CN110101723B - 一种用于治疗肿瘤的伪狂犬病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言,本发明涉及伪狂犬病毒(PRV)或其修饰形式,或包含PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的核酸分子,用于在受试者(例如,人)中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的用途,以及在制备用于在受试者(例如,人)中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的药物组合物中的用途。本发明还涉及一种治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的方法,其包括向有此需要的受试者施用PRV或其修饰形式,或包含PRV或其修饰形式的基因组序列的核酸分子的步骤。

Description

一种用于治疗肿瘤的伪狂犬病毒
技术领域
本发明涉及病毒领域和肿瘤治疗领域。具体而言,本发明涉及伪狂犬病毒(PRV)或其修饰形式,或包含PRV或其修饰形式的基因组序列的核酸分子,用于在受试者(例如,人)中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的用途,以及在制备用于在受试者(例如,人)中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的药物中的用途。本发明还涉及一种治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的方法,其包括向有此需要的受试者施用PRV或其修饰形式,或包含PRV或其修饰形式的基因组序列的核酸分子的步骤。
背景技术
目前恶性肿瘤的治疗手段主要包括手术治疗、化疗和放疗。这些传统疗法对于已转移的肿瘤治疗效果不尽如人意,并且还会对患者身体健康产生伤害巨大。
溶瘤病毒是一种能够在肿瘤细胞当中自我复制,从而杀死、溶解肿瘤细胞,或者使肿瘤细胞生长停滞的病毒。当进行体内治疗时,溶瘤病毒表现出对肿瘤细胞的选择特异性,能够直接诱导肿瘤细胞死亡,而对正常细胞影响较小或无影响;同时,溶瘤病毒也能通过激发免疫系统当中的B淋巴细胞和T淋巴细胞反应,间接地杀伤肿瘤细胞。因此,溶瘤病毒被认为是一种比较有前景的肿瘤治疗手段。
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)又称猪疱疹病毒I型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒,属于α疱疹病毒亚科水痘病毒属。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒,猪是伪狂犬病毒的天然宿主,猪感染后出现发热、腹泻、呼吸困难、脑脊髓炎、繁殖障碍等急性传染病症状。伪狂犬病毒具备以下特点:首先作为双链DNA病毒,其基因组在宿主体内没有整合基因组到宿主染色体的过程;其次,伪狂犬病毒虽然在其他的一些低等哺乳动物中发生流行,但还没有正式的文献报道其能感染人及致病;再次,伪狂犬病毒不含致癌基因。目前,伪狂犬病毒被广泛使用于作为兽用疫苗等,目前本领域尚未有任何伪狂犬病毒具有溶瘤活性的报道。
发明内容
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、病毒学、生物化学、细胞生物学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)”是指,α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、水痘病毒属(Varicellovirus)的一种病毒。该病毒的基因组为线性双链DNA,其大小在130kd-150kd之间。该病毒的基因组包括一个独特的长区序列(UL)和一个独特的短区序列(US),在US两侧还存在着末端重复序列(TRR)和内部的重复序列(IRS)。PRV的基因是根据他们所在的区域和发现顺序所命名的,但也可由他们编码的蛋白命名。编码结构蛋白的基因包括位于US区的US2(28K)、US3(PK)、US4(gG)、US6(gD)、US7(gI)、US8(gE)、US9(11K)等基因和位于UL区的UL9(OBP)、UL27(gB)、UL(gH)、UL(TK)、UL(gC)衣壳蛋白基因、DNA多聚酶基因等。位于UL区的非结构蛋白基因包括能够参与转录调节的UL54。在本发明中,表述“伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)”意指野生型PRV,其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰,其实例包括原型株Bartha-K61株(BK61)与HB-98株,以及各种标本分离株(例如,本发明实施例1所描述的分离株)。野生型PRV基因组序列是本领域熟知的,并且可参见各种公共数据库(例如,GenBank数据库登录号:JF797217.1)。
如本文中所使用的,术语“溶瘤病毒”是指,能够感染肿瘤细胞,在肿瘤细胞中复制,引起肿瘤细胞死亡、裂解或阻止肿瘤细胞生长的病毒。优选地,该病毒对非肿瘤细胞具有最小的毒性效应。
如本文中所使用的,术语“肿瘤特异性”是指,选择性地在肿瘤细胞内展现出生物功能或活性。例如,在本发明中,当术语“肿瘤特异性”用于描述病毒的杀伤选择性时,意指该病毒能够选择性杀伤肿瘤细胞而不杀伤或基本上不杀伤非肿瘤细胞,或者,该病毒对肿瘤细胞的杀伤比对非肿瘤细胞的杀伤更为有效。
如本文中所使用的,术语“溶瘤活性”主要包括肿瘤杀伤活性。当描述病毒的溶瘤活性时,通常可以通过其病毒感染肿瘤细胞的能力、在肿瘤细胞内复制的能力和/或杀伤肿瘤细胞的能力等指标衡量该病毒的溶瘤活性。病毒的溶瘤活性可以采用本领域已知的任何方法进行测定。例如,病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过测量感染给定百分率的肿瘤细胞(例如50%细胞)所需要的病毒剂量进行评价;在肿瘤细胞内复制的能力可以通过测量病毒在肿瘤细胞内的生长情况进行评价;杀伤肿瘤细胞的能力可以通过观察致细胞病变效应(CPE)或测量肿瘤细胞活性进行评价。
如本文中所使用的,术语病毒的“修饰形式”是指,对野生型病毒进行修饰而获得的经修饰的病毒,其保留了野生型病毒的期望的活性(例如,溶瘤活性)。在本发明中,PRV的“修饰形式”包括但不限于经修饰的PRV病毒,其与野生型PRV的基因组序列相比具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除,并且至少保留了PRV的溶瘤活性。应当理解的是,本发明的PRV的修饰形式或经修饰的PRV不受限于其生产方式。例如,本发明的PRV的修饰形式或经修饰的PRV可通过同源重组产生,也可通过培养感染了所述修饰形式或经修饰的PRV的宿主细胞而制备。
如本文中所使用的,术语“EP0蛋白”是指PRV病毒的early protein 0,其由EP0基因编码,并且为PRV病毒早期表达的转录激活因子。EP0蛋白的氨基酸序列是已知的,并可参见例如公共数据库(例如,EM64001.1)。
如本文中所使用的,表述“不表达功能性EP0蛋白”是指,当病毒或病毒基因组感染细胞后,所述病毒或病毒基因组不能产生或表达具有生物学功能活性的EP0蛋白。例如,所述病毒或病毒基因组可以因基因缺失而完全不产生或表达EP0蛋白,或者因功能丧失性突变而产生或表达不具有生物学功能活性的EP0蛋白。
如本文中所使用的,术语“功能丧失性突变”是指这样的突变,其导致突变基因所编码和表达的蛋白丧失了其生物学功能活性。功能丧失性突变包括但不限于,错义突变,无义突变,移码突变,碱基缺失,碱基置换,碱基添加,以及其任何组合(例如,基因片段的缺失或置换或添加),只要包含该功能丧失性突变的基因不能产生或表达具有生物学功能活性的蛋白即可。
如本文中所使用的,表述“PRV的cDNA序列”意指,以该病毒基因组转录的mRNA为模板经逆转录而获得的DNA序列,其与所述基因组序列相比差异仅在于所述cDNA序列不包含所述基因组序列中的内含子序列。
如本文中所使用的,术语“外源核苷酸序列”是指,人工引入的核苷酸序列,其相对于原始序列而言是外来的。外源核苷酸序列包括但不限于,未在所述病毒基因组中发现的任何基因或核苷酸序列。然而,在某些情况下,优选地,外源核苷酸序列编码具有治疗用途的多肽,例如免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗肿瘤蛋白或多肽等。
如本文中所使用的,术语“免疫调节多肽”是指,能调节免疫细胞功能的多肽,其实例包括但不限于,CD40L、OX40L、可诱导共刺激分子(ICOS)、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、和CD28(参见例如,Khalil D N,Smith E L,Brentjens R J,et al.The futureof cancer treatment:immunomodulation,CARs and combination immunotherapy[J].Nat Rev Clin Oncol,2016,13(5):273-290)。
