina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 14.66 L-fenilalanina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 8.64 L-valina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 13.08 g/litro L-serina: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 13 g/litro Fosfato de sodio monobásico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 14.41 g/litro Sulfato de zinc: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.054 g/litro Sulfato cúprico: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.00016 g/litro Vanadato de amonio: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.000039 g/litro Cloruro de cobalto: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.000125 g/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.00002 g/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.000008 g/litro Dihidrato de cloruro de estaño: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.000004 g/litro Tetrahidrato de cloruro de manganeso: por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 0.000015 g/litro En una modalidad de la invención, la alimentación de nutrientes es una solución madre 50X. En una modalidad de la invención, la alimentación de nutrientes se agrega al medio de cultivo para alcanzar una concentración final de aproximadamente 20 ml/litro. Cuando se emplea el proceso mejorado, la alimentación de nutrientes se agrega al cultivo entre los días 3 y 5 postinoculación, o cuando la densidad celular viable alcanza aproximadamente 1.2 X 106 células/ml.

Además, en una modalidad de la invención, cuando se emplea el proceso nivel 3 o el proceso mejorado, la glucosa (de una solución madre 2.5 M) y la L-glutamina (de una solución madre 0.2 M), se agregan al medio de cultivo en cualquier punto, por ejemplo, cuando la concentración de los nutrientes cae por debajo de 1.5 g/litro de glucosa y 150 mg/litro de L-glutamina.

Cambio de la osmolalidad y temperatura La presente invención también incluye procesos en donde la osmolalidad y/o la temperatura del cultivo se cambian opcionalmente. El cambio de la osmolalidad a la temperatura puede hacerse en cualquier punto durante el proceso.

El cambio de la osmolalidad ha mostrado incrementar la productividad específica del cultivo, así como la viabilidad celular.

Típicamente, el medio de cultivo de células de mamífero inicial tiene una osmolalidad inicial de aproximadamente 300 mOsm. El "cambio de osmolalidad" de la presente invención, sin embargo, incluye cambiar la osmolalidad del cultivo de aproximadamente 400 mOsM a aproximadamente 500 mOsm.

La osmolalidad es una medida de las osmoles de soluto por kilogramo de solvente. La osmolalidad puede medirse utilizando un osmómetro que mide las propiedades coligativas, tales como depresión del punto de congelación, presión de vapor o elevación del punto de ebullición.

La osmolalidad de un cultivo celular puede cambiarse por cualquiera de varios medios. Por ejemplo, puede agregarse una solución concentrada de sales (por ejemplo, incluyendo una solución madre de sales de NaCI 5M, 8-12 mL/L agregados), una solución de hidrolisado de soya (solución madre de 200 g/L, 50-80 mL/L agregados), o dióxido de carbono. En una modalidad de la invención, la adición de la alimentación de nutrientes al medio cambia la osmolalidad.

En una modalidad de la invención, la temperatura del cultivo se cambia opcionalmente, por ejemplo, en un cambio en pasos, de aproximadamente 36.5°C (± 0.5°C) a entre aproximadamente 33°C y 35°C.

Proteínas La presente invención incluye modalidades que comprenden métodos para producir de manera recombinante proteínas tales como cadenas de inmunoglobulina. En una modalidad de la invención, la inmunoglobulina comprende un anticuerpo anti-IGF1R (por ejemplo, anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico) o un fragmento que se une al antígeno del mismo, por ejemplo, incluyendo una región variable de cadena ligera y/o pesada de inmunoglobulina, enlazada opcionalmente con una región constante de inmunoglobulina.

Por ejemplo, la presente invención incluye métodos en donde una proteína a ser expresada (por ejemplo, una inmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo anti-IGF1 R), se codifica por un polinucleótido en un vector de plásmido, por ejemplo, en donde el polinucleótido está enlazado de manera operable a un promotor, tal como el promotor CMV. En una modalidad de la invención, las cadenas ligera y pesada se incluyen en un solo vector de plásmido.

En una modalidad de la invención, la cadena de inmunoglobulina codifica cualquiera de aquéllas expuestas a continuación; por ejemplo, cualquiera de las siguientes cadenas ligera y/o pesada de la inmunoglobulina y/o cualquiera de las CDR de la misma (por ejemplo, las 3 de una sola cadena ligera o pesada). El tipo punteado, subrayado, codifica el péptido de la señal. El tipo sólido, subrayado, codifica las CDR. El tipo sencillo codifica las regiones del marco. En una modalidad de la invención, las cadenas se expresan con el péptido de la señal que es escindido tras la secreción de la célula hospedera, para generar un fragmento maduro de la cadena.

Las composiciones y procesos para producir cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina objetivo o fragmentos maduros de las mismas, forman parte de la presente invención. 19D12/15H12 Cadena Ligera (SEQ ID NO: 1) MSPSpjLIG^ QSPKLLIKYASQSLSGVPSRPSGSGSGTDPTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSRLPHTPGGG TKVEIKRT 19D 2/15H12 Cadena Pesada (SEQ ID NO: 2) MEFGLSWFLVAILKGyQC GKGLEWISVIDTRGATYYADSVKGi^ISRDNAKNSLYLQM SLRAEDMAVYYC-U XaW YYGMDVWGQGTTVTVSS 19D12/15H12 Cadena Ligera-C (LCC) (SEQ ID NO: 3) M .... S _P S. g I G F L L L W V P A S R....G E I V L T Q S P D S L S V T P G E R V T I T C R A S Q S I G S S L H W Y c Q K P G Q S P K L L I K Y A S Q s L S G V P S R F S G S G S G T D P T L T I S S L E A E D A A A Y Y c S S R L P H T F G Q G T K V E I K R T 19D12/15H12 Cadena Ligera-D (LCD) (SEQ ID NO: 4) N s P s L I G F L L L W V P A S R G E I V L T Q S P D S L S V T P G E R V T I T C R A S Q S I G S S L H W Y <3 Q K P G Q S P K L L I K Y A S Q s L S Q V P S R F S' e S G s O T D F T L T I S S L E A E D F A V Y Y c H Q S S R L P H T F G Q G T K V E I K R T 19D12/15H12 Cadena Ligera-E (LCE) (SEQ ID NO: 5) M S P s ¾ L I G F L L L W V P A S R G E I V L T Q S P G T L s V S P G E R A T L ? c R A S ¾ S I G S s L H W Y Q 0 K P G Q A P R L L I Y A s 9 s L s G I P D R P S G s G S G G s F T L T I S R L E P E D A A A Y Y C H ? S s R L P H T F G Q G T K V E I K R T D12/15H12 Cadena Ligera-F (LCF) (SEQ ID NO: 6) M S P ? Q L I G F L L L V P A S R G E I V L T C S P G T L S V S P <3 E R A T L s c R A S 9 S I G s s L H Y Q Q K P G Q A P R L L I K Y A S q S L s G I P D R F S G ? G s G T D F T L ? I s R L E P E D F A V Y Y C H 9 S s R L P H T F G e G T K V E I K R T D12/15H12 Cadena Pesada-A (HCA) (SEQ ID NO: 7) jtet Glu Phe G^ lie Leu Lys Gly Val Gln Cya Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lya Pro Gly Gly Ser Leu Ara Leu Ser Cya Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Ser Val lie Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lya Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lya Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Pha Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser D12/15H12 Cadena Pesada-B (HCB) (SEQ ID NO: 8) Gln .Cys, Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met Hig Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Ser Val lie Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Aap Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Véase la publicación de la solicitud internacional no. WO2003/100008, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. 2C6 Cadena pesada MELGLS IFLLAILKGVQC I^QLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGErroDYA14tHWVRQAPG SLYLQ SLRAEDTALYYCAKDlRieVJ-XSXYyeiiDTOGHGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9) 2C6 CD -H1: GFTFDDYAMH (SEQ ID NO: 10) 2C6 CDR-H2: GISW SGSKGYVDSVKG (SEQ ID NO: 11) 2C6 CDR-H3: DIRIGVAASYYFGMDV (SEQ ID NO: 12) 2C6 Cadena ligera MDMRVPAQLLGLLLL LPGARC AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCW-SQGISSVIAWYQQKPG APKLLIYDASSI-EBGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQPHSTPYTFGQGTKLEI (SEQ ID NO: 13) 2C6 CDR-L1 : RASQGissviA (SEQ ID NO: 14) 2C6 CDR-L2: DASSLES (SEQ ID NO: 15) 2C6 CDR-L3: QQFNSYPYT (SEQ ID NO: 16) 9H2 Cadena pesada MDWTWRILFLVAAATGAHS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGTraFTSYVMHW TVYMELSSLRSEDTAVYYCAR<X5WFVAGP^^ (SEQ ID NO: 17) 9H2 CDR-H1 : GYTF SYVMH (SEQ ID NO: 18) 9H2 CDR-H2: WINAGNGNTKTSQKFQC- (SEQ ID NO: 19) 9H2 CDR-H3: GGMPVAGPGYFYYYGMDV (SEQ ID NO: 20) 9H2 Cadena ligera METPAQLLFLLLLWLPDTTG EI\n.TQSPGTLSLSPGEFiATLSCIUlSQSroRSTIA^ RLEPEDFAVYCCQQYGSSFWTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 21 ) 9H2 CDR-L1 : RASQSVSRSYLA (SEQ ID NO: 22) 9H2 CDR-L2: GASSRAT (SEQ ID NO: 23) 9H2 CDR-L3: QQYGSSPWT (SEQ ID NO: 24) Secuencia de la región variable de inmunoglobulina de cadena pesada # 1.0 E VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CTASGFTFSS YAMNWVRQAP GKGLEWVSAI SGSGGTTFYA DSVKGRFTIS RDNSRTTLYL QMNSLRAEDT AVYYCA DLG WSDSYYYYYG MDVWGQGTTV TVSS (SEQ ID NO: 25) ; Secuencia de la región variable de inmunoglobulina de cadena ligera # 1.0 DIQMTQFP SSLSASVGDR VTITCRASQG IR DLGWYQQ KPGKAPKRLI YAASRLHRGV PSRFSGSGSG TEFTLTISSL QPEDFATYYC LQHNSYPCSF GQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 26); Las modalidades de la invención incluyen aquéllas en donde la inmunoglobulina se expresa, por ejemplo, en combinación con cualquiera de aquéllas expuestas en la presente (por ejemplo, Ig, de cadena pesada # 1.0 e Ig. dé cadena ligera #1.0; o LCC y HCA; o LCF y HCA; o LCC y HCB). El apareamiento de las cadenas de cadena ligera y pesada puede resultar en la generación de un anticuerpo o un fragmento que se une al antígeno del mismo.

