CN115369069B - 293细胞补料培养基及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种293细胞补料培养基及其制备和应用，所述293细胞补料培养基包含氨基酸、维生素无机盐、葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水。相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：本发明通过氨基酸、维生素和无机盐种类的选择，并搭配葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，形成特定配方的培养基配方，在采用生长培养基培养293细胞的过程中补加该培养基配方，能够很好地维持细胞密度增长并保持较高的细胞活率，同时维持细胞蛋白抗体浓度持续升高，同时该补料对于病毒的表达滴度亦有帮助作用。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，特别涉及293细胞补料培养基及其制备和应用。
背景技术
293细胞是腺病毒和慢病毒及载体复制和包装的重要细胞系，是用5型腺病毒75株系转化、含有Ad5 E1区的人胚肾细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，为人亚三倍体细胞系。同时，293细胞也是重组蛋白及抗体表达的重要平台。
随着悬浮培养技术愈加成熟，悬浮细胞在无血清培养基中得以放大培养，加之293细胞来源于人，且在蛋白的翻译和修饰功能方面具有独特的优势，也比较容易转染，常用于外源基因的表达，这使得293细胞在生物制药领域的用途愈加广泛。
分批补料式培养是细胞放大培养的有效方式，主要是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。分批补料式培养不仅避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成，还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成，是确保细胞维持增殖的有效手段。
鉴于293细胞在腺病毒和慢病毒制备等中的广泛应用，对293细胞进行放大培养是必要的，然而目前分批补料式培养还未成功应用于293细胞，适用于293细胞的补料培养基还未曾被报道。
发明内容
基于此，本发明的目的包括提供一种293细胞补料培养基，在采用生长培养基培养293细胞的过程中补加该培养基，能够很好地维持细胞密度增长并保持较高的细胞活率，同时维持细胞蛋白抗体浓度持续升高。
在本发明的第一方面，提供一种293细胞补料培养基，所述293细胞补料培养基包含1312.2mg/L-16780mg/L氨基酸、23.9mg/L-562.6mg/L维生素、681.875mg/L-11328.1mg/L无机盐、2250mg/L-12000mg/L葡萄糖、100mg/L-1650mg/L丙酮酸钠、4mg/L-70mg/L次黄嘌呤、0.7mg/L-10.89mg/L胸腺嘧啶核苷和水；其中，
所述氨基酸包含L-谷氨酸、L-脯氨酸、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、胱氨酸二盐酸盐、谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；
所述维生素包含氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B12；
所述无机盐包含九水硝酸铁、七水氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌和亚硒酸钠。
在本发明的一些实施方式中，所述L-谷氨酸的浓度为28.2mg/L-200mg/L，所述L-脯氨酸的浓度为80mg/L-379mg/L，所述甘氨酸的浓度为60mg/L-450mg/L，所述L-精氨酸盐酸盐的浓度为86mg/L-327mg/L，所述胱氨酸二盐酸盐的浓度为45mg/L-645mg/L，所述谷氨酰胺的浓度为292mg/L-3504mg/L，所述L-组氨酸的浓度为84mg/L-630mg/L，所述L-异亮氨酸的浓度为65mg/L-475mg/L，所述L-亮氨酸的浓度为65mg/L-1575mg/L，所述L-赖氨酸盐酸盐的浓度为46mg/L-2190mg/L，所述L-甲硫氨酸的浓度为60mg/L-450mg/L，所述L-苯丙氨酸的浓度为52mg/L-990mg/L，所述L-丝氨酸的浓度为84mg/L-330mg/L，所述L-苏氨酸的浓度为67mg/L-425mg/L，所述L-色氨酸的浓度为32mg/L-1240mg/L，所述L-酪氨酸的浓度为78mg/L-1560mg/L，所述L-缬氨酸的浓度为88mg/L-1410mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