CN112641939B - 油包水型复合佐剂及其制备方法和应用、疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种油包水型复合佐剂及其制备方法和应用、疫苗的制备方法，涉及生物技术领域。本发明提供的油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括白油79％～89％、亲水乳化剂3％～6％和亲油乳化剂8％～15％，其中白油为法国道达尔EOLANE150白油，稳定性好，碳链长度分布集中，应激小、安全性高；以特定比例的白油、亲水乳化剂和亲油乳化剂制备得到的油包水型复合佐剂的环烷基含量高，易于机体吸收；正异构比例适中，以其为原料制备得到疫苗的效价高且持续时间长。本发明提供的疫苗的制备方法简单，制备得到的疫苗稳定性好，保存时间长，免疫后抗体持续期长；黏度低，更易于注射；免疫后副反应低，免疫应答水平高。

Description

油包水型复合佐剂及其制备方法和应用、疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种油包水型复合佐剂及其制备方法和应用、疫苗的制备方法。

背景技术

所谓佐剂就是当一种抗原物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，并能在免疫反应中诱导全面持久的免疫应答。在疫苗制剂中，佐剂的功能主要包括：增强疫苗抗原的免疫原性；促进细胞免疫和体液免疫，优化免疫应答；增进抗原与黏膜之间的传递以及免疫接触；减少疫苗成分中抗原的需求量以及在实施过程中的免疫接种次数；优化抗原结构，维持抗原构象等。灭活疫苗尤其是病毒灭活疫苗因其抗原分子小、免疫原性不强，不能引起足够强的免疫应答，需要佐剂辅助刺激机体才能产生较强的免疫应答，矿物油佐剂加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答，效果远远优于水质佐剂，这也是口蹄疫灭活疫苗、禽流感灭活疫苗等一直使用油佐剂的原因所在。油佐剂疫苗按照剂型又分可为水包油型(O/W)、油包水型(W/O)、水包油包水型(W/O/W)，有些还包含其他免疫刺激性物质，而油包水剂型(W/O)有着免疫持续期长、兼顾体液免疫和细胞免疫、成本低廉等诸多优势，所以在灭活疫苗上广泛应用，特别是禽用灭活疫苗。

然而，现有的油包水型(W/O)疫苗的制备过程较为繁琐，批间受到矿物油品种以及乳化剂的加入等诸多因素影响差异较大。一方面，需要在抗原内加入亲水性的乳化剂，吐温-80等；还需要在矿物油中加入亲油性的乳化剂和助悬剂，如司盘-80、硬脂酸铝等，诸多原料的加入造成操作的繁琐，进而使疫苗的质量把控较为困难。而硬脂酸铝的溶解性较差，必须通过加热至100℃以上才能充分溶解，这使得佐剂的除菌方式较为单一，只能采用高温灭菌的方法实现，而无法采用过滤除菌等其它更为简易的方式，而硬脂酸铝本身带有一定毒性，这在使用过程中也有一定的安全隐患；另一方面，诸多物质的加入也给疫苗最终的剂型、黏度、稳定性等指标带来更多的不可控因素，可能会造成疫苗质量的不稳定。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种油包水型复合佐剂，以缓解现有技术中存在的佐剂灭菌方式单一，批间差异大，使用方法繁琐的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种油包水型复合佐剂的制备方法，该方法简单方便。

本发明的第三目的在于提供一种油包水型复合佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种疫苗的制备方法，该方法操作简单，制备得到的疫苗黏度小，易于注射，稳定性好，有效抗体持续时间长，副反应小。

为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种油包水型复合佐剂，包括按质量百分比计的如下组分：白油79％～89％、亲水乳化剂3％～6％和亲油乳化剂8％～15％；

所述白油为法国道达尔EOLANE150白油。

作为进一步技术方案，包括按质量百分比计的如下组分：白油83％-89％、亲水乳化剂3％-5％和亲油乳化剂8％-12％。

作为进一步技术方案，包括按质量百分比计的如下组分：白油89％、亲水乳化剂3％和亲油乳化剂8％。

作为进一步技术方案，所述亲水乳化剂包括吐温-80和/或吐温-85。

作为进一步技术方案，所述亲油乳化剂包括司盘-80、司盘-85或甘露醇单油酸酯中的至少一种。

第二方面，本发明提供了一种油包水型复合佐剂的制备方法，包括如下步骤：

将配方量的亲水乳化剂和亲油乳化剂加入至白油中，混合后制备得到油包水型复合佐剂。

第三方面，本发明提供了一种油包水型复合佐剂在制备疫苗中的应用。

作为进一步技术方案，所述疫苗包括兽用灭活疫苗或禽用灭活疫苗，优选为禽用灭活疫苗。

第四方面，本发明提供了一种疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将油包水型复合佐剂与含有抗原的水相混合，制备得到疫苗；

