CN101333513B - 一种动物细胞无血清低密度培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物细胞无血清低密度培养基及其应用，该动物细胞无血清低密度培养基以合成培养基为原材料，添加胰岛素粉末、转铁蛋白粉末、L-谷氨酰胺粉末、亚硒酸钠粉末、乙醇胺溶液、脂类溶液、表皮生长因子粉末、重组人酸性成纤维生长因子、维生素溶液、植物水解物溶液、腐胺、硫酸亚铁、氢化可的松、胰岛素类因子，此培养基能够满足哺乳动物细胞在无血清和低密度条件下的生长代谢和产物表达。通过使用动该物细胞无血清低密度培养基，结合D-多聚赖氨酸粉末包被96孔培养板可完成无血清克隆化，实现动物细胞无血清培养的连续性，提高产物表达的稳定性，确保产品质量及安全性，增强生产工艺的可控性。具有广泛的使用范围。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域的细胞工程技术，主要涉及动物细胞无血清低密度(50-5×103cells/mL)培养基及其应用。该动物细胞无血清低密度培养基不仅能够进行多种动物细胞的无血清克隆化筛选而且能够满足密度50-5×103cells/mL时细胞的生长代谢和产物表达。
背景技术
动物细胞培养是生命科学基础理论研究和生物技术领域广泛应用的关键技术之一。动物细胞由于具有活性高、稳定性好等优点已被生物制药行业中被广泛使用。目前美国FDA批准上市的生物技术药物中70％由动物细胞表达生产的。其广泛使用的动物细胞有CHO、SP2/0、HEK293、Vero和BHK等。
生物制药行业中，优化和筛选稳定表达目标产物的动物细胞系是关键技术之一。通常采用融合技术或转染技术获得表达目标产物的动物细胞系，采用传统克隆化方法筛选获得生长代谢正常、产物表达稳定的细胞株。传统克隆化方法通常采用动物血清、饲养细胞等动物来源成分进行[1]。动物细胞体外培养过程中，影响动物细胞体外培养效果的最直接、最重要的环境因素是培养基。大多数动物细胞采用含血清培养基进行体外培养。血清等动物来源成分不明确、批次不稳定、价格昂贵等较多因素会影响实验重复性、可靠性以及生产稳定性[2]。
无血清培养基以其成分明确、批次差异小、有利于产物的分离纯化及无源性污染等优点越来越受到使用者的欢迎[3]。无血清培养基一般是在合成培养基的基础上添加血清替代成分而构成。目前已有商品化的无血清培养基，如：SFM-II(Gibco公司)、SFM4(Hyclone公司)、EX-302(JRH公司)、EX-620(JRH公司)、EX-610(JRH公司)、EX-CELL 525(JRH公司)等。目前报道的无血清培养基仅能够满足细胞密度大于5×103cells/mL时，细胞的生长代谢和产物表达，且使用细胞株范围较窄。如Kim EJ，等人在以合成培养基D/F12为基础添加氨基酸、乙醇胺、卵磷脂等物质研究开发出了细胞密度大于6.4×103cells/mL时适合重组CHO细胞生长代谢的无血清培养基[4]；同年，Kim EJ等人以合成培养基IMDM为基础开发了一种适合rCHO(表达EPO)且细胞密度大于5×104cells/mL时的无血清培养基，此无血清培养基中添加了蛋氨酸、谷氨酸、PF-68、胰岛素、硫酸锌、暖磷脂、丝氨酸、氢化可的松等物质[5]。Do Yun Kim等人在2006年以IMDM为基础添加酵母提取物、硫酸锌、氯化铜、亚硒酸钠、乙醇胺等物质开发了适合rCHO细胞的无血清培养基，能够实现细胞在高密(7×106cell/mL)的的生长[6]。此类满足细胞密度大于5×103cells/mL时细胞生长代谢的无血清培养基的文献较多。
目前生物制药行业，动物细胞培养多采用传统克隆化方法(含血清和饲养细胞)获得的细胞株，此细胞株经无血清悬浮驯化后方可用于生产。无血清悬浮驯化过程会出现外源基因丢失和目标产物表达水平下降的现象；同时，生产用动物细胞在体外长期培养过程中同样存在目标产物分泌表达稳定性的问题[7]，如外源基因丢失导致目标产物表达水平下降等现象。解决无血清条件下动物细胞克隆化方法，对筛选获得稳定表达产物的细胞株尤为重要。
目前，在无血清条件下能满足多种动物细胞低密度培养的培养基尚未见报道。
经申请人所作的资料检索，相关的参考文献如下：
1、Glassy M C，Tharakan J P，Chao P C.Serum free media in hybridom aculture and monoclonal antibody production.Biochemical and Biotechnology，1988，32：1015-1028；
2、Even MS，Sandusky CB，Barnard ND.Serum-free hybridoma culture：ethical，scientific and safety considerations.Trends Biotechnol.2006，24(3)：105-8；