述氯化胆碱的浓度为4mg/L-124.6mg/L，所述泛酸钙的浓度为1.6mg/L-50mg/L，所述叶酸的浓度为2.3mg/L-60mg/L，所述烟酰胺的浓度为2.8mg/L-50mg/L，所述盐酸吡哆醇的浓度为1.4mg/L-50mg/L，所述核黄素的浓度为0.8mg/L-40mg/L，所述盐酸硫胺素的浓度为4mg/L-60mg/L，所述肌醇的浓度为4.2mg/L-108mg/L，所述维生素B12的浓度为2.8mg/L-20mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述九水硝酸铁的浓度为0.01mg/L-10mg/L，所述七水氯化镁的浓度为100mg/L-3005mg/L，所述氯化钾的浓度为400mg/L-6000mg/L，所述磷酸二氢钠的浓度为141mg/L-1700mg/L，所述硫酸铜的浓度为0.005mg/L-0.1mg/L，所述硫酸锌的浓度为0.86mg/L-13mg/L，所述亚硒酸钠的浓度为40mg/L-600mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述293细胞补料培养基包含120mg/L-160mg/L L-谷氨酸、180mg/L-220mg/L L-脯氨酸、135mg/L-160mg/L甘氨酸、110mg/L-130mg/L L-精氨酸盐酸盐、300mg/L-330mg/L胱氨酸二盐酸盐、1700mg/L-2000mg/L谷氨酰胺、200mg/L-220mg/L L-组氨酸、300mg/L-350mg/L L-异亮氨酸、435mg/L-475mg/L L-亮氨酸、700mg/L-750mg/L L-赖氨酸盐酸盐、125mg/L-170mg/L L-甲硫氨酸、250mg/L-300mg/L L-苯丙氨酸、200mg/L-230mg/L L-丝氨酸、250mg/L-300mg/L L-苏氨酸、650mg/L-700mg/L L-色氨酸、700mg/L-760mg/L L-酪氨酸、350mg/L-400mg/L L-缬氨酸、30mg/L-40mg/L氯化胆碱、30mg/L-40mg/L泛酸钙、5mg/L-6mg/L叶酸、30mg/L-40mg/L烟酰胺、7mg/L-8mg/L盐酸吡哆醇、20mg/L-30mg/L核黄素、5mg/L-6mg/L盐酸硫胺素、60mg/L-70mg/L肌醇、4mg/L-5mg/L维生素B12、0.2mg/L-1mg/L九水硝酸铁、750mg/L-850mg/L七水氯化镁、800mg/L-1200mg/L氯化钾、500mg/L-600mg/L磷酸二氢钠、0.005mg/L-0.05mg/L硫酸铜、3mg/L-4mg/L硫酸锌、100mg/L-200mg/L亚硒酸钠、5500mg/L-6500mg/L葡萄糖、125mg/L-175mg/L丙酮酸钠、15mg/L-20mg/L次黄嘌呤、2.5mg/L-3.5mg/L胸腺嘧啶核苷和水。
在本发明的一些实施方式中，所述293细胞补料培养基的pH值为6.8-7.4。
在本发明的第二方面，提供第一方面所述的293细胞补料培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：混合所述的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水，制备所述293细胞补料培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括将混合所得混合物的pH值调节至6.8-7.4的步骤。
在本发明的第三方面，提供一种293细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将293细胞接种于生长培养基中培养，培养的过程中添加第一方面所述的293细胞补料培养基，制备293细胞。
在本发明的一些实施方式中，添加的次数为1次-10次，每次添加的所述293细胞补料培养基的体积占所述生长培养基的体积的0.5％-10％。
在本发明的一些实施方式中，所述生长培养基为293无血清悬浮培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述293细胞的类型为悬浮型。
在本发明的一些实施方式中，培养的时间为8d-16d。
在本发明的第四方面，提供一种腺病毒的生产方法，所述生产方法包括如下步骤：
将293细胞接种于生长培养基中进行第一阶段培养，补加如第一方面所述的293细补料培养基，腺病毒接毒，进行第二阶段培养。
在本发明的一些实施方式中，所述生产方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)所述生长培养基为293无血清悬浮培养基；
(2)所述293细胞的类型为悬浮型；
(3)补加的所述293细补料培养基的体积是所述生长培养基的体积的8％-12％；
