CN110373379A - 一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪蓝耳病病毒疫苗制备领域,特别涉及一种Marc‑145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,本发明公开了Marc‑145单层细胞驯化至悬浮培养的方法,实现了Marc‑145细胞在培养基中的全悬浮培养,因而采用猪蓝耳病毒直接接种于Marc‑145悬浮细胞培养,并利用生物反应器扩大培养,培养的猪蓝耳病毒疫苗增殖速度稳定,病毒含量≥108.5TCID50;培养至细胞病变达80%以上时收获病毒液,即得。本发明将猪蓝耳病毒直接接种于Marc‑145悬浮细胞驯化培养,有效增加生产得到的悬浮病毒的稳定性、连续性与安全性,并利用生物反应器放大培养,每0.1ml病毒含量≥108.5TCID50,进一步提高了猪蓝耳病疫苗的质量和产量。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制药技术领域,具体涉及一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法。
背景技术
Marc-145细胞即猴胚胎肾上皮细胞,来源于猴肾细胞,是母细胞(MA104 细胞)的克隆株,贴壁依赖性生长,可连续传代培养,无致瘤性,该细胞株经过数次悬浮驯化得到悬浮适应株,可不依赖于载体悬浮生长。该细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特别敏感,目前广泛用于猪蓝耳病疫苗的生产。
猪蓝耳病(PRRS),又称为神秘猪病、新猪病、猪流行性流产和呼吸综合症、猪生殖与呼吸综合症、猪蓝耳病、猪瘟疫等,是我国猪病中最主要的一种免疫抑制病,主要引起怀孕母猪后期流产、早产、产死胎和木乃伊胎增多,仔猪出现呼吸道症状和断奶前死亡率增高以及成年猪的免疫机障碍。猪蓝耳病病毒 (PRRSV)属于套式病毒目、动脉炎病毒科,呈卵圆形,有囊膜,基因组为单股正链RNA病毒;该病毒的主要靶细胞是单核细胞-巨噬细胞系统,目前普遍认为该病毒的初级复制部位是鼻黏膜或上呼吸道系统中的巨噬细胞,然后通过血液循环扩散至其他器官,并在其中的单核巨噬细胞系统内增殖。
目前我国动物疫苗生产工艺相对落后,生产病毒所用的细胞绝大部分来自转瓶培养,且主要采用最基础的合成细胞培养基,甚至天然培养基(如水解乳蛋白)加入10%左右新生牛血清,这些动物来源成分带来的疫苗安全、质量和成本等问题已经凸显。主要表现在:①牛血清用量大,使细胞的生长状况对血清的依赖性大,但是血清是一种成分不确定的混合物,批与批之间的组分存在差异,直接影响产品质量的稳定性;②增加生产成本;③血清来源于动物,有可能携带传染源,对正在生长的细胞或者产品带来危险。在生产过程中控制和减少动物来源成分已成为一种趋势。美国FDA和美国农业部已经严密控制在细胞培养中胎牛血清的使用,以降低动物血清可能携带的传染源对细胞和制品带来的风险。降低新生牛血清的用量甚至不使用新生牛血清已成为目前生物制品发展的方向。
猪蓝耳病是一种高度接触性传染病,各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染,但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感染。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源,主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播,也可通过胎盘垂直传播。
目前,猪蓝耳病的主要防治手段是是接种疫苗,但是在实践过程中,猪蓝耳病疫苗防治经常会出现免疫失败,其主要原因是疫苗免疫时,机体产生中和抗体时间较长,或不能产生高效价的抗体,而在此期间均有可能感染猪蓝耳病毒。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,本实发明专利设计了一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病疫苗的方法,是将猪蓝耳病毒直接接种于Marc-145全悬浮细胞进行培养,就可直接获得病毒液(半成品),解决了猪蓝耳病毒疫苗大规模细胞培养的批间差等一系列问题。
本发明所提供的使用Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病疫苗的方法的技术方案为:
(a)Marc-145细胞的驯化培养,所述驯化培养为Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将Marc-145细胞由含血清培养基培养驯化为无血清培养基进行培养;
