CN105175551A - 一种抗伪狂犬病毒合成肽疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多肽，其包含T1-B-T2或T2-B-T1构型排列的氨基酸序列，其中，T1为修饰后的SEQ？ID？NO：1；B为SEQ？ID？NO：10；以及T2为修饰后的SEQ？ID？NO：2，以及该多肽还在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。该多肽可以用于合成肽或其它类型的疫苗，可提高疫苗的免疫原性。

Description

一种抗伪狂犬病毒合成肽疫苗及其用途

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种抗伪狂犬病毒合成肽疫苗及其用途。

背景技术

抗体在抗感染免疫中具有重要的作用。抗体直接和病原体结合，阻止病原体感染正常细胞；抗体还可以和细菌毒素作用，阻断毒素作用于靶细胞。此外，抗体也可以吸附于病原体表面，从而激活补体介导的途径来裂解病原体或增进吞噬细胞，如巨噬细胞、嗜中心粒细胞的吞噬作用以及自然杀伤性细胞介导的ADCC作用。另外，抗体，特别是IgG，还可以穿过母体胎盘进入胎儿的循环系统，从而保护胎儿在出生初期免受病原体的感染。因为抗体强大的抗感染作用，不难理解几乎所有上市的人用疫苗保护效力都与抗体水平相关(Vaccines,6thedition,S.A.Plotkin)。

抗体能够抗病原侵袭从而对机体起保护作用，如何提高疫苗的免疫原性从而增强抗体的应答水平成为疫苗研究与开发领域的关键性问题。抗体的分泌细胞称为浆细胞，其来源于活化的B细胞，特别是位于淋巴组织生发中心的B细胞(GerminalCenterBcells,GCB)。GCB细胞分化成浆细胞需要抗原的持续刺激。灭活疫苗或亚单位疫苗中的佐剂成分很大程度是通过缓释抗原，从而向GCB细胞提供持续抗原刺激，促进其分化成分泌抗体的浆细胞。除了抗原刺激，GCB细胞还需要激活的、同源性(cognate)的CD4T细胞的“帮助”才能分化成浆细胞。激活的CD4T细胞在不同的免疫微环境下分化成功能和表型不同的亚类，包括TH1、TH2以及TH17等，这些激活的CD4T细胞通常被称为辅助性T细胞(helperTcell,Th)。其中TH1和TH2都具有“帮助”B细胞分化成浆细胞的能力。

最新的研究发现，专业提供B细胞“帮助”的辅助性T细胞是一个不同于TH1和TH2的新型亚类。因该亚类在细胞表面高度表达趋化因子受体CXCR5，受趋化因子CXCL13的招募后，迁移至B细胞滤泡区域而被称为滤泡辅助性T细胞(FollicularhelperTcell)。在滤泡区里，活化的Tfh细胞向GCB细胞提供CD40L、ICOS、IL-21等“帮助”信号，确保GCB细胞的存活并促进其分化为浆细胞。而B细胞欲获得Tfh细胞的“帮助”，必须将Tfh的TCR可识别的表位肽段置于MHCII上，并展示在细胞表面供TCR结合以激活Tfh细胞。综上，B细胞分化成分泌抗体的浆细胞，先后需要三个步骤：1)B细胞利用B细胞受体(Bcellreceptor,BCR)特异性地识别、结合抗原，从而激活BCR信号通路，使B细胞处于活化状态，为随后的细胞增值和浆细胞分化作准备；2)抗原与BCR结合后，以内吞(Endocytosis)的方式被吞入B细胞形成内噬体(Endosomes)，在内噬体低pH条件下，抗原被降解、截断成13-25个氨基酸的短肽，这些短肽被置于B细胞的MHCII分子上，并被转运至细胞表面，供Tfh的TCR识别。3)Tfh的TCR识别B细胞MHCII类分子递呈的抗原后，通过膜上的共刺激分子CD28与B细胞的B7分子结合而活化，活化的Tfh细胞上调表达CD40L，该分子与B细胞膜受体CD40结合进一步刺激B细胞，使B细胞完全活化。所以，诱导较高抗体水平的抗原至少包含两个部分，一个是可供B细胞BCR识别的抗原成分，另外则是可以被TCR识别的T细胞表位，二者缺一不可。

所有有核细胞表面都分布MHCⅠ类分子，而MHCII类分子主要分布于专职抗原递呈细胞膜，如B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。MHCII类分子以一定的亲和力与抗原肽结合为复合物(pMHC)并递呈于细胞表面，Tfh细胞利用TCR特异性的识别、结合该复合物而被激活。威胁人类的病原体种类繁多，并时常变异，因而MHC基因的高度多态性和多基因性极大扩展了个体对抗原肽递呈的范围，提高个体对不利环境的抵御能力，有利于维持种群生存与延续。最新研究发现，抗原肽与MHCII类分子的亲和力越高，两者的结合范围越广，TCR识别、结合pMHC的能力越强，则生成效应性Tfh细胞群就越多，产生的免疫效力更强。因此，研制一种对MHCII类分子具有普遍亲和力的T细胞表位抗原肽，成为当前疫苗研制的重大课题。