En una modalidad de la invención, la cadena ligera se fusiona a una cadena constante de inmunoglobulina, por ejemplo, una cadena kappa. En una modalidad de la invención, la cadena pesada se fusiona a una cadena constante de inmunoglobulina, por ejemplo, una cadena gamma-1 , gamma-2, gamma-3 o gamma-4.

Otras proteínas de interés que pueden expresarse utilizando los métodos y composiciones de la presente invención incluyen receptores, ligandos, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas y enzimas.

Procesos de producción v materiales Los vectores, tales como plásmidos, incluyen un gen a ser expresado mediante un proceso de la presente invención, pueden introducirse en una célula hospedera mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. La transformación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el método de precipitación con fosfato de calcio como se describe por Graham y Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978). Otros métodos para introducir ADN a las células, tales como mediante inyección nuclear o mediante fusión del protoplasto, también pueden utilizarse. Los métodos para la transformación también incluyen electroporacion, transformación liposomal y transformación con DEAE-Dextrano.

Las células hospederas son, en una modalidad de la invención, células de mamífero. Por ejemplo, células de ovario de hámster chino (células CHO). Una célula CHO-K1 es una que requiere prolina y es diploide para el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr). En una modalidad de la invención, la línea celular es la línea celular CHO DXB1 1 (Urlaub et al. (1983) Cell 33: 405-412). Otras líneas celulares incluyen, por ejemplo, HEK293.

Las células hospederas que comprenden un gen a ser expresado utilizando un proceso de la presente invención, pueden seleccionarse y clasificarse para identificar la clona con las características requisito para la expresión del gen objetivo. En las células de ovario de hámster chino (CHO), un procedimiento común, para lograr la expresión máxima, involucra el uso de líneas celulares mutantes y un incremento gradual en la presión de selección durante varios meses para un marcador de selección cotransfectado, tal como dihidrofolato reductasa (DHFR) (Kaufman et al. (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621 ; Schimke et al. (1982) Natl. Cáncer Inst. Monogr. 60: 79-86). Con el fin de alcanzar altas velocidades de producción, una línea celular negativa de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (por ejemplo, una línea celular CHO) (Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. ScL USA 77: 4216-4220), se transforma con un vector de expresión que contiene un gen DHFR funcional en combinación con el gen objetivo a ser expresado. La amplificación de los genes objetivo insertados en el vector ocurre en respuesta a la adición de cantidades que se incrementan del antagonista de la DHFR metotrexato (MTX) al medio de cultivo, y las clonas o subpoblaciones que portan múltiples copias de los genes recombinantes se generan y pueden seleccionarse (Wurm (1990) Biologicals 18:159-164). El proceso de amplificación del gen toma típicamente varios meses hasta que se obtienen líneas celulares estables que muestran altos números de copias del gen objetivo y altas velocidades de producción de la proteína deseada.

En una modalidad de la invención, un polinucleótido de la presente invención se integra en el ADN cromosomal de una célula hospedera (por ejemplo, CHO, CHO-K1 , CHO DXB11) o se replica de manera ectópica y autónoma. En una modalidad de la invención, el polinucleótido de la presente invención está presente en la célula a varias copias por célula (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20). En donde un vector de expresión se ha integrado en el ADN genómico de la célula hospedera para mejorar la estabilidad, el número de copia del ADN del vector, y de manera concomitante, la cantidad del producto que podría expresarse, puede incrementarse seleccionando líneas celulares en las cuales las secuencias del vector se han amplificado después de la integración en el ADN de la célula hospedera. Los genes integrados pueden seleccionarse para la presencia y cantidad relativa del ADN incorporado cromosomalmente y el ARNm correspondiente y la síntesis polipeptídica mediante métodos estándar. Por ejemplo, la presencia del integrado deseado puede detectarse mediante procedimientos estándar, tales como secuenciamiento del ADN, Southern blotting, Northern blotting y/o Western blotting.

Cualquiera de varios medios de cultivo celular conocidos en la técnica, puede utilizarse para propagar las células que expresan un gen objetivo. Existen varios medios de cultivo comercialmente disponibles. Si se expresa una proteína a ser utilizada terapéuticamente, puede ser deseable un medio libre de productos animales (por ejemplo, medio libre de suero (SFM)). Existen varios métodos conocidos en la técnica mediante los cuales las células pueden adaptarse para cultivarse en un medio libre de suero. Por ejemplo, la adaptación directa incluye cambiar simplemente las células de medio suplementado con suero a un medio libre de suero. La adaptación secuencial o independencia, incluye cambiar las células de un medio suplementado con suero a un medio libre de suero en varios pasos (por ejemplo, SFM al 25%, SFM al 50%, SFM al 75%, a continuación, SFM al 90% durante aproximadamente 3 pasos, a continuación SFM al 100%). La adaptación secuencial tiende a ser menos dura para las células que la adaptación directa. Generalmente, para adaptar las células al medio libre de suero, el medio debe estar en la fase semilogarítmica, > 90% viable y sembrado a un inóculo de células iniciales mayor que durante la adaptación directa. En una modalidad de la invención, el medio de cultivo de células de mamífero inicial es medio EX-CELL ACF CHO que está comercialmente disponible de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Este cultivo está libre de componentes animales, con HEPES (ácido N-2-Hidroxietilpiperacin-N'-2-etansulfónico), sin L-glutamina, líquido, filtrado con esterilización y probado para el cultivo celular. El medio también incluye sales inorgánicas, amortiguadores de bicarbonato de sodio, aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, insulina humana recombinante, hidrolisados de plantas, otros compuestos orgánicos, elementos en trazas y agentes tensoactivos. El medio tampoco contiene antibióticos, antimicóticos o transferrina y tampoco contiene proteínas derivadas de animales u otros componentes. Típicamente, para la reconstitución del medio, un practicante debe agregar de manera aséptica 20-40 mi de una solución de L-glutamina 200 mM por litro de medio antes del uso.