如本文中所使用的,术语“细胞因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而,在本发明中,当使用本发明的溶瘤病毒来治疗肿瘤时,特别优选地,所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的细胞因子。“细胞因子”的实例包括但不限于,白介素(例如IL-2、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)、集落刺激因子(例如GM-CSF),及其任何组合(参见例如,Ardolino M,Hsu J,Raulet D H.Cytokine treatment incancer immunotherapy[J].Oncotarget,2015,6(23):19346-19347)。
如本文中所使用的,术语“趋化因子”具有本领域技术人员公知的含义。然而,在本发明的方法中,当使用本发明的溶瘤病毒来治疗肿瘤时,特别优选地,所述细胞因子为能够用于肿瘤治疗的趋化因子。“趋化因子”的实例包括但不限于,CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1,及其任何组合(Homey B,Muller A,Zlotnik A.CHEMOKINES:AGENTS FOR THE IMMUNOTHERAPY OF CANCER[J].Nat RevImmunol,2002,2:175-184)。
如本文中所使用的,术语“抗肿瘤蛋白或多肽”是指,具有治疗肿瘤活性的蛋白或多肽,其包括但不限于:(1)对细胞具有毒性、可抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的蛋白或多肽,其实例包括但不限于胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL和FasL(参见例如,Candolfi M,KingG D,Muhammad A G,et al.Evaluation of proapototic transgenes to use incombination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach forGlioblastoma multiforme(GBM)[J].FASEB J,2008,22:1077.13);(2)具有免疫治疗作用的蛋白或多肽,例如免疫检查点抑制剂,其实例包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗Lag-3抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD73抗体、抗KIR抗体、抗ICOS抗体、抗CSF1R抗体(参见例如,Nolan E,Savas P,Policheni A N,et al.Combined immune checkpoint blockade as atherapeutic strategy for BRCA1-mutated breast cancer[J].Science Trans Med,2017,9:eaal4922;其全部通过引用并入本文);(3)肿瘤特异性靶向抗体,其实例包括但不限于抗HER2抗体(如赫赛汀)、抗CD20抗体(如利妥昔单抗)、抗VEGF抗体(如贝伐珠单抗)、抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)或其任意组合;(4)抑制肿瘤血管生成的蛋白或多肽,其实例包括但不限于抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)的单链抗体(scFv)、VEGF来源多肽(例如D(LPR)、KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK等)和ATN-161(参见例如,Rosca E V,Koskimaki J E,Rivera C G,et al.Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics[J].CurrPharm Biotechnol,2011,12(8):1101–1116;其全部通过引用并入本文)。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个蛋白/多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据,或两个蛋白/多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据),那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60%的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法,使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义,其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。
如本文中所使用的,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指,在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,离子强度增强剂,维持渗透压的试剂,延迟吸收的试剂,稀释剂,佐剂,防腐剂,稳定剂等。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水,水性缓冲液(如缓冲盐水),醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝),弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂,例如硫柳汞,2-苯氧乙醇,对羟苯甲酸酯,三氯叔丁醇,苯酚,山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义,其能够稳定药物中的活性成分的期望活性(例如溶瘤活性),包括但不限于谷氨酸钠,明胶,SPGA,糖类(如山梨醇,甘露醇,淀粉,蔗糖,乳糖,葡聚糖,或葡萄糖),氨基酸(如谷氨酸,甘氨酸),蛋白质(如干燥乳清,白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的,术语“治疗”是指,治疗或治愈疾病(例如肿瘤),延缓疾病(例如肿瘤)的症状的发作,和/或延缓疾病(例如肿瘤)的发展。
如本文中所使用的,术语“有效量”是指,可以有效实现预期目的的量。例如,治疗有效量可以是有效地或足以治疗或治愈疾病(例如肿瘤),延缓疾病(例如肿瘤)症状的发作和/或延缓疾病(例如肿瘤)发展的量。这样的有效量可以由本领域技术人员或医生容易地确定,并且可以与预期目的(例如治疗)、受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重、待治疗的疾病的严重程度、并发症、施用方式等相关。这样的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
如本文中使用的,术语“受试者”是指哺乳动物,例如灵长类哺乳动物,例如人。在某些实施方式中,所述受试者(例如人)患有肿瘤,或者,具有患有肿瘤的风险。
本申请的发明人经过大量实验和反复摸索,出人意料地发现,伪狂犬病毒(PRV)具有广谱、显著的肿瘤细胞杀伤能力。基于这一发现,本发明人开发了新的用于治疗肿瘤的溶瘤病毒以及基于该病毒的肿瘤治疗方法。
因此,在第一方面,本发明提供了伪狂犬病毒(PRV)或其修饰形式或一种核酸分子,用于在受试者中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的用途,或者用于制备在受试者中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的药物的用途;其中,所述核酸分子包含选自下列的序列:
(1)PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列;
(2)所述cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中,所述PRV为野生型PRV。在某些优选的实施方案中,所述PRV可以是从感染伪狂犬病毒(PRV)的动物体内分离得到的毒株。
在某些优选的实施方案中,所述PRV或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。在某些优选的实施方案中,所述PRV或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述修饰形式为经修饰的PRV,其与野生型PRV相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV与野生型PRV相比,具有一个或多个选自下列的修饰:
(1)一个或多个内源基因的缺失或突变;
(2)位于非翻译区(例如启动子)中的一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入;
