CN105462916B - 一种培养Marc‑145细胞用的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培养Marc‑145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺。本发明提供的培养Marc‑145细胞用的无血清培养基能促进Marc‑145细胞快速生长和增殖，且本发明培养Marc‑145细胞用的培养基不含血清，动物源成分含量低，有效降低了后续病毒纯化的分离难度，同时也提高了疫苗的安全性。

Description

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种无血清培养基及其制备方法，具体涉及一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

猴胚胎肾上皮细胞(Marc-145)是上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA104细胞)克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞主要用于病毒的培养，特别是猪繁殖与呼吸障碍综合病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感。

猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起，以成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征的传染病，是一种免疫抑制病，常常继发其他病原感染。目前，该病在全世界几乎所有养猪地区都已流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损伤。我国高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征的预防采用弱毒疫苗或者灭活疫苗进行预防。PRRSV的增殖对细胞有严格的选择性，其中Marc-145细胞对PRRSV敏感性强，病毒可以达到很高的滴度，因而广泛应用于高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的灭活疫苗或者活疫苗生产。

现有的Marc-145细胞培养过程中，通常需要加入8-10％的牛血清进行培养。如公开号为CN102002482A的发明专利申请文件，公开了一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其中公开了细胞生长液的配方：体积百分含量为90-92％的DMEM溶液、8-10％的牛血清、1％的双抗、1％的谷氨酰胺；公开号为CN101748101A的发明专利申请文件，公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法，其中公开了生长液为添加10％新生牛血清的DMEM培养液。

血清能为细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入血清替代成分，制备得到的培养基既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。研发一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，可有效降低后续病毒纯化的分离难度，同时也可有效提高疫苗的安全性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能促进Marc-145细胞快速生长和增殖，不含血清，动物源成分含量低的培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子0.1～10μg/mL、表皮生长因子5～20μg/mL、成纤维生长因子0.1～10μg/mL、转铁蛋白5～20μg/mL、亚硒酸钠20～30μg/mL、小麦蛋白酶解物1～5mg/mL、1～5％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺10～20μg/mL。

优选地，本发明提供的培养Marc-145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子5μg/mL、表皮生长因子10μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠25μg/mL、小麦蛋白酶解物4mg/mL、2％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL。

本发明所述的基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基和F12培养基中的一种或两种。优选地，所述的基础培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其体积比为1：1。

优选地，本发明所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成。

相应地，本发明还提供所述的培养Marc-145细胞用的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：

S1：制备小麦蛋白酶解物；

S2：制备酶解明胶溶液；

S3：向基础培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即得培养基。

优选地，所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤：取小麦蛋白粉，加入其重量15～20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8～10mol/L HCL调节溶液pH值为2.0～4.0，加入1200～1800U/g的酶，35～45℃下酶解6～10h，用1～2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶15～20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物。

本发明所述的酶解小麦蛋白的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种。优选地，所述的酶解小麦蛋白的酶为胃蛋白酶。

优选地，所述酶解明胶溶液的制备方法包括如下步骤：

S1：将明胶溶解在PBS溶液中，得到明胶PBS溶液，所述明胶PBS溶液的质量体积浓度为200-400mg/mL；

S2：将S1得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；

S3：将经S2处理后的明胶PBS溶液冷却至常温，加入其体积0.5～2％的质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解24～36h；

S4：将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至2-8℃，如出现凝固现象，则重复S3步骤，直至在2-8℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的培养Marc-145细胞用的无血清培养基。本发明提供的培养Marc-145细胞用的无血清培养基能促进Marc-145细胞快速生长和增殖，同时，与传统的含血清培养基相比，本发明培养Marc-145细胞用的培养基不含血清，动物源成分含量低，有效降低了后续病毒的纯化带来分离难度，同时也提高了疫苗的安全性。此外，本发明的制备方法简单、易操作，便于实现大规模生产的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1本发明培养Marc-145细胞用的无血清培养基

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其包括MEM培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子2μg/mL、表皮生长因子5μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、亚硒酸钠20μg/mL、小麦蛋白酶解物5mg/mL、5％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺10μg/mL。

制备方法：

S1：取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入10mol/LHCL调节溶液pH值为3.0，加入1800U/g的酸性蛋白酶，40℃下酶解8h，用2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物；

S2：将20g明胶溶解在90mL的PBS溶液中，得到明胶PBS溶液；

S3：将S2得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；

S4：将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至常温，加入10mL质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解36h；

S5：将经S4处理后的明胶PBS溶液冷却至4℃，如出现凝固现象，则重复S4步骤，直至在4℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液；

S6：向MEM培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即得本发明实施例1无血清培养基。

实施例2本发明培养Marc-145细胞用的无血清培养基

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其包括DMEM培养基，还包括如下组分：

胰岛素样生长因子1μg/mL、表皮生长因子18μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠28μg/mL、小麦蛋白酶解物1mg/mL、2％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL。

制备方法：

S1：取小麦蛋白粉，加入其重量20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入10mol/LHCL调节溶液pH值为2.0，加入500U/g的酸性蛋白酶和1000U/g的胃蛋白酶，42℃下酶解8h，用2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物；