3、Froud SJ.The development，benefits and disadvantages of serum-freemedia.Dev Biol Stand.1999；99：157-66；
4、Gstraunthaler G.Altematives to the use of fetal bovine serum：serum-freecell culture.ALTEX.2003；20(4)：275-81；
5、Kim EJ，Kim NS，Lee GM.Development of a serum-free medium fordihydrofolate reductase-deficient Chinese hamster ovary cells(DG44)using astatistical design：beneficial effect of weaning of cells.In Vitro Cell Dev BiolAnim.1999Apr；35(4)：178-82；
6、Kim EJ，Kim NS，Yoon SK，Ahn YH，Song JY.Development of aserum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture ofrecombinant Chinese hamster ovary cells using a statistical design.J Biotechnol.1999Apr15；69(2-3)：85-93；
7、Do Yun Kim，Joon Chul Lee，Ho Nam Chang，Duk Jae Oh.Developmentof serum-free media for a recombinant CHO cell line producing recombinantantibody，Enzyme and Microbial Technology 39(2006)426-433；
8、Barnes LM，Dickson AJ.Mammalian cell factories for efficient and stableprotein expression.Curr Opin Biotechnol.2006；17(4)：381-6。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种动物细胞无血清低密度(5-5×103cells/mL)培养基及其应用，该动物细胞无血清培养基适于哺乳动物细胞密度在5-5×103cells/mL时的生长代谢，并且维持细胞正常的比生长速率与产物合成速率，实现了细胞在无血清低密度条件下的生长代谢、产物表达，对传统克隆化方法的作了有益的改进，使无血清条件下进行细胞克隆化筛选成为可能。采用本发明可以提高实验结果的重复性、可控性和可靠性；尤其在生物制药领域，本发明的使用可避免由血清批次间的质量差异造成的生产不稳定性、消除血清中复杂蛋白组分对重组蛋白纯化的不利影响、简化产品质量控制项目、延长生产用动物细胞稳定期，从而提高细胞表达产品的稳定性、质量可靠性及安全性。
同时，本发明无血清克隆化方法的应用具有广泛的应用价值。采用本发明对于建立生产用动物细胞高效稳定表达平台成为可能；在生产过程中，超过稳定期的细胞可以采用本发明进行细胞株筛选再次获得生长代谢和产物表达稳定的细胞株；使细胞株改造及细胞株优化成为可能；可作为生产末期细胞库质量控制检测的新方法，解决了生物制药领域技术瓶颈。
本发明所采取的技术解决方案如下：
一种动物细胞无血清低密度培养基，其特征在于制得的该动物细胞无血清低密度培养基是在合成培养基或商品化的无血清培养基中加入添加物构成；其中：所述的添加物及其用量为：
胰岛素：5-50mg/L，转铁蛋白：5-50μg/mL，亚硒酸钠：10-100nM，乙醇氨：10-100μM，L-谷氨酰胺：4-8mM，脂类溶液：适量，腐胺：10-100mg/L、胰岛素类因子IGF-1：10-500μg/L、酸性成纤维细胞生长因子rh-aFGF：10-600μg/L，表皮生长因子EGF：5-200μg/L，硫酸亚铁：0.42-0.83mg/L，氢化可的松：1--10μmol/L，维生素混合液：适量，植物水解物溶液：适量。
本发明的动物细胞无血清低密度培养基主要用于动物细胞无血清克隆化技术，包括动物细胞无血清低密度培养基和D-多聚赖氨酸粉末包被96孔培养板两个方面。实现了动物细胞在单细胞或低密度(5-5×103cells/mL)水平下的生长代谢和产物表达及较好细胞集落的形成。