(3)一个或多个外源核苷酸序列的插入;和
(4)上述三项的任意组合。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV不表达功能性EP0蛋白。如本领域技术人员所熟知的,可通过对编码EP0蛋白的基因(EP0基因)进行改造来阻止所述蛋白的功能性表达。例如,可在编码EP0蛋白的基因中引入功能丧失性突变,或者将编码EP0蛋白的基因缺失或置换成外源核苷酸序列(例如,编码外源蛋白的核苷酸序列),从而阻止所述目的蛋白的功能性表达。
因此,在某些优选的实施方案中,本发明的经修饰的PRV的基因组下述修饰:EP0基因包含功能丧失性突变(例如,一个或多个核苷酸的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如,编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中,所述功能丧失性突变选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合(例如,基因片段的缺失或置换或添加)。
在某些优选的实施方案中,所述EP0基因被缺失。在此类实施方案中,所述经修饰的PRV不表达EP0蛋白。在某些优选的实施方案中,所述EP0基因被置换成外源核苷酸序列(例如,编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些实例性实施方案中,所述外源蛋白是荧光蛋白。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV的基因组序列与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV的基因组序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV包括位于非编码区(如启动子)中的一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV的基因组包含下述修饰:一个或多个PRV基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子。在本发明中,任意PRV基因的原生启动子均可被替换为肿瘤特异性启动子。在某些优选的实施方案中,所述肿瘤特异性启动子选自人端粒逆转录酶(hTERT)启动子、甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、前列腺特异性抗原启动子、Survivin启动子和环氧化酶COX-2启动子。
在本发明中,肿瘤特异性启动子的使用在某些情况下是有利的,例如有益于提高溶瘤病毒的肿瘤特异性。在正常细胞中,肿瘤特异性启动子的活性通常处于较低水平,而在肿瘤细胞中其活性处于较高水平。因此利用肿瘤特异性启动子来调控一些PRV关键蛋白的转录表达可以让病毒获得肿瘤特异性的杀伤能力。因此,在某些情况下,将PRV的关键蛋白的原生启动子换成肿瘤特异性启动子可以减少病毒对正常细胞的杀伤能力减小毒副作用,而不影响其对肿瘤细胞的杀伤能力。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV包含外源核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述外源核苷酸序列编码选自下列的外源蛋白:荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗肿瘤蛋白或多肽。
在某些优选的实施方案中,所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白,红色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白,黄色荧光蛋白,及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述免疫调节多肽选自CD40L、OX40L、可诱导共刺激分子(ICOS)、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28,及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述细胞因子选自白介素(例如IL-2、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)、集落刺激因子(例如GM-CSF),及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述趋化因子选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1,及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述抗肿瘤蛋白或多肽选自:细胞毒性肽,例如胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL、FasL或其任意组合;免疫检查点抑制剂,例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗Lag-3抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD73抗体、抗KIR抗体、抗ICOS抗体、抗CSF1R抗体或其任意组合;肿瘤特异性靶向抗体,例如抗HER2抗体(如赫赛汀)、抗CD20抗体(如利妥昔单抗)、抗VEGF抗体(如贝伐珠单抗)、抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)或其任意组合;抑制肿瘤血管生成的蛋白或多肽,例如抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)抗体、VEGF来源多肽(如D(LPR)、KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK等)、ATN-161或其任意组合;以及上述各蛋白或多肽的任意组合。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV包含至少一种如上所述的外源核苷酸序列的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区(例如启动子)的突变、缺失或插入。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV不表达功能性EP0蛋白,并且包含至少一种如上所述的外源核苷酸序列的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区(例如启动子)的突变、缺失或插入。
在本申请中,可以通过本领域内众所周知的技术获得本发明的经修饰的PRV。例如,可以通过碱基的缺失、置换或插入,在病毒基因中引入功能丧失性突变,使病毒基因在功能上失活。在某些示例性实施方案中,通过缺失(例如缺失整个基因或其部分),使病毒基因在功能上失活。在此类实施方案中,可缺失目的病毒基因序列的至少25%,至少50%,至少75%,或100%,或者可缺失至少10bp,至少100bp,或至少1000bp的目的病毒基因序列。在某些示例性实施方案中,通过碱基的插入或缺失造成移码突变,从而使病毒基因在功能上失活。在某些示例性实施方案中,通过将整个目的基因或其部分置换为外源核苷酸序列,使病毒基因在功能上失活。
在某些优选的实施方案中,本发明的经修饰的PRV可以通过CRISPR/Cas9技术获得。所述CRISPR/Cas9技术是本领域已知的,例如可参见Ran FA,Feng Zhang etal.nature,2013,2281-2308;其全部通过引用并入本文。在此类实施方案中,通常对野生型PRV的病毒基因组进行修饰(例如,外源核苷酸序列的插入、内源基因的缺失或突变或位于非翻译区的突变)从而获得经修饰的PRV。
本发明的PRV或其修饰形式可以经预处理以减少或消除受试者对该病毒的免疫反应,其中所述预处理可以包括:将所述PRV包装在脂质体或胶束中,和/或使用蛋白酶(例如,糜蛋白酶或胰蛋白酶)去除病毒的衣壳蛋白以减小宿主对病毒的体液和/或细胞免疫。
在本发明中,可以将如本文所述的PRV或其修饰形式在肿瘤细胞内连续适应性传代。在某些优选的实施方案中,所述肿瘤细胞可以为本领域已知的肿瘤细胞系或肿瘤细胞株,也可以为从患有肿瘤的个体(例如,受试者)体内经手术切除或临床分离而得到的肿瘤细胞。在某些优选的实施方案中,将所述PRV或其修饰形式在获得自患有肿瘤的个体(例如,受试者)体内的肿瘤细胞内连续适应性传代。在某些优选的实施方案中,所述肿瘤细胞从患有肿瘤的个体(例如,受试者)体内经手术切除或临床分离而得到。在某些优选的实施方案中,所述连续适应性传代的方法包括多个(例如至少5个,至少10个,至少15个,至少20个)由下述过程所构成的周期:1)将病毒感染靶肿瘤细胞;2)收获上清中的病毒;和3)将获得的病毒重新感染新鲜靶肿瘤细胞。