Una línea celular que contiene una célula hospedera que comprende un gen a ser expresado utilizando un proceso de la presente invención, puede almacenarse en un banco de células maestro (MCB) y/o un banco de células de trabajo (WCB). Típicamente, cuando una línea celular se va a utilizar durante muchos ciclos de fabricación, puede establecerse un sistema de banco de células con dos niveles, que consiste de un banco de células maestro o un banco de semillas maestro (MSB) y un banco de células de trabajo. Una línea celular se establece por una sola clona de la célula hospedera, y esta línea celular se utiliza para constituir el MCB. Generalmente, este MCB debe caracterizarse y probarse de manera extensa para contaminantes tales como bacterias, hongos, viruses y micoplasma. Una muestra de las células del MCB puede expandirse para formar el WCB, que está caracterizado por la viabilidad celular antes del uso en un proceso de fabricación. Las células en un MCB o un WCB pueden almacenarse en viales, por ejemplo, a baja temperatura (por ejemplo, 0°C o menos, -20°C o -80?C).

Típicamente, el banco de células de trabajo incluye células de un vial del banco maestro que se han cultivado durante varios pasajes antes del almacenamiento. En general, cuando las células futuras se necesiten, se tomarán del banco de células de trabajo; mientras que el banco de células maestro se utiliza únicamente cuando es necesario, asegurando una existencia de células con un número de pasajes bajo para evitar la variación genética dentro del cultivo celular.

La presente invención proporciona dos procesos para cultivar células y producir de manera recombinante una proteína, el proceso de "nivel 3" y el "proceso mejorado". Ambos procesos generan altos niveles de proteínas de interés, sin embargo, el proceso mejorado genera niveles especialmente altos.

En una modalidad de la invención, el proceso de nivel 3 para producir una proteína, tal como un anticuerpo (por ejemplo, anti-IGF1 R) comprende los pasos: 1 - expandir las células que expresan la proteína en un medio de cultivo de mamífero inicial estándar (por ejemplo, medio CHO de Sigma con L-glutamina agregada (4 mM)).

Esta expansión puede hacerse, por ejemplo, en matraces agitados. En una modalidad de la invención, la expansión ocurre mediante el cultivo a aproximadamente 1-2 x 106 células/ml, la dilución de una muestra de esas células (por ejemplo, a una densidad de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml) y a continuación, volver a cultivar a aproximadamente 1-2 x 106 células/ml, durante aproximadamente 10-30 pasajes. 2 - inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial con las células expandidas del paso (1), a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml, y agregar suplementos al medio.

Los suplementos son hidrolisados de trigo y/o soya, alimentación de aminoácidos, alimentación de vitaminas/sales, glucosa y L-glutamina.

El día de inoculación es el "día 0", el siguiente día es el "día 1", el siguiente día es el "día 2", y a si sucesivamente.

Los hidrolisados de soya o trigo se agregan, por ejemplo, ya sea en el día 0 o después de que se ha alcanzado la densidad celular viable durante más de aproximadamente 106 células/ml. En una modalidad de la invención, los hidrolisados se agregan simplemente en el día 3 cuando la densidad celular viable alcanza típicamente 106 células/ml. Las alimentaciones de aminoácidos (discutidas anteriormente), se agregan, por ejemplo, en el día 0, por ejemplo, para alcanzar concentraciones del cultivo final aproximadas como se expone a continuación (no incluyendo la concentración de ningún componente indicado de otras fuentes, tales como el medio de cultivo de células de mamífero inicial): Componente Concentración final en el cultivo (mq/litro) L-arginina 126.4 L-cistina 34 L-histidina 42 L-isoleucina 52 L-leucina 52 L-lisina 72 L-Metionina 15.2 L-fenilalanina 33 L-treonina 47.6 L-triptófano 10.2 L-tirosina 36 L-valina 46.8 L-alanina 8.9 L-asparagina 30 Ácido L-aspártico 26.6 Ácido L-glutámico 29.4 Glicina 15 L-prolina 23 L-serina 21 En una modalidad de la invención, las alimentaciones de aminoácidos no se agregan al medio. solución de alimentación de vitaminas/sales (discutida anteriormente) se agrega, por ejemplo, entre los días 3 y 5 o cuando la densidad celular viable alcanza aproximadamente 106 células/ml, por ejemplo, para alcanzar concentraciones del cultivo final aproximadas como se expone a continuación (no incluyendo la concentración de ningún componente indicado de otras fuentes tales como el medio de cultivo de células de mamífero inicial): Componente Concentraciones del cultivo final (mq/litro) Selenito de sodio 0.01426 Sulfato de adenina I .632 Adenosina 17.6 Citidina 17.6 Guanosina 17.6 Uridina 17.6 Hipoxantina I I .8 L-citrulina 12.6 L-ornitina-HCI 25.6 Biotina 0.28 Dinucleótido de Flavina Adenina 0.05 Ácido Fólico 4.6 Ácido Lipoico 0.52 Niacina 31.4 Piridoxina HCI 3 Riboflavina 1.86 Tiamina HCI 16 Vitamina E 0.376 Vitamina B12 3.4 Cloruro de colina 50.2 Etanolamina HCI 4.4 i-lnositol 73.2 Timidina 7.8 Putrescina 2HCI 0.4 Progesterona 0.015 Pantotenato de D-Calcio 23.8 La glucosa se agrega, por ejemplo, cuando la concentración de glucosa en el medio de cultivo cae por debajo de aproximadamente 1.5 g/litro y la L-glutamina se agrega, por ejemplo, cuando la concentración de glutamina en el medio de cultivo cae por debajo de aproximadamente 150 mg/litro. 3 - Recolectar opcionalmente las células del medio cultivo de las células de producción, por ejemplo, cuando la viabilidad está por debajo del 60%, retirando las células del medio de cultivo (por ejemplo, disminuyendo la temperatura de las células a aproximadamente 15°C, agregando amortiguador de fosfato de sodio para estabilizar el pH a aproximadamente 6.8 y centrifugando el medio de cultivo para clarificarlo de las células). Si la proteína se secreta, el medio puede retenerse para el procesamiento adicional, si la proteína no se secreta, las células pueden retenerse para el procesamiento adicional.

Cualquiera de varios métodos puede utilizarse para retirar las células del medio, por ejemplo, mediante centrifugación. Por ejemplo, utilizando una centrífuga con pila de discos continua, por ejemplo, con una velocidad de flujo/sigma (cm/segundo) de aproximadamente 9.27 x 10"7.

Además, el medio puede filtrarse para retirar las células, por ejemplo, mediante filtración profunda con o sin una centrífuga. Por ejemplo, con una centrífuga, el proceso puede, en una modalidad de la invención, comprender el uso de un filtro de 8 ± 2 L de caldo/pie2 (por ejemplo, un filtro de celulosa cargado); sin una centrífuga, el proceso puede, en una modalidad de la invención, comprender el uso de un filtro de 20 ± 3 L de caldo/pie2.

Además, el medio puede filtrarse a través de un filtro fino, por ejemplo, con un tamaño de poro de 0.2 mieras (por ejemplo, un filtro de PVDF), y; 4 - Opcionalmente, purificar además la proteína, por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía.