早期的实验已经证明，抗体的生成需要CD4T细胞的“帮助”。以此为基础，通常把B细胞表位或其它化学小分子类的半抗原成分共价偶联到载体蛋白，如KLH、BSA、OVA上，这些载体蛋白在BCR识别和结合抗原后，随目标抗原一起被内吞到B细胞内，从而被加工、展示于MHCII上，继而递呈给CD4T细胞，使CD4T细胞活化，相应的B细胞在获得活化CD4T细胞帮助后，分化成浆细胞产生抗体。另外，在疫苗学领域，通常将B细胞表位和CD4T细胞表位的组合物作为抗原接种机体，使B细胞在CD4T细胞的帮助下产生抗体，从而起到免疫保护的作用。尽管动物用包含CD4T细胞表位和B细胞表位的口蹄疫合成肽疫苗已经上市，但此类合成肽疫苗大部分还处于试验阶段，免疫效果还有待商榷。迄今为止，尚未有人用合成肽疫苗上市，一个重要的原因是对Tfh细胞及B细胞相互关系的认识还处于初级阶段，所设计的合成肽疫苗刺激能帮助的B细胞的CD4T细胞(即Tfh)的数量和质量有待提高。

发明内容

本发明的一方面提供了一种多肽，其包含T1-B-T2或T2-B-T1构型排列的氨基酸序列，

其中，T1为修饰后的SEQIDNO：1；

B为SEQIDNO：10；

T2为修饰后的SEQIDNO：2。

T1、B或T2可以通过间隔序列来功能性连接，其中间隔序列可以是任何不影响T1、B或T2结构或者功能的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中，间隔序列为εK。

在本发明的实施例中，所述修饰包括置换、添加和/或缺失原来的细胞表位中的一个或多个氨基酸，且修饰后的细胞表位与所述原来的细胞表位具有相同免疫功能。

在本发明的代表实施例中，所述SEQIDNO：1的修饰可以包括下列的一个或多个修饰：

(1)第1位氨基酸丝氨酸置换为疏水性氨基酸；

(2)第2位氨基酸谷氨酸置换为带正电的氨基酸；

(3)第12位氨基酸谷氨酸置换为疏水性氨基酸；和

(4)第13位氨基酸甘氨酸置换为疏水性氨基酸。

在本发明的代表实施例中，所述SEQIDNO：2的修饰包括下列的一个或多个修饰：

(1)第1位氨基酸脯氨酸置换为疏水性氨基酸；

(2)第3位氨基酸酪氨酸置换为其他芳香族氨基酸；

(3)第6位氨基酸谷氨酰胺置换为疏水性氨基酸；

(4)第7位氨基酸天冬酰胺置换为带正电或芳香族的氨基酸；和

(5)第13位氨基酸苏氨酸置换为疏水性氨基酸。

在本发明的一个具体实施例中，T1表位包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，T2表位包含SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。

其中，上述表位组合通过人工合成、通过原核或真核细胞表达、或通过基因重组技术嵌入病原体而获得。

在本发明的另一个方面中，提供了一种分离的多核苷酸，其包含选自下组中的一种：

a)编码如前面所述的多肽；或者

b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。

在本发明的另外一个方面中，提供了一种疫苗，其包含至少一种前面所述的多肽。

在本发明中，本发明的疫苗还包含医学或兽医学上可接受的递送载体或佐剂。

在本发明的实施例中，疫苗施用途径选自眼内、鼻内、肌内、注射、口服、腹腔内、皮下、局部、皮内和透皮递送。

在本发明的一个方面中，提供了一种疫苗佐剂，其包含至少一种前面所述的多肽。

此外，本发明的多肽在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。以及根据本发明的分离的多肽用于生产多核苷酸的用途也是在本发明的范畴内。

在本发明中，本发明的多肽在制备单克隆或多克隆抗体中的用途。

在本发明中，本发明的多核苷酸在制备多肽中的用途。

在本发明中，本发明的疫苗在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。

在本发明中，本发明的疫苗佐剂在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。

本发明的有益效果通过实施例，发明人发现T1-B-T2诱导机体产生抗体的能力比单一的T1-B或T2-B或B高5-10倍，此发现说明本发明的序列组合可以刺激机体产生较强的Tfh应答，更重要的是，增强Tfh的应答能力可以大幅度地促进相应的抗体产生。本发明所述的包含表位组合产物可以广泛地使用于抗病原感染或肿瘤或自身免疫性疾病的预防性疫苗、治疗性疫苗，以诱导产生高水平的抗体；本序列组合也可用于生产多克隆或单克隆抗体，用于诊断、治疗以及科研。因为本发明为人工合成产物，具有成分明确、质量可控、靶标清楚的特点，用于合成肽疫苗具有较强的优势。