在某些优选的实施方案中,可以组合使用如上所述的PRV和其修饰形式。因此,所述药物可以包括PRV以及其修饰形式中的一种或数种。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子由如本文所述的PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列组成。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子具有如本文所述的PRV或其修饰形式的基因组序列。在某些优选的实施方案中,所述核酸分子具有选自下列的核苷酸序列:
(1)如SEQ ID NO:1或4所示的核苷酸序列;
(2)与如SEQ ID NO:1或4所示的核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子为包含如本文所述的PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如,克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中,所述核酸分子为包含如本文所述的PRV或其修饰形式的cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如,克隆载体或表达载体)。
本发明的核酸分子可以通过本领域已知的任何方式进行递送,例如,直接注射裸露的核酸分子(例如,裸RNA),或利用非病毒递送系统(non-viral delivery system)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得,其中所述材料包括但不限于详细描述于“Yin H,et al.Nat Rev Genet.2014Aug;15(8):541-55.”以及“Riley MK,Vermerris W.Nanomaterials(Basel).2017Apr 28;7(5).pii:E94.”中的各种材料,其全部通过引用并入本文,例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如PEG)等等。
在某些优选的实施方案中,所述药物包含治疗有效量的PRV和/或其修饰形式,或治疗有效量的如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中,所述药物可以为医学领域已知的任何形式。例如,所述药物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中,所述药物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中,所述药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中,所述药物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中,所述药物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中,所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物,例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中,所述另外的溶瘤病毒包括但不限于腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫检查点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
在某些优选的实施方案中,所述药物包含单位剂量的PRV和/或其修饰形式,例如包含至少1×102pfu、至少1×103pfu、至少1×104pfu、1×105pfu、1×106pfu、至少1×107pfu、至少1×108pfu、至少1×109pfu、至少1×1010pfu、至少1×1011pfu、至少1×1012pfu、至少1×1013pfu、至少1×1014pfu或至少1×1016pfu的PRV和/或其修饰形式。在某些优选的实施方案中,所述药物包含1×102pfu~1×1017pfu的PRV和/或其修饰形式。
在某些优选的实施方案中,所述药物含有单位剂量的如本文所述的核酸分子,例如含有1×1010~5×1014(例如,3×1010~3×1014)病毒基因组拷贝数(virus genomecopies)的所述核酸分子。
在某些优选的实施方案中,可以将所述药物与额外的疗法一起施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法,例如手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或基因治疗。这种额外的疗法可以在施用所述药物之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中,所述肿瘤选自神经胶质瘤、神经母细胞瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、成骨肉瘤、前列腺癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌、膀胱癌等。在某些示例性实施方案中,所述肿瘤复发是肝癌复发。
在某些优选的实施方案中,所述受试者为哺乳动物,例如人。
在第二方面,本发明提供了一种治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发的方法,其包括向有此需要的受试者施用有效量的PRV或其修饰形式,或有效量的核酸分子的步骤;其中,所述核酸分子包含选自下列的序列:
(1)PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列;和
(2)所述cDNA序列的互补序列。
在某些优选的实施方案中,向所述受试者施用PRV。在某些优选的实施方案中,所述PRV为野生型PRV。在某些优选的实施方案中,所述PRV可以是从感染伪狂犬病毒(PRV)的动物体内分离得到的毒株。
在某些优选的实施方案中,所述PRV或其修饰形式的基因组序列与如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。在某些优选的实施方案中,所述PRV或其修饰形式的基因组序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,向所述受试者施用PRV的修饰形式。在某些优选的实施方案中,所述修饰形式为经修饰的PRV,其与野生型PRV相比在基因组中具有一个或多个核苷酸的替换、插入或删除。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV与野生型PRV相比,具有一个或多个选自下列的修饰:
(1)一个或多个内源基因的缺失或突变;
(2)位于非翻译区(例如启动子)中的一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入;
(3)一个或多个外源核苷酸序列的插入;和
(4)上述三项的任意组合。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV不表达功能性EP0蛋白。
在某些优选的实施方案中,本发明的经修饰的PRV的基因组包含下述修饰:EP0基因包含功能丧失性突变(例如,一个或多个核苷酸的添加、缺失和/或置换)或者被缺失或者被置换为外源核苷酸序列(例如,编码外源蛋白的核苷酸序列)。在某些优选的实施方案中,所述功能丧失性突变选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合(例如,基因片段的缺失或置换或添加)。
在某些优选的实施方案中,所述EP0基因被缺失。在此类实施方案中,所述经修饰的PRV不表达EP0蛋白。在某些优选的实施方案中,所述EP0基因被置换为外源核苷酸序列(例如,编码外源蛋白的核苷酸序列)。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV的基因组序列与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性。在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV的基因组序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV包括位于非编码区(如启动子)中的一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV的基因组包含下述修饰:一个或多个PRV基因的原生启动子被替换为肿瘤特异性启动子。在本发明中,任意PRV基因的原生启动子均可被替换为肿瘤特异性启动子。在某些优选的实施方案中,所述肿瘤特异性启动子选自hTERT启动子、甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、前列腺特异性抗原启动子、Survivin启动子和环氧化酶COX-2启动子。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV包含外源核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述外源核苷酸序列编码选自下列的外源蛋白:荧光蛋白、免疫调节多肽、细胞因子、趋化因子、抗肿瘤蛋白或多肽。