无血清克隆化实验结果的判断标准是克隆率和克隆阳性率两个指标。其中克隆率就是单克隆数目除以96孔培养板中细胞悬液的接种数。而阳性率为检测后为阳性单克隆数目除以单克隆总数。
本发明具有如下特点：
1、该动物细胞无血清低密度培养基不仅能够进行多种动物细胞的无血清克隆化筛选而且能够满足密度5-5×103cells/mL时细胞的生长代谢和产物表达。此培养基是实现动物细胞无血清克隆化的前提。
2、采用本发明的动物细胞无血清低密度培养基，以D-多聚赖氨酸包被96孔培养板的方法改进细胞集落形态，实现细胞在96孔培养板底部的黏附。此创新之处便于操作人员在光学显微镜下对细胞克隆集落的观察与单克隆的选择和判断。
附图说明
图1是动物细胞无血清克隆化构建细胞株的操作流程；
图2是A、B分别是对比CERC-18细胞采用经D-多聚赖氨酸包被的96孔培养板与未经D-多聚赖氨酸包被的96孔培养板进行无血清克隆化的效果图。
图3是无血清克隆化获得的单克隆细胞集落表达产物的检测图；
以下结合附图和申请人给出的具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明的动物细胞无血清低密度培养基，是以合成培养基粉末或商品化的无血清培养基粉末为原材料，添加胰岛素粉末、转铁蛋白粉末、L-谷氨酰胺粉末、亚硒酸钠粉末、乙醇胺溶液、脂类溶液、表皮生长因子粉末、重组人酸性成纤维生长因子、维生素溶液、植物水解物溶液、腐胺粉末、硫酸亚铁粉末、氢化可的松粉末、胰岛素类因子粉末制备而成。
动物细胞无血清低密度培养基的配制及添加物的作用如下：
1.合成培养基或商品化无血清培养基
本发明所述的合成培养基有DMEM、D/F12及RPMI1640等。本发明所述的商品化无血清培养基有EX-302(JRH公司)、EX-620(JRH公司)、SFM4(hyclone公司)等。合成培养基或无血清培养基的配置按照常规培养基或无血清培养基说明书的溶解方法进行。之后采用0.22um的滤膜过滤除菌。配置好的培养基置于4℃储存。
2.添加物的作用及配制方法
2.1胰岛素(Insulin)的作用及配置方法：
本发明中提供的动物细胞无血清低密度培养基中胰岛素是重要的血清替代成分。胰岛素可促进糖元与脂肪酸的合成，同时促进RNA、蛋白质和脂类的合成。胰岛素可以为重组胰岛素、牛源胰岛素或人源胰岛素，胰岛素类因子也可以使用。本发明中提供的动物细胞无血清低密度培养基中胰岛素的浓度范围是5-50mg/L，具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为5-15mg/L。
2.2转铁蛋白(Transferrin)的作用及配置方法：
本发明中使用的转铁蛋白主要是细胞获取微量元素的主要渠道，同时具有促进胰岛素发挥作用的功能。在该发明使用的转铁蛋白可以是重组的、人源的或牛源的等，另外柠檬酸铁也可以起到同样的作用。转铁蛋白的使用浓度在5-50mg/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为5-15mg/L。
2.3亚硒酸钠(Sadium seleuite)的作用及配置方法：
本发明中使用的亚硒酸钠对细胞生长代谢有着显著的支持作用。同时硒元素具有消除过氧化物和氧自由基对细胞伤害的功能。亚硒酸钠的使用浓度为10--100nM。推荐使用浓度为20-60nM。
2.4L-谷氨酰胺的作用及配置方法：
本发明中使用的L-谷氨酰胺主要提供细胞生长代谢过程中所需的能量物质。L-谷氨酰胺的使用浓度为4-8mM。推荐使用浓度为4-6mM。
2.5脂类的作用及使用方法：
本发明中使用的脂类主要是细胞膜合成和细胞生长所必需的物质。为无动物来源成分、化学成分限定的物质。使用时浓度参考说明书推荐浓度，采用相应培养基稀释即可。
2.6乙醇氨的作用及配置方法：
本发明中使用的乙醇氨是杂交瘤细胞生长所必需的生长因子。乙醇氨的使用浓度10--100μmol/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为30-50μmol/L。
2.7胰岛素类因子(IGF-1)的作用、配置及储存：
本发明中使用的胰岛素类因子具促进细胞增值的能力。胰岛素类因子的使用浓度10--500μg/L。推荐使用浓度为20-100μg/L。该胰岛素类因子可以与添加组分中的胰岛素同时添加。
2.8表皮生长因子(EGF)的作用及配置方法：
本发明中使用的表皮生长因子具促进细胞生长的作用。表皮生长因子的使用浓度5--200μg/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为10-100μg/L。
2.9基因重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)的作用及配置方法：