En una modalidad de la invención, el proceso mejorado para producir una proteína, tal como un anticuerpo (por ejemplo, anti-IGF1 R), comprende los pasos: 1 - expandir las células que expresan la proteína en un medio de cultivo de mamífero inicial estándar.

Esta expansión puede hacerse, por ejemplo, en matraces agitados. En una modalidad de la invención, la expansión ocurre mediante el cultivo a aproximadamente 1-2 x 106 células/ml, dilución de una muestra de estas células (por ejemplo, a una densidad de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml) y a continuación, volver a cultivar a aproximadamente 1-2 x 106 células/ml, durante aproximadamente 10-30 ciclos. 2 - inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial con las células expandidas, a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml, y agregar suplementos al medio. Los suplementos son hidrolisados de soya y/o de trigo, alimentación de aminoácidos, alimentación de vitaminas/sales, alimentación de nutrientes, glucosa y L-glutamina.

El día de la inoculación es el "día 0", el siguiente día es el "día 1", el siguiente día es el "día 2", y así sucesivamente.

Los hidrolisados de soya y/o de trigo se agregan, por ejemplo, ya sea en el día 0 o después de que se ha alcanzado la densidad celular viable de más de aproximadamente 106 células/ml. En una modalidad de la invención, el hidrolisado se agrega simplemente en el día 3.

Las alimentaciones de aminoácidos (discutidas anteriormente) se agregan, por ejemplo, en el día 0, por ejemplo, para alcanzar concentraciones del cultivo final aproximadas como se expone a continuación (no incluyendo la concentración de ningún componente indicado de otras fuentes, tales como del medio de cultivo de células de mamífero inicial): Componente Concentración final en el cultivo (mq/litro) L-arginina 126.4 L-cistina 34 L-histidina 42 L-isoleucina 52 L-leucina 52 L-lisina 72 L-Metionina 15.2 L-fenilalanina 33 L-treonina 47.6 L-triptófano 10.2 L-tirosina 36 L-valina 46.8 L-alanina 8.9 L-asparagina 30 Ácido L-aspártico 26.6 Ácido L-glutámico 29.4 Glicina 15 L-prolina 23 L-serina 21 En una modalidad de la invención, las alimentaciones de aminoácidos no se agregan al medio.

La solución de alimentación de vitamina/sales (discutida anteriormente) se agrega, por ejemplo, entre los días 3 y 5 o cuando la densidad celular viable alcanza aproximadamente 1.2 x 106 células/ml, por ejemplo, para alcanzar las concentraciones del cultivo final aproximadas expuestas a continuación (no incluyendo la concentración de ningún componente indicado de otras fuentes tales como el medio de cultivo de células de mamífero inicial): Componente Concentraciones en el cultivo final fmq/litro) Selenito de sodio 0.01426 Sulfato de adenina 1.632 Adenosina 17.6 Citidina 17.6 Guanosina 17.6 Uridina 17.6 Hipoxantina 11.8 L-citrulina 12.6 L-ornitina-HCI 25.6 Biotina 0.28 Dinucleótido de Flavina Adenina 0.05 Ácido Fólico 4.6 Ácido Lipoico 0.52 Niacina 31.4 Piridoxina HCI 3 Riboflavina 1.86 Tiamina HCI 16 Vitamina E 0.376 Vitamina B12 3.4 Cloruro de colina 50.2 Etanolamina HCI 4.4 i-lnositol 73.2 Timidina 7.8 Putrescina 2HCI 0.4 Progesterona 0.015 Pantotenato de D-Calcio 23.8 Algunos componentes de la alimentación de vitaminas/sales también están en otras alimentaciones, tales como la alimentación de aminoácidos. Estas concentraciones del cultivo final son de los componentes de la alimentación de vitaminas/sales, y no reflejan las concentraciones acumulativas de los componentes indicados de la alimentación de aminoácidos y la alimentación de vitaminas/sales.

La alimentación de nutrientes (discutida anteriormente) se agrega, por ejemplo, entre los días 3 y 5 o cuando la densidad celular viable alcanza aproximadamente 1.2 x 106 células/ml, por ejemplo, para alcanzar las concentraciones del cultivo final aproximadas expuestas a continuación (no incluyendo la concentración de ningún componente indicado de otras fuentes, tales como el medio de cultivo de células de mamífero inicial o la alimentación de aminoácidos): Componente Concentración del cultivo final (mg/litro) L-asparagina 812 mg/litro L-prolina 216 mg/litro L-isoleucina 370 mg/litro L-cisteína-HCI 224 mg/litro L-leucina 332 mg/litro L-treonina 164 mg/litro L-tirosina 198 mg/litro L-arginina 186 mg/litro Ácido L-aspártico 71 mg/litro Ácido L-glutámico 126 mg/litro Glicina 57 mg/litro L-histidina 125 mg/litro L-metionina 132 mg/litro L-triptófano 99 mg/litro L-lisina 293 mg/litro L-fenilalanina 174 mg/litro L-valina 262 mg/litro L-serina 260 mg/litro Fosfato de sodio monobásico 288.2 mg/litro Sulfato de zinc 1.08 mg/litro Sulfato cúprico 0.0032 mg/litro Vanadato de amonio 0.00078 mg/litro Cloruro de cobalto 0.0025 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel 0.0004 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio 0.00016 mg/litro Dihidrato de cloruro de estaño 0.00008 mg/litro Tetrahidrato de cloruro de manganeso 0.0003 mg/litro Algunos componentes de la alimentación de nutrientes también están en otras alimentaciones, tales como la alimentación de aminoácidos. Estas concentraciones del cultivo final son de los componentes de la alimentación de nutrientes, y no reflejan las concentraciones acumulativas de los componentes indicados de la alimentación de aminoácidos y la alimentación de nutrientes.

La glucosa se agrega, por ejemplo, cuando la concentración de glucosa en el medio de cultivo cae por debajo de aproximadamente 1.5 g/litro y la L-glutamina de agrega, por ejemplo, cuando la concentración de glutamina en el medio de cultivo cae por debajo de aproximadamente 150 mg/litro. 3 - Opcionalmente, recolectar las células del cultivo de células de producción, por ejemplo, cuando la viabilidad está por debajo de 60%, retirando las células del medio de cultivo (por ejemplo, disminuyendo la temperatura de las células a aproximadamente 15°C, agregando amortiguador de fosfato de sodio para estabilizar el pH a aproximadamente 6.8 y centrifugar el medio de cultivo para clarificarlo de células). Si la proteína se secreta, el medio puede retenerse para el procesamiento adicional, si la proteína no se secreta, las células pueden retenerse para el procesamiento adicional.

Cualquiera de varios métodos puede utilizarse para retirar las células del medio, por ejemplo, mediante centrifugación. Por ejemplo, utilizando una centrífuga de pila de discos continua, por ejemplo, con una velocidad de flujo/sigma (cm/segundo) de aproximadamente 9.27 x 10"7.

Además, el medio puede filtrarse para retirar las células, por ejemplo, mediante filtración profunda con o sin una centrífuga. Por ejemplo, con una centrífuga, el proceso puede, en una modalidad de la invención, comprender el uso de un filtro de 8 ± 2 L de caldo/pie2 (por ejemplo, un filtro de celulosa cargado); sin una centrífuga, el proceso puede, en una modalidad de la invención, comprender el uso de un filtro de 20 + 3 L de caldo/pie2.

Además, el medio puede filtrarse a través de un filtro fino, por ejemplo, con un tamaño de poro de 0.2 mieras (por ejemplo, un filtro de PVDF), y; 4 - Opcionalmente, purificar además la proteína, por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, de manera cromatográfica.

Opcionalmente, cuando se utiliza el proceso de nivel 3 o el mejorado, la osmolalidad del cultivo se cambia a aproximadamente 400 mOsm a aproximadamente 500 mOsm (discutida anteriormente). En una modalidad de la invención, este desplazamiento ocurre cuando las células están a una densidad de, o por encima de 1 x 106 células/ml.