在某些优选的实施方案中,所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白,红色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白,黄色荧光蛋白,及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述免疫调节多肽选自CD40L、OX40L、可诱导共刺激分子(ICOS)、FTL3L、LIGHT、CD137L、CD70、4-1BB、GITR、CD28,及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述细胞因子选自白介素(例如IL-2、IL-12和IL-15)、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)、集落刺激因子(例如GM-CSF),及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述趋化因子选自CCL2、RANTES、CCL7、CCL9、CCL10、CCL12、CCL15、CCL19、CCL21、CCL20、XCL-1,及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,所述抗肿瘤蛋白或多肽选自:细胞毒性肽,例如胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL、FasL或其任意组合;免疫检查点抑制剂,例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗Lag-3抗体、抗CD137抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体、抗CD73抗体、抗KIR抗体、抗ICOS抗体、抗CSF1R抗体或其任意组合;肿瘤特异性靶向抗体,例如抗HER2抗体(如赫赛汀)、抗CD20抗体(如利妥昔单抗)、抗VEGF抗体(如贝伐珠单抗)、抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)或其任意组合;抑制肿瘤血管生成的蛋白或多肽,例如抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)抗体、VEGF来源多肽(如D(LPR)、KSVRGKGKGQKRKRKKSRYK等)、ATN-161或其任意组合;以及上述各蛋白或多肽的任意组合。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV包含至少一种如上所述的外源核苷酸序列的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区(例如启动子)的突变、缺失或插入。
在某些优选的实施方案中,所述经修饰的PRV不表达功能性EP0蛋白,并且包含至少一种如上所述的外源核苷酸序列的插入和/或至少一种如上所述的位于非翻译区(例如启动子)的突变、缺失或插入。
在某些优选的实施方案中,可以组合使用如上所述的PRV和其修饰形式。因此,可以向受试者施用PRV以及其修饰形式中的一种或多种。
在某些优选的实施方案中,向所述受试者施用如本文所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子由如本文所述的PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列组成。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子具有如本文所述的PRV或其修饰形式的基因组序列。在某些优选的实施方案中,所述核酸分子具有选自下列的核苷酸序列:
(1)如SEQ ID NO:1或4所示的核苷酸序列;
(2)与如SEQ ID NO:1或4所示的核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中,所述核酸分子为包含如本文所述的PRV或其修饰形式的基因组序列或cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如,克隆载体或表达载体)。在某些优选的实施方案中,所述核酸分子为包含如本文所述的PRV或其修饰形式的cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的载体(例如,克隆载体或表达载体)。
在本发明中,可以通过本领域已知的任何方式递送如本文所述的核酸分子,例如,直接注射裸露的核酸分子(例如,裸RNA),或利用非病毒递送系统(non-viral deliverysystem)。所述非病毒递送系统可通过本领域熟知的各种材料制备获得,其中所述材料包括但不限于详细描述于“Yin H,et al.Nat Rev Genet.2014Aug;15(8):541-55.”以及“RileyMK,Vermerris W.Nanomaterials(Basel).2017Apr 28;7(5).pii:E94.”中的各种纳米材料,其全部通过引用并入本文,例如脂质体、无机纳米粒子(如金纳米颗粒)、多聚物(如PEG)等等。
在某些优选的实施方案中,可以将PRV和/或其修饰形式,或如本文所述的核酸分子,作为药物组合物进行配制和施用。这样的药物组合物可包含治疗有效量的PRV和/或其修饰形式,或治疗有效量的如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中,所述药物组合物可以是医学领域已知的任何形式。例如,所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中,所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中,所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中,所述药物组合物包含稳定剂。
在本发明中可以通过各种合适的方式,向受试者施用PRV和/或其修饰形式,或如本文所述的核酸分子。在某些情况下,PRV和/或其修饰形式,或如本文所述的核酸分子的施用方式取决于肿瘤的位置和类型。例如,对于容易接近的实体肿瘤,任选地通过直接向肿瘤注射(例如,瘤内注射)来施用该病毒或核酸分子;对于造血系统的肿瘤,可以通过静脉内或其他血管内途径施用该病毒或核酸分子;对于体内不容易接近的肿瘤(例如转移瘤),可以系统地施用该病毒或核酸分子以使其遍布全身并由此到达肿瘤(例如,静脉内或肌肉内注射)。任选地,可以经皮下、腹膜内、鞘内(例如对于脑部肿瘤)、局部(例如对于黑素瘤)、口服(例如对于口腔或食道癌)、经鼻或通过吸入喷雾(例如对于肺癌)等途径施用本发明的病毒或核酸分子。在某些优选的实施方案中,可以通过皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、口服给予等途径施用本发明的PRV和/或其修饰形式,或如本文所述的核酸分子。
在某些优选的实施方案中,所述方法还包括施用具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。这种另外的药学活性剂可以在施用PRV和/或其修饰形式,或如本文所述的核酸分子之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中,所述另外的药学活性剂包括另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在本发明中,所述另外的溶瘤病毒包括但不限于腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合。所述化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(如表柔比星或多柔比星)、依托泊苷、铂类化合物(如卡铂或顺铂)、紫杉烷类(如紫杉醇或紫杉特尔)或其任意组合。所述免疫治疗剂包括但不限于免疫检查点抑制剂(如PD-L1/PD-1抑制剂或CTLA-4抑制剂)、肿瘤特异性靶向抗体(如利妥昔单抗或赫赛汀)或其任意组合。
在某些优选的实施方案中,可以以1~1×1015pfu/kg受试者体重的任何量施用PRV和/或其修饰形式,例如以至少1×103pfu/kg、至少1×104pfu/kg、1×105pfu/kg、1×106pfu/kg、至少1×107pfu/kg、至少1×108pfu/kg、至少1×109pfu/kg、至少1×1010pfu/kg、至少1×1011pfu/kg或至少1×1012pfu/kg受试者体重的量施用PRV和/或其修饰形式。在某些优选的实施方案中,可以以1×1010~5×1014(例如,3×1010~3×1014)病毒基因组拷贝数(virus genome copies)/kg受试者体重的任何量施用如本文所述的核酸分子。在某些优选的实施方案中,可以以每日3次、每日2次、每日1次、每两日1次或每周1次的方式施用PRV和/或其修饰形式,或如本文所述的核酸分子,任选地酌情每周或每月重复如上所述的给药方案。