(4)第一阶段培养所得培养产物中的细胞密度为(3-4)×106cells/mL，补加所述293细补料培养基；
(5)第一阶段培养的时间为48h-72h。
相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：
本发明通过氨基酸、维生素和无机盐种类的选择，并搭配葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，形成特定配方的培养基配方，在采用生长培养基培养293细胞的过程中补加该培养基配方，能够很好地维持细胞密度增长并保持较高的细胞活率，同时维持细胞蛋白抗体浓度持续升高。同时，本发明还发现该补料培养基可以作为部分病毒生产工艺中的补料，有助于提高病毒滴度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述补料培养基和对比例培养细胞的活细胞密度和细胞活率随时间的变化图；
图2为本发明所述补料培养基和对比例添加至转染后的293细胞工艺中活细胞密度和细胞活率随时间的变化图；
图3为本发明所述补料培养基和对比例添加至转染后的293细胞工艺中所收获蛋白抗体浓度随着培养天数的变化图；
图4为实施例和对比例添加补料培养基后的腺病毒表达滴度随着培养天数的变化图；
图5为实施例和对比例添加补料培养基后的腺相关病毒(AAV)表达滴度随着培养天数的变化图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
293细胞无血清培养基众多，既有提高细胞密度的培养基，又有提高瞬时转染或蛋白表达的培养基，还有提高病毒表达方面的专用培养基，例如CN109294976A、CN104450607B、CN104450607B、CN111793595A、CN112501113B、CN111826341A记载的培养基，以及市售的DMEM培养基。然而这些培养基并不适用于作为补料培养基应用293细胞的培养。目前还缺少在生产过程中一次或多次添加的293细胞补料培养基，以补充持续培养工艺中实际营养成分与293细胞所需营养成分的匹配。市面上已报道的补料培养基有CHO细胞补料培养基，通常属于CHO细胞专用培养基，不适用于293细胞的培养。
为此，本发明通过氨基酸、维生素和无机盐的选择，以及葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的搭配，形成特定配方的培养基配方，在采用生长培养基培养293细胞的过程中补加该培养基配方，能够很好地维持细胞密度增长并保持较高的细胞活率，同时维持细胞蛋白抗体浓度持续升高。
本发明提供的293细胞补料培养基：不含碳酸氢钠，不存在该补料培养基因为长时间放置引起的二氧化碳溢出的情况，状态稳定；添加了谷氨酰胺，以补充293细胞对于谷氨酰胺需求量大的情况；不含氯化钙在内的Ca2+成分，更适用于293细胞的培养；通过单次或多次补加，在延长293细胞生长周期、维持高密度生长和活率方面效果良好，可以应用于重组蛋白、单抗或病毒表达的生产过程中；培养基成分明确，无血清无蛋白无动物来源，利于下游纯化；所含成分较全面，营养比例均衡，可适用于包含HEK293、Expi293F等在内的绝大多数293细胞，也可广泛应用于293细胞外的其他哺乳动物细胞；本发明所述补料培养基原料易得，适合大批量工业化生产；含有293细胞在高密度生产过程中的必须成分，可应用于包括批次培养、补料批次培养、灌流培养等293不同生产工艺流程及应用，通过提高细胞密度、维持细胞活率、进一步提高单位体积内重组蛋白、单抗、病毒的表达，从而提高生产效率，降低成本；该补料培养基可以通过单次添加或间隔添加，或在生产过程后期连续添加，以补充耗尽的营养物，支持细胞稳定期生长和蛋白质表达及病毒复制其最简单的形式可以仅提供葡萄糖，为细胞生长提供所需的主要碳源。
本发明的第一方面
本发明提供一种293细胞补料培养基，所述293细胞补料培养基包含1312.2mg/L-16780mg/L氨基酸、23.9mg/L-562.6mg/L维生素、681.875mg/L-11328.1mg/L无机盐、2250mg/L-12000mg/L葡萄糖、100mg/L-1650mg/L丙酮酸钠、4mg/L-70mg/L次黄嘌呤、0.7mg/L-10.89mg/L胸腺嘧啶核苷和水；其中，
所述氨基酸包含L-谷氨酸、L-脯氨酸、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、胱氨酸二盐酸盐、谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；
所述维生素包含氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇和维生素B12；
所述无机盐包含九水硝酸铁、七水氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌和亚硒酸钠。
