TW202208400A - 來自ｓａｒｓ–ｃｏｖ–２之保守肽抗原決定基於開發廣泛型ｃｏｖｉｄ–１９疫苗之用途 - Google Patents

來自ｓａｒｓ–ｃｏｖ–２之保守肽抗原決定基於開發廣泛型ｃｏｖｉｄ–１９疫苗之用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202208400A
TW202208400A TW110125031A TW110125031A TW202208400A TW 202208400 A TW202208400 A TW 202208400A TW 110125031 A TW110125031 A TW 110125031A TW 110125031 A TW110125031 A TW 110125031A TW 202208400 A TW202208400 A TW 202208400A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
treml1
peptide
cov
ecd
sars
Prior art date
Application number
TW110125031A
Other languages
English (en)
Inventor
呂衍達
張家鳴
黃品諺
Original Assignee
英屬開曼群島商先知生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 英屬開曼群島商先知生物科技股份有限公司 filed Critical 英屬開曼群島商先知生物科技股份有限公司
Publication of TW202208400A publication Critical patent/TW202208400A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

本發明係關於一種用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力的疫苗，該疫苗包括存於可增強免疫反應之調配物中之SARS-CoV-2之S2’肽，其中該S2’肽包括選自SEQ ID NO: 1至10之胺基酸序列。該調配物包括囊封該S2’肽之奈米複合物，或該調配物包括作為免疫增強劑之TREM樣轉錄本-1 (TREM-like transcript-1；TREML1)細胞外域(extracellular domain；ECD)或莖肽。

Description

來自SARS-COV-2之保守肽抗原決定基於開發廣泛型COVID-19疫苗之用途
本發明係關於COVID-19疫苗，且特別地係關於以肽為基礎之疫苗，該以肽為基礎之疫苗包含來自SARS-CoV-2之刺突蛋白之高度保守抗原決定基。
SARS-CoV-2已成為重大全球健康問題，導致2020年3月之COVID-19大流行。因為疫苗係控制傳染病最經濟方式，所以迫切需要對抗SARS-CoV-2感染之廣泛且有效之疫苗。
類似於MERS-CoV及SARS-CoV，SARS-CoV-2係屬於β-冠狀病毒群之正股RNA病毒。SARS-CoV-2之基因體編碼4種主要結構蛋白，包括刺突(S)蛋白、外膜(E)蛋白、膜(M)蛋白及核蛋白衣(N)蛋白。SARS-CoV-2通過捕獲及融合過程(catch-and-fuse process)進入宿主細胞(主要肺上皮細胞)內，該過程涉及其S蛋白與宿主細胞上表現之人類血管收縮素轉化酶2 (angiotensin-converting enzyme 2；ACE2)之間的相互作用。
圖1顯示闡述SARS-CoV-2進入宿主細胞內之可能機制之示意圖。首先，刺突(S)蛋白結合宿主細胞上之ACE2受體。然後，蛋白酶轉化該刺突蛋白。因此，該刺突蛋白穿透該等宿主細胞並使該宿主細胞之細胞膜與病毒膜靠近。當該等膜融合時，其為病毒基因體創造進入該等宿主細胞內之孔。
在病毒進入過程中，刺突蛋白S裂解成N端S1區及C端S2區。此等兩個次單元介導附著並進入宿主細胞內之不同任務。具體言之，S1介導結合至ACE2以使病毒附著於該等宿主細胞。另一方面，S2介導病毒及宿主細胞膜之融合以便為病毒基因體創造進入該等宿主細胞內之孔洞。S2域於S2’位點處進一步裂解以自內部融合肽分離融合肽(FP)，及然後該融合肽參與病毒進入過程。
由於S蛋白或該S蛋白中所含有之受體結合域(RBD)對於病毒附著及進入宿主細胞內而言很重要，因此S蛋白或該S蛋白中所含有之受體結合域(RBD)可充當免疫原以誘導保護性免疫力。亦即，對抗S蛋白之抗體或對抗該S蛋白中所含有之受體結合域(RBD)之抗體可預防該等宿主細胞之病毒感染。然而，已報導含有該RBD之SARS-CoV-2 S1域經常突變，此可潛在地使疫苗有效性降低或完全無效。因此，疫苗設計中之重要考量係使用保守抗原，該保守抗原可產生通用抗體以預防SARS-CoV-2變體感染。