在某些优选的实施方案中,所述方法还包括施用额外的疗法。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法,例如手术、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、激素治疗或基因治疗。这种额外的疗法可以在施用如上所述的方法之前、同时或之后施用。
在某些优选的实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
在某些优选的实施方案中,所述肿瘤选自神经胶质瘤、神经母细胞瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、成骨肉瘤、前列腺癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌、膀胱癌等。在某些实例性实施方案中,所述肿瘤复发是肝癌复发。
在第三方面,本发明还涉及一种药物组合物,其包含如在第一方面或第二方面中所定义的PRV和/或其修饰形式,或如在第一方面或第二方面中所定义的核酸分子。
在某些优选的实施方案中,所述药物组合物可以为医学领域已知的任何形式。例如,所述药物组合物可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在一些实施方案中,所述药物组合物为注射液或冻干粉剂。
在某些优选的实施方案中,所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些优选的实施方案中,所述药物组合物包含稳定剂。
在某些优选的实施方案中,所述药物组合物任选地还包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中,所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物,例如另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
在某些优选的实施方案中,所述药物组合物用于在受试者中治疗肿瘤和/或降低或抑制肿瘤复发。
在某些优选的实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
在某些优选的实施方案中,所述肿瘤选自神经胶质瘤、神经母细胞瘤、胃癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、胰腺癌、成骨肉瘤、前列腺癌、鼻咽癌、鼻中隔鳞状细胞癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺导管癌、膀胱癌等。在某些实例性实施方案中,所述肿瘤复发是肝癌复发。
在第四方面,本发明还涉及如在第一方面或第二方面中所定义的PRV和/或其修饰形式,或如在第一方面或第二方面中所定义的核酸分子,其用作药物。
发明的有益效果
与现有技术相比,本发明的技术方案至少具有以下有益效果:
本申请的发明人首次发现,伪狂犬病毒(PRV)具有广谱肿瘤杀伤活性。基于这一发现,本发明进一步提供了基于PRV的溶瘤病毒。本发明的溶瘤病毒可单独用于肿瘤的治疗,亦可用作传统肿瘤治疗的辅助方法,或作为缺少其他治疗方法时的治疗手段,具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A-1C显示了实施例2中野生型PRV对人肺癌细胞系H1299、人肝癌细胞系BEL7402、人胃癌细胞系BGC823、人结肠癌细胞系HCT-116、小鼠乳腺癌细胞系4T1、人黑色素瘤细胞系MPWO、人宫颈癌细胞系SIHA、小鼠肾癌细胞系Renca、人卵巢癌细胞系A2780、人鼻咽癌细胞系CNE1、神经胶质瘤细胞系GBM、人喉癌细胞系Hep-2、人胰腺癌细胞系Panc-1、人淋巴瘤细胞系A20、小鼠前列腺癌细胞系Tramp C2、人胚肺成纤维细胞MRC5的体外杀伤实验结果的显微镜照片,其中,MOCK表示未感染病毒的细胞。结果显示,在感染复数(MOI)为1感染72小时后,PRV对人和小鼠肿瘤细胞系均有显著的溶瘤作用,但对人非肿瘤细胞的MRC5杀伤较小。
图2显示了实施例2中野生型PRV病毒对小鼠肾癌细胞系Renca的杀伤效果。结果显示,PRV感染Renca细胞24小时出现CPE已十分明显,到48小时几乎全部裂解死亡。
图3显示了实施例3中PRV-WT对人鼻咽癌模型CNE1(A)、人Burkitt's淋巴瘤模型Raji(B)和人神经胶质瘤模型GBM(C)的体内抗肿瘤实验结果。结果显示,在攻毒实验组中,皮下分别接种了CNE1、Raji和GBM细胞的SCID小鼠所形成的肿瘤的生长明显变慢、停滞,甚至裂解消失;相比之下,未经溶瘤病毒治疗的阴性组(Mock)的肿瘤则保持正常生长,其肿瘤体积显著大于攻毒实验组。
图4显示了实施例3中PRV-WT对小鼠结肠癌模型CT26(图4A)、小鼠肝癌模型Hep1-6(图4B)、小鼠肾癌模型Renca(图4C)、小鼠乳腺癌模型4T1(图4D)的体内抗肿瘤实验结果。结果显示,PRV-WT在上述小鼠肿瘤模型中均展现出显著的治疗效果。
图5显示了实施例4中PRV-WT在小鼠静脉注射模型中的安全性评价结果。通过对Bab/c小鼠静脉注射PBS(A)或1*107PFU病毒(B),监测小鼠体重与生存率变化,结果显示PRV-WT组与PBS组小鼠体重呈现相同的变化趋势,同时无一小鼠死亡现象,证实野生型PRV-WT在小鼠静脉模型中具有十分好的安全性。
图6显示了实施例4中野生型PRV-WT在小鼠颅内注射模型中的安全性评价结果。通过对Bab/c小鼠颅内注射2*106,2*105,2*104PFU PRV-WT,检测小鼠生存率变化,结果显示注射病毒小鼠均相继死去,并呈现一定的剂量依赖性。这一结果提示PRV-WT可能具有一定的神经毒性。
图7显示了实施例5中PRV-del-EP0对肿瘤细胞系以及二倍体细胞系(类正常细胞系)的体外杀伤活性评价结果。图7A显示了PRV-del-EP0(BK61-dEP0)对多种肿瘤细胞系的杀伤结果,图7B显示了PRV-del-EP0(BK61-dEP0)对多种二倍体细胞系(类正常细胞系)的杀伤结果,结果显示,PRV-del-EP0具有与PRV-WT相当的肿瘤杀伤活性,并且对正常细胞的杀伤活性降低。
图8显示了实施例5中PRV-del-EP0在小鼠颅内注射模型中的安全性评价结果。对小鼠颅内注射1*106,1*105,1*104,1*103,1*102,1*101PFU的PRV-WT(A)或PRV-del-EP0(B),监测小鼠生存率变化。结果显示,相比于野生型PRV,PRV-del-EP0具有显著提高的体内安全性。
图9-10显示了实施例5中PRV-del-EP0对小鼠肝癌模型的治疗效果。其中,图9显示了PRV-del-EP0对小鼠肝癌模型小鼠的肿瘤大小的影响;图10显示了PRV-del-EP0对小鼠肝癌模型小鼠的生存率的影响。结果显示,PRV-del-EP0具有与PRV-WT相当的显著的抗肿瘤活性。
图11显示了实施例5中经PRV-WT和PRV-del-EP0治愈小鼠的肿瘤复发率评估结果。结果显示,PRV-WT和PRV-del-EP0能够预防肿瘤的复发。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1:序列的描述
Figure BDA0001966065000000241
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1:PRV及其修饰形式的获得及制备
1.1从标本中分离伪狂犬病毒病毒PRV
(1)病猪的咽拭子和肛拭子来源于中国,厦门市疾病预防与控制中心,猪胚肾细胞(PK-15;ATCC NumberCCL-33TM)由中国,厦门大学,国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存,使用添加有10%胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素和链霉素的DMEM培养基进行培养。
(2)标本处理:将咽拭子和肛拭子在标本保存液中充分搅动,以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等,随后将标本保存液在4℃条件下4000rpm高速离心30min;
(3)接种与观察:
A.将PK-15细胞铺24孔板,每孔细胞数量为1×105个,吸去生长液(DMEM培养基,10%胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素),每孔换上1mL的维持液(DMEM培养基,2%胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素),随后除了阴性对照孔,每孔接种50μL的标本上清液,37℃,5%CO2培养箱培养;
B.一周内每天在显微镜下观察细胞,记录接种孔内是否有特征性的细胞病变效应(CPE)的出现;
C.若7天内接种孔细胞出现伪狂犬病毒特征性CPE时,收集细胞及上清至-80℃冻存;若7天后仍无CPE出现,将细胞进行盲传;
D.盲传6代内出现细胞CPE的,收集细胞及上清至-80℃冻存;盲传6代后仍未出现CPE的,判定为阴性;
(4)病毒的分离与克隆化:
使用PCR鉴定从临床标本中分离获得的病毒,选取伪狂犬病毒阳性的培养物进行至少3次病毒空斑纯化实验;对每一轮由病毒空斑获得的克隆毒株同样使用PCR鉴定,选取伪狂犬病毒阳性的克隆毒株后进行下一轮克隆化;挑选生长活力强的伪狂犬病毒单一毒株作为溶瘤病毒候选毒株.
