CN101607082A - 一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

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孙进忠
乔荣岑
习向锋
荣骏弓
闵亚杰
孟照国
杨海岳
晋春霞
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Abstract

一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：①生产用毒种的制备；②制苗用病毒液的制备；③灭活疫苗制备：将病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃灭活48小时后，取灭活病毒液94～98份(体积份)，加入2～6份(体积份)的吐温－80混合制成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本－806(体积份)份混合后制成油相；将水相与油相混合之比为1∶1.5～1∶2.5一起乳化即制成，分装，入库。该方法具有生产工艺简单，制出的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗效果好等优点。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属兽医生物新医药技术领域，具体地讲涉及一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的繁殖障碍性和呼吸道的传染病，在世界范围内广泛分布，造成了巨大的经济损失，严重制约了养猪业的健康发展，已经成为猪病研究的热点。现在由于对猪繁殖与呼吸综合征尚无有效治疗方法，注射疫苗是防制该病的重要手段。目前国内外已研制出许多疫苗来预防和控制猪繁殖与呼吸综合征，但由于使用猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗预防猪繁殖与呼吸综合征有潜在的生物安全危险，因而兽医科技工作者和生产人员多主张采用灭活苗预防。
发明内容：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是公开一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，该灭活疫苗可以有效地防止猪繁殖与呼吸综合征，并且具有生产方便，使用安全，易于保存的优点。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
所述一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含0.01TCID50/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃含5％CO2培养箱中培养观察48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。
②、制苗用病毒液的制备：将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0.01TCID50/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃旋转培养至48小时收获病毒液。
③、灭活疫苗制备：将病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃灭活48小时后，取灭活病毒液94～98份(体积份)，加入2～6份(体积份)的吐温-80混合制成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本-80 6(体积份)份混合后，随加随搅拌至透明为止，加热到121℃、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶1.5～1∶2.5一起乳化，分装，入库。
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株是本公司自行在国内分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株CQ株，为国内流行的美洲型基因型毒株，与国内同期其它分离株的同源性都在95％以上，该毒株繁殖特性好。在Marc145细胞上的毒价可达108.0/ml以上。
猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株的取得：通过对从河南省猪繁殖与呼吸综合征流行猪场送检的高热病流产死胎肺脏分离的病毒株进行细胞培养特性观察、病毒理化特性测定、病毒核酸类型测定、病毒中和试验、RT-PCR鉴定和动物回归等试验，证实分离的病毒株均为为猪繁殖与呼吸综合征病毒。试验分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒株能被美洲型抗血清所中和。另外，本研究应用美洲型PRRSV特异的引物进行的RT-PCR反应，能对本分离株扩增出特异性DNA片段，对欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒则不能，进一步证实分离毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。将其命名为猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株。
所述制苗用病毒液创新采用低温灭活，2～8℃经48小时，可彻底灭活病毒，并不影响其免疫原性。
该猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗采用的油相的配方与常规不同，白油94份，司本-806份，无硬铝。实验证明没有硬脂酸铝的油苗粘度更小，稳定性也好，对动物机体的刺激性也小。
由于采用了如上所述的技术方案，本发明具有如下积极效果：
①、采用的毒株为在国内分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株，免疫原性良好，用其制备的疫苗免疫国内猪群能更好的抵抗野毒的攻击，为猪繁殖与呼吸综合征疫情的防控提供了技术保障。
②、采用了转瓶生产的方法，而且采用先进科学的接毒工艺，不仅提高了产量，而且所收获的病毒液毒价也高。猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株在Marc-145细胞上增殖过程中，接种剂量为0.01～0.1TCID50/个细胞，最佳收毒时间为48～60h，最佳基础培养基为DMEM，冻融次数以一次为宜，这大大的降低了生产成本，简化了生产工艺。
③、本发明采用低温灭活，4℃经48小时，可彻底灭活病毒，并不影响其免疫原性。
④、使用的佐剂属于免疫增强剂中的一类，单独使用时一般没有免疫原性，与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免疫原性，增强机体的免疫应答，或者改变机体免疫应答类型。本发明采用的佐剂是白油、吐温-80、司盘，没有加入硬脂酸铝稳定剂，实验证明没有硬脂酸铝的油苗粘度更小，稳定性也好，对动物机体的刺激性也小。本发明成品检验效力检验部分采用血清学的方法评价，比常规的攻毒检测方法更为准确、直观、快速、结果更可靠，而且更符合生物安全的原则。
具体实施方式：
实施例1：一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含0.01TCID50/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃含5％CO2培养箱中培养观察48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。
②、制苗用病毒液的制备：将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0.01TCID50/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃旋转培养至48小时收获病毒液。
③、灭活疫苗制备：将病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃灭活48小时后，取灭活病毒液94份(体积份)，加入6份(体积份)的吐温-80混合制成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本-806(体积份)份混合后，随加随搅拌至透明为止，加热到121℃、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油混合，混合之比为1∶1.5一起乳化，分装，入库。
实施例2：一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含0.01TCID50/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃含5％CO2培养箱中培养观察48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。
②、制苗用病毒液的制备：将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0.01TCID50/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃旋转培养至48小时收获病毒液。
③、灭活疫苗制备：将病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃灭活48小时后，取灭活病毒液96份(体积份)，加入4份(体积份)的吐温-80混合制成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本-806(体积份)份混合后，随加随搅拌至透明为止，加热到121℃、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶2.0一起乳化，分装，入库。
实施例3：一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含0.01TCID50/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃含5％CO2培养箱中培养观察48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内。
②、制苗用病毒液的制备：将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0.01TCID50/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃旋转培养至48小时收获病毒液。
③、灭活疫苗制备：将病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃灭活48小时后，取灭活病毒液98份(体积份)，加入2份(体积份)的吐温-80混合制成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本-806(体积份)份混合后，随加随搅拌至透明为止，加热到121℃、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶2.5一起乳化，分装，入库。

Claims (1)

1、一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的制备方法，其特征是：其制备步骤如下：
①、生产用毒种的制备：将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，以含0.01TCID50/个细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株病毒液，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，在37℃含5％CO2培养箱中培养观察48小时，冻融1次收获感染细胞毒液，装于灭菌容器内；
②、制苗用病毒液的制备：将生长良好的单层Marc-145细胞，倒去生长液，按照0.01TCID50/细胞接种猪繁殖与呼吸综合征病毒CQ株生产用毒种，37℃吸附1小时后，加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃旋转培养至48小时收获病毒液；
③、灭活疫苗制备：将病毒含量≥107.0TCID50/ml病毒液在4℃灭活48小时后，取灭活病毒液94～98份(体积份)，加入2～6份(体积份)的吐温-80混合制成水相；取注射用白油94份(体积份)，司本-806(体积份)份混合后，加热到121℃、压力103kPa灭菌后备用，即为油相；将水相与油相混合，混合之比为1∶1.5～1∶2.5，一起乳化，分装，入库。
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