本發明之實施例係關於使用SARS-CoV-2之S2’肽作為疫苗抗原或免疫增強劑。儘管SARS-CoV-2之刺突蛋白(S蛋白)或SARS-CoV-2之刺突蛋白中之受體結合域(RBD)係疫苗開發之流行標靶，但本發明之發明人已發現，SARS-CoV-2之S2’肽(其圍繞S2’蛋白酶裂解位點)提供更具吸引力之標靶。該等S2’肽在不同冠狀病毒物種之間係高度保守的，表明此等S2’肽序列可為冠狀病毒發揮關鍵作用(例如，膜融合及細胞進入)。因此，該等S2’肽不太可能在不斷演變之SARS-CoV-2變體中發生突變。本發明之發明人已發現，使用靶向酶促S2’裂解位點之疫苗阻斷冠狀病毒之融合域可破壞病毒進入過程，藉此中和病毒進入宿主細胞內。另外，本發明之發明人已意外發現，此等S2’肽亦可在疫苗開發中用作促效劑佐劑、免疫增強劑或載體抗原決定基。
本發明之一個態樣係關於用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力之疫苗。根據本發明之一個實施例，用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力之疫苗包含SARS-CoV-2之S2’肽於增強免疫反應之調配物中，其中該S2’肽包含選自SEQ ID NO: 1至10之胺基酸序列。
根據本發明之實施例，增強免疫反應之調配物可包含囊封S2’肽之奈米複合物，或該調配物包括TREM樣轉錄本-1 (TREML1)細胞外域(ECD)或莖肽作為免疫增強劑。根據本發明之實施例，該等奈米複合物可包含聚-γ-麩胺酸(γ-PGA)及幾丁聚醣。該TREM樣轉錄本-1 (TREML1)細胞外域(ECD)或莖肽可包含選自SEQ ID NO: 11至14之胺基酸序列。
本發明之一個態樣係關於用於增強免疫反應之醫藥組合物。根據本發明之一個實施例，用於增強免疫反應之醫藥組合物包含SARS-CoV-2之S2’肽，其中該S2’肽包含選自SEQ ID NO: 1至10之胺基酸序列。
本發明之其他態樣將自下列實施方式及隨附圖式變得顯而易見。
本發明之實施例係關於使用衍生自SARS-CoV-2之刺突蛋白之S2’肽之SARS-CoV-2疫苗。此等疫苗包含S2’肽於可引起有效免疫反應之獨特奈米複合物(NC)中。或者，該等S2’肽與TREML1細胞外域(ECD)或莖肽一起作為免疫增強劑調配。TREML1係骨髓細胞上表現之觸發受體樣轉錄本1。如上文提及，該等S2’肽對病毒進入宿主細胞內而言係重要的且該等S2’肽中所含有之融合肽在冠狀病毒之間係高度保守的。此等事實使S2’肽成為設計SARS-CoV-2疫苗之理想免疫原。另外，本發明之實施例亦係關於該等S2’肽在其他疫苗中作為促效劑佐劑或免疫增強劑之用途。
本發明之發明人發現一種製備基於奈米顆粒之疫苗之電動力學方法。此方法與習知疫苗技術大不相同。此技術藉由壓縮力操縱溶液系統之雙電層，以用帶(+/-)電荷之聚合物囊封蛋白質，以形成穩定、窄電荷分佈及分散之球形奈米複合物(參考美國專利第10,052,390 B2號；英國：2754436；中國：CN103910892B；台灣：I511744；所有此等專利之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中)。本發明之實施例將基於奈米顆粒之方法與SARS-CoV-2 S2’肽組合以達成高效疫苗。
根據本發明之一些實施例，S2’肽可進一步與獨特免疫增強劑一起調配。本發明之發明人已意外發現，骨髓細胞上表現之觸發受體樣轉錄本1 (TREML1)之細胞外域(ECD)或其莖可結合至TLR4/MD2 (LY-96，淋巴球抗原96)。由於TREML1 ECD或其莖肽結合至TLR4複合物，TREML1 ECD或其莖可誘導樹突狀細胞活化及成熟。因此，TREML1 ECD或其莖可充當疫苗佐劑或免疫增強劑，如2021年5月14日申請之PCT/US2021/032620中描述，該案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。 S2’肽序列之選擇
很少突變之保守基因體很可能與病毒之重要功能相關聯。一些保守基因體可在病毒用以進入宿主細胞內之策略中(尤其在捕獲及融合過程中)發揮關鍵作用。如圖2中顯示，S2’裂解位點在SARS-CoV與SARS-CoV-2之間係高度保守的。研究顯示，識別此裂解位點之單株抗體抑制SARS-CoV於猴中之傳播(The Journal of Infectious Diseases 203(11):1574-81)。吾人搜索SARS-CoV-2之遺傳變異之資料庫並確定數個保守S2’序列，已尤其針對來自彼等恢復期SARS病患之抗體圖譜分析該等保守S2’序列。然後若已發現此等候選者中之任一者與所研究之人類及大型動物中之先前SARS疫苗之結果匹配，則篩選並選擇該等候選者。吾人設計之一些免疫原候選者亦具有重疊序列，該等重疊序列已藉由生物資訊學分析預測為針對SARS-CoV-2之良好免疫原。所選擇序列列於表I中。此等肽已作為本發明之疫苗測試。亦已測試所設計之S2’肽在健康動物中產生抗病毒抗體之效力。如本文使用，術語「S2’肽」係指源自於SARS-CoV-2之刺突蛋白中之S2’蛋白酶裂解位點周圍之序列的肽，如圖2中所示。S2’-1至S2’-10肽係指表I中列舉之特異性序列。 表I：S2’肽序列