Opcionalmente, cuando se utiliza el proceso de nivel 3 o el mejorado, la temperatura del cultivo se cambia de 33°C a aproximadamente 35°C (discutido anteriormente). En una modalidad de la invención, este cambio ocurre, en una modalidad de la invención, entre los días 4 y 8, por ejemplo, cuando el cambio en la densidad celular viable durante un periodo de 24 horas es menor de 10%.

En una modalidad de la invención, cuando se utiliza el proceso de nivel 3 o el mejorado, la concentración de O2 en el cultivo de células, el pH y las condiciones de temperatura se verifican de manera continua y se ajustan durante el cultivo celular. En una modalidad de la invención, la concentración de O2 se verifica y mantiene a aproximadamente 60% durante el cultivo celular; y/o el pH se verifica de manera continua y se mantiene a aproximadamente 6.8 (por ejemplo, ± 0.02) durante el cultivo celular; y/o la temperatura se verifica de manera continua y se mantiene a aproximadamente 36.5°C (por ejemplo, aproximadamente ± 0.5°C) durante el cultivo celular.

El cultivo celular puede realizarse en cualquiera de varios sistemas. Por ejemplo, el cultivo celular puede hacerse en un matraz simple, por ejemplo, un matraz de vidrio agitado. Otros sistemas incluyen biorreactores de tanque, biorreactores de bolsa y biorreactores desechables. Un biorreactor de tanque incluye, típicamente, un recipiente de metal (por ejemplo, un recipiente enchaquetado de acero inoxidable), en el cual las células se cultivan en un medio líquido. Los biorreactores de tanque pueden utilizarse para una amplia gama de volúmenes de cultivo (por ejemplo, 100 I, 150 I, 10000 I, 15000 I). Los biorreactores de tanque con frecuencia tienen características adicionales para controlar las condiciones del cultivo celular, incluyendo medios para el control de la temperatura, agitación del medio, controlar las concentraciones del gas que se burbujea, controlar el pH, controlar la concentración de O2, retirar las muestras del medio, indicación y control del peso del reactor, elementos físicos para la limpieza, esterilización de los elementos físicos tubería o tubos para suministrar todos los servicios, agregar el medio, control del pH, control de las soluciones, y control de los gases, bombear los fluidos estériles al recipiente de cultivo y control de supervisión y adquisición de datos. Las clasificaciones del biorreactor de tanque incluyen reactores de tanque agitado, en donde se utilizan agitadores mecánicos (por ejemplo, impulsores) para mezclar el reactor para distribuir el calor y los materiales (tales como el oxígeno y los sustratos). Los reactores de columna de burbuja son reactores altos que utilizan aire solo para mezclar el contenido. Los reactores de aire son similares a los reactores de columna de burbujas, pero difieren del hecho de que contienen un tubo de corriente de aire. El tubo de corriente de aire es típicamente un tubo interno que mejora la circulación y transferencia del oxígeno e iguala las fuerzas cortantes en el reactor. En los reactores de lecho fluidizado, las células se "inmovilizan" en pequeñas partículas que se mueven con el fluido. Las partículas pequeñas crean un área superficial grande para que las células se adhieran, y permite una alta velocidad de transferencia de oxigeno y nutrientes a las células. En los reactores de lecho empacado, las células se inmovilizan en partículas grandes. Estas partículas no se mueven con el líquido. Los reactores de lecho empacado son simples de construir y operar, pero pueden sufrir de bloqueos y de una pobre transferencia de oxígeno. Un biorreactor desechable es un biorreactor desechable de un solo uso. Con frecuencia, los biorreactores desechables poseen características similares a los biorreactores no desechables (por ejemplo, sistema de agitación, burbujeo, sondas, aberturas, etc.).

La presente invención incluye además cualquier medio de cultivo líquido generado por cualquiera de los procesos expuestos en la presente; por ejemplo, producido mediante un proceso que comprende inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial, precalentado a aproximadamente 37°C; medio el cual comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y que no comprende L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales; con células hospederas CHO DXB11 , que expresan la inmunoglobulina de cadena ligera y la inmunoglobulina de cadena pesada del anticuerpo, a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml; y agregando los siguientes suplementos al medio antes, de manera simultánea, o inmediatamente después de la inoculación: hidrolisado de soya a una concentración final de aproximadamente 10 g/litro; y, opcionalmente, una alimentación de aminoácidos, en donde la concentración de los componentes agregados por la alimentación de aminoácidos son aproximadamente aquellas expuestas a continuación: L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina: 52 mg/litro L-leucina: 52 mg/litro L-lisina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalanina: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; y, cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1.2 x 106 células/ml, agregar alimentaciones de suplemento, en donde la concentración de los componentes agregados por las alimentaciones de suplemento son aproximadamente aquellas expuestas a continuación: Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro L-asparagina: 812 mg/litro L-prolina: 216 mg/litro L-isoleucina: 370 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-leucina: 332 mg/litro L-treonina: 164 mg/litro L-tirosina: 198 mg/litro L-arginina: 186 mg/litro Ácido L-aspártico: 71 mg/litro Ácido L-glutámico: 126 mg/litro Glicina: 57 mg/litro L-histidina: 125 mg/litro L-metionina: 132 mg/litro L-triptófano: 99 mg/litro L-lisina: 293 mg/litro L-fenilalanina: 174 mg/litro L-valina: 262 mg/litro L-serina: 260 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro; y, durante el cultivo celular, agregar glucosa al medio cuando los niveles de glucosa caen por debajo de aproximadamente 1.5 g/litro y agregar L-glutamina cuando los niveles de L-glutamina caen por debajo de aproximadamente 150 mg/litro; y durante el cultivo celular, mantener la concentración de 02 a aproximadamente 60%; el pH a aproximadamente 6.8 ± 0.02 y la temperatura a aproximadamente 36.5°C ± 0.5°C; por ejemplo, en donde el medio comprende células que han alcanzado 60% de viabilidad.

EJEMPLOS La siguiente información se proporciona para describir más claramente la presente invención, y no debe interpretarse como que limita la presente invención. Cualquiera y todas de las composiciones y métodos descritos a continuación, completos o en parte, caen dentro del alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1 Expresión de anti-IGF1 R utilizando el proceso de nivel 3 y el mejorado Se realizaron varias corridas utilizando el proceso mejorado y el proceso de nivel 3. En esas corridas, se cultivaron las células CHO DXB11 que expresan las cadenas LCF (kappa) y HCA (gamma-1) de anti-IGF1R. El medio de cultivo de células de mamífero inicial al cual se le agregaron los suplementos, fue el medio EX-CELL ACF CHO (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO).

Se realizó un conjunto de corridas similar, en donde no hubo adiciones de alimentaciones (excepto para la glutamina y la glucosa durante el proceso). Bajo estas condiciones, se obtuvo un título de 435 mg/L. Este título se estimó cuantificando la inmunoglobulina producida que se adhirió de manera específica a la proteína A. Los títulos obtenidos en las siguientes corridas del proceso de nivel 3 y el mejorado se estimaron cuantificando la inmunoglobulina que se adhirió a un sustrato de cromatografía en fase inversa. Se había obtenido un título estimado de aproximadamente 300 mg/L en la corrida sin la adición de alimentaciones en el que se utilizó el método de cuantificación en fase inversa.

Con relación al título obtenido en la corrida que excluye la adición de alimentaciones, los procesos de nivel 3 y el mejorado (discutidos anteriormente), producen títulos muy superiores.

Proceso mejorado Las células se inocularon inicialmente a 3-4 x 105 células/ml el medio EX-CELL ACF CHO (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO), que precalentó a 37°C y se ajustó a pH 6.8.