(b)取细胞状态良好并经驯化后Marc-145悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养,待细胞状态稳定,生长良好后接种于2L~8L的生物反应器中进行预培养,随后根据细胞状态,生长情况,逐步放大培养直至终级反应器;
(c)待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0~10.0×106.0个/ml,同时细胞状态稳定,调整反应器细胞密度,使其达到4.0×106.0~5.0×106.0个 /ml,按MOI0.1~1.0接种猪蓝耳病毒至Marc-145悬浮细胞中,猪蓝耳病毒的含量为每0.1ml病毒含量≥108.5TCID50,培养至细胞病变达80%以上时收获病毒液;
(d)将收获的病毒液进行纯化、灭活后得灭活疫苗。
进一步的,所述步骤(a)将Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将含血清培养基培养驯化为由无血清培养基进行培养的方法为:
(1)贴壁Marc-145细胞用胎牛血清含量为7~10%的MEM培养基连续传代培养2次;
(2)使用胰酶消化Marc-145细胞、低速离心,得到的细胞用无血清悬浮培养基并加入7~10%的胎牛血清以转速为40-60r/min进行摇床培养,接种密度以1.0×106~1.5×106个/ml连续传代培养4次;
(3)无血清悬浮培养基并加入4~6%的胎牛血清以转速为60-80r/min进行摇床培养,接种密度以0.8×106~1.2×106个/ml连续传代培养4次;
(4)无血清悬浮培养基并加入1~2%的胎牛血清以转速为80-100r/min 进行摇床培养,接种密度以0.6×106~0.8×106个/ml连续传代培养4次;
(5)无血清悬浮培养基以转速为100-140r/min进行摇床培养,接种密度以0.6×106~0.8×106个/ml连续传代培养4次;
(6);无血清悬浮培养基以转速为100-140r/min进行摇床培养,接种密度以0.45×106~0.65×106个/ml连续传代培养4次;
进一步的,所述Marc-145细胞进行摇床培养时每一代的培养时间为72-120 小时。
进一步的,所述步骤(b)中进行摇瓶扩大培养时,每次放大时细胞密度不低于0.45×106~0.65×106个/ml,放大体系为由20ml摇瓶逐级放大至50ml至 100ml至150ml的摇瓶。
进一步的,所述步骤(d)中将收获的病毒液进行纯化的方法为将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓缩80-100倍后,采用分子筛层析柱对滤液进行纯化;将收获的病毒液进行灭活的方法为采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后,加入常规稳定剂1:1混合配制成灭活疫苗。
进一步的,所述猪蓝耳病灭活疫苗为PRRS,所述PRRS为CH-1a株,包括且不限于此毒株。
本发明进一步规范了猪蓝耳病毒疫苗的生产规范,能够最大程度使疫苗生产更加的,规范、安全、高效、低成本的生产猪蓝耳病毒疫苗,最重要的减少了猪蓝耳病毒需经贴壁细胞增殖所产生的一系列安全性及操作多等缺点与不足,减少不必要操作与成本。
附图说明
图1显示了本发明经减低血清含量细胞状态。
图2显示了本发明初上摇瓶细胞状态。
图3显示了本发明经完全驯化后的细胞状态
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
本发明中提及的无血清培养基均购自北京鼎持生物有限公司及壹生科(深圳)有限公司。
贴壁细胞培养型Marc-145细胞从CCTCC引进,引进时间:2018年5月, CCTCC编号:3153C0001000000217。
本细胞经在北京鼎持生物有限公司扩增培养后建立了细胞库,细胞库的编号为:BJDC-201800005。
本发明经培养适应无血清全悬浮培养的Marc-145细胞株命名为Marc145-S 株,该株细胞已于2019年07月04送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCCNO.18181。
实施例1
使用含7%的胎牛血清的MEM培养液复苏Marc-145冻存贴壁细胞,待细胞生长致密后进行传代,连续传代培养2次;