下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。

附图说明

图1示出PCV疫苗免疫小鼠后血清稀释倍数的结果。

图2示出不同CD4T细胞和B细胞表位组合诱导Tfh的频率。

图3示出不同CD4T细胞和B细胞表位组合诱导Tfh的数量。

图4示出PRSV疫苗免疫兔后产生的抗体稀释倍数的结果。

具体实施方式

除非特别说明，本发明的术语具有本领域通常使用的含义。

表位可以分类为B细胞型、T细胞型或B细胞型和T细胞型两者，取决于它们引起的免疫应答的类型。B细胞或T细胞表位的定义不是明确的；例如，一种肽表位能够诱导抗体产生，但同时该表位能够具有一种序列，该序列能够结合于人HLA分子，使得它容易到达CTL，因此对于该特定表位为双B细胞和T细胞分类。“T辅助细胞”或“Tfh”是在被特异性抗原刺激时释放促进B细胞和杀伤T细胞的活化和功能的细胞因子的任何T细胞。

“氨基酸”是指化合物，其具有氨基基团和羧酸基团，优选是在碳骨架上的1,2-取代、1,3-取代或1,4-取代模式。α-氨基酸是最优选的，且包括在蛋白中发现的20种天然氨基酸(它们是L-氨基酸，除了甘氨酸)、相应的D-氨基酸、相应的N-甲基氨基酸、侧链修饰的氨基酸、没有在蛋白中发现的生物合成获得的氨基酸(例如4-羟基-脯氨酸、5-羟基-赖氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、β-氰基丙氨酸)、以及合成衍生的α-氨基酸(例如氨基异丁酸、正亮氨酸、正缬氨酸、同型半胱氨酸和同型丝氨酸)。丙氨酸和Y-氨基丁酸分别是1,3-氨基酸和1,4-氨基酸的例子，且许多其它氨基酸在本领域是公知的。抑胃酶氨酸样等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOH置换)、羟基亚乙基等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CHOHCH₂置换)、还原的酰胺等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CH₂NH键置换)和硫代酰胺等构物(包括两个氨基酸的二肽，其中CONH键被CSNH键置换)也是本发明有用的氨基酸残基。用于本发明的氨基酸是可商业获得或者可通过常规合成方法获得的氨基酸。

“置换”是指由不同的氨基酸或核苷酸置换一个或多个氨基酸或核苷酸。

“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在或改变前的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。

“置换、缺失和/或添加一个或多个氨基酸”则是指，利用定位诱变法等公知的突变核酸或多肽的制作法置换、缺失和/或添加能够置换、缺失和/或添加的程度的数目的氨基酸或核苷酸。上述突变不限于利用已知的定点突变法而人为诱导的突变，也可以是对天然存在的核酸或蛋白质的突变进行分离纯化而得到的。对氨基酸的突变可以包含有一个或多个氨基酸残基为构象为D-型的氨基酸，自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸，这些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。与此相类似的，诱导核酸发生突变，可以包括自然界天然存在的核苷酸，也可以包括具有修饰的核苷酸。

本领域技术人员已知的氨基酸的保守替代是在本发明的范围内。保守氨基酸替代包括一个氨基酸用另一个具有相同类型官能团或侧链例如脂肪族、芳族、带正电、带负电的氨基酸置换。这些替代可以增强口服生物利用度、渗透到中枢神经系统、靶向特异性细胞群体等。本领域技术人员知晓，在编码序列中改变、增加或删除单个氨基酸或小百分率的氨基酸的对肽、多肽或蛋白序列的个别替代、删除或增加是“保守修饰变体”，其中改变导致了氨基酸用化学类似的氨基酸替代。例如，以下六组各自含有用于彼此保守替代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。提供功能上类似的氨基酸的保守替代方式在本领域中是公知的，其他任何已知的替代方式都是可以的。

“疏水性氨基酸”是指侧链具有高疏水性的氨基酸，例如蛋氨酸(M)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)和丙氨酸(A)。

“芳香族氨基酸”是指含有芳香环的氨基酸，例如酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)以及甲状腺素。

“带正电的氨基酸”是指侧链带有正电荷的氨基酸，例如赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。

“多肽”或“氨基酸序列”是指肽、寡肽、多肽或蛋白质及其部分片段，其间以肽键相连接的氨基酸。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。本发明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作为附加的肽，如多组氨酸标签(His-tag)、或Myc、FLAG等表位标记的肽为例。

肽类似物和肽模拟物也包括在本发明的范围内，此外还包括本发明的肽的盐和酯。根据本发明的肽类似物可任选地包括至少一个非天然氨基酸和/或在C端或N端的至少一个封闭基团。本发明的肽的盐是生理学上可接受的有机盐和无机盐。适当的“类似物”的设计可以用计算机辅助。

“肽模拟物”是指根据本发明的肽以包括至少一个非肽键例如脲键、氨基甲酸酯键、磺酰胺键、肼键或任何其它共价键的这种方式来修饰。适当的“肽模拟物”的设计可以用计算机来辅助。

