CN105695416B - 一种哺乳动物细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种哺乳动物细胞无血清培养基，它是由基础细胞培养基和添加物组成。本发明还提供了该无血清培养基的用途。本发明的无血清培养基，适合哺乳动物细胞生长和产物表达，而且成分明确、生产成本较低，工业应用前景良好。

Description

一种哺乳动物细胞无血清培养基
技术领域
本发明属于哺乳动物细胞培养领域，涉及一种哺乳动物细胞无血清培养基及其用途。
背景技术
体外培养动物细胞时，通常需要在培养基中加入血清，用于提供细胞生长所需的营养物质及生长环境，但血清存在价格昂贵、极易感染病毒或支原体、成分复杂不利于进行细胞产品的分离纯化等诸多缺点。随着现代生物技术的发展，科学家们开始寻求一种新的替代培养基——无血清培养基。
无血清培养基(Serum Free Medium,SFM)，是指在基础细胞培养基基础上，添加成分完全确定或部分确定的血清替代成分形成的培养基，适合大规模生产，被广泛应用于细胞生物学、药理学、肿瘤学领域。
中国仓鼠卵巢细胞，又称CHO细胞(Chinese hamster ovary)，具有不死性，可以传代百代以上，在生物工程上被广泛作为外源基因的宿主，用于基因工程制药。为了商业化生产蛋白药物，开发成分明确、能够有效提高细胞密度和蛋白表达量的CHO细胞无血清培养基非常必要。
目前已有CHO细胞用的无血清培养基报道，例如公告号为CN1696283A的专利公开了一种用于CHO细胞培养的无血清培养基，但培养基中的胰岛素等动物蛋白含量较高，无血清培养基的配制成本高、后期产物纯化的难度增加。国际上也有商业化的无血清培养基，但其价格高昂，且配方保密，生产成本高。
因此，开发成分明确、价格低廉的CHO细胞无血清培养基对实现CHO细胞工业化生产具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成分明确、价格低廉，能够有效提高细胞密度和蛋白表达量的无血清培养基。
本发明提供了一种哺乳动物细胞无血清培养基，它是由基础细胞培养基和添加物组成，所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、转铁蛋白、维生素、氨基酸和微量元素；所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L。
基础细胞培养基：指仅能维持细胞生存基本营养需求的培养基，例如RPMI1640、DMEM/F12、M199培养基。
其中，所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.46-2.71mg/L的叶酸、0.25-0.35mg/L的核黄素、2.18-2.36mg/L的泛酸钙、8.77-9.14mg/L的氯化胆碱、12.39-12.81mg/L的肌醇、1.92-2.12mg/L的烟酰胺、0.88-1.12mg/L的维生素B6以及0.56-0.80mg/L的维生素B12。
其中，所述氨基酸是终浓度为13.5-16.5mg/L的甘氨酸、8.6-11.4mg/L的L-丙氨酸、38-42mg/L的L-谷氨酸、95-105mg/L的L-谷氨酰胺、28-32mg/L的L-精氨酸、37-43mg/L的L-组氨酸、36-44mg/L的L-亮氨酸、57-63mg/L的L-异亮氨酸、68-72mg/L的L-丝氨酸、76-84mg/L的L-苏氨酸、38-42mg/L的L-酪氨酸、57-63mg/L的L-赖氨酸、56-64mg/L的L-蛋氨酸、68-72mg/L的L-苯丙氨酸、37-43mg/L的L-脯氨酸、67-73mg/L的L-色氨酸、68-72mg/L的L-缬氨酸、26-34mg/L的L-天冬氨酸以及55-65mg/L的L-天冬酰胺。
其中，所述微量元素是终浓度为0.47-0.53mg/L的七水硫酸亚铁、0.0007-0.0013mg/L的四水硫酸锰、1.82-2.18mg/L的七水硫酸锌、0.0018-0.0022mg/L的亚硒酸钠、0.007-0.013mg/L的七钼酸铵、0.0017-0.0023mg/L的五水硫酸铜、0.018-0.022mg/L的六水氯化镍以及0.9-1.1mg/L的二水氯化亚锡。