名稱 序列 SEQ ID NO
S2’-1 LPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFI 1
S2’-2 SKPSKRSFIEDLLFNKV 2
S2’-3 KRSFIEDLLFNKVTLAD 3
S2’-4 KRSFIEDLLFNKV 4
S2’-5 LLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAA 5
S2’-6 SQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLA 6
S2’-7 LPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFM 7
S2’-8 LKPTKRSFIEDLLFNKV 8
S2’-9 LLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINA 9
S2’-10 SQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLA 10
使用奈米複合物平臺及TREML1佐劑平臺產生對抗SARS-CoV-2之抗血清。
此等S2’肽誘導免疫反應之能力係藉由檢查其等對抗體產生之影響進行研究。使用兩種不同之疫苗平臺。第一個平臺涉及囊封免疫原之特殊奈米複合物(nanocomplexes；NC)，及第二個平臺涉及使用特殊免疫反應增強劑(即，TREML1 ECD或其莖)。
使用奈米複合物平臺，藉由將帶電聚合物溶液添加至另一帶相反電荷之聚合物溶液內，使用簡單電動力學方法將免疫原肽(例如，S2’肽)囊封於奈米複合物中。例如，混合該等免疫原肽與聚-γ-麩胺酸(γ-PGA) (M.W.較佳約200 kDa或更小，例如，10至200 kDa、50至200 kDa或100至200 kDa)以形成第一帶電聚合物溶液。然後，此溶液與第二帶電聚合物溶液(例如，幾丁聚醣，CS)以適當比率混合。幾丁聚醣之分子量(MW)係較佳約10至100 kDa，適於在維持蛋白質及肽藥物之生物活性之pH值(例如，pH值5至9，較佳6至8，更佳6.5至7.5)下具有足夠溶解度。本文中γ-PGA或幾丁聚醣(CS)之分子量(MW)係指重均MW。
免疫原肽(例如，S2’肽)及各種組分在奈米複合物中之濃度之例示性範圍如下：免疫原肽(例如，S2’肽)：0.5至2 mg/ml，幾丁聚醣 (CS)：20至30 mg/ml，及γ-PGA：5至20 mg/ml。所得S2’肽-奈米複合物(S2’肽/NC)可用動態光散射(DLS)表徵。該等奈米複合物(NC)較佳具有約+30 mV至約+50 mV之ζ電位及較佳約100 nm至約800 nm之尺寸範圍。此等S2’肽/NC在奈米顆粒表面上帶正電荷且顯示具有不同尋常之誘導免疫反應之能力，藉此在預防及治療SARS-CoV-2感染中具有不同尋常之治療效用。
測試此等S2’肽/NC在BALB/c小鼠中引起免疫反應之能力。圖3顯示闡述測試方案之示意圖。簡而言之，在第0、14及28天，經由皮下(sc)或經口途徑將每個劑量10 µg之S2’肽/NC或單獨NC作為對照接種至BALB/c小鼠內。在疫苗接種前及在第42天，獲得血液樣本。
上文實施例使用奈米複合物作為疫苗平臺。該等奈米複合物疫苗誘導異常穩健之免疫反應。另外，本發明之一些實施例使用第二個平臺。該第二個疫苗平臺涉及使用TREM樣轉錄本-1 (TREML1)蛋白之細胞外域(ECD)。TREML1包含ECD (殘基1至162或16至162)、跨膜域(殘基163至183)及胞質尾(殘基184至311)。TREML1之ECD包含單一免疫球蛋白可變(IgV)域(殘基16至121)及莖(殘基122至162)。根據本發明之實施例，該TREML1 ECD可為成熟ECD (殘基16至162)或前ECD (殘基1至162，包括信號肽)，其等兩者在本文中均將統稱為TREML1 ECD。本發明之實施例可使用來自人類或另一哺乳動物(例如，小鼠)之TREML1 ECD或其莖。人類TREML1由158個胺基酸構成且具有17.3 kDa之分子質量。
TREML1僅存在於人類外周血之血小板上。血小板一經活化，TREML1即迅速曝露於膜上且隨後裂解，導致可溶性片段(sTREML1)之釋放。先前研究表明，可溶性TREML1在發炎相關疾病中發揮重要作用。吾人發現，可溶性TREML1可直接結合至單核細胞並調節免疫反應(WO2016197975A1，該案之揭示內容係以引用之方式併入本文中)及TREML1 ECD或其莖可結合至TLR4/MD2 (LY-96，淋巴球抗原96)。由於TREML1 ECD或其莖結合至各種TLR，TREML1 ECD或其莖可誘導樹突狀細胞活化及成熟。因此，TREML1 ECD或其莖可充當疫苗佐劑或免疫增強劑，如2021年5月14日申請之PCT/US2021/032620中描述，該案之揭示內容係以全文引用之方式併入本文中。