CUADRO 1 Alimentaciones agregadas para las corridas del proceso mejorado Alimentación SHYS: una alimentación de hidrolisado de soya 200 g/L (acuoso) de DMV international (Países Bajos) Alimentación Hys: una alimentación de hidrolisado de soya 200 g/L (acuoso) de Kerry Biosciences Alimentación CHO 1 : Alimentación de vitaminas/sales 50X Alimentación CHO 2: Alimentación de nutrientes 50X Alimentación de aminoácidos 50X Alimentación de aminoácidos 100X El pH se verificó de manera continua y se ajustó a un punto de referencia de 6.8.

La concentración de oxígeno se verificó de manera continua y se ajustó a un punto de referencia de 60%.

La temperatura se verificó de manera continua y se mantuvo a 37 ± 1°C. Se realizó un cambio de la temperatura durante el proceso a 34°C en las partidas indicadas.

La glucosa se agregó, por ejemplo, cuando la concentración de glucosa en el medio de cultivo cayó por debajo de 1.5 g/litro y la L-glutamina se agregó, por ejemplo, cuando la concentración de glutamina en el medio de cultivo cayó por debajo de 150 mg/litro. La osmolalidad se cambió a más de 400 mOsm de la adición de la alimentación de nutrientes. Las células se recolectaron entre los días 21-24, excepto para las partidas 3 y 4, que se recolectaron antes (días 14-18); generalmente, cuando la viabilidad celular se redujo a aproximadamente 60%.

CUADRO 2 Resultados de las corridas del proceso mejorado * Corrida de la partida abreviada La adición de las alimentaciones de aminoácidos puede omitirse cuando las alimentaciones de nutrientes se utilizan en el proceso mejorado.

Proceso de nivel 3 Las células se inocularon inicialmente a 3-4 x 105 células/ml en el medio EX-CELL ACF CHO (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO), que se precalentó a 37°C y se ajustó a pH 6.8.

CUADRO 3 Alimentaciones agregadas para el proceso de nivel 3 Partida Alimentaciones Tiempo que Relación de Cambio de la agregadas se agregó volumen temperatura (volumen de la durante el alimentación / proceso volumen de la partida ) A Alimentación SHYS Día O 0.05 No Alimentación de Día O 0.02 aminoácidos 50X Alimentación de Día O 0.01 aminoácidos 100X Alimentación CHO 1 Dia 3 0.02 B Alimentación SHYS Día O 0.05 No Alimentación de Día O 0.02 aminoácidos 50X Alimentación de Día O 0.01 aminoácidos 100X Alimentación CHO 1 Día 3 0.02 Alimentación SHYS: una alimentación de hidrolisado de soya 200 g/L (acuoso) de DMV international (Países Bajos) Alimentación CHO 1 : Alimentación de vitaminas/sales 50X Alimentación de nutrientes 50X Alimentación de aminoácidos 100X El pH se verificó de manera continua y se mantuvo a 6.8 ± 0.02.

La temperatura se verificó de manera continua y se mantuvo a 36.5 + 0.5°C.

La glucosa se agregó, por ejemplo, cuando la concentración de glucosa en el medio de cultivo cayó por debajo de 1.5 g/litro y la L-glutamina se agregó, por ejemplo, cuando la concentración de glutamina en el medio de cultivo cayó por debajo de 150 mg/litro.

CUADRO 4 Resultados de las corridas del proceso de nivel 3 Las alimentaciones utilizadas y las concentraciones de los componentes de cada alimentación se exponen a continuación.

CUADRO 5 Alimentación de vitaminas/sales Componente Concentración en la Concentración final alimentación (g/L) en el cultivo (mg/L) Selenito de sodio 7.13 X 10-4 0.01426 Sulfato de adenina 0.0816 1.632 Adenosina 0.88 17.6 Citidina 0.88 17.6 Guanosina 0.88 17.6 Uridina 0.88 17.6 Hipoxantina 0.59 1 1.8 L-citrulina 0.63 12.6 L-ornitina-HCI 1.28 25.6 Biotina 0.014 0.28 Dinucleótido de Flavina 0.0025 0.05 Adenina Ácido Fólico 0.23 4.6 Ácido Lipoico 0.026 0.52 Niacina 1.57 31.4 Piridoxina HCI 0.15 3 Riboflavina 0.093 1.86 Tiamina HCI 0.8 16 Vitamina E 0.0188 0.376 Vitamina B12 0.17 3.4 Cloruro de colina 2.51 50.2 Etanolamina HCI 0.22 4.4 i-lnositol 3.66 73.2 Timidina 0.39 7.8 Putrescina 2HCI 0.02 0.4 Progesterona 0.00075 0.015 Pantotenato de D- 1.19 23.8 Calcio CUADRO 6 Alimentación de aminoácidos #1 (50X) CUADRO 7 Alimentación de aminoácidos #2 (100X) Componente Concentración en la Concentración final alimentación (g/L) en el cultivo (mg/L) L-alanina 0.89 8.9 L-asparagina 1.5 30 Ácido L-aspártico 1.33 26.6 Ácido L-glutámico 1.47 29.4 Glicina 0.75 15 L-prolina 1.15 23 L-serina 1.05 21 CUADRO 8 Alimentación de nutrientes Componente Concentración en la Concentración final alimentación (g/L) en el cultivo (mg/L) L-asparag¡na 40.6 812 L-serina 13 260 L-prolina 10.81 216 L-isoleucina 18.53 370 L-cisteína-HCI 1 1.19 224 L-leucina 16.58 332 L-treonina 8.2 164 L-tirosina 9.9 198 L-arginina 9.29 186 Ácido L-aspártico 3.56 71 Ácido L-glutámico 6.28 126 glicina 2.83 57 L-histidina 6.23 125 L-metionina 6.58 132 L-triptófano 4.93 99 L-lisina 14.66 293 L-fenilalanina 8.64 174 L-valina 13.08 262 Fosfato de sodio 14.41 288.2 monobásico Sulfato de zinc 0.054 1.08 Sulfato cúprico 0.00016 0.0032 Vanadato de amonio 0.000039 0.00078 Cloruro de cobalto 0.000125 0.0025 Hexa hidrato de 0.00002 0.0004 dicloruro de níquel Dihidrato de molibdato 0.000008 0.00016 de sodio Dihidrato de cloruro de 0.000004 0.00008 estaño Tetrahidrato de cloruro 0.000015 0.0003 de manganeso La presente invención no debe limitarse en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. En realidad, el alcance de la presente invención incluye las modalidades expuestas de manera específica en la presente y otras modalidades no expuestas de manera específica en la presente; las modalidades expuestas de manera específica en la presente no pretenden necesariamente ser exhaustivas. Varias modificaciones de la invención, además de aquéllas descritas en la presente, se volverán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones.

Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones de productos y protocolos se citan a través de esta solicitud, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir una proteína, que comprende inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial con células hospederas que expresan la proteína y agregar suplementos, que comprenden: glucosa; L-glutamina; hidrolisado de soya o hidrolisado de trigo o ambos; sulfato de adenina; adenosina; vanadato de amonio; biotina; cloruro de colina; cloruro de cobalto; sulfato cúprico; citidina; pantotenato de D-calcio; etanolamina HCI; dinucleótido de Flavina Adenina; ácido fólico; glicina; guanosina; hipoxantina; i-lnositol; L-alanina; L-arginina; L-asparagina; ácido L-aspártico; L-citrulina; L-cisteína-HCI; L-cistina; ácido L-glutámico; L-histidina; ácido lipoico; L-isoleucina; L-leucina; L-lisina; L-metionina; L-ornitina-HCI; L-fenilalanina; L-prolina; L-serina; L-treonina; L-triptófano; L-tirosina; L-valina; tetrahidrato de cloruro de manganeso; niacina; hexahidrato de dicloruro de níquel; progesterona; putrescina 2HCI; piridoxina HCI; riboflavina; dihidrato de molibdato de sodio; fosfato de sodio monobásico; selenito de sodio; tiamina HCI; timidina; dihidrato de cloruro de estaño; uridina; vitamina B12; vitamina E; y sulfato de zinc al medio.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la concentración final de los componentes agregados al medio de los suplementos son aquéllas expuestas a continuación: Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Glicina: 72 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-arginina: 312.4 mg/litro L-asparagina: 842 mg/litro Ácido L-aspártico: 97.6 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro Ácido L-glutámico: 155.4 mg/litro L-histidina: 167 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro L-isoleucina: 422 mg/litro L-leucina: 384 mg/litro L-lisina: 365 mg/litro L-metionina: 147.2 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro L-fenilalanina: 207 mg/litro L-prolina: 239 mg/litro L-serina: 281 mg/litro L-treonina: 211.6 mg/litro L-triptófano: 109.2 mg/litro L-tirosina: 234 mg/litro L-valina: 308.8 mg/litro Tetrahidrato de cloruro de manganeso: 0.0003 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Dihidrato de cloruro de estaño: 0.00008 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Glucosa: 1.5 g/litro L-glutamina: 150 mg/litro