其中，所述基础细胞培养基为DMEM/F12培养基。
进一步地，所述乙醇胺的终浓度为10mg/L，所述丁酸钠的终浓度为10mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为2mg/L；
所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.65mg/L的叶酸、0.3g/L的核黄素、2.24mg/L的泛酸钙、8.98mg/L的氯化胆碱、12.60mg/L的肌醇、2.02mg/L的烟酰胺、1mg/L的维生素B6以及0.68mg/L的维生素B12；
所述氨基酸是终浓度为15mg/L的甘氨酸、10mg/L的L-丙氨酸、40mg/L的L-谷氨酸、100mg/L的L-谷氨酰胺、30mg/L的L-精氨酸、40mg/L的L-组氨酸、40mg/L的L-亮氨酸、60mg/L的L-异亮氨酸、70mg/L的L-丝氨酸、80mg/L的L-苏氨酸、40mg/L的L-酪氨酸、60mg/L的L-赖氨酸、60mg/L的L-蛋氨酸、70mg/L的L-苯丙氨酸、40mg/L的L-脯氨酸、70mg/L的L-色氨酸、70mg/L的L-缬氨酸、30mg/L的L-天冬氨酸以及60mg/L的L-天冬酰胺；
所述微量元素是终浓度为0.5mg/L的七水硫酸亚铁、0.001mg/L的四水硫酸锰、2mg/L的七水硫酸锌、0.002mg/L的亚硒酸钠、0.01mg/L的七钼酸铵、0.002mg/L的五水硫酸铜、0.02mg/L的六水氯化镍以及1mg/L的二水氯化亚锡。
本发明还提供了上述无血清培养基在哺乳动物细胞培养中的用途。
其中，所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
其中，所述细胞为表达人肿瘤坏死因子受体-人IgG-Fc抗体融合蛋白的中国仓鼠卵巢细胞。
通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如果不加血清，绝大部分细胞不能增殖，但是用血清培养存在极易感染病毒等问题。而一般的无血清培养基虽然能够避免使用血清带来的种种风险，但很难维持细胞的良好生长、繁殖及蛋白表达。
而本发明提供的无血清培养基，可有效提高哺乳动物细胞尤其是CHO细胞密度，大大提高rhTNFR:Fc重组CHO细胞的目标蛋白表达量，适合CHO细胞生长和产物表达，效果与有血清培养基相当，完全可以替代有血清培养基；而且本发明无血清培养基的成分明确、蛋白含量低，生产成本较低，具有良好的工业应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1不同培养基对rhTNFR:Fc重组CHO细胞密度的影响图，不同小写字母表示差异显著。
图2不同培养基对rhTNFR:Fc重组CHO细胞蛋白表达量的影响图，不同小写字母表示差异显著。
图3本发明培养基与有血清培养基的对比结果图。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
本发明所用的试剂、仪器如下：
CHO细胞株：CHO-S，购自invitrogen公司；
表达人肿瘤坏死因子受体-人IgG-Fc抗体融合蛋白的CHO细胞系(即rhTNFR:Fc重组CHO细胞)：购自安必奇生物科技有限公司；
DMEM/F12培养基(无血清)：购自Hyclone公司；
蛋白表达量检测用标准品购自美国安进公司；
其它试剂均为市售。
实施例1本发明无血清培养基的制备
本发明无血清培养基是在DMEM/F12培养基基础上，添加表1的成分组成。其中，表1各成分的浓度均按照最终细胞培养基的总体积计。
表1本发明无血清培养基的添加物
Figure BDA0000946241070000041
Figure BDA0000946241070000051
将表1各成分添加到DMEM/F12培养基后，混匀，用Millipore公司0.22uM滤膜过滤除菌，然后在4℃冰箱中保存备用。