本发明的肽的盐和酯包括在本发明的范围内。本发明的肽的盐是生理学上可接受的有机盐和无机盐。本发明的肽的功能衍生物包括可以通过本领域已知的方式由作为残基上的侧链或N或C端基团存在的官能团制备的衍生物，并且包括在本发明中，只要它们保持药学上可接受，即它们不破坏肽的活性且不赋予含有它的组合物以毒性。这些衍生物例如包括羧基的脂肪族的酯、通过与氨或伯胺或仲胺反应所产生的羧基的酰胺、通过与酰基部分(例如烷酰基或碳环芳酰基)反应形成的氨基酸残基的游离氨基的N-酰基衍生物或通过与酰基部分反应形成的游离羟基(例如丝氨酰基或苏氨酰基残基)的O-酰基衍生物。

“多核苷酸”、“核酸序列”或“碱基序列”是指核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本发明的核酸能够以RNA(例如，mRNA)的形态、或DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)、或非编码链(反义链)中任一种。另外，本发明的多核苷酸也可以在其5’端或3’端融合编码标签标记(标签序列或标记物序列)的多核苷酸。它们可以是合成的或是从天然来源获得的(例如，分离和/或纯化)，其可以包含天然的、非天然的或者修饰过的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸之间的键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，用来代替在未修饰的寡核苷酸中核苷酸之间存在的磷酸二酯键。

“分离的”一词是指将物质从它原始的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)分离出来。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，而同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸或多肽可以是某一载体的一部分，也可以是某一组合物的一部分。既然载体和组合物不是它的天然环境的成分，它们仍然是分离的。

“核酸杂交”在本领域已公知(参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rdEd.，ColdSpringHarborLaboratory，2001)。通常，温度越高，盐浓度越低，则严谨性变得越高(难以杂交)，从而能够取得更加相同的多核苷酸。适合的杂交温度根据碱基序列或其碱基序列的长度而异。另外，本发明还涉及在“严格条件”下杂交。本发明中，“严格条件”是指，在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，例如，42℃的条件下、在(50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/mL的变性剪切鲑鱼精子DNA)中孵育过夜，然后在65℃条件下用0.1×SSC洗脱。

本发明的疫苗包括多肽或包含多肽的重组融合蛋白和任选的佐剂。所述疫苗可以被配制用于以多种不同方式之一施用。根据本发明的一个实施方案，所述疫苗鼻内施用。所述疫苗制剂可以任何便利的方式应用到淋巴组织。然而，优选将它作为液流或液滴应用到鼻通道的壁上。鼻内组合物能够例如以液体形式配制为滴鼻剂、喷雾剂，或者适合于吸入，配制为粉剂、霜剂或乳剂。该组合物能够含有多种添加剂，例如佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂或防腐剂。

为了简单应用，所述疫苗优选在适于以滴鼻剂或气溶胶的形式分布所述多肽或重组融合蛋白的容器中供应。在某些优选实施方案中，所述疫苗被配制用于粘膜递送，尤其鼻部递送(Arnon等，Biologicals(生物制品).2001；29(3-4):237-42；Ben-Yedidia等，IntImmunol.(国际免疫学)1999；11(7):1043-51)。

在本发明的一个实施例中，可通过喷雾、气雾剂或滴眼剂进行经眼施用。可将疫苗配制为液体或干粉，以作为气雾剂、喷雾剂或滴眼剂施用。作为气雾剂、滴眼剂或喷雾剂施用的组合物可包含一种或多种类型的通常包含在此类组合物中的赋形剂，例如防腐剂、粘度调节剂、张力调节剂、泪液阻断剂、缓冲剂、稳定剂、载体、佐剂等，以制备经眼施用的制剂。

在本发明的一个实施方案中，施用为口服，且所述疫苗可以例如以片剂的形式提供，或者在明胶胶囊或微胶囊内包裹。还在又一个实施方案中，所述疫苗被配制用于胃肠外施用。在一些实施方案中，所述疫苗被配制用于大规模接种，例如与喷射注射器或一次性用药筒一起使用。还根据又一个实施方案，所述施用是肌内。还根据又一个实施方案，所述施用是皮内。专门设计用于皮内投入疫苗的针在本领域中是已知的，例如特别是公开在美国专利号6,843,781和7,250,036中。根据其它实施方案，所述施用用无针注射器进行。

这些形式的制剂对于本领域技术人员来说是常识。

递送载体包括脂质体、微颗粒、纳米颗粒等。脂质体提供了用于抗原递送和呈递的另一递送系统。脂质体是由包围一个通常含水中心的磷脂和其它甾醇组成的双层囊泡，在所述含水中心中抗原或其它产物能够被包封。脂质体结构是高度多样的，许多类型是在从约25nm到约500μm的纳米级到微米级的范围内。已经发现，脂质体可有效递送治疗剂到皮肤和粘膜表面。脂质体能够进一步被修饰，用于例如通过将特异性抗体并入到表面膜来靶向递送，或者被改变成包封细菌、病毒或寄生虫。完整的脂质体结构的平均生存时间或半衰期可以在包括某些聚合物例如聚乙二醇时延长，允许在体内延长释放。脂质体可以是单层的或多层的。微颗粒和纳米颗粒使用小的可生物降解的球体，它用作疫苗递送的贮库。聚合物微球具有的超过其它贮库效应的佐剂的主要优点是，它们是极其安全的，且已经被美国食品和药品管理局批准作为适合的缝合线用于人类医药以及用作可生物降解的药物递送系统。共聚物水解的速率被很好表征，进而允许制造在延长时间内具有持续抗原释放的微颗粒。疫苗(包括多肽、佐剂等)可以用递送载体包封递送。