根據本發明之實施例，TREML1 ECD或TREML1莖肽可用作免疫增強劑。S2’肽可與重組或合成TREML1 ECD蛋白或TREML1莖肽以適當比率混合。TREML1 ECD及莖肽序列之實例顯示於表II中。此等疫苗在本說明書中可稱為TREML1佐劑疫苗。各疫苗調配物可具有適當比率之S2’肽及TREML1 ECD或莖，例如，在典型疫苗劑量中為1至100 μg (較佳約50 μg) S2’肽及1至50 μg (較佳約20 μg)重組或合成TREML1 ECD蛋白或莖肽。 表II：本發明之例示性實施例中使用之TREML1 ECD或莖肽。
多肽名稱 肽序列 SEQ ID
TREML1 ECD QGIVGSLPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLVSSAVDRRAPAGRRTFLTDLGGGLLQVEMVTLQEEDAGEYGCMVDGARGPQILHRVSLNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIP 11
mTREML1 ECD DSHPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVRALKVWCQFLQEGCHPLVTSAVDRRAPGNGRIFLTDLGGGLLQVEMVTLQEEDTGEYGCVVEGAAGPQTLHRVSLLVLPPVPGPREGEEAEDEKETYRIGTGSLLEDPSLDPSASAGPHEFRRRENSIP 12
TREML1莖 ILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIP 13
mTREML1莖 EGEEAEDEKETYRIGTGSLLEDPSLDPSASAGPHEFRRRENSIP 14
為測試此等疫苗誘導SARS-CoV-2抗體之能力，用TREML1佐劑疫苗(例如，50 μg S2’肽及20 μg重組TREML1 ECD蛋白)皮下(sc)免疫BALB/c小鼠，及然後在初次免疫後第14天及第28天，使用與初次免疫相似之劑量，皮下投與增強劑疫苗接種(如圖3中所示)。使用單獨TREML1 ECD(無S2’肽)作為對照。
為測定接種疫苗之小鼠之抗S2’肽抗體濃度，在免疫後第42天收集抗血清。使用S2’肽進行ELISA。為評估T輔助(Th)細胞之極化/活化，分別使用IgG2a及IgG1免疫球蛋白同型作為Th1及Th2淋巴球之標幟物。如圖4中顯示，S2’-6/TREML1 ECD疫苗在小鼠中誘導極高濃度之血清S2’-6特異性IgG1，而單獨TREML1 ECD不誘導。S2’-6/TREML1 ECD疫苗亦顯著誘導IgG2a效價，但單獨TREML1 ECD不誘導。在經S2’-1/NC疫苗治療之小鼠中觀測到相似結果。S2’-1/NC誘導高效價之S2’-1特異性IgG1及IgG2a兩者，而單獨NC不誘導。此等結果顯示，本發明之S2’肽疫苗具有可極化T輔助細胞以誘導Th1及Th2功能之性質，表明此等疫苗可誘導細胞免疫反應及體液免疫反應兩者。
吾人接著檢查S2’肽疫苗是否可產生可結合至刺突蛋白之三級結構(亦即，該刺突蛋白之天然結構)之抗體。使用SARS-CoV-2刺突細胞外域(ECD)以供ELISA檢定。如圖5中顯示，來自S2’-6/TREML1 ECD及S2’-1/NC疫苗接種後之BALB/c小鼠之小鼠血清可產生高效價之抗SARS-CoV-2刺突(ECD)抗體，而彼等接種單獨TREML1 ECD或單獨奈米複合物者不產生。總之，S2’肽疫苗接種可產生高效價之不僅可結合至S2’肽之一級結構且亦可識別刺突蛋白之三級結構之抗體。 S2’肽疫苗可用作促效劑佐劑以誘導強中和抗體反應
許多肽(諸如破傷風毒素肽(TT肽)或泛HLA DR結合抗原決定基(PADRE))可活化抗原特異性CD4+ T細胞(美國專利第9,249,187 B2號)。因此，此等肽在疫苗開發中可用作促效劑佐劑。相較於RBD/TREML1 ECD疫苗，意外發現來自RBD/TREML1 ECD+S2’-6/TREML1 ECD疫苗接種後之BALB/c小鼠之小鼠血清可產生效價高於由RBD/TREML1 ECD疫苗誘導之效價之抗SARS-CoV-2 RBD抗體(圖6)。此等結果指示，當與基於RBD之疫苗組合時，S2’肽疫苗可強烈增強抗RBD抗體反應。此很可能由於以下事實，S2’肽疫苗可極化T輔助細胞以誘導Th1及Th2功能，其然後增強RBD/TREML1 ECD疫苗之免疫反應。