使用胰酶消化Marc-145细胞、低速离心,得到的细胞用无血清悬浮培养基并加入10%的胎牛血清以转速为40r/min进行摇床培养,接种密度以1.0×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基并加入4%的胎牛血清以转速为60r/min进行摇床培养,接种密度以0.8×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基并加入1%的胎牛血清以转速为80r/min进行摇床培养,接种密度以0.6×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基以转速为100r/min进行摇床培养,接种密度以0.6×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基以转速为120r/min进行摇床培养,接种密度以0.45× 106个/ml连续传代培养4次;
细胞按照上述步骤完成驯化后,得到全悬浮Marc-145细胞培养72h可达到峰值8.0×106个/ml左右,曲线特征为近“S”型曲线,72h后细胞进入衰退期,细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间20~25小时。可见,本发明培养得到的无血清全悬浮培养Marc-145细胞性能优异。
取经过上述步骤驯化得到悬浮Marc-145细胞,置于摇瓶扩大培养,培养 72h后,待细胞密度达到8.0×106个/ml左右时,进行离心后,弃去上清,使用无血清培养基进行重悬,进行扩增培养,由20ml摇瓶至50ml至100ml至 150ml摇瓶进行逐级放大,摇瓶扩大培养的条件参数为转速120转/分、温度37 ±1℃、CO28.0%。
待到细胞体系及状态,达到生物反应器的接种要求时,接种于1L的生物反应器进行悬浮培养,培养的条件参数为转速120转/分、pH值7.2±0.2、溶氧 40%~60%、温度37±0.5℃。
随后进行逐级放大直至最终200L生物反应器,培养的参数为转速120转/ 分、pH值7.2±0.2、溶氧60%、温度37±0.5℃;待最终生物反应器细胞密度达到10.0×106.0个/ml时,调整细胞密度使细胞密度调整为5.0×106.0个/ml,按照MOI感染复数0.1~1.0直接接入猪蓝耳病毒种毒,所述猪蓝耳病毒疫苗,每0.1ml病毒含量≥108.5TCID50,培养至细胞病变达80%以上时收获病毒液,即得。
将按照上述方法制备的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓缩100 倍后,采用分子筛层析柱对滤液进行纯化;后采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后,加入常规稳定剂1:1混合配制成灭活疫苗。
实施例2
使用含9%的胎牛血清的MEM培养液复苏Marc-145冻存贴壁细胞,待细胞生长致密后进行传代,连续传代培养2次;
使用胰酶消化Marc-145细胞、低速离心,得到的细胞用无血清悬浮培养基并加入9%的胎牛血清以转速为50r/min进行摇床培养,接种密度以1.2×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基并加入5%的胎牛血清以转速为70r/min进行摇床培养,接种密度以1.0×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基并加入1.5%的胎牛血清以转速为90r/min进行摇床培养,接种密度以0.7×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基以转速为130r/min进行摇床培养,接种密度以0.7×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基以转速为130r/min进行摇床培养,接种密度以0.5×106个/ml连续传代培养4次;
细胞按照上述步骤完成驯化后,得到全悬浮Marc-145细胞培养72h可达到峰值8.0×106个/ml左右,曲线特征为近“S”型曲线,72h后细胞进入衰退期,细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间25小时。可见,本发明培养得到的无血清全悬浮培养Marc-145细胞性能优异。
取经过上述步骤驯化得到悬浮Marc-145细胞,置于摇瓶扩大培养,培养 72h后,待细胞密度达到8.0×106个/ml左右时,进行离心后,弃去上清,使用无血清培养基进行重悬,进行扩增培养,由20ml摇瓶至50ml至100ml至 150ml摇瓶进行逐级放大,摇瓶扩大培养的条件参数为转速130转/分、温度37 ±1℃、CO28.0%。
待到细胞体系及状态,达到生物反应器的接种要求时,接种于1L的生物反应器进行悬浮培养,培养的条件参数为转速130转/分、pH值7.2±0.2、溶氧 50%、温度37±0.5℃。
