CN102038942B

CN102038942B - 应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法

Info

Publication number: CN102038942B
Application number: CN2010102821512A
Authority: CN
Inventors: 温文生; 刘汉平; 秦红刚; 漆世华; 李伟; 王桢桢; 肖敏; 张萍; 韩兴
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-09-15
Also published as: CN102038942A

Abstract

本发明涉及一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪蓝耳病病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养并收获病毒液；(3)对收获的病毒液加入冻干保护剂制备冻干弱毒活疫苗，或对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活，通过柱层析方法纯化灭活的病毒，加入佐剂制备灭活疫苗。本发明与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

Description

应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，对养猪业危害很大。目前PRRS在国内愈演愈烈，直接和间接地造成了2006年流行我国大部分省份的所谓“猪无名高热病”，即高致病性猪蓝耳病，导致1000万～3000万头生猪死亡。我国已将高致病性猪蓝耳病列为一类传染病，疫苗免疫是目前防制该病的最根本有效措施。

目前猪蓝耳病疫苗的生产是采用传统的转瓶工艺，即猪蓝耳病病毒接种已形成单层的细胞，培养后一次性收获病毒液。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。

专利公开号为CN101612395 A的专利申请，公开了一种应用生物反应器培养敏感细胞生产猪蓝耳病疫苗的方法，所用的生物反应器为搅拌式生物反应器、气升式生物反应、Wave生物反应器和中空纤维反应器；培养的方式是通过向生物反应器内接种种子细胞，并培养到一定的密度后，接种病毒，收获病毒液。但是利用Cell Lift型生物反应器，采用生物反应器间逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养以制备疫苗，未见报道。

发明内容

本发明的目的为了克服猪蓝耳病疫苗现有生产工艺的缺陷，提供了一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；培养速度快、生产效率高；生产机械化，易于自动控制；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液效价高，与传统的转瓶工艺相比，收获的病毒液滴度提高了0.5～1.5个LogTCID₅₀/ml，疫苗质量稳定。

本发明的技术方案为：

一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用微载体培养制苗用细胞：将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪蓝耳病病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所述的制苗用细胞为对猪蓝耳病病毒毒株敏感的细胞，且为Marc-145细胞和MA104细胞；(2)每天按时取样观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液制得猪蓝耳病活疫苗；或对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活，通过柱层析方法纯化灭活的病毒，加入佐剂制备灭活疫苗。

所述的病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。

所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧(DO)30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH6.8～7.2、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定35℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。

所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

所述的生物反应器容积为14～150L。制苗用细胞可采用14L～40L或14L～40L～150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L的反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；于40L或150L生物反应器培养猪蓝耳病病毒；或直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。

所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度以每天0.5～4个工作体积。

猪蓝耳病病毒可以是制苗用的强毒株，用来制备灭活苗；也可以是制苗用弱毒株，制备弱毒活疫苗。

本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪蓝耳病疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2a为细胞接种后6h的微载体细胞图片。

图2b为细胞接种后5d的微载体细胞图片。

图2c为接毒后细胞状态的微载体细胞图片。

图3为细胞生长曲线。

具体实施方式

以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。

实施例一：生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器，生物反应器设定参数为：pH 7.2、温度37℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm；

微载体：Cytodex 1(通用电气医疗集团生命科学部)；

猪蓝耳病病毒：JXA1株；

细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；

病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；

细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1，水化后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌，接种Marc-145细胞，进行培养；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1×10⁶/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生长，培养4天，细胞的密度达到6×10⁶/ml。

微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到6×10⁶/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度0.02％EDTA的pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度0.02％EDTA、质量浓度0.25％胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。

病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到7×10⁶/ml，排出细胞生长液并更换成病毒维持液，按照0.001MOI接种猪蓝耳病病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，待细胞病变达到80％以上时，同时收获病毒液，测定病毒含量为7.5logTCID₅₀/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，或保存在-20℃。

制备疫苗：将上述收获的病毒液用100KD截留分子量的超滤膜包浓缩10倍，灭活剂与病毒液的体积比按1∶2000加入质量浓度为37％的甲醛溶液进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化疫苗，按抗原和油佐剂1∶1比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗，油佐剂的配制为94％(V/V)白油、6％(V/V)的Span-80，2％(g/V)硬脂酸铝。

实施例二：生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器，生物反应器设定参数为：pH 7.2、温度37℃、DO50％、搅拌速度30～100rpm；

微载体：Cytodex 1(通用电气医疗集团生命科学部)；

猪蓝耳病病毒：JXA1-R株；

细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1，水化后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌，接种Marc-145细胞，进行培养；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1×10⁶/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生长，培养4d，细胞的密度达到6×10⁶/ml。

病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到7×10⁶/ml，排出细胞生长液并更换成病毒维持液，按照0.001MOI接种猪蓝耳病病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，待细胞病变达到80％以上时，同时收获病毒液，测定病毒含量为8.0logTCID₅₀/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，保存在-20℃。

制备疫苗：将上述收获的病毒液按病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶1加入质量浓度为5％蔗糖脱脂乳冻干保护剂，制成冻干活疫苗。

Claims

1.一种应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）用微载体培养制苗用细胞：将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪蓝耳病病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所述的制苗用细胞为对猪蓝耳病病毒毒株敏感的细胞，且为Marc-145细胞和MA104细胞；（2）待细胞病变达到80%以上时，停止培养，收获病毒液；（3）制苗用的弱毒株，对收获的病毒液加入冻干保护剂制备冻干弱毒活疫苗，或制苗用的强毒株，对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活，通过柱层析方法纯化灭活的病毒，加入佐剂制备灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。

3、根据权利要求1所述应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80%和搅拌速度30～100rpm。

4、根据权利要求1所述应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

5、根据权利要求1～4之一所述应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

6、根据权利要求1～4之一所述的应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器容积为14～150L；制苗用细胞经过14L～40L或14L～40L～150L逐级放大培养后，于40L或150L生物反应器培养猪蓝耳病病毒；或直接用14L、40L或150 L的生物反应器培养病毒。

7、根据权利要求1～4之一所述应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～4个工作体积。