亦測試抗血清對抗RBD-ACE2結合之阻斷效應。如圖7中顯示，來自RBD/TREML1 ECD疫苗接種後之BALB/c小鼠之小鼠血清產生可活體外阻斷RBD-ACE2相互作用之抗體。相較於RBD/TREML1 ECD疫苗接種，RBD/TREML1 ECD與S2’-6/TREML1 ECD疫苗接種之組合產生實質上更高效價之阻斷抗體以抑制RBD-ACE2相互作用。在最終血清稀釋度為1:2000時，單獨RBD/TREML1 ECD及RBD/TREML1 ECD+S2’-6/TREML1 ECD疫苗之平均抑制率分別係29.97%及53.31%。
亦使用假病毒中和檢定測試抗血清對抗SARS-CoV-2感染之中和能力。該等中和檢定係藉由用連續稀釋之血清、穩定表現人類ACE2之HEK-293T細胞及TMPRSS2基因培養假病毒以查看接種疫苗之小鼠血清是否可保護細胞免受病毒感染來進行。如圖8中顯示，來自RBD/TREML1 ECD疫苗接種後之BALB/c小鼠之小鼠血清產生高效價之中和抗體並活體外預防假病毒感染。相較於RBD/TREML1 ECD疫苗接種，RBD/TREML1 ECD與S2’-6/TREML1 ECD疫苗接種之組合產生更高效價之中和抗體以預防假病毒感染。RBD/TREML1 ECD疫苗及RBD/TREML1 ECD+S2’-6/TREML1 ECD疫苗之IC50值(基於血清稀釋度)分別係243.4及529.7。總之，S2’肽疫苗幫助基於RBD之疫苗誘導明顯更強之中和抗體反應。因此，除用作免疫原外，S2’肽亦可充當適用於開發疫苗之促效劑佐劑或載體抗原決定基。
結合下列特定實例進一步闡述本發明之實施例。熟習此項技術者應知曉，此等特定實例僅用於闡述，且在不背離本發明之範圍之情況下，其他修飾及變化係可能的。 實例 S2’-1/NC之製備及表徵。
用γ-聚麩胺酸(γ-PGA；w/v=1%於ddH2 O中；重均M.W.範圍=約200 kDa或更小，諸如約150至200 kDa)及預定量之S2’-1肽製備第一溶液。以於1%乙酸中之幾丁聚醣(w/v=2.5%幾丁聚醣，重均M.W.範圍=約10至100 kDa)來製備第二溶液。將該第二溶液(幾丁聚醣溶液)添加至該第一溶液(具有S2’-1肽之γ-PGA)以形成奈米複合物(NC)。將NC在4℃下儲存過夜以供穩定性測試。用Malvern Zetasizer Nano系列(Zetasizer Nano ZS，Malvern Panalytical Ltd.，英國)測定尺寸、ζ電位及多分散性指數(PdI)。 RBD/TREML1 ECD及S2’-6/TREML1 ECD之製備
以於50 μl PBS中之20 μg TREML1 ECD及各種抗原(實例：20 μg RBD或50 μg S2’-6肽)來製備抗原溶液。將Alhydrogel®佐劑2% (InvivoGen, San Diego, CA, USA)添加至該抗原溶液；Alhydrogel®佐劑2%與抗原溶液之最終體積比係1:1。藉由上下移液5分鐘均勻混合，以使Alhydrogel®佐劑2%有效吸附該抗原及TREML1 ECD。疫苗可在室溫下儲存。 抗體誘導實驗
所有動物研究均係在無特異性病原體之條件下進行。在抗體誘導實驗中，將六至八週齡雌性BALB/c小鼠分為2組：僅NC及10 μg/劑量S2’-1/NC。在第0、14及28天，對小鼠接種此等疫苗。在疫苗接種前及在第42天，收集小鼠血液樣本。在相關研究中，將六至八週齡雄性BALB/c小鼠分為4組：僅TREML1 ECD、20 μg/劑量RBD/TREML1 ECD、50 μg/劑量S2’-6/TREML1 ECD或20 μg/劑量RBD/TREML1 ECD + 50 μg/劑量S2’-6/TREML1 ECD。在第0、14及28天，對小鼠接種此等疫苗。在疫苗接種前及在第42天，收集小鼠血液樣本。 接種途徑
本發明之疫苗可經由任何合適之途徑，諸如皮下(sc)、靜脈內(iv)、肌內(im)、腹膜內(ip)注射，及經由經口途徑或經鼻途徑投與。 抗S2’-1、抗S2’-6、抗RBD及抗刺突抗體偵測之酶聯免疫吸附檢定(ELISA)。
將SARS-CoV-2 S2’相關肽、RBD或刺突蛋白之細胞外域(刺突ECD，GenScript)以5 ug/ml塗佈於96孔盤並在4℃下保持過夜。將小鼠血清連續稀釋並添加至各孔內以在室溫下培養2小時。將抗小鼠IgG1或抗小鼠IgG2a抗體或與HRP結合之抗小鼠IgG添加至孔內並在室溫下培養30分鐘。清洗後，添加MB受質以產生有色產物，並藉由添加1N HCl終止反應。使用設定至450 nm及540 nm之分光光度計，立即測定各孔之光密度。結果顯示於圖4至6中。 SARS-CoV-2替代病毒中和檢定
藉由自GenScript (Piscataway, NJ, USA)購買之SARS-CoV-2替代病毒中和測試套組進行抗體介導之ACE2-RBD蛋白-蛋白相互作用阻斷之中和檢定。結果顯示於圖7中。 假型病毒中和檢定