1.2基于CRISPER/CAS9技术对PRV基因编辑及其修饰形式的获得
本实施例以野生型PRV毒株也可以称为BK61-WT(SEQ ID NO:1)为示例,展示如何通过基因编辑方式获得用于本发明的PRV及其修饰形式,具体方法如下所述。
(1)基于CRISPER/CAS9技术的sgRNA设计:利用病毒基因组分析在要插入外源基因的位点附近找到PAM位点,根据PAM附近的序列设计sgRNA,以便CAS9蛋白可以切割开病毒的基因组,而后在利用同源重组,形成新的改造病毒。
(2)供体目的片段的构建:由于利用同源重组技术形成新的改造病毒,目的基因片段的获取,也是改造成功的关键,因此将目的片段送往上海生工进行合成。
修饰形式:将野生型PRV的关键蛋白EP0基因序列(其DNA序列见SEQ ID NO:2)替换为绿色荧光蛋白(GFP)基因序列(其DNA序列见SEQ ID NO:3),从而获得重组病毒(命名为PRV-del-EP0也可称为BK61-dEP0)的基因组(其DNA序列见SEQ ID NO:4)。
(3)将上述构建的sgRNA转入293T细胞中形成稳定细胞株,再将目的片段转入细胞中,之后感染PRV病毒,利用胞内的同源重组技术,使其形成新的重组病毒。
(4)将感染293T后形成的子代病毒,去感染PK-15细胞,重组成功的子代病毒带有荧光信号,可用于子代病毒的筛选与分离。
实施例2:野生型PRV的体外抗肿瘤活性评价
2.1所使用的病毒与细胞系
(1)病毒:本实施例使用实施例1所提供的PRV-WT(SEQ ID NO:1)。
(2)细胞系:人横纹肌肉瘤细胞RD(
Figure BDA0001966065000000271
Number:CCL-136TM);人结直肠癌细胞系SW1116(
Figure BDA0001966065000000272
Number:CCL-233TM)、SW480(
Figure BDA0001966065000000273
Number:CCL-228TM)和HT-29(
Figure BDA0001966065000000274
Number:HTB-38TM);人胃癌细胞系AGS(
Figure BDA0001966065000000275
Number:CRL-1739TM)、SGC7901(CCTCC保藏编号:GDC150)、BGC823(CCTCC保藏编号:GDC151)和NCI-N87(
Figure BDA0001966065000000276
Number:CRL-5822TM);人食管癌细胞系TE-1(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,编号:3131C0001000700089);人小细胞肺癌细胞系DMS114(
Figure BDA0001966065000000277
Number:CRL-2066TM);人非小细胞肺癌细胞系SPC-A-1(CCTCC保藏编号:GDC050)、NCI-H1975(
Figure BDA0001966065000000278
Number:CRL-5908TM)、NCI-H1299(
Figure BDA0001966065000000279
Number:CRL-5803TM)、A549(
Figure BDA00019660650000002710
Number:CCL-185TM)、NCI-H661(
Figure BDA00019660650000002711
Number:HTB-183TM)、EBC-1(Thermo Fisher Scientific,Catalog#:11875101)和NCI-H1703(
Figure BDA00019660650000002712
Number:CRL-5889TM);人肝癌细胞系C3A(
Figure BDA00019660650000002713
Number:CRL-10741TM)、HepG2(
Figure BDA00019660650000002714
Number:HB-8065TM)、SMMC7721(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心,编号:3111C0001CCC000087)、BEL7402(CCTCC保藏编号:GDC035)、BEL7404(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,编号:3131C0001000700064)、Huh7(CCTCC保藏编号:GDC134)和PLC/PRF/5(
Figure BDA00019660650000002715
Number:CRL-8024TM);人卵巢癌细胞系SKOV3(
Figure BDA00019660650000002716
Number:HTB-77TM)和Caov3(
Figure BDA00019660650000002717
Number:HTB-75TM);人子宫内膜癌细胞系Hec-1-A(
Figure BDA0001966065000000281
Number:HTB-112TM)、Hec-1-B(
Figure BDA0001966065000000282
Number:HTB-113TM)和Ishikawa(ECACC No.99040201);人宫颈癌细胞系Hela(
Figure BDA0001966065000000283
Number:CCL-2TM)、Caski(
Figure BDA0001966065000000284
Number:CRL-1550TM)和C-33A(
Figure BDA0001966065000000285
Number:HTB-31TM);人黑色素瘤细胞系SK-MEL-1(
Figure BDA0001966065000000286
Number:HTB-67TM)和MeWo(
Figure BDA0001966065000000287
Number:HTB-65TM);人乳腺癌细胞系BcaP37(CCTCC保藏编号:GDC206)、BT-474(
Figure BDA0001966065000000288
Number:HTB-20TM)和MDA-MB-231(
Figure BDA0001966065000000289
Number:HTB-26TM);人肾癌细胞系A-498(
Figure BDA00019660650000002810
Number:HTB-44TM)和786-O(
Figure BDA00019660650000002811
Number:CRL-1932TM);人胰腺癌细胞系Capan-2(