S2：将30g明胶溶解在90mLPBS溶液中，得到明胶PBS溶液；

S3：将S2得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；

S4：将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至常温，加入10mL质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解30h；

S5：将经S4处理后的明胶PBS溶液冷却至8℃，如出现凝固现象，则重复S4步骤，直至在8℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液；

S6：向DMEM培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即得本发明实施例2无血清培养基。

实施例3本发明培养Marc-145细胞用的无血清培养基

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其包括DMEM培养基和F12培养基，其中，DMEM培养基：F12培养基＝1:1，还包括如下组分：胰岛素样生长因子5μg/mL、表皮生长因子10μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠25μg/mL、小麦蛋白酶解物4mg/mL、2％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL。

制备方法：

S1：取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8mol/LHCL调节溶液pH值为2.0，加入1200U/g的胃蛋白酶，42℃下酶解10h，用1mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物；

S2：将25g明胶溶解在90mLPBS溶液中，得到明胶PBS溶液；

S3：将S2得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；

S4：将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至常温，加入10mL质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解36h；

S5：将经S4处理后的明胶PBS溶液冷却至4℃，如出现凝固现象，则重复S4步骤，直至在4℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液；

S6：向基础培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即得本发明实施例3无血清培养基。

实施例4本发明培养Marc-145细胞用的无血清培养基

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其包括DMEM培养基，还包括如下组分：

胰岛素样生长因子2μg/mL、表皮生长因子10μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白13μg/mL、亚硒酸钠23μg/mL、小麦蛋白酶解物3mg/mL、3％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL.

制备方法同实施例3。

对比例1培养Marc-145细胞用的无血清培养基

对比例1培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其中，DMEM培养基：F12培养基＝1:1，还包括如下组分：胰岛素样生长因子5μg/mL、表皮生长因子10μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠25μg/mL、5％体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL。

制备方法与实施3类似，不同的是不需要制备小麦蛋白酶解物。

对比例2培养Marc-145细胞用的无血清培养基

对比例2培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其中，DMEM培养基：F12培养基＝1:1，还包括如下组分：胰岛素样生长因子6μg/mL、表皮生长因子15μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠25μg/mL、小麦蛋白酶解物5mg/mL和乙醇胺15μg/mL。

制备方法与实施例3类似，不同的是不需要制备酶解明胶溶液。

对比例3培养Marc-145细胞用的培养基

对比例3培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其中，DMEM培养基：F12培养基＝1:1，还包括10％胎牛血清。

制备方法：将胎牛血清加入到培养基中，混匀，即得对比例3培养基。

试验例一

取本发明实施例1-4、对比例1-3制备的培养基培养Marc-145细胞，Marc-145细胞按照1:3的比例进行传代，分别在培养过程中的3h、1d、2d、3d进行观察细胞生长状况，具体情况详见表1。

表1Marc-145细胞生长状况表

注：“—”表示：Marc-145细胞不贴壁，不生长；“+”表示：Marc-145细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。

从表1的结果可知，本发明提供的培养Marc-145细胞用的无血清培养基，用于培养Marc-145细胞，细胞生长和增殖速度快，培养效果与添加10％胎牛血清的培养基的培养效果相当，其效果明显优于对比例1和对比例2培养基的培养效果，说明本发明培养Marc-145细胞用的无血清培养基配方合理，能促进Marc-145细胞快速生长和增殖。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其特征在于：由基础培养基及以下组分制成：胰岛素样生长因子0.1~10μg/mL、表皮生长因子5~20μg/mL、成纤维生长因子0.1~10μg/mL、转铁蛋白5~20μg/mL、亚硒酸钠20~30μg/mL、小麦蛋白酶解物1~5mg/mL、1~5%体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺10~20μg/mL；

所述的基础培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其体积比为1:1；

所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤：

取小麦蛋白粉，加入其重量15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10mol/L HCL调节溶液pH值为2.0~4.0，加入1200~1800U/g的胃蛋白酶，35~45℃下酶解6~10h，用1~2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物；

所述酶解明胶溶液的制备方法包括如下步骤：

S1：将明胶溶解在PBS溶液中，得到明胶PBS溶液，所述明胶PBS溶液的质量体积浓度为200-400mg/mL；

S2：将S1得到的明胶PBS溶液进行湿热高压灭菌处理，所述湿热高压灭菌处理的温度为121℃、压力为103.4KPa、时间为20min；

S3：将经S2处理后的明胶PBS溶液冷却至常温，加入其体积0.5~2%的质量百分浓度为0.25％的胰酶溶液，在37℃温度下酶解24~36h；

S4：将经S3处理后的明胶PBS溶液冷却至2-8℃，如出现凝固现象，则重复S3步骤，直至在2-8℃时无凝固现象出现，得到酶解明胶溶液。

2.根据权利要求1所述的培养Marc-145细胞用的无血清培养基，其特征在于：由基础培养基及以下组分制成：胰岛素样生长因子5μg/mL、表皮生长因子10μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠25μg/mL、小麦蛋白酶解物4mg/mL、2%体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL。

3.一种根据权利要求1所述的培养Marc-145细胞用的无血清培养基的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

S1：制备小麦蛋白酶解物；

S2：制备酶解明胶溶液；

S3：向基础培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦蛋白酶解物、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即得培养基。