在本发明的一些实施方式中，所述L-谷氨酸的浓度为28.2mg/L-200mg/L，所述L-脯氨酸的浓度为80mg/L-379mg/L，所述甘氨酸的浓度为60mg/L-450mg/L，所述L-精氨酸盐酸盐的浓度为86mg/L-327mg/L，所述胱氨酸二盐酸盐的浓度为45mg/L-645mg/L，所述谷氨酰胺的浓度为292mg/L-3504mg/L，所述L-组氨酸的浓度为84mg/L-630mg/L，所述L-异亮氨酸的浓度为65mg/L-475mg/L，所述L-亮氨酸的浓度为65mg/L-1575mg/L，所述L-赖氨酸盐酸盐的浓度为46mg/L-2190mg/L，所述L-甲硫氨酸的浓度为60mg/L-450mg/L，所述L-苯丙氨酸的浓度为52mg/L-990mg/L，所述L-丝氨酸的浓度为84mg/L-330mg/L，所述L-苏氨酸的浓度为67mg/L-425mg/L，所述L-色氨酸的浓度为32mg/L-1240mg/L，所述L-酪氨酸的浓度为78mg/L-1560mg/L，所述L-缬氨酸的浓度为88mg/L-1410mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述氯化胆碱的浓度为4mg/L-124.6mg/L，所述泛酸钙的浓度为1.6mg/L-50mg/L，所述叶酸的浓度为2.3mg/L-60mg/L，所述烟酰胺的浓度为2.8mg/L-50mg/L，所述盐酸吡哆醇的浓度为1.4mg/L-50mg/L，所述核黄素的浓度为0.8mg/L-40mg/L，所述盐酸硫胺素的浓度为4mg/L-60mg/L，所述肌醇的浓度为4.2mg/L-108mg/L，所述维生素B12的浓度为2.8mg/L-20mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述九水硝酸铁的浓度为0.01mg/L-10mg/L，所述七水氯化镁的浓度为100mg/L-3005mg/L，所述氯化钾的浓度为400mg/L-6000mg/L，所述磷酸二氢钠的浓度为141mg/L-1700mg/L，所述硫酸铜的浓度为0.005mg/L-0.1mg/L，所述硫酸锌的浓度为0.86mg/L-13mg/L，所述亚硒酸钠的浓度为40mg/L-600mg/L。
在本发明的一些实施方式中，所述293细胞补料培养基包含120mg/L-160mg/L L-谷氨酸、180mg/L-220mg/L L-脯氨酸、135mg/L-160mg/L甘氨酸、110mg/L-130mg/L L-精氨酸盐酸盐、300mg/L-330mg/L胱氨酸二盐酸盐、1700mg/L-2000mg/L谷氨酰胺、200mg/L-220mg/L L-组氨酸、300mg/L-350mg/L L-异亮氨酸、435mg/L-475mg/L L-亮氨酸、700mg/L-750mg/L L-赖氨酸盐酸盐、125mg/L-170mg/L L-甲硫氨酸、250mg/L-300mg/L L-苯丙氨酸、200mg/L-230mg/L L-丝氨酸、250mg/L-300mg/L L-苏氨酸、650mg/L-700mg/L L-色氨酸、700mg/L-760mg/L L-酪氨酸、350mg/L-400mg/L L-缬氨酸、30mg/L-40mg/L氯化胆碱、30mg/L-40mg/L泛酸钙、5mg/L-6mg/L叶酸、30mg/L-40mg/L烟酰胺、7mg/L-8mg/L盐酸吡哆醇、20mg/L-30mg/L核黄素、5mg/L-6mg/L盐酸硫胺素、60mg/L-70mg/L肌醇、4mg/L-5mg/L维生素B12、0.2mg/L-1mg/L九水硝酸铁、750mg/L-850mg/L七水氯化镁、800mg/L-1200mg/L氯化钾、500mg/L-600mg/L磷酸二氢钠、0.005mg/L-0.05mg/L硫酸铜、3mg/L-4mg/L硫酸锌、100mg/L-200mg/L亚硒酸钠、5500mg/L-6500mg/L葡萄糖、125mg/L-175mg/L丙酮酸钠、15mg/L-20mg/L次黄嘌呤、2.5mg/L-3.5mg/L胸腺嘧啶核苷和水。
在本发明的一些实施方式中，所述293细胞补料培养基的pH值为6.8-7.4。pH值例如为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4。
本发明提供一种293细胞补料培养基的配方，进而提供该补料培养基的配制方法，实施例还涉及部分补料培养基添加策略，通过单次或多次添加该补料培养基策略，维持293细胞密度和活率，适用于规模化培养，并有利于重组蛋白、单抗、病毒及载体的复制表达
本发明的第二方面