在一些应用中，佐剂或赋形剂可以包括在疫苗制剂中。所述佐剂的选择将部分通过疫苗的施用方式来决定。使用的佐剂还可以理论上是已知用于基于肽或蛋白的疫苗的任何佐剂。佐剂以辅佐量使用，该量能够随佐剂、宿主动物和免疫原而改变。

下面的实施例中提供了具体的合成肽组合表位的免疫原，用于举例说明本发明。这些实施例的目的仅在于说明本发明一部分功能，不能够对本发明的范围构成任何方式的限制，本发明的应用领域不限于下列的实施例。

作为具体实施例，本发明提供了一种抗伪狂犬病毒合成肽，其通过新型T1和/或T2细胞表位序列串联形成组合物。该组合物配合佐剂制成药物接种哺乳动物或鸟类，能够使哺乳动物或鸟类在一段时间内产生针对伪狂犬病毒的抗体，通过产生的伪狂犬病毒抗体水平和特异性Tfh数量和频率，评价T1和/或T2表位辅助B细胞表位的能力。

实施例1、表位组合的设计

在本发明的组合表位中，T1来源于麻疹病毒融合蛋白的CD4T细胞表位(Genebank:AAF85664.1,a.a292-304)。此表位被称为通用型辅助型T细胞表位，其可以结合不同种类动物及同种动物不同的MHCII分子，从而激活更多种类Tfh的克隆。

在本发明的组合表位中，B为SEQIDNO:10(实施例5、伪狂犬病毒表面衣壳蛋白(PRSV)(GenBank:ACQ65661.1，glycoproteinB,partial[Cervidherpesvirus2]，aa43-65)。

在本发明的组合表位中，T2来源于甲型流感病毒(H3N8)的血凝素蛋白的CD4T细胞表位(GenBank:ABV58843.2，a.a59-71)；此表位被称为通用型辅助型T细胞表位，其可以结合不同种类动物及同种动物不同的MHCII分子，从而激活更多种类的Tfh的克隆。本发明将B细胞表位置于T1及T2之间，目的是防止T1及T2的相邻生成新的B细胞表位而降低目标抗体的生成能力。

本发明采用异质性的T1、T2通用表位而不是相同的通用表位，目的是结合不同种类的MHCII，从而激活更广泛的Tfh前体，即幼稚型的CD4T细胞。

在本实施例中，修饰后的T1序列为下述SEQIDNO:3氨基酸序列：AKIKGVIVHRLAA(SEQIDNO:3)。T1序列来源于麻疹病毒融合蛋白的CD4T细胞表位(Genebank:AAF85664.1,a.a292-304)，其序列为SEIKGVIVHRLEG(SEQIDNO：1)。最新的发现表明，表位肽/MHCII的复合物与TCR的亲和力与Tfh的分化正相关。此亲和力体现在两个方面，1)特定表位肽在MHCII上的丰度，此丰度取决于表位肽与MHCII分子的亲和力；2)特定表位肽的侧链与TCR的亲和力。以此为基础，发明者对SEIKGVIVHRLEG进行如下修饰，以提高其诱导Tfh分化的能力：

(1)第1位的氨基酸S为MHCII的锚定氨基酸，通常为疏水性氨基酸。在本实施例中，其被为置换为疏水性较强的A。

(2)第二位的氨基酸E为TCR的结合位点，通常带正电的氨基酸可以促进与TCR的结合。在本实施例中，其被为置换为带正电的氨基酸K。

(3)表位C末端的氨基酸为MHCII锚定序列，通常为疏水性的氨基酸。在本实施例中，将12位、13位的E、G置换为疏水性较强的A，以提高MHCII的锚定能力。

在本实施例中，修饰后的T2序列为下述SEQIDNO:4氨基酸序列：AKFVKAWTLKLAA(SEQIDNO:4)。T2序列来源于甲型流感病毒(H3N8)的血凝素蛋白的CD4T细胞表位(GenBank:ABV58843.2，a.a59-71)，其氨基酸序列为PKYVKQNTLKLAT(SEQIDNO：2)。与T1的修饰相似，发明者对PKYVKQNTLKLAT进行如下修饰，以提高其诱导Tfh分化的能力：