以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：
试验例1本发明无血清培养基用于细胞培养
取本发明无血清培养基(按照实施例1方法制备的无血清培养基)50mL置于100mL体积的摇瓶中；将CHO-S细胞以密度为5*105个/mL接种到摇瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中培养，即可。
试验例2本发明无血清培养基用于细胞培养
取本发明无血清培养基(按照实施例1方法制备的无血清培养基)50mL置于100mL体积的摇瓶中；将rhTNFR:Fc重组CHO细胞以密度为5*105个/mL接种到摇瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中培养，即可。
试验例3不同无血清培养基的效果比较
一、试验材料
培养基A：按照实施例1方法制备的无血清培养基；
培养基B：将培养基A中终浓度为10mg/L的乙醇胺，替换为终浓度为10mmol/L的磷脂酰胆碱；其它同培养基A；
培养基C：将培养基A中终浓度为10mg/L的乙醇胺，替换为终浓度为0.05％(V/V)脂肪乳剂，其它同培养基A；
培养基D：将培养基A中终浓度为10mg/L的乙醇胺去除，其它同培养基A。
二、试验方法
取不同无血清培养基50mL分别置于不同100mL体积的摇瓶中；将rhTNFR:Fc重组CHO细胞以密度为5*105个/mL接种到摇瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中，100r/min悬浮振荡培养，连续培养9天，检测细胞密度及目标蛋白(rhTNFR:Fc)表达量。
细胞密度检测方法：血球计数板计数，每天计数一次。
目标蛋白表达量的检测方法：培养9天后，采用亲和层析HPLC法，流动相为20mmol/L Tris pH7.0,上样用流动相洗脱，流速3mL/min,进样20μL。利用标准品在此条件下吸收峰面积与浓度绘制标准曲线，得到标准曲线方程，然后通过将待测目标蛋白的吸收峰带入，计算得到待测目标蛋白的含量。
三、试验结果
不同无血清培养基培养的CHO细胞密度见图1；rhTNFR:Fc蛋白表达量见图2。
由图1可以看出，整个培养过程中，培养基B对重组CHO细胞的密度增加效果最好；尤其是细胞培养到第7天时，可使细胞的密度达到了3.68*106个/mL。将第6天和第7天的细胞密度进行显著性比较，与其他培养基相比，培养基B对重组CHO细胞的密度增加效果具有显著性差异(P＜0.05)。
由图2可以看出，培养基B对促进重组CHO细胞表达rhTNFR:Fc蛋白的效果最好，达到395mg/L，与其它培养基相比具有明显优势，经比较，数据差异具有显著性。
因此，本发明的无血清培养基可有效提高CHO细胞密度，促进目标蛋白表达(P＜0.05)。
试验例4本发明培养基与有血清培养基的效果比较
一、试验材料
无血清培养基：按照实施例1方法制备的无血清培养基；
有血清培养基：在实施例1方法制备的无血清培养基基础上，添加了5％V/V胎牛血清。
二、试验方法
取不同培养基50mL分别置于不同100mL体积的摇瓶中；将rhTNFR:Fc重组CHO细胞以密度为5*105个/mL接种到摇瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中，100r/min悬浮振荡培养，连续培养9天，检测细胞密度。
细胞密度检测方法：血球计数板计数，每天计数一次。
三、试验结果
不同培养基培养的CHO细胞密度见图3。
由图3可以看出，本发明无血清培养基与有血清培养基相比，细胞密度没有明显差异。
因此，本发明的无血清培养基可有效提高CHO细胞密度，效果与有血清培养基相当。
综上，本发明的无血清培养基，可有效提高哺乳动物细胞的密度，促进目标蛋白表达，适合于CHO细胞生长和产物表达，效果均与有血清培养基相当，完全可以替代有血清培养基；而且本发明无血清培养基的成分明确、蛋白含量低，生产成本较低，具有良好的工业应用前景。

Claims (6)