本发明提供第一方面所述的293细胞补料培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：混合所述的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水，制备所述293细胞补料培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述水的温度为30℃-50℃。例如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括将混合所得混合物的pH调节至6.8-7.4的步骤。例如将pH调节至6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括对混合所得混合物进行除菌的步骤。除菌的方式可以为过滤除菌，例如用0.22微米孔径的过滤器过滤除菌。
本发明的第三方面
本发明提供一种293细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将293细胞接种于生长培养基中培养，培养的过程中添加第一方面所述的293细胞补料培养基，制备293细胞。
在本发明的一些实施方式中，添加的次数为1次-10次，每次添加的所述293细胞补料培养基的体积占所述生长培养基的体积的0.5％-10％。添加的次数例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次。每次添加的所述293细胞补料培养基的体积占所述生长培养基的体积的0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％。补加可以是培养的第一天、也可以为规定间隔的补加策略，还可以是连续多次补加等。
在本发明的一些实施方式中，培养的方式包括但不限于：批次培养、补料批次培养、灌流培养等方式。
在本发明的一些实施方式中，所述生长培养基为293无血清悬浮培养基。本发明中的293细胞均可通过商业化途径获得，状态稳定，分散性较好，完全适应在无血清悬浮生长培养基中进行悬浮培养，能够规模化生产。
在本发明的一些实施方式中，所述293细胞的类型为悬浮型。包括：ATCC CRL-1573。
在本发明的一些实施方式中，培养的时间为8d-16d。例如为8d、9d、10d、11d、12d、13d、14d、15d、16d。
在本发明的一些实施方式中，培养的条件包括：36.5℃-37.5℃、4.5％-5.5％CO2、110rpm-130rpm。培养的温度例如为36.5℃、37℃、37.5℃。CO2的浓度例如4.5％、5％、5.5％。转速例如为110rpm、115rpm、120rpm、125rpm、130rpm。
在本发明的一些实施方式中，所述HEK293细胞的接种接种密度为0.5×106cells/mL-1.5×106cells/mL。例如为0.5×106cells/mL、1×106cells/mL、1.5×106cells/mL。
在本发明的一些实施方式中，培养的过程中，细胞每隔3天进行传代，密度在2.0×106cells/mL-5.0×106cells/mL，活率在90％以上。
本发明的第四方面
本发明提供一种腺病毒的生产方法，所述生产方法包括如下步骤：
将293细胞接种于生长培养基中进行第一阶段培养，补加如第一方面所述的293细补料培养基，腺病毒接毒，进行第二阶段培养。
在本发明的一些实施方式中，所述生产方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
(1)所述生长培养基为293无血清悬浮培养基；
(2)所述293细胞的类型为悬浮型；
(3)补加的所述293细补料培养基的体积是所述生长培养基的体积的8％-12％；
(4)第一阶段培养所得培养产物中的细胞密度为(3-4)×106cells/mL，补加所述293细补料培养基；
(5)第一阶段培养的时间为48h-72h。
本发明中，补加的所述293细补料培养基的体积是所述生长培养基的体积的例如8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％。
本发明中，第一阶段培养所得培养产物中的细胞密度例如为3×106cells/mL、3.1×106cells/mL、3.2×106cells/mL、3.3×106cells/mL、3.4×106cells/mL、3.5×106cells/mL、3.6×106cells/mL、3.7×106cells/mL、3.8×106cells/mL、3.9×106cells/mL、4×106cells/mL，补加所述293细补料培养基。
本发明中，第一阶段培养的时间例如为48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、HEK293细胞补料培养基及其补料培养效果
1、HEK293细胞补料培养基及其制备
按照表1所示成分配制HEK293细胞补料培养基，成分及配方与基础配方DMEM培养基成分及含量对比如下：
表1
所述HEK293细胞补料培养基的制备方法包括如下步骤：
(1)按表1称取各成分，按类型分成氨基酸、维生素、无机盐和其他组分(包括葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)；