(1)第1位的氨基酸P为MHCII的锚定氨基酸，通常为疏水性氨基酸。在本实施例中，其被为置换为疏水性较强的A。

(2)第3位的氨基酸Y为MHCII的结合位点，同为芳香族氨基酸的F比Y有更强的MHCII结合能力。在本实施例中，将第3位的Y置换为F。

(3)第6位的氨基酸Q为MHCII的锚定氨基酸。为了提高MHCII的锚定能力，将第6位的Q置换为疏水性较强的A

(4)第7位的氨基酸N为TCR的结合位点，通常带正电或芳香族的氨基酸可以促进与TCR的结合。在本实施例中，其被为置换为芳香族的氨基酸W。

(5)第13位的氨基酸T为MHCII的锚定氨基酸。在本实施例中，将13位的T置换为疏水性较强的A，以提高MHCII的锚定能力。

实施例2、多肽的合成

用化学合成法合成表1中的肽。本发明利用Merrifield固相合成方法，使用ABI公司433A型自动多肽合成仪，采用WANG树脂和9-芴甲氧羰基(Fmoc氨基保护基团)和其它保护基团修饰的氨基酸，按照从羧基端(-COOH)到氨基端(-NH₂)方向，依次合成表1中合成肽的序列。当合成完成后，按照ABI公司多肽合成标准裂解程序，应用氢氟酸切割多肽和树脂，使多肽和树脂分离，同时也脱去氨基酸侧链的保护基团。

被裂解下来的多肽通过反复洗涤和沉淀，通过反相高效液相色谱和质谱进行定量分析。当分析的多肽质量合格后，称重分装，然后用于下游实验。

实施例3、多肽的乳化

准确称量表1中所选择的序列号为SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14共10个组合成肽免疫原的多肽(参见表1)，用二甲基亚枫(DMSO)和注射用水溶解，超声过滤后，配制成浓度为500μg/mL的多肽溶液。量取相同体积的法国道达尔公司白油(医药级)作为佐剂，用英国IKA乳化机乳化成油包水的合成肽免疫原。另外配制一组不含有任何抗原物质的注射用水和道达尔白油佐剂乳化组，作为阴性对照使用。通过质量检验后用于动物免疫。

表1、PCV和PRSV病毒表位及其组合方式

实施例4、猪圆环病毒表位衣壳蛋白(GenBank:ACZ06596.1，capsid[Porcinecircovirus-2]，aa119-130和aa231-233)

1、免疫方案

根据上述乳化好的SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9共计5种合成肽免疫原，在相同条件下使用每种合成肽免疫原免疫5只小鼠，按照下面列出的试验免疫方案免疫小鼠：

实验组和动物数量：共分为6组，试验组5组，对照组1组。

实验动物：C57小鼠，每组5只小鼠。

动物年龄、性别和体重：6周龄雄性小鼠，体重20克到22克。

合成肽免疫原佐剂和剂型：道达尔白油佐剂，油包水。

免疫剂量：每只0.2mL，每毫升含有500μg合成肽免疫原。

采血时间：免疫前第0天，免疫后第7天、第15天和第30天采血。

接种途径：双后肢肌内注射，分2点注射，每点0.1mL。

严格按照上述小鼠动物实验方案执行。在采血分离血清储藏用于ELISA(酶联免疫吸附试验)实验，确定血清中抗体水平。

2、间接ELISA方法测定小鼠血清抗体水平及结果判定

A.抗体测定。用事先准备好的序列号SEQIDNOs:5-9合成肽包被96孔平底酶标板，通过间接ELISA方法，确定小鼠产生的抗体水平。用PH＝9.6的0.05M碳酸盐缓冲液溶解合成肽SEQIDNOs:5-9，浓度为7μg/mL，每孔加入100μL。4度放置16小时。用5％脱脂奶粉(sigma)/PBS封闭，37度保温3小时。封闭酶标板后立刻用于间接ELISA分析。

将分离的小鼠血清先做50倍稀释，然后3倍系列稀释直到第8列孔，第一列即50倍稀释，血清稀释见表2。每孔加入样品100μL，同时设定阴性对照。孵育1小时。洗涤后，加入酶标二抗，每孔100μL，孵育1小时。洗涤后加入TMB底物反应15分钟，加入终止液。在波长450nm测定酶标板各孔的OD值。

表2、血清样品稀释倍数表

注：X1到X96为具体测定的样品OD值。

结果判定标准：基于吸收度的线性回归分析，将波长450nm吸收的截止值设定为0.5，该设定值是正确和精确的，因为进行每次分析稀释正常对照小鼠样品的OD值均小于0.15。我们运用Reed-Muench法测定各组小鼠在OD值时血清样品的稀释倍数。

Reed-Muench法公式：

待检测样品＝预先稀释倍数×3k

K＝n+(X1-0.5)/(X1-X2)