本发明中使用的酸性成纤维生长因子也是动物细胞无血清低密度(5--5×103cells/mL)培养基的关键成份之一。具有促进细胞生长的作用。细胞在克隆化过程中需要单细胞生长，因此采用多生长因子联合作用的方法可实现单细胞在无血清条件下的生长代谢。基因重组人酸性成纤维细胞生长因子的使用浓度10--600μg/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为50-500μg/L。
2.10植物水解物的作用及配制方法：
本发明中使用的植物水解物是重要的脂肪酸载体和微量元素的来源。本发明所使用的植物水解物是液体且无菌包装液，含有较多的短肽。本发明所使用的维生素是无菌包装的维生素混合液。使用浓度参考市售的产品说明书推荐浓度，采用相应培养基稀释即可。
2.11腐胺的作用及配制方法：
本发明中使用的腐胺也是动物细胞无血清低密度(50--5×103cells/mL)培养基的成份之一，具有促进促细胞分裂的作用。腐胺的使用浓度10-100mg/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为20-50mg/L。
2.12维生素的作用及使用方法：
本发明中使用的维生素为细胞的生长代谢提供必要的维生素，促进细胞生长和延长细胞活性，提供营养物质的同时降低代谢产物的堆积。本发明所使用的维生素是无菌包装的维生素混合液。使用浓度参考说市售的产品明书推荐浓度，采用相应培养基稀释即可。
2.13硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)的作用及配制方法：
本发明中使用的硫酸亚铁为培养基提供细胞生长所需的亚铁离子，同时可以作为转铁蛋白的替代成分。硫酸亚铁的浓度控制在0.42-0.83mg/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度0.83mg/L。
2.14氢化可的松的作用及配制方法
本发明中使用的氢化可的松是促进细胞有丝分裂的生长激素。氢化可的松的使用浓度1--10μmol/L。具体浓度因细胞系的差异而定。推荐使用浓度为2-5μmol/L。
采用本发明的动物细胞无血清低密度培养基所进行的无血清克隆化方法主要是采用动物细胞无血清低密度培养基，并且结合促进细胞贴壁和细胞增殖的D-多聚赖氨酸改进细胞克隆集落形成来实现的。
3、D-多聚赖氨酸包被96孔培养板：
动物细胞的无血清克隆化筛选须采用96孔培养板进行。为了促进细胞在无血清克隆化过程中形成较为聚集的细胞集落，同时促进细胞生长。该发明采用促进细胞贴壁和细胞增殖的D-多聚赖氨酸包被96孔培养板的方法改进细胞集落形态，并且实现了细胞在96孔培养板底部的黏附。D-多聚赖氨酸包被96孔培养板的时间和浓度需要根据不同细胞系和实验目的进行筛选，一般使用浓度为10--500mg/L，包被时间为30min-3h完成96孔培养板的包被。
D-多聚赖氨酸的配置与储存：D-多聚赖氨酸干粉采用无菌纯水溶解。充分溶解后分装，-20℃储存。本发明使用的D-多聚赖氨酸购于碧云天公司。
4、发明人采用了杂交瘤细胞株CERC-18，该细胞是经免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得CERC-18杂交瘤细胞株。该细胞株能够稳定高效表达抗人肝癌的单克隆抗体。除此之外，申请人还采用了CERC-1和rCHO-10细胞株(第四军医大学细胞工程中心构建)进行克隆化实验方法的验证。
采用本发明的动物细胞无血清低密度培养基应用于无血清克隆化是将96孔培养板采用D-多聚赖氨酸进行包被。D-多聚赖氨酸为10-500mg/L，包被时间为0.5-3h。
采用梯度稀释法制备细胞悬液，细胞密度为50cells/mL，以200μL/孔接种96孔培养板。克隆化结果在光学显微镜进行观察，计算克隆率；上清采用ELISA或免疫荧光的方法进行检测，计算克隆阳性率。
以下是发明人给出的实施例：
本实施例所采用本发明的动物细胞无血清低密度培养基所进行的无血清克隆化方法的操作流程如下：
先进行细胞的复苏；
接着进行动物细胞无血清低密度培养基的配置，无菌检测进行7天，结果阴性即可用于实验；
以PDL包被96孔培养板；
制备细胞克隆板；
显微镜下观察和上清液的检测，计算克隆率和阳性率。克隆化细胞株的获得：