所述油包水型复合佐剂和含有抗原的水相的质量比为3:1～3:2，优选为7:3。

作为进一步技术方案，所述混合之前还包括将油包水型复合佐剂进行除菌；

优选地，所述除菌的方式包括过滤除菌或高压灭菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的油包水型复合佐剂批间差异小，质量稳定可控性强，使用方法简单，灭菌方式多样，按质量百分比计包括白油79％～89％、亲水乳化剂3％～6％和亲油乳化剂8％～15％，其中白油为法国道达尔EOLANE150白油，其稳定性好，碳链长度分布集中(C16-C20的分布集中度在90％以上)，应激小、安全性高；白油、亲水乳化剂和亲油乳化剂相互配合，以特定比例的白油、亲水乳化剂和亲油乳化剂制备得到的油包水型复合佐剂的环烷基含量高，易于机体吸收；正异构比例适中，亲水亲油平衡值可控，以其为原料制备得到疫苗的效价高且持续时间长。

本发明提供的疫苗的制备方法简单，便于大规模产业化；制备得到的疫苗稳定性好，保存时间长(室温保存6个月不会破乳，2-8℃保存18个月不会破乳)，免疫后抗体持续期长；黏度低，更易于注射；免疫后副反应低，免疫应答水平高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的疫苗的制备方法流程图；

图2为现有技术中疫苗的制备流程图。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种油包水型复合佐剂，包括按质量百分比计的如下组分：白油79％～89％、亲水乳化剂3％～6％和亲油乳化剂8％～15％；

所述白油为法国道达尔EOLANE150白油。

乳化剂是一种表面活性剂，分子中有亲水基和亲油基。根据亲水亲油平衡值(HLB)，可将乳化剂分为油包水型(W/O型，即亲油型)和水包油型(O/W型，即亲水型)两大类。前者使水分散到油中；后者使油分散到水中。

在本发明的油包水型复合佐剂中，亲水乳化剂的质量百分比典型但非限制性的为3％、4％、5％或6％；亲油乳化剂的质量百分比典型但非限制性的为8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

法国道达尔EOLANE150白油，该白油采用全自动工业化生产工艺生产，产品稳定性好，其运动粘度在4-7之间，碳链长度C16-C20的分布集中度在90％以上(C14以下的占比太大容易造成过大的应激反应；C21以上的占比太大，佐剂的作用不明显)，易碳化合物、稠环芳烃、砷含量、铅含量及重金属都满足国标的要求。

在本发明的油包水型复合佐剂中，白油的质量百分比典型但非限制性的为79％、81％、83％、85％、87％或89％。

本发明提供的油包水型复合佐剂批间差异小、使用方法简单、灭菌方式多样，以特定比例的白油、亲水乳化剂和亲油乳化剂制备得到的油包水型复合佐剂的环烷基含量高，易于机体吸收；正异构比例适中，以其为原料制备得到疫苗的效价高且持续时间长。

在一些优选的实施方式中，包括按质量百分比计的如下组分：白油83％-89％、亲水乳化剂3％-5％和亲油乳化剂8％-12％。

在本发明中，通过对油包水型复合佐剂中各个组分配比的进一步优化和调整，使得油包水型复合佐剂更易于机体吸收，以其为原料制备得到疫苗的效价高且持续时间更长。

在一些优选的实施方式中，包括按质量百分比计的如下组分：白油89％、亲水乳化剂3％和亲油乳化剂8％。

在本发明中，通过对油包水型复合佐剂中各个组分配比的更进一步优化和调整，使得油包水型复合佐剂更易于机体吸收，以其为原料制备得到疫苗的效价高且持续时间更长。

在一些优选的实施方式中，所述亲水乳化剂包括但不限于吐温-80和/或吐温-85，或者本领域技术人员所熟知的能够用于疫苗制备的其他亲水乳化剂。

需要说明的是，“和/或”是指亲水乳化剂可以为吐温-80，也可以为吐温-85，还可以为吐温-80和吐温-85。

在一些优选的实施方式中，所述亲油乳化剂包括但不限于司盘-80、司盘-85或甘露醇单油酸酯中的至少一种，或者本领域技术人员所熟知的能够用于疫苗制备的其他亲油乳化剂。