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado además porque los suplementos se agregan de una alimentación de aminoácidos que comprende aminoácidos a aproximadamente las siguientes concentraciones: L-arginina: 6.32 g/litro L-cistina: 1.7 g/litro L-histidina: 2.1 g/litro L-isoleucina: 2.6 g/litro L-leucina: 2.6 g/litro L-lisina: 3.6 g/litro L-Metionina: 0.76 g/litro L-fenilalanina: 1.65 g/litro L-treonina: 2.38 g/litro L-triptofano: 0.51 g/litro L-tirosina: 1.8 g/litro L-valina: 2.34 g/litro.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque aproximadamente 20 mi de la alimentación de aminoácidos se agregan por litro de medio de cultivo.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los suplementos se agregan de una alimentación de aminoácidos que comprende aminoácidos a aproximadamente las siguientes concentraciones: L-alanina: 0.89 g/litro L-asparagina: 1.5 g/litro Ácido L-aspártico: 1.33 g/litro Ácido L-glutámico: .47 g/litro Glicina: 0.75 g/litro L-prolina: 1.15 g/litro L-serina: 1.05 g/litro.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque aproximadamente 10 mi de alimentación de aminoácidos se agregan por litro de medio de cultivo.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los suplementos se agregan de una alimentación de nutrientes que comprende suplementos a aproximadamente las siguientes concentraciones: L-asparagina: 40.6 g/litro L-prolina: 10.81 g/litro L-isoleucina: 18.53 g/litro L-cisteína-HCI: 11.19 g/litro L-leucina 16.58 g/litro L-treonina 8.2 g/litro L-tirosina: 9.9 g/litro L-arginina: 9.29 g/litro Ácido L-aspártico: 3.56 g/litro Ácido L-glutámico: 6.28 g/litro Glicina 2.83 g/litro L-histidina: 6.23 g/litro L-metionina: 6.58 g/litro L-triptófano: 4.93 g/litro L-lisina: 14.66 g/litro L-fenilalanina: 8.64 g/litro L-valina: 13.08 g/litro L-serina: 13 g/litro Fosfato de sodio monobásico: 14.41 g/litro Sulfato de zinc: 0.054 g/litro Sulfato cúprico: 0.00016 g/litro Vanadato de amonio: 0.000039 g/litro Cloruro de cobalto: 0.000125 g/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.00002 g/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.000008 g/litro Dihidrato de cloruro de estaño: 0.000004 g/litro Tetrahidrato de cloruro de manganeso: 0.000015 g/litro.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque aproximadamente 20 mi de alimentación de nutrientes se agregan por litro de medio de cultivo.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque los suplementos se agregan de una alimentación de vitaminas/sales, que comprende suplementos a aproximadamente las siguientes concentraciones: Selenito de sodio: 7.13 X 10-4 g/litro Sulfato de adenina: 0.0816 g/litro Adenosina: 0.88 g/litro Citidina: 0.88 g/litro Guanosina: 0.88 g/litro Uridina: 0.88 g/litro Hipoxantina: 0.59 g/litro L-citrulina: 0.63 g/litro L-ornitina-HCI: 1.28 g/litro Biotina: 0.014 g/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.0025 g/litro Ácido Fólico: 0.23 g/litro Ácido Lipoico: 0.026 g/litro Niacina: 1.57 g/litro Piridoxina HCI: 0.15 g/litro Riboflavina: 0.093 g/litro Tiamina HCI: 0.8 g/litro Vitamina E: 0.0188 g/litro Vitamina B12: 0.17 g/litro Cloruro de colina: 2.51 g/litro Etanolamina HCI: 0.22 g/litro i-lnositol: 3.66 g/litro Timidina: 0.39 g/litro Putrescina 2HCI: 0.02 g/litro Progesterona: 0.00075 g/litro Pantotenato de D-Calcio: 1.19 g/litro.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque se agregan aproximadamente 20 mi de la alimentación de vitaminas/sales por litro de medio de cultivo.

11- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente recolectar el medio de las células hospederas; en donde la proteína se secreta de las células en el medio.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el medio de cultivo se recolecta de las células hospederas cuando la viabilidad de las células está por debajo de aproximadamente 60%.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque comprende adicionalmente purificar el medio de cultivo de las células, centrifugando el medio y/o filtrando a profundidad el medio y/o filtrando el medio a través de un filtro de 0.2 mieras.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la proteína es' una o más cadenas de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento que se une al antígeno del mismo.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el anticuerpo o el fragmento se une de manera específica a IGF1R.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento comprende una cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 , 3-6, 13, 21 y 26; o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma; y/o una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 7-9, 17 y 25, o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento secretado de la célula hospedera es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera, que comprende los aminoácidos 20-128 de la SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ó 6; y una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de la SEQ ID NO: 8 ó 9.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la inmunoglobulina de cadena ligera está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante kappa y la inmunoglobulina de cadena pesada está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante gamma-1.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio de cultivo de células de mamífero inicial al cual se agregan los suplementos, comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y no comprende L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales.

20.- Un método para producir un anticuerpo, que comprende inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial, precalentar a aproximadamente 37°C; medio inicial el cual comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y que no comprende L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales; con células hospederas CHO DXB11 que expresan la inmunoglobulina de cadena ligera y la inmunoglobulina de cadena pesada del anticuerpo, a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml; y, agregar los siguientes suplementos al medio antes, de manera simultánea con, o inmediatamente después de la inoculación: hidrolisado de soya a una concentración final de aproximadamente 10 g/litro; y, opcionalmente, una alimentación de aminoácidos, en donde la concentración de los componentes agregados por la alimentación de aminoácidos son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina: 52 mg/litro L-leucina: 52 mg/litro L-lisina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalanina: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro Glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; y, cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1.2 x 106 células/ml, agregar alimentaciones de suplemento, en donde la concentración de los componentes agregados por las alimentaciones de suplemento son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro L-asparagina: 812 mg/litro L-prolina: 216 mg/litro L-isoleucina: 370 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-leucina: 332 mg/litro L-treonina: 164 mg/litro L-tirosina: 198 mg/litro L-arginina: 186 mg/litro Ácido L-aspártico: 71 mg/litro Ácido L-glutámico: 126 mg/litro Glicina: 57 mg/litro L-histidina: 125 mg/litro L-metionina: 132 mg/litro L-triptófano: 99 mg/litro L-lisina: 293 mg/litro L-fenilalaniria: 174 mg/litro L-valina: 262 mg/litro L-serina: 260 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro; y, mantener la concentración de glucosa en el medio a aproximadamente 1 .5 g/litro y mantener la concentración de L-glutamina en el medio a aproximadamente 150 mg/litro; y durante el cultivo celular mantener la concentración de O2 a aproximadamente 60%; el pH a aproximadamente 6.8 ± 0.02 y la temperatura a aproximadamente 36.5°C ± 0.5°C; y, opcionalmente, eliminar las células hospederas del medio cuando la viabilidad celular está por debajo de aproximadamente 60%.