藉由用連續稀釋之熱滅活血清培養假病毒進行中和檢定，將於50 μL opti-MEM (Gibco)中穩定表現人類ACE2及TMPRSS2基因之HEK-293T細胞(1 × 104 )接種於黑色μCLEAR平底96孔盤(Greiner Bio-one™)之各孔中。在37℃及5% CO2 下將細胞培養過夜。第二天，將各血清於opti-MEM中兩倍連續稀釋，並用SARS-CoV-2假型慢病毒在37℃下培養1 h。將病毒-血清混合物轉移至293T/ACE2/TMPRSS2細胞盤，及最終感染倍率(MOI)為0.1。對於各血清，起始稀釋度為1/10，及七次兩倍稀釋至1/640之最終稀釋度。然後在感染後16小時，用新鮮DMEM (用10% FBS、100 U/ml青黴素/鏈黴素補充)替換培養基，並將細胞再連續培養56小時。在37℃下將感染細胞培養72小時後，在ImageXpress微共焦高內涵成像系統(Molecular Devices)上定量細胞之GFP螢光。 影像及統計分析
在37℃下將感染細胞培養72小時後，在37℃下用DAPI將該等細胞染色20分鐘，及然後在ImageXpress微共焦高內涵成像系統(Molecular Devices)上偵測GFP陽性細胞及總細胞核。使用20×水浸物鏡獲取原始影像(5 × 5個位點，總計25個位點)，使用適當之設定處理並拼接。定量各孔之總細胞(藉由核染色指示)及GFP陽性細胞。所有分析均使用MetaXpress細胞評分模組計數各位點之陽性細胞及總細胞數進行。細胞評分分析後，藉由Lumi-Vcal (LumiSTAR客製化分析軟體)處理原始資料。藉由將GFP陽性細胞數除以總細胞數確定轉導率。藉由將血清處理組之感染率標準化為非血清處理對照組之感染率獲得相對轉導率。藉由將非血清處理對照組視為0%抑制獲得抑制百分比。使用Prism 8 (GraphPad)繪製相對抑制率對血清稀釋度之曲線。使用非線性回歸方法以確定表現50% GFP螢光(IC50)時之稀釋倍數。一式三份測試各血清。所有SARS-CoV-2假病毒中和檢定均在BSL-2設施中進行。結果顯示於圖8中。
已用數量有限之實例描述本發明之實施例。此等實例僅用於闡述且無意限制本發明之範圍。熟習此項技術者應知曉，在不背離本發明之範圍之情況下，其他修飾及變化係可能的。因此，保護範圍應僅受隨附申請專利範圍限制。
圖1顯示闡述冠狀病毒進入宿主細胞內之捕獲及融合過程之示意圖。首先，該冠狀病毒之刺突(S)蛋白結合該等宿主細胞上之ACE2受體。然後蛋白酶轉化該刺突蛋白，使該刺突蛋白穿透該等宿主細胞並使該宿主細胞之細胞膜與該病毒膜靠近。膜融合後，形成孔以使病毒基因體進入該等宿主細胞內。
圖2顯示SARS-CoV與SARS-CoV-2之間之S2’裂解位點之序列比對。如圖2中顯示，融合肽及蛋白酶裂解位點在此等病毒之間係保守的。此等保守序列在宿主細胞進入過程中賦予重要功能。儘管病毒基因體之其他部分容易突變，但此等保守融合肽序列不太可能具有任何突變，使得其等成為疫苗開發之理想免疫原。
圖3顯示使用用於測試S2’肽之免疫原性之BALB/c小鼠模型之疫苗接種及血液採樣之時間表。用僅奈米複合物(NC)、S2’-1/NC、僅骨髓細胞上表現之觸發受體樣轉錄本1 (TREML1)細胞外域(ECD)、刺突蛋白受體結合域(RBD)/TREML1 ECD、S2’-6/TREML1 ECD或RBD/TREML1 ECD+ S2’-6/TREML1 ECD免疫BALB/c小鼠(n=5至6隻/組)。在第42天收集小鼠血清。
圖4顯示接種S2’肽疫苗後之S2’肽特異性IgG1 (1:10000之血清稀釋度)及IgG2a (1:1000之血清稀釋度)血清濃度之血清抗體效價。資料顯示為S/N比。
圖5顯示S2’-6/TREML1 ECD及S2’-1/NC疫苗在BALB/c小鼠中誘導高效價之抗刺突(ECD) IgG抗體。該等結果呈現為終點稀釋血清效價。
圖6顯示接種RBD/TREML1 ECD疫苗或RBD/TREML1 ECD加S2’-6/TREML1 ECD疫苗後之RBD特異性IgG1及IgG2a血清濃度。資料顯示為1:10000之最終血清稀釋度下之S/N比。
圖7顯示來自RBD/TREML1 ECD疫苗或RBD/TREML1 ECD加S2’-6/TREML1 ECD疫苗之抗血清在1:2000之最終血清稀釋度下對RBD-ACE2結合之阻斷效應。資料顯示為平均值± SD。虛線表示20%抑制之截止點。
圖8顯示來自RBD/TREML1 ECD疫苗或RBD/TREML1 ECD加S2’-6/TREML1 ECD疫苗之抗血清對由S-ACE2相互作用介導之病毒進入宿主細胞內之抑制效應。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (6)

  1. 一種用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力的疫苗，其包含存於可增強免疫反應之調配物中之SARS-CoV-2之S2’肽，其中該S2’肽包含選自SEQ ID NO: 1至10之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力的疫苗，其中該調配物包含囊封該S2’肽之奈米複合物。