X1高于截止值0.5的样品最大稀释倍数的OD值

X2低于截止值0.5的样品稀释倍数OD值

之后计算加权平均值，最终结果见表3。如果血清样品稀释度越高则说明免疫效果越好。

表3、PCV疫苗5种肽免疫原免疫小鼠后抗体检测结果，稀释倍数表

a表示低于50倍稀释，在此稀释范围内小于截止值0.5，阴性。因此不做处理。

B.结果判定。经间接ELISA测定每组小鼠的平均OD值可见T1-B-T2和T2-B-T1的组合物明显好于其它各组。

从图1中可以看出，测定的结果可以直观的反映抗体水平的高低，也能够体现T辅助细胞表位的作用强弱。序列SEQIDNO:5未产生抗体，表明如果抗原没有T辅助细胞表位就不会引起抗体应答；SEQIDNO:8和SEQIDNO:9两个合成肽组合物产生的抗体稀释度倍数超过SEQIDNO:6和SEQIDNO:7组合物的6到8倍。T细胞表位直接关系到抗体的产生，良好的T细胞表位设计会产生高的抗体应答。

通过结果分析，从图1可以看出，合成肽SEQIDNO:5表位组、组合肽T1-B组SEQIDNO:6和B-T2组SEQIDNO:7平均OD值均远远低于T1-B-T2组SEQIDNO:8和T2-B-T1SEQIDNO:9的平均OD值，说明T1-B-T2和T2-B-T1这两种组合肽具有最好的免疫效果。

3、使用流式细胞术评价Tfh细胞的数量和频率

无菌采免疫8天后的小鼠脾脏，加入2mL的红细胞裂解液，用5mL注射器尾部挤压出脾脏细胞，加入5mL2％血清RPMI-1640培养液重悬，1800转离心6分钟，弃上清。细胞沉淀用2％血清RPMI-1640培养液重悬。细胞计数后，用来源于BD公司的各种抗Tfh细胞标记分子的抗体(CD4，CD44，CXCR5)标记细胞，按照标准的BD应用程序操作染色，然后用BD流式细胞仪CantoII测定结果。

结果判定标准：测定每只小鼠的Tfh细胞在CD4T细胞中所占的频率和每只脾脏中Tfh数量。

(1)不同CD4T细胞和B细胞表位组合诱导Tfh的频率：含不同CD4T细胞和B细胞表位组合的合成肽免疫小鼠8天后，取脾脏，去除红细胞，分离脾脏全细胞，采用针对CD4、CD44、CXCR5的荧光标记抗体进行染色。Tfh细胞被界定为CD4+CD44+CXCR5+的细胞群。图2中矩形上方的数值显示为Tfh细胞的频率。频率越高则说明合成肽的免疫效果更佳。从图2可以看出，T1-B-T2组SEQIDNO:8和T2-B-T1SEQIDNO:9的频率远远高于合成肽SEQIDNO:5表位组、组合肽T1-B组SEQIDNO:6和B-T2组SEQIDNO:7的频率，说明T1-B-T2和T2-B-T1这两种组合肽具有最好的免疫效果。

(2)不同CD4T细胞和B细胞表位组合诱导Tfh的数量：根据细胞的频率以及脾脏全细胞的数量，按以下公式计算每个小鼠脾脏中Tfh的数量：Tfh细胞数量＝脾细胞数量×CD4T细胞频率×CD44+CXCR5+细胞频率。数量越多则说明合成肽的免疫效果更佳。从图3可以看出，序列SEQIDNO:5未产生抗体，表明如果抗原没有T辅助细胞表位就不会引起抗体应答。T细胞表位直接关系到抗体的产生，良好的T细胞表位设计会产生高的抗体应答。T1-B-T2组SEQIDNO:8和T2-B-T1SEQIDNO:9的频率远远高于合成肽SEQIDNO:5表位组、组合肽T1-B组SEQIDNO:6和B-T2组SEQIDNO:7的数量，说明T1-B-T2和T2-B-T1这两种组合肽具有最好的免疫效果。

实施例5、伪狂犬病毒表面衣壳蛋白(GenBank:ACQ65661.1，glycoproteinB,partial[Cervidherpesvirus2]，aa43-65)

1、免疫方案

根据上述乳化好的SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14共计5种合成肽免疫原，在相同条件下使用每种合成肽免疫原免疫5只新西兰大耳白兔，按照下面列出的试验免疫方案免疫兔：

实验组和动物数量：共分为6组，试验组5组，对照组1组。

实验动物：新西兰大耳白兔，每组5只。

动物年龄、性别和体重：2月龄兔，体重3-4公斤。

合成肽免疫原佐剂和剂型：道达尔白油佐剂，油包水。

免疫剂量：每只1mL，每毫升含有500μg合成肽免疫原。

采血时间：免疫前第0天，免疫后第7天、第15天和第30天采血。

接种途径：腿部肌肉注射1mL。

严格按照上述动物实验方案执行。在采血分离血清储藏用于ELISA(酶联免疫吸附试验)实验，确定血清中抗体水平。

2、间接ELISA方法测定兔血清抗体水平及结果判定

A.抗体测定。用事先准备好的序列号SEQIDNOs:10-14合成肽包被96孔平底酶标板，通过间接ELISA方法，确定兔产生的抗体水平。用PH＝9.6的0.05M碳酸盐缓冲液溶解合成肽SEQIDNOs:10-14，浓度为7μg/mL，每孔加入100μL。4度放置16小时。用5％脱脂奶粉(sigma)/PBS封闭，37度保温3小时。封闭酶标板后立刻用于间接ELISA分析。