(2)使用纯化水溶解分别溶解(1)所述各组分，水温控制在30℃-50℃之间。过程中可加入一定量的5M氢氧化钠以促进混合物的溶解；
(3)将(2)所述各组分溶解物混合，使用盐酸或氢氧化钠调节pH至6.9-7.10，使用纯化水定容，0.22微米滤器除菌过滤，即得所述HEK293细胞补料培养基。
参照上述制备方法，按照表2所示成分及浓度配制对照培养基配方。
表2
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2、HEK293细胞补料培养基细胞测试方案
生长培养基：CD HEK293 374；
测试细胞：HEK293悬浮型细胞；
培养容器：Corning 250mL带滤膜三角摇瓶；
接种密度和工作体积：1×106cells/mL，50mL；
培养条件：37℃，5％CO2，120±5rpm(摇床轨道直径25mm)；
补料培养基：表1和表2所示的补料培养基配方；
补料培养基添加策略：不补加作为空白对照；第4、6、8、10天各补加1次，每次补加比例为工作体积的5％。
培养天数：14天，期间不再添加葡萄糖之外的其他成分。
HEK 293细胞按照1×106cells/mL密度接种在生长培养基中，工作体积50mL，在250mL摇瓶中进行流加培养，每天取样进行细胞计数，监测细胞密度和细胞活率。
实验设置两个补料培养基添加策略(见下表3)：
a.在培养过程中不添加补料培养基，作为空白对比；
b.分别在培养第4天、第6天、第8天、第10天分别添加5％比例的表1和表2所示的补料培养基。培养至第14天，期间维持残糖量在3g/L-6g/L，监测细胞的密度和活率随培养时间的变化。
表3
3、实施例和对比例细胞培养效果
表1的配方1至配方3与表2的对照配方1至对照配方4的细胞培养结果见附图1和表4。
表4
表1的配方1至配方3相对于表2的对照配方1至对照配方4，营养成分更适合293细胞的培养，可用于维持293悬浮细胞高密度全悬浮生长及维持较高活率，进而可提高293细胞相关产品的产能。
4、转染及蛋白表达方面的效果
(1)实验材料
1)细胞株：Expi293F。
2)生长转染培养基：Expi293 Expression Medium(Gibco)。
3)补料培养基：
表1中的配方1和表2中的对照配方1所示的补料培养基；
对比例为Gibco转染和促表达专用的商业化产品(Expi293 Enhancer 1&Enhancer2)。
4)培养容器和体积：Corning 250mL带滤膜三角摇瓶，50mL。
5)转染密度：3×106cells/mL。
6)培养条件：37℃，5％CO2，120±5rpm(摇床轨道直径25mm)。
7)转染方式：ExpiFectamine 293Transfection Kit(Gibco)。
(2)实验方法
按照ExpiFectamine 293Transfection Kit说明书的操作步骤进行细胞培养和转染，转染体积50mL，转染细胞密度3×106cells/mL，转染后放置于37℃，5％CO2，120±5rpm(摇床轨道直径25mm)培养条件下培养。转染第1天后开始补加补料培养基，过程中不再补加任何其他试剂，包括葡萄糖。转染后每隔24h监测细胞密度和细胞活率，48h后开始跟踪蛋白表达情况。试验周期8天。
补料培养基添加策略设置如下：
表5
| 条件 | Expi293 Enhancer 1 | Expi293 Enhancer 2 | 表1配方1/表2对照配方1 |
| 对比例 | 第1天补加5‰ | 第1天补加5％ | / |
| 实施例 | / | / | 第1天补加10％ |
(3)实施例与对比例实验结果
实验结果见图2、图3和表6。
图2为实施例和对比例添加至转染后的293细胞工艺中活细胞密度和细胞活率随时间的变化图。
图3为实施例和对比例添加至转染后的293细胞工艺中所收获蛋白抗体浓度随着培养天数的变化图。
表6
根据图2、图3和表6结果，在同一转染条件、同一生长转染培养基的条件下，优选补料培养基配方与对比例相比，不仅提高了细胞密度和维持活率，同时获得更多的瞬时表达抗体。
5、病毒培养方面的效果
(1)实验材料
1)细胞株：HEK293悬浮细胞株。
2)生长及生产培养基：HEK293 SFM 615。
3)补料培养基：
表1和表2所示的补料培养基(表1所示配方1以及表2所示对照配方1)；
对比例为原有批次工艺，不添加补料。
4)培养容器和体积：Corning 250mL带滤膜三角摇瓶，60mL。
5)接毒时细胞密度：4×106cells/mL。
6)培养条件：37℃，5％CO2，120±5rpm(摇床轨道直径25mm)。
7)接毒方式：直接接毒
(2)实验方法
按照批次培养工艺培养HEK293悬浮细胞，细胞密度达到4.0×106cells/mL时，按照5MOI进行接毒，接毒体积50mL，根据表5实验设计添加补料培养基，接毒，接毒后放置于37℃，5％CO2，120±5rpm(摇床轨道直径25mm)培养条件下培养。过程中不再补加任何其他试剂，包括葡萄糖。接毒后48h及72h收获病毒液进行病毒滴度检测。