本实施例的CERC-18和CERC-1杂交瘤细胞株是在体外培养时间超过其稳定期的细胞，进行常规的细胞传代培养，无血清克隆化时可直接使用。为了获得生长和表达稳定的细胞株，申请人从原始细胞库取出rCHO-10(已经完成细胞株质量控制并鉴定合格)，至于37℃水浴中迅速融化。之后在生物安全柜或超净台内进行。将细胞悬液移入含7-8mL无血清培养(4℃)的离心管中，1200rpm离心5min，弃去上清，采用动物细胞无血清培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液移入T-Flask中培养。置于37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中静止培养。之后在无血清培养基中连续传代3次以上，细胞活性大于95％即可用于无血清克隆化。
动物细胞无血清低密度培养基的配制：
动物细胞CERC-18与rCHO-10分别采用D/F12合成培养基(hyclone公司)和EX-302(JRH公司)无血清培养基补加添加物组成的动物细胞无血清低密度培养基。
D/F12的配置与储存：
按照常规基础培养基的配置方法配制1L的D/F12培养基。称取5.08gD/F12培养基干粉溶解于1L纯水中，过滤前加入碳酸氢钠粉末2.438g。采用0.22μm滤膜过滤、4℃储存。
EX-302的配置与储存：参照EX-302说明书配制1L无血清培养基。称取21.2g EX-302培养基干粉、0.588gL-谷氨酰胺干粉，依次分别溶解于1L纯水中，过滤前加入碳酸氢钠干粉1.6g。采用0.22μm滤膜过滤、4℃储存。
胰岛素(Sigma公司)采用0.1M HCl盐酸溶解。将1mg的重组胰岛素溶解于1mL 0.1M HCl盐酸中，配制成浓度为1mg/mL母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。
转铁蛋白(Sigma公司)采用纯水进行溶解。将1mg的转铁蛋白溶解于1mL纯水中，配制成浓度为1mg/mL的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。
亚硒酸钠(Acros organics公司)采用纯水进行溶解。将5.2mg的亚硒酸钠溶解于5mL纯水中，配制成浓度为6mM的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。本实施例中使用的亚硒酸钠FW：172.94，含硒44-46％。
脂类(JRH公司)为无菌包装、500×母液。分别给1L D/F12合成培养基和1L EX-302无血清培养基添加2mL脂类即可。
乙醇氨(Sigma公司)采用纯水进行溶解。将15uL的乙醇胺溶解于50mL的纯水中，配制成浓度为5mM的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。胰岛素类因子(JRH公司)分别采用D/F12合成培养基和EX-302无血清培养基进行溶解。将1mg的表皮生长因子溶解于10mL D/F12和EX-302中，配制成浓度为0.1mg/mL的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。
表皮生长因子(Sigma公司)分别采用D/F12合成培养基和EX-302无血清培养基进行溶解。将1mg的表皮生长因子溶解于1mL D/F12和EX-302中，配制成浓度为1mg/mL的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。酸性成纤维生长因子(Sigma公司，纯度大于97％)采用纯水或无血清培养基进行溶解。将1mg的表皮生长因子溶解于1mL D/F12和EX-302中，配制成浓度为1mg/mL的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。
腐胺(Sigma公司，FW：161.08，纯度为97％)分别采用D/F12合成培养基和EX-302无血清培养基进行溶解。将1mg的腐胺溶解于1mL D/F12和EX-302中，配制成浓度为1mg/mL的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。
硫酸亚铁(Sigma公司)分别采用D/F12合成培养基和EX-302无血清培养基进行溶解。将1mg的硫酸亚铁溶解于1mL无血清培养基中，配制成浓度为1mg/mL的母液，0.22um滤膜过滤除菌、4℃储存。
氢化可的松(Sigma公司)采用无水乙醇进行溶解。将1mg的氢化可的松溶解于1mL无水乙醇中，配制成浓度为1mg/mL母液，4℃储存。维生素混合液(JRH公司)为无菌包装，40×母液。分别给1L D/F12合成培养基和1L EX-302无血清培养基添加2mL、4mL维生素混合液。
植物水解物(JRH公司)为无菌包装，50×母液。分别给1L D/F12合成培养基和1L EX-302无血清培养基添加12.5mL、37.5mL植物水解物即可。