随后进行逐级放大直至最终200L生物反应器,培养的参数为转速130转/ 分、pH值7.2±0.2、溶氧50%、温度37±0.5℃;待最终生物反应器细胞密度达到10.0×106.0个/ml时,调整细胞密度使细胞密度调整为5.0×106.0个/ml,按照MOI感染复数0.1~1.0直接接入猪蓝耳病毒种毒,所述猪蓝耳病毒疫苗,每0.1ml病毒含量≥108.5TCID50,培养至细胞病变达80%以上时收获病毒液,即得。
将按照上述方法制备的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓缩90倍后,采用分子筛层析柱对滤液进行纯化;后采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后,加入常规稳定剂1:1混合配制成灭活疫苗。
实施例3
使用含10%的胎牛血清的MEM培养液复苏Marc-145冻存贴壁细胞,待细胞生长致密后进行传代,连续传代培养2次;
使用胰酶消化Marc-145细胞、低速离心,得到的细胞用无血清悬浮培养基并加入10%的胎牛血清以转速为60r/min进行摇床培养,接种密度以1.5×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基并加入6%的胎牛血清以转速为80r/min进行摇床培养,接种密度以1.2×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基并加入2%的胎牛血清以转速为100r/min进行摇床培养,接种密度以0.8×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基以转速为140r/min进行摇床培养,接种密度以0.8×106个/ml连续传代培养4次;
无血清悬浮培养基以转速为140r/min进行摇床培养,接种密度以0.65× 106个/ml连续传代培养4次;
细胞按照上述步骤完成驯化后,得到全悬浮Marc-145细胞培养72h可达到峰值8.0×106个/ml左右,曲线特征为近“S”型曲线,72h后细胞进入衰退期,细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间20小时。可见,本发明培养得到的无血清全悬浮培养Marc-145细胞性能优异。
取经过上述步骤驯化得到悬浮Marc-145细胞,置于摇瓶扩大培养,培养 72h后,待细胞密度达到8.0×106个/ml左右时,进行离心后,弃去上清,使用无血清培养基进行重悬,进行扩增培养,由20ml摇瓶至50ml至100ml至 150ml摇瓶进行逐级放大,摇瓶扩大培养的条件参数为转速140转/分、温度37 ±1℃、CO28.0%。
待到细胞体系及状态,达到生物反应器的接种要求时,接种于1L的生物反应器进行悬浮培养,培养的条件参数为转速140转/分、pH值7.2±0.2、溶氧 40%、温度37±0.5℃。
随后进行逐级放大直至最终200L生物反应器,培养的参数为转速140转/ 分、pH值7.2±0.2、溶氧40%、温度37±0.5℃;待最终生物反应器细胞密度达到10.0×106.0个/ml时,调整细胞密度使细胞密度调整为5.0×106.0个/ml,按照MOI感染复数0.1~1.0直接接入猪蓝耳病毒种毒,所述猪蓝耳病毒疫苗,每0.1ml病毒含量≥108.5TCID50,培养至细胞病变达80%以上时收获病毒液,即得。
将按照上述方法制备的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓缩80- 100倍后,采用分子筛层析柱对滤液进行纯化;后采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后,加入常规稳定剂1:1混合配制成灭活疫苗。
按照上述实施例进行操作得到的猪蓝耳病毒均可达到有效的效果,测毒方法如下:
将各待检样品分别做10倍系列稀释,从10-1稀释至10-7,将不同稀释度分别接种于长成单层的Marc-145细胞96孔细胞培养板中,每个稀释度接种5 孔,每孔100μL,另设5孔只接种稀释液作为阴性对照,每孔100μL。吸附 1h后各孔再加100μL维持液,置于37℃、8%CO2培养箱中培养7d,每天观察并记录各孔细胞病变情况,按Reed-Muench法计算TCID50。测毒效果情况如表 1所示:
表1
实施例 | TCID<sub>50</sub> |
1 | 10<sup>8.5</sup> |
2 | 10<sup>8.6</sup> |
3 | 10<sup>8.5</sup> |
实施例4
疫苗对本动物的安全性
将20只28~35日龄仔猪随机分为4组,每组5头;1-3组分别免疫1次实施例制备的灭活疫苗(5ml/头),4组免疫1次市售猪蓝耳病灭活疫苗(5ml/头),感染后每天上下午各测一次体温,观察临床症状,14日后,均无不良反应。
疫苗效力试验