第二方面，本发明提供了一种油包水型复合佐剂的制备方法，包括如下步骤：

将配方量的亲水乳化剂和亲油乳化剂加入至白油中，混合后制备得到油包水型复合佐剂。

本发明提供的油包水型复合佐剂的制备方法简单快捷。

第三方面，本发明提供了一种油包水型复合佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明的油包水型复合佐剂HLB值可控，在6～8之间，完全满足油包水型乳剂的乳化值要求，稳定性好，能够用于疫苗的制备。

在一些优选的实施方式中，所述疫苗包括兽用灭活疫苗或禽用灭活疫苗，优选为禽用灭活疫苗。

本发明的油包水型复合佐剂能够用于制备兽用灭活疫苗油包水W/O剂型和禽用灭活疫苗油包水W/O剂型，其中用于禽用灭活疫苗油包水W/O剂型的效果最佳。

第四方面，本发明提供了一种疫苗的制备方法，包括如下步骤：

将油包水型复合佐剂与含有抗原的水相混合，制备得到疫苗；

所述油包水型复合佐剂和含有抗原的水相的质量比为3:1～3:2，例如可以为，但不限于3:1、2:1、7:3或3:2，优选为7:3。本发明的油包水型复合佐剂可适应的油水比例更为广泛，适应不同需求，能够在保持疫苗效果的同时，减少水相使用，降低成本。

在本发明中，对于水相中的抗原不做具体限制，例如可以为灭活的重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株、H5N1亚型Re-12株或H7N9亚型H7-Re2株等。

油包水型复合佐剂与水相混合的方式包括但不限于搅拌混合或者采用高剪切混合器混合，例如可以将二者在1000-2000转/分钟下进行搅拌混合，也可以在4000-6000转/分钟条件下使用高剪切混合器进行混合，已获得性质稳定的制剂。

本发明提供的疫苗的制备方法简单，便于大规模产业化；制备得到的疫苗稳定性好，保存时间长(室温保存6个月不会破乳，2-8℃保存18个月不会破乳)，免疫后抗体持续期长；黏度低，在20cP左右，易于注射；免疫后副反应低，免疫应答水平高。

在一些优选的实施方式中，所述混合之前还包括将油包水型复合佐剂进行除菌，避免制备得到的疫苗存在病菌污染。

优选地，所述除菌的方式包括过滤除菌或高压灭菌。

由于本发明的油包水型复合佐剂不含硬脂酸铝，其除菌方式可选择性强，除了高温灭菌之外还可以采用过滤除菌，以减少高温碳化对佐剂作用的影响，适合不同需求，更适合产业化应用。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

一种油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括法国道达尔EOLANE150白油89％、吐温-80 3％和司盘-80 8％。

制备方法：将亲水乳化剂和亲油乳化剂加入至白油中充分混合，制备得到油包水型复合佐剂。

实施例2

一种油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括法国道达尔EOLANE150白油86％、吐温-85 4％和司盘-85 10％。

制备方法同实施例1。

实施例3

一种油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括法国道达尔EOLANE150白油83％、吐温-80 5％和失水甘露醇单油酸酯12％。

制备方法同实施例1。

实施例4

一种油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括法国道达尔EOLANE150白油79％、吐温-80 6％和司盘-80 15％。

制备方法同实施例1。

对比例1

一种油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括法国道达尔EOLANE150白油96％、吐温-80 1％和司盘-80 3％。

制备方法同实施例1。

对比例2

一种油包水型复合佐剂，按质量百分比计，包括法国道达尔EOLANE150白油70％、吐温-80 10％和司盘-80 20％。

制备方法同实施例1。

对比例3

一种油包水型复合佐剂，与实施例1的区别在于，白油为美孚Marcol 52白油。

制备方法同实施例1。

实施例5-8

一种疫苗，制备方法如图1所示：

将实施例1-4的油包水型复合佐剂过滤除菌，称取70g分别与同一批次含有抗原的水相30g使用高剪切混合器(4000-6000转/分钟)混合，制备得到实施例5-8的疫苗，每种疫苗做3个批次。