1.一种哺乳动物细胞无血清培养基，其特征在于：它是由基础细胞培养基和添加物组成，
所述添加物为乙醇胺、丁酸钠、转铁蛋白、维生素、氨基酸和微量元素；
所述乙醇胺的终浓度为9.88-10.12mg/L，所述丁酸钠的终浓度为9.73-10.27mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为1.86-2.14mg/L；
所述氨基酸是终浓度为13.5-16.5mg/L的甘氨酸、8.6-11.4mg/L的L-丙氨酸、38-42mg/L的L-谷氨酸、95-105mg/L的L-谷氨酰胺、28-32mg/L的L-精氨酸、37-43mg/L的L-组氨酸、36-44mg/L的L-亮氨酸、57-63mg/L的L-异亮氨酸、68-72mg/L的L-丝氨酸、76-84mg/L的L-苏氨酸、38-42mg/L的L-酪氨酸、57-63mg/L的L-赖氨酸、56-64mg/L的L-蛋氨酸、68-72mg/L的L-苯丙氨酸、37-43mg/L的L-脯氨酸、67-73mg/L的L-色氨酸、68-72mg/L的L-缬氨酸、26-34mg/L的L-天冬氨酸以及55-65mg/L的L-天冬酰胺；
所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.46-2.71 mg/L的叶酸、0.25-0.35mg/L的核黄素、2.18-2.36mg/L的泛酸钙、8.77-9.14mg/L的氯化胆碱、12.39-12.81mg/L的肌醇、1.92-2.12mg/L的烟酰胺、0.88-1.12mg/L的维生素B6以及0.56-0.80mg/L的维生素B12；
所述微量元素是终浓度为0.47-0.53mg/L的七水硫酸亚铁、0.0007-0.0013mg/L的四水硫酸锰、1.82-2.18mg/L的七水硫酸锌、0.0018-0.0022mg/L的亚硒酸钠、0.007-0.013mg/L的七钼酸铵、0.0017-0.0023mg/L的五水硫酸铜、0.018-0.022mg/L的六水氯化镍以及0.9-1.1mg/L的二水氯化亚锡。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础细胞培养基为DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于：
所述乙醇胺的终浓度为10mg/L，所述丁酸钠的终浓度为10mg/L，所述转铁蛋白的终浓度为2mg/L；
所述维生素是终浓度为0.2mg/L的生物素、2.65mg/L的叶酸、0.3g/L的核黄素、2.24mg/L的泛酸钙、8.98mg/L的氯化胆碱、12.60mg/L的肌醇、2.02mg/L的烟酰胺、1mg/L的维生素B6以及0.68mg/L的维生素B12；
所述氨基酸是终浓度为15mg/L的甘氨酸、10mg/L的L-丙氨酸、40mg/L的L-谷氨酸、100mg/L的L-谷氨酰胺、30mg/L的L-精氨酸、40mg/L的L-组氨酸、40mg/L的L-亮氨酸、60mg/L的L-异亮氨酸、70mg/L的L-丝氨酸、80mg/L的L-苏氨酸、40mg/L的L-酪氨酸、60mg/L的L-赖氨酸、60mg/L的L-蛋氨酸、70mg/L的L-苯丙氨酸、40mg/L的L-脯氨酸、70mg/L的L-色氨酸、70mg/L的L-缬氨酸、30mg/L的L-天冬氨酸以及60mg/L的L-天冬酰胺；
所述微量元素是终浓度为0.5mg/L的七水硫酸亚铁、0.001mg/L的四水硫酸锰、2mg/L的七水硫酸锌、0.002mg/L的亚硒酸钠、0.01 mg/L的七钼酸铵、0.002mg/L的五水硫酸铜、0.02mg/L的六水氯化镍以及1mg/L的二水氯化亚锡。
4.权利要求1或2所述的无血清培养基在哺乳动物细胞培养中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述细胞为表达人肿瘤坏死因子受体-人IgG-Fc抗体融合蛋白的中国仓鼠卵巢细胞。
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