按照上述方法配制胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、乙醇胺、脂类、L-谷氨酰胺、酸性成纤维细胞生长因子等。其中，各添加物浓度控制如下：胰岛素：5-15mg/L；转铁蛋白：5-15mg/L；亚硒酸钠：20-60nmol/L；乙醇氨：30-50μmol/L；脂类溶液采用培养基500倍稀释；腐胺为20-50mg/L；类胰岛素因子(IGF-1)为20-100μg/L；酸性成纤维细胞生长因子(aEGF)为10-100μg/L；酸性表皮生长因子(FGF)为50-500μg/L；硫酸亚铁为0.83mg/L；氢化可的松为2-5μmol/L；混合维生素溶液采用40倍稀释；植物水解物溶液采用50倍稀释、L-谷氨酰胺：4-6mM。动物细胞无血清低密度培养基在配制过滤7天后检查无菌结果，阴性即可用于无血清克隆化。
3、D-多聚赖氨酸包被96孔培养板
采用无菌纯水配制D-多聚赖氨酸。取10mg D-多聚赖氨酸溶解于10mL无菌纯水中，母液1g/L、-20℃储存。采用无菌纯水将母液进行稀释，CERC-18细胞株和rCHO-10D-多聚赖氨酸终浓度分别为50mg/L和100mg/L，200uL/孔，包被2h和1h，之后用于动物细胞无血清克隆化。
4、CERC-18细胞悬液的接种
将CERC-18细胞株移入生物安全柜中，取样后进行细胞计数。采用逐步稀释的方法将CERC-18细胞密度调整至5cells/mL，200uL/孔接种细胞悬液。接着置于37℃、5％二氧化碳浓度的培养箱中静止培养。
5、光学显微镜下观察
细胞悬液接种至96孔培养板后7-10天，在普通光学倒置显微镜下进行观察，标记形成单克隆的细胞集落。采用单克隆数除以96即可得到相应的克隆率。
CERC-18细胞在各种培养基中进行克隆化的实验结果见图2和表1。
其中阴性对照是采用无血清培养基；阳性对照采用传统的克隆化方法进行，也就是说采用了饲养细胞和血清。实验组是采用动物细胞无血清低密度培养基结合无血清克隆化方法进行。
表1：CERC-18细胞克隆化结果
| 分组 | 克隆化所用培养基 | 结果 |
| 阴性对照 | D-H502 | 0个 |
| 阳性对照 | PRMI-1640(杂交瘤细胞专用)+10％FBS | 18个，克隆率为18.8％，阳性率为100％ |
| 实验组 | D/F12+添加物组成的无血清低密度培养基 | 27个，克隆率为28.1％，阳性率为100％ |
6、采用ELISA方法进行上清液中表达产物的检测
CERC-18细胞采用ELISA方法检测上清液中目标产物的分泌。ELISA方法中使用的试剂如下：小鼠IgG标准品购于sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自Pierce公司。检测结果采用酶标仪进行读取，获得相应的荧光值。实验结果见表2。
表2：CERC-18细胞单克隆孔上清中目标产物检测结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ## | ## | 0.565 | ## | 0.53 | ## | ## | ## | ## | 0.546 | ## | 0.647 |
| B | ## | ## | ## | 0.502 | 0.67 | ## | ## | 0.62 | ## | ## | ## | 0.618 |
| C | ## | 0.648 | ## | 0.635 | ## | ## | ## | ## | ## | ## | ## | ## |
| D | ## | ## | 0.018 | ## | ## | ## | ## | ## | 0.599 | 0.731 | ## | ## |
| E | ## | 0.734 | ## | ## | ## | ## | ## | ## | ## | 0.735 | ## | 0.673 |
| F | ## | 0.644 | 0.7 | ## | ## | ## | ## | ## | ## | ## | ## | ## |
| G | ## | 0.714 | ## | 0.712 | ## | ## | ## | 0.733 | 0.826 | ## | ## | ## |
| H | 0.256 | ## | ## | 0.715 | 0.684 | ## | ## | 0.691 | ## | ## | 0.377 | ## |
rCHO-10细胞采用ELISA方法检测上清液中目标产物的分泌。ELISA方法中使用的试剂如下：小鼠IgG标准品购于sigma公司；HRP标记的羊抗人IgG购自Pierce公司。检测结果采用酶标仪进行读取，获得相应的荧光值。其CERC-1细胞在各种培养基中进行克隆化的实验结果见表3和图3，其中阴性对照是采用无血清培养基性；阳性对照采用传统的克隆化方法进行，也就是说采用了饲养细胞和血清。实验组是采用无血清克隆化培养基进行克隆化的实验结果。