  3. 如請求項2之用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力的疫苗，其中該等奈米複合物包含聚-γ-麩胺酸(poly- γ-glutamic acid；γ-PGA)及幾丁聚醣。
  4. 如請求項1之用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力的疫苗，其中該調配物包含作為免疫增強劑之TREM樣轉錄本-1 (TREML1)細胞外域(extracellular domain；ECD)或莖肽。
  5. 如請求項4之用於產生對抗SARS-CoV-2感染之免疫力的疫苗，其中該TREM樣轉錄本-1 (TREML1)細胞外域(ECD)或莖肽包含選自SEQ ID NO: 11至14之胺基酸序列。
  6. 一種用於增強免疫反應之醫藥組合物，其包含SARS-CoV-2之S2’肽，其中該S2’肽包含選自SEQ ID NO: 1至10之胺基酸序列。
TW110125031A 2020-07-07 2021-07-07 來自ｓａｒｓ–ｃｏｖ–２之保守肽抗原決定基於開發廣泛型ｃｏｖｉｄ–１９疫苗之用途 TW202208400A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063048655P 2020-07-07 2020-07-07
US63/048,655 2020-07-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202208400A true TW202208400A (zh) 2022-03-01

Family

ID=79552016

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110125031A TW202208400A (zh) 2020-07-07 2021-07-07 來自ｓａｒｓ–ｃｏｖ–２之保守肽抗原決定基於開發廣泛型ｃｏｖｉｄ–１９疫苗之用途

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202208400A (zh)
WO (1) WO2022011021A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024038155A1 (en) * 2022-08-17 2024-02-22 PMCR GmbH Immunization against viral infections disease(s)
WO2024038157A1 (en) * 2022-08-17 2024-02-22 PMCR GmbH Immunization against coronavirus

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006071896A2 (en) * 2004-12-23 2006-07-06 The Hong Kong University Of Science And Technology Epitope-based sars vaccine
EP2446899B1 (en) * 2009-06-25 2020-09-30 Bioleaders Corporation Adjuvant composition comprising (poly-gamma-glutamate)-chitosan nanoparticles
JP7284557B2 (ja) * 2015-06-12 2023-05-31 マッカイ メディカル ファンデーション ザ プレスビュテロス チャーチ イン タイワン マッカイ メモリアル ホスピタル 医薬組成物
PL3718565T3 (pl) * 2015-10-22 2022-09-19 Modernatx, Inc. Szczepionki przeciwko wirusom układu oddechowego
US10960070B2 (en) * 2016-10-25 2021-03-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion coronavirus spike proteins and their use

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022011021A1 (en) 2022-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220401550A1 (en) NUCLEIC ACID VACCINE AGAINST THE SARS-CoV-2 CORONAVIRUS