其中水相中的抗原为灭活的重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株，灭活前H5亚型Re-11株鸡胚液HA效价均不低于1∶512。

实施例9

一种疫苗，与实施例5的区别在于，将实施例1的油包水型复合佐剂60g分别与同一批次含有抗原的水相40g使用高剪切混合器(4000-6000转/分钟)混合。

实施例10

一种疫苗，与实施例5的区别在于，将实施例1的油包水型复合佐剂75g分别与同一批次含有抗原的水相25g使用高剪切混合器(4000-6000转/分钟)混合。

实施例11

一种疫苗，与实施例5的区别在于，水相中的抗原为灭活的重组禽流感病毒H5N1亚型Re-12株，灭活前H5亚型Re-12株鸡胚液HA效价均不低于1∶512。

实施例12

一种疫苗，与实施例5的区别在于，水相中的抗原为灭活的重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re2株，灭活前H7N9亚型H7-Re2株鸡胚液HA效价均不低于1∶512。

对比例3

一种疫苗，与实施例5的区别在于，将实施例5的油包水型复合佐剂替换为对比例1的。

对比例4

一种疫苗，与实施例5的区别在于，将实施例5的油包水型复合佐剂替换为对比例2的。

对比例5

一种疫苗，与实施例5的区别在于，将实施例5的油包水型复合佐剂替换为对比例3的。

对比例6

一种疫苗，制备方法如图2所示：

将吐温80进行高压灭菌，然后称取4.2g加入至55.8g含有抗原的水相中，再与40g经过高压灭菌的佐剂混合，制备得到疫苗。

其中，佐剂组成(按质量百分比计)为：美孚Marcol 52白油94％、司盘80 5％和硬脂酸铝1％。

混合的方式为使用高剪切混合器(4000-6000转/分钟)。

含有抗原的水相与实施例5的相同且为同一批次。

对比例7

一种疫苗，与对比例6的区别在于，水相中的抗原为灭活的重组禽流感病毒H5N1亚型Re-12株，灭活前H5亚型Re-12株鸡胚液HA效价均不低于1∶512。

对比例8

一种疫苗，与对比例6的区别在于，水相中的抗原为灭活的重组禽流感病毒H7N9亚型H7-Re2株，灭活前H7N9亚型H7-Re2株鸡胚液HA效价均不低于1∶512。

实验例1

分别检测实施例5-12和对比例3-8的疫苗的外观、黏度、稳定性、安全性及免疫后21天HI抗体效价，结果如表1所示。

表1疫苗检测结果

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (12)

1.一种油包水型复合佐剂，其特征在于，由按质量百分比计的如下组分组成：白油79%~89%、亲水乳化剂3%~6%和亲油乳化剂8%~15%；

所述白油为法国道达尔EOLANE150白油。

2.根据权利要求1所述的油包水型复合佐剂，其特征在于，由按质量百分比计的如下组分组成：白油83%-89%、亲水乳化剂3%-5%和亲油乳化剂8%-12%。

3.根据权利要求1所述的油包水型复合佐剂，其特征在于，由按质量百分比计的如下组分组成：白油89%、亲水乳化剂3%和亲油乳化剂8%。

4.根据权利要求1-3任一项所述的油包水型复合佐剂，其特征在于，所述亲水乳化剂包括吐温-80和/或吐温-85。

5.根据权利要求1-3任一项所述的油包水型复合佐剂，其特征在于，所述亲油乳化剂包括司盘-80、司盘-85或甘露醇单油酸酯中的至少一种。

6.权利要求1-5任一项所述的油包水型复合佐剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将配方量的亲水乳化剂和亲油乳化剂加入至白油中，混合后制备得到油包水型复合佐剂。

7.权利要求1-5任一项所述的油包水型复合佐剂或采用权利要求6所述的制备方法制备得到的油包水型复合佐剂在制备疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括兽用灭活疫苗或禽用灭活疫苗。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗为禽用灭活疫苗。

10.一种疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1-5任一项所述的油包水型复合佐剂与含有抗原的水相混合，制备得到疫苗；

所述油包水型复合佐剂和含有抗原的水相的质量比为3:1~3:2。

11.根据权利要求10所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述油包水型复合佐剂和含有抗原的水相的质量比为7:3。

12.根据权利要求10所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述混合之前还包括将油包水型复合佐剂进行除菌；

所述除菌的方式包括过滤除菌或高压灭菌。