表3：CERC-1细胞克隆化结果
| 分组 | 克隆化所用培养基 | 结果 |
| 阴性对照 | EX-620： | 4个，克隆率为4.1％，阳性率为50％ |
| 阳性对照 | PRMI-1640(杂交瘤细胞专用)+10％FBS | 单克隆较少，多为多克隆。 |
| 实验组 | EX-620+克隆化添加培养基 | 39个，克隆率为39.7％，阳性率为100％ |
注：在进行无血清克隆化的过程中为了更加好的说明无血清克隆化方法的可行性，采用阳性对照(传统的克隆化方法)和阴性对照(采用无血清培养基)进行比较。
rCHO-10细胞在各种培养基中进行克隆化的实验结果见表4、表5。其中阴性对照是采用无血清培养基；阳性对照采用传统的克隆化方法进行，也就是说采用了饲养细胞和血清。实验组是采用动物细胞无血清低密度培养基进行。
表4：rCHO-10细胞克隆化结果
| 分组 | 克隆化所用培养基 | 结果 |
| 阴性对照 | SFM4 | 4个，克隆率为4.5％，阳性率为75％ |
| 阳性对照 | PRMI-1640(杂交瘤细胞专用)+10％FBS | 33个，克隆率为33.7％，阳性率为100％ |
| 实验组 | SFM4+克隆化添加培养基 | 27个，克隆率为27.6％，阳性率为100％ |
rCHO-10细胞单克隆孔上清中目标产物检测结果
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| A | ## | ## | ## | ## | 0.53 | ## | ## | 3.20 | 0.62 | ## | ## | ## |
| B | ## | ## | 0.51 | 1.02 | 0.49 | ## | ## | ## | ## | ## | ## | 1.34 |
| C | ## | 5.13 | 0.39 | 0.70 | 0.30 | ## | ## | 0.27 | 0.67 | ## | ## | ## |
| D | ## | ## | N.A | ## | ## | 0.18 | 0.67 | ## | ## | ## | ## | ## |
| E | ## | ## | 0.37 | ## | ## | ## | ## | ## | 0.64 | ## | ## | 0.39 |
| F | ## | ## | ## | ## | 0.13 | 0.28 | 0.27 | 0.36 | ## | 1.98 | ## | ## |
| G | ## | ## | ## | 1.11 | 0.50 | ## | ## | ## | ## | ## | ## | 0.53 |
| H | ## | ## | ## | 0.76 | ## | ## | ## | ## | 0.44 | ## | ## | ## |
注：N.A为显色结果为弱阳性，但酶标仪不能检测。
Claims (5)
1.一种动物细胞无血清低密度培养基，其特征在于制得的该动物细胞无血清低密度培养基适于哺乳动物细胞密度在5cells/mL～5×103cells/mL时的生长代谢，维持细胞正常的比生长速率与产物合成速率，该动物细胞无血清低密度培养基是在合成培养基DMEM、D/F12或RPMI1640粉末中加入添加物构成，或者是在无血清培养基EX-302、EX-620或SFM4中加入添加物构成；其中：所述的添加物及其用量为：
胰岛素：5-50mg/L，转铁蛋白：5-50μg/mL，亚硒酸钠：10-100nM，乙醇胺：10-100μM，L-谷氨酰胺：4-8mM，脂类溶液：适量，腐胺：10-100mg/L、胰岛素类因子IGF-1：10-500μg/L、酸性成纤维细胞生长因子rh-aFGF：10-600μg/L，表皮生长因子EGF：5-200μg/L，硫酸亚铁：0.42-0.83mg/L，氢化可的松：1--10μmol/L，维生素混合液：适量，植物水解物溶液：适量。
2.权利要求1所述的动物细胞无血清低密度培养基用于动物细胞无血清克隆化的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将96孔培养板采用D-多聚赖氨酸进行包被。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的D-多聚赖氨酸为10-500mg/L，包被时间为0.5-3h。
5.如权利要求2所述的的应用，其特征在于，采用细胞密度为50cells/mL的悬液接种96孔培养板，0.2mL/孔，置于5％CO2培养箱中静止培养7-10天。
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