KR20220140586A (ko) SARS-CoV-2 백신
EP3156068B1 (en) Pharmaceutical compositions comprising a polypeptide comprising at least one cxxc motif and heterologous antigens and uses thereof
KR20170102905A (ko) 신규 다가 나노입자 기반 백신
TW202307212A (zh) 對抗廣譜冠狀病毒變種的信使rna疫苗
TW202208400A (zh) 來自ｓａｒｓ–ｃｏｖ–２之保守肽抗原決定基於開發廣泛型ｃｏｖｉｄ–１９疫苗之用途
KR20210018206A (ko) 항원성 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩타이드
WO2021203017A2 (en) Biodegradable nanocomplex vaccines, methods for prevention of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) infection
US20230285545A1 (en) Polypeptides, vaccine compositions, and use thereof for inducing immune response to sars-cov-2 in primates
CN113151184A (zh) 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法
WO2023086961A1 (en) Sars-cov-2 spike fused to a hepatitis b surface antigen
US20230149537A1 (en) Vaccines, adjuvants, and methods of generating an immune response
JP2021501792A (ja) ワクチンアジュバントとしての、ｇｍ３ガングリオシドの合成バリアントを含有するナノ粒子
AU2022322270A1 (en) Vaccine construct and uses thereof
JP2015091811A (ja) ペプチドアジュバント
JP2023554587A (ja) Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２ スパイクタンパク質の受容体結合ドメインにコンジュゲートまたは融合している抗体およびワクチン目的でのそれらの使用
WO2012040266A2 (en) Gene-based adjuvants and compositions thereof to increase antibody production in response to gene-based vaccines
AU2021298886A1 (en) A dna plasmid SARS-Coronavirus-2/covid-19 vaccine
EP4144752A1 (en) Viral-like particles for the treatment or prevention of an infection by a coronaviridae virus
US20230390384A1 (en) Recombinant covid-19 vaccine composition comprising lipopeptide and poly (i:c) adjuvant, and use thereof
JP2001505763A (ja) Ｈｉｖ ｐ―１７ペプチドフラグメント、それを含有する組成物並びにその製造及び使用方法
WO2022133361A2 (en) Polypeptides, vaccine compositions, and use thereof for inducing immune response to sars-cov-2 in primates
TW202142553A (zh) 用於預防嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)感染之生物可分解奈米複合物疫苗及方法
Shores Designing Multi-Epitope Supramolecular Nanofiber Vaccines for Autoimmunity and Infectious Disease
WO2023183136A1 (en) Composition comprising antigen and dna and use thereof