将分离的兔血清先做50倍稀释，然后3倍系列稀释直到第8列孔，第一列即50倍稀释，血清稀释见表2。每孔加入样品100μL，同时设定阴性对照。孵育1小时。洗涤后，加入酶标二抗，每孔100μL，孵育1小时。洗涤后加入TMB底物反应15分钟，加入终止液。在波长450nm测定酶标板各孔的OD值。

结果判定标准：基于吸收度的线性回归分析，将波长450nm吸收的截止值设定为0.5，该设定值是正确和精确的，因为进行每次分析稀释正常对照兔样品的OD值均小于0.15。我们运用Reed-Muench法测定各组兔在OD值时血清样品的稀释倍数，计算加权平均值，结果见表4。如果血清样品稀释度越高则说明免疫效果越好。

表4、PRSV疫苗5种肽免疫原免疫兔后抗体检测结果，稀释倍数表

a表示低于50倍稀释，在此稀释范围内小于截止值0.5，阴性。因此不做处理。

B.结果判定。经间接ELISA测定每组兔的平均OD值可见T1-B-T2和T2-B-T1的组合物明显好于其它各组。

从图4中可以看出，测定的结果可以直观的反映抗体水平的高低，也能够体现T辅助细胞表位的作用强弱。序列SEQIDNO:10未产生抗体，表明如果抗原没有T辅助细胞表位就不会引起抗体应答；SEQIDNO:13和SEQIDNO:14两个合成肽组合物产生的抗体稀释度倍数超过SEQIDNO:11和SEQIDNO:12组合物的3到5倍。T细胞表位直接关系到抗体的产生，良好的T细胞表位设计会产生高的抗体应答。

通过结果分析，从图4可以看出，合成肽SEQIDNO:10表位组、组合肽T1-B组SEQIDNO:11和B-T2组SEQIDNO:12平均OD值均远远低于T1-B-T2组SEQIDNO:13和T2-B-T1SEQIDNO:14的平均OD值，说明T1-B-T2和T2-B-T1这两种组合肽具有最好的免疫效果。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims (17)

1.一种多肽，其包含T1-B-T2或T2-B-T1构型排列的氨基酸序列，

其中，T1为修饰后的SEQIDNO：1；

B为SEQIDNO：10；

T2为修饰后的SEQIDNO：2。

2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述修饰包括置换、添加和/或缺失原来的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸，且修饰后的氨基酸序列与所述原来的氨基酸序列具有相同功能。

3.如权利要求2所述的多肽，其中，所述SEQIDNO：1的修饰包括下列的一个或多个修饰：

(1)第1位氨基酸丝氨酸置换为疏水性氨基酸；

(2)第2位氨基酸谷氨酸置换为带正电的氨基酸；

(3)第12位氨基酸谷氨酸置换为疏水性氨基酸；和

(4)第13位氨基酸甘氨酸置换为疏水性氨基酸。

4.如权利要求2或3所述的多肽，其中，所述SEQIDNO：2的修饰包括下列的一个或多个修饰：

(1)第1位氨基酸脯氨酸置换为疏水性氨基酸；

(2)第3位氨基酸酪氨酸置换为其他芳香族氨基酸；

(3)第6位氨基酸谷氨酰胺置换为疏水性氨基酸；

(4)第7位氨基酸天冬酰胺置换为带正电或芳香族的氨基酸；和

(5)第13位氨基酸苏氨酸置换为疏水性氨基酸。

5.如权利要求3所述的多肽，其中，T1氨基酸序列包含SEQIDNO：3所示的氨基酸序列。

6.如权利要求4或5所述的多肽，其中，T2氨基酸序列包含SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。

7.如权利要求1-6任一项所述的多肽，其通过人工合成、通过原核或真核细胞表达、或通过基因重组技术嵌入病原体而获得。

8.一种分离的多核苷酸，其包含选自下组中的一种：

a)编码如权利要求1-6任一项所述的多肽的多核苷酸；或者

b)与多核苷酸a)互补或严格杂交的多核苷酸。

9.一种疫苗，其包含至少一种如权利要求1-6所述的多肽。

10.如权利要求9所述的疫苗，其还包含医学或兽医学上可接受的递送载体或佐剂。

11.如权利要求9或10所述的疫苗，其施用途径选自眼内、鼻内、肌内、注射、口服、腹腔内、皮下、局部、皮内和透皮递送。

12.一种疫苗佐剂，其包含至少一种如权利要求1-6所述的多肽。

13.如权利要求1-6任一项所述的多肽在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。

14.如权利要求1-6任一项所述的多肽在制备单克隆或多克隆抗体中的用途。

15.如权利要求8所述的多核苷酸在制备多肽中的用途。

16.如权利要求9-11任一项所述的疫苗在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。

17.如权利要求12所述的疫苗佐剂在制备用于抗伪狂犬病毒的预防性疫苗、治疗性疫苗中的用途。