补料培养基添加策略设置如下：
表7
| 条件 | 表1配方1 | 表2对照配方1 |
| 对比例 | / | / |
| 配方1 | 接毒前补加10％ | / |
| 对照配方1 | 接毒前补加10％ |
(3)实施例与对比例实验结果
实验结果见图4、图5、表8和表9。
图4为实施例和对比例添加补料培养基后的腺病毒表达滴度随着培养天数的变化图。
图5为实施例和对比例添加补料培养基后的腺相关病毒(AAV)表达滴度随着培养天数的变化图。
表7为实施例和对比例添加补料培养基后的腺病毒表达细胞密度和活率变化情况。
表8为实施例和对比例添加补料培养基后的腺相关病毒(AAV)表达细胞密度和活率变化情况。
表7
表8
根据图4和图5，在同一接毒条件下，优选补料培养基配方与对比例相比，可获得更高的腺病毒表达滴度，但对于腺相关病毒(AAV)的表达，优选补料培养基配方与对比例相比优点并不突出。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (7)
1.293细胞补料培养基，其特征在于，
所述293细胞补料培养基由如下浓度的各成分组成：120mg/L-160mg/L L-谷氨酸、180mg/L-220mg/L L-脯氨酸、135mg/L-160mg/L甘氨酸、110mg/L-130mg/L L-精氨酸盐酸盐、300mg/L-330mg/L胱氨酸二盐酸盐、1700mg/L-2000mg/L谷氨酰胺、200mg/L-220mg/L L-组氨酸、300mg/L-350mg/L L-异亮氨酸、435mg/L-475mg/L L-亮氨酸、700mg/L-750mg/L L-赖氨酸盐酸盐、125mg/L-170mg/L L-甲硫氨酸、250mg/L-300mg/L L-苯丙氨酸、200mg/L-230mg/L L-丝氨酸、250mg/L-300mg/L L-苏氨酸、650mg/L-700mg/L L-色氨酸、700mg/L-760mg/L L-酪氨酸、350mg/L-400mg/L L-缬氨酸、30mg/L-40mg/L氯化胆碱、30mg/L-40mg/L泛酸钙、5mg/L-6mg/L叶酸、30mg/L-40mg/L烟酰胺、7mg/L-8mg/L盐酸吡哆醇、20mg/L-30mg/L核黄素、5 mg/L-6mg/L盐酸硫胺素、60mg/L-70mg/L肌醇、4mg/L-5mg/L维生素B12、0.2mg/L-1mg/L九水硝酸铁、750mg/L-850mg/L七水氯化镁、800mg/L-1200mg/L氯化钾、500mg/L-600mg/L磷酸二氢钠、0.005mg/L-0.05mg/L硫酸铜、3mg/L-4mg/L硫酸锌、100mg/L-200mg/L亚硒酸钠、5500mg/L-6500mg/L葡萄糖、125mg/L-175mg/L丙酮酸钠、15mg/L-20mg/L次黄嘌呤、2.5mg/L-3.5mg/L胸腺嘧啶核苷和水；
所述293细胞补料培养基的pH值为6.8-7.4。
2.权利要求1所述的293细胞补料培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：混合所述的各成分，制备所述293细胞补料培养基；所述制备方法还包括将混合所得混合物的pH值调节至6.8-7.4的步骤。
3.293细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
将293细胞接种于生长培养基中培养，培养的过程中添加权利要求1所述的293细胞补料培养基，制备293细胞。
4.根据权利要求3所述的293细胞的制备方法，其特征在于，添加的次数为1次-10次，每次添加的所述293细胞补料培养基的体积占所述生长培养基的体积的0.5%-10%。
5.根据权利要求3或者4所述的293细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
（1）所述生长培养基为293无血清悬浮培养基；
（2）所述293细胞的类型为悬浮型；
（3）培养的时间为8d-16d。
6.腺病毒的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括如下步骤：
将293细胞接种于生长培养基中进行第一阶段培养，补加如权利要求1所述的293细补料培养基，腺病毒接毒，进行第二阶段培养。
7.根据权利要求6所述的腺病毒的生产方法，其特征在于，所述生产方法具有如下技术特征中的一个或者多个：
（1）所述生长培养基为293无血清悬浮培养基；
（2）所述293细胞的类型为悬浮型；
（3）补加的所述293细补料培养基的体积是所述生长培养基的体积的8%-12%；
（4）第一阶段培养所得培养产物中的细胞密度为（3-4）×106cells/mL，补加所述293细补料培养基；
（5）第一阶段培养的时间为48h-72h。
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