将25只28~35日龄仔猪随机分为5组,每组5头;1-3组分别免疫1次实施例1~3制备的灭活疫苗(5ml/头),4组免疫1次市售猪蓝耳病灭活疫苗 (5ml/头),5组作为对照组,28日后攻毒,攻毒后观察21天,宰杀后解剖观测其肺脏及其它器官的变化。
实验结果如下:
结果表明:该猪蓝耳病毒疫苗可产生良好的保护效果。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已,不能以此限定本发明创造的实施范围,即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰,皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)Marc-145细胞的驯化培养,所述驯化培养为Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将Marc-145细胞由含血清培养基培养驯化为无血清培养基进行培养;
(b)取细胞状态良好并经驯化后Marc-145悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养,待细胞状态稳定,生长良好后接种于2L~8L的生物反应器中进行预培养,随后根据细胞状态,生长情况,逐步放大培养直至终级反应器;
(c)待终级反应器细胞密度达到8.0×106.0~10.0×106.0个/ml,同时细胞状态稳定,调整反应器细胞密度,使其达到4.0×106.0~5.0×106.0个/ml,按MOI 0.1~1.0接种猪蓝耳病毒至Marc-145悬浮细胞中,猪蓝耳病毒的含量为每0.1ml病毒含量≥108.5TCID50,培养至细胞病变达80%以上时收获病毒液;
(d)将收获的病毒液进行纯化、灭活后得灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,其特征在于,所述步骤(a)中将Marc-145细胞由贴壁培养驯化为悬浮培养同时将含血清培养基培养驯化为由无血清培养基进行培养的方法为:
(1)贴壁Marc-145细胞用胎牛血清含量为7~10%的MEM培养基连续传代培养2次;
(2)使用胰酶消化Marc-145细胞、低速离心,得到的细胞用无血清悬浮培养基并加入7~10%的胎牛血清以转速为40-60r/min进行摇床培养,接种密度以1.0×106~1.5×106个/ml连续传代培养4次;
(3)无血清悬浮培养基并加入4~6%的胎牛血清以转速为60-80r/min进行摇床培养,接种密度以0.8×106~1.2×106个/ml连续传代培养4次;
(4)无血清悬浮培养基并加入1~2%的胎牛血清以转速为80-100r/min进行摇床培养,接种密度以0.6×106~0.8×106个/ml连续传代培养4次;
(5)无血清悬浮培养基以转速为100-140r/min进行摇床培养,接种密度以0.6×106~0.8×106个/ml连续传代培养4次;
(6);无血清悬浮培养基以转速为100-140r/min进行摇床培养,接种密度以0.45 ×106~0.65×106个/ml连续传代培养4次。
3.根据权利要求2所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,其特征在于,所述Marc-145细胞进行摇床培养时每一代的培养时间为72-120小时。
4.根据权利要求1所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,其特征在于,所述步骤(b)中进行摇瓶扩大培养时,每次放大时细胞密度不低于0.45×106~0.65×106个/ml,放大体系为由20ml摇瓶逐级放大至50ml至100ml至150ml的摇瓶。
5.根据权利要求1、2、3、4任一所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,其特征在于,所述步骤(d)中将收获的病毒液进行纯化的方法为将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓缩80-100倍后,采用分子筛层析柱对滤液进行纯化;将收获的病毒液进行灭活的方法为采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后,加入常规稳定剂1:1混合配制成灭活疫苗。
6.根据权利要求5所述的Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法,其特征在于,所述猪蓝耳病灭活疫苗为PRRS,所述PRRS为CH-1a株,包括且不限于此毒株。
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