21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 , 3-6, 13, 21 y 26; o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma; y/o una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 7-9, 17 y 25, o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento comprende un anticuerpo secretado de las células hospederas, que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-128 de la SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ó 6; y una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de la SEQ ID NO: 8 ó 9.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la inmunoglobulina de cadena ligera está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante kappa y la inmunoglobulina de cadena pesada está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante gamma-1.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque comprende adicionalmente recuperar el medio de cultivo de las células mediante centrifugación con pila de discos del medio, filtración profunda del medio y filtración del medio a través de un filtro con un tamaño de poro de aproximadamente 0.2 mieras.

25. - El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende adicionalmente purificar las inmunoglobulinas del medio mediante fraccionación cromatográfica en columna.

26.- Un medio de cultivo celular líquido acuoso que comprende: aproximadamente 10 g/litro de hidrolisado de soya, aproximadamente 1.5 g/litro de glucosa, aproximadamente 150 mg/litro de L-glutamina, pH de aproximadamente 6.8 ± 0.02, HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina recombinante humana, elementos en trazas, agentes tensoactivos, una alimentación de aminoácidos, en donde la concentración de los componentes agregados por la alimentación de aminoácidos son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina: 52 mg/litro L-leucina: 52 mg/litro L-lisina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalanina: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro Glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; en donde el medio no comprende antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales.

27.- Un medio de cultivo líquido acuoso producido mediante un proceso que comprende inocular un medio de cultivo de células de mamífero inicial, precalentar a aproximadamente 37°C; medio el cual comprende HEPES, amortiguadores de bicarbonato de sodio, sales inorgánicas, aminoácidos no esenciales, insulina humana recombinante, elementos en trazas y agentes tensoactivos; y que no comprende L-glutamina, antibióticos, antimicóticos o componentes derivados de animales; con células hospederas CHO DXB11 que expresan una inmuno-globulina de cadena ligera y la inmunoglobulina de cadena pesada del anticuerpo, a una densidad celular de aproximadamente 2.5-5 x 105 células/ml; y, agregar los siguientes suplementos al medio antes, de manera simultánea, o inmediatamente después de la inoculación: hidrolisado de soya a una concentración final de aproximadamente 10 g/litro; y, opcionalmente, una alimentación de aminoácidos, en donde la concentración de los componentes agregados por la alimentación de aminoácidos son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: L-arginina: 126.4 mg/litro L-cistina: 34 mg/litro L-histidina: 42 mg/litro L-isoleucina: 52 mg/litro L-leucina: 52 mg/litro L-lisina: 72 mg/litro L-Metionina: 15.2 mg/litro L-fenilalanina: 33 mg/litro L-treonina: 47.6 mg/litro L-triptófano: 10.2 mg/litro L-tirosina: 36 mg/litro L-valina: 46.8 mg/litro L-alanina: 8.9 mg/litro L-asparagina: 30 mg/litro Ácido L-aspártico: 26.6 mg/litro Ácido L-glutámico: 29.4 mg/litro Glicina: 15 mg/litro L-prolina: 23 mg/litro L-serina: 21 mg/litro; y, cuando la densidad celular viable alcanza más de aproximadamente 1.2 x 106 células/ml, agregar alimentaciones de suplemento, en donde la concentración de los componentes agregados por las alimentaciones de suplemento son aproximadamente aquéllas expuestas a continuación: Selenito de sodio: 0.01426 mg/litro Sulfato de adenina: 1.632 mg/litro Adenosina: 17.6 mg/litro Citidina: 17.6 mg/litro Guanosina: 17.6 mg/litro Uridina: 17.6 mg/litro Hipoxantina: 11.8 mg/litro L-citrulina: 12.6 mg/litro L-ornitina-HCI: 25.6 mg/litro Biotina: 0.28 mg/litro Dinucleótido de Flavina Adenina: 0.05 mg/litro Ácido Fólico: 4.6 mg/litro Ácido Lipoico: 0.52 mg/litro Niacina: 31.4 mg/litro Piridoxina HCI: 3 mg/litro Riboflavina: 1.86 mg/litro Tiamina HCI: 16 mg/litro Vitamina E: 0.376 mg/litro Vitamina B12: 3.4 mg/litro Cloruro de colina: 50.2 mg/litro Etanolamina HCI: 4.4 mg/litro i-lnositol: 73.2 mg/litro Timidina: 7.8 mg/litro Putrescina 2HCI: 0.4 mg/litro Progesterona: 0.015 mg/litro Pantotenato de D-Calcio: 23.8 mg/litro L-asparagina: 812 mg/litro L-prolina: 216 mg/litro L-isoleucina: 370 mg/litro L-cisteína-HCI: 224 mg/litro L-leucina: 332 mg/litro L-treonina: 164 mg/litro L-tirosina: 198 mg/litro L-arginina: 186 mg/litro Ácido L-aspártico: 71 mg/litro Ácido L-glutámico: 126 mg/litro Glicina: 57 mg/litro L-histidina: 125 mg/litro L-metionina: 132 mg/litro L-triptófano: 99 mg/litro L-lisina: 293 mg/litro L-fenilalanina: 174 mg/litro L-valina: 262 mg/litro L-serina: 260 mg/litro Fosfato de sodio monobásico: 288.2 mg/litro Sulfato de zinc: 1.08 mg/litro Sulfato cúprico: 0.0032 mg/litro Vanadato de amonio: 0.00078 mg/litro Cloruro de cobalto: 0.0025 mg/litro Hexahidrato de dicloruro de níquel: 0.0004 mg/litro Dihidrato de Molibdato de sodio: 0.00016 mg/litro; y, mantener la concentración de glucosa en el medio a aproximadamente 1.5 g/litro y mantener la concentración de L-glutamina en el medio a aproximadamente 150 mg/litro; y durante el cultivo celular mantener la concentración de 02 a aproximadamente 60%; el pH a aproximadamente 6.8 ± 0.02 y la temperatura a aproximadamente 36.5°C ± 0.5°C.

28.- El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque las células hospederas comprenden un vector que codifica las inmunoglobulinas del anticuerpo, en donde el anticuerpo se secreta en el medio.

29.- El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la viabilidad de la célula hospedera es de aproximadamente 60% o menor, y/o en donde el crecimiento de la célula hospedera se produce durante aproximadamente 14 a 24 días.

30.- El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque las células hospederas se retiran del medio.

31. - El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque las células hospederas se retiran del medio centrifugando el medio y/o filtrando a profundidad el medio y/o filtrando el medio a través de un filtro de 0.2 mieras.

32. - El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el anticuerpo se une de manera específica a IGF1 R.

33.- El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la cadena pesada de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en un miembro seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1 , 3-6, 13, 21 y 26; o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma; y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 2, 7-9, 17 y 25, o un fragmento maduro de la misma o una o más CDR de la misma.

34. - El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo que se selecciona de la célula hospedera que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera que comprende los aminoácidos 20-128 de la SEQ ID NOs: 3, 4, 5 ó 6; y una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende los aminoácidos 20-137 de la SEQ ID NO: 8 ó 9.

35. - El medio de cultivo líquido acuoso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la inmunoglobulina de cadena ligera está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante kappa y la inmunoglobulina de cadena pesada está enlazada a una cadena de inmunoglobulina constante gamma-1.

36. - Un recipiente que comprende el medio de cultivo liquido acuoso de la reivindicación 27.

37. - El recipiente de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque es un matraz, un biorreactor, un biorreactor de tanque, un biorreactor de bolsa o un biorreactor desechable.

38. - El recipiente de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el biorreactor es un biorreactor de tanque agitado, un biorreactor de columna de burbujas, un biorreactor de aire, un biorreactor de lecho fluidizado o un biorreactor de lecho empacado.