Figure BDA00019660650000002812
Number:HTB-80TM)和HPAF-2(
Figure BDA00019660650000002813
Number:CRL-1997TM);人成骨肉瘤细胞系U2OS(
Figure BDA00019660650000002814
Number:HTB-96TM);人前列腺癌细胞系DU145(
Figure BDA00019660650000002815
Number:HTB-81TM)和LNCap(
Figure BDA00019660650000002816
Number:CRL-1740TM);人神经胶质瘤细胞系GBM(病人肿瘤组织分离原代肿瘤细胞系);人神经母瘤细胞系SH-SY5Y(
Figure BDA00019660650000002817
Number:CRL-2266TM);人鼻咽癌细胞系CNE(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心,编号:3131C0001000700013);人鼻中隔鳞状癌细胞系RPMI 2650(
Figure BDA00019660650000002818
Number:CCL-30TM);人喉癌细胞系HEp-2(
Figure BDA00019660650000002819
Number:CCL-23TM);人甲状腺癌细胞系SW579(由国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存)和人甲状腺导管癌细胞系TT(
Figure BDA00019660650000002820
Number:CRL-1803TM);人膀胱癌细胞系J82(
Figure BDA00019660650000002821
Number:HTB-1TM)和5637(
Figure BDA00019660650000002822
Number:HTB-9TM);人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi(
Figure BDA00019660650000002823
Number:CCL-213TM)和Raji(
Figure BDA00019660650000002824
Number:CCL-86TM);人正常细胞系包括:人皮肤角化细胞系HaCat(CCTCC保藏编号:GDC106)、人胚肺成纤维细胞系MRC-5(
Figure BDA00019660650000002825
Number:CCL-171TM)、人包皮成纤维细胞系HFF-1(
Figure BDA00019660650000002826
Number:SCRC-1041TM)、人前列腺基质细胞系WPMY-1(
Figure BDA00019660650000002827
Number:CRL-2854TM)、人脐静脉内皮细胞系HUVEC(Thermo Fisher Scientific,Catalog#:C01510C)以及分化后的人肝祖细胞系HepaRG(具原代肝细胞特征;ThermoFisher Scientific,Catalog#:HPRGC10)。以上细胞均由中国,厦门大学,国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心保存。HepaRG细胞在WME培养基(添加1.5%DMSO)中培养;AGS和TT使用F-12K培养基;SH-SY5Y使用DMEM:F12(1:1)培养基;RD、C-33A、EBC-1、SK-MEL-1、J82和DU145使用MEM培养基,Raji、Daudi、5637、786-O、TE-1、Caski、NCI-H1299、NCI-H1703、NCI-H1975、NCI-H661、SGC7901、BGC823、SW1116、HEp-2和LNCap使用RPMI-1640培养基,其他细胞都使用DMEM培养基,这些培养基均需添加10%的胎牛血清、谷氨酰胺与青霉素-链霉素双抗。以上所有细胞在37℃,5%CO2的标准条件下培养。
2.2病毒的培养
将RD细胞均匀铺于10厘米细胞培养板上,培养条件为含有10%胎牛血清以及谷氨酰胺、青霉素和链霉素的DMEM培养基,37℃,5%CO2,饱和湿度;待细胞汇合度达到90%以上时,将细胞培养基更换为2%血清的DMEM培养基,每板接种106PFU的PRV-WT。
继续培养24小时后,PRV-WT在RD细胞内增殖并引起细胞出现CPE;当90%以上细胞出现收缩变圆、颗粒感增加以及脱落裂解时,收获细胞及其培养液上清;经3次反复冻融后,收集培养上清进行离心除去细胞碎片,离心条件为4000rpm,10min,4℃;最后,用0.22μm的一次性滤器(Millipore公司)过滤上清,除尽细胞碎片等杂质。
2.3病毒滴度的测定
将RD细胞铺于6孔板当中,细胞密度为105个/孔;待细胞贴壁长满之后,将病毒进行10倍梯度稀释,每孔100ul,感染感染细胞,每15分钟震荡混匀一次,5次之后,移去上清。将用pbs配制的2%琼脂糖溶液,加热溶解之后将其与10%血清的DMEM培养基按体积比1:1混匀,加入到细胞中,待其冷却凝固后倒扣在培养箱中,培养三天之后加入10%的甲醛溶液进行固定1小时,再将胶扣出,利用结晶紫染液进行染色15min,通过计算形成空斑的个数,来确定病毒的滴度。
2.4病毒的体外抗肿瘤实验
将人肿瘤细胞与正常细胞按照104个/孔接种至96孔板;待细胞贴壁,每孔更换为无血清的对应细胞培养基,并且分别接种MOI为10、1、0.1和0.01的病毒;随后,每天在显微镜下观察细胞是否产生CPE。
显微镜照片如图1A-1C所示。结果显示,在感染复数(MOI)为1感染72小时后,病毒感染组的肿瘤细胞数量明显减少,且明显皱缩、破裂等现象;而经病毒感染的非肿瘤细胞与Mock组的非肿瘤细胞相比,其细胞形态变化较小。上述结果表明,PRV对人和鼠多种肿瘤细胞系均有显著的溶瘤作用,但对非肿瘤细胞人胚肺成纤维细胞MRC5影响较小。此外,在MOI为1感染24小时后,Renca细胞的CPE已十分明显,到48小时几乎全部裂解死亡(图2)。
在病毒感染培养72小时后使用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒;上海碧云天生物技术有限公司)检测细胞存活率,具体方法如下:
在96孔细胞培养板中,贴壁细胞直接弃掉原培养基,悬浮细胞经离心后小心弃掉原培养基,随后更换为每孔100μl的新鲜无血清培养基;在接种细胞的孔中每孔加入10μlCCK-8溶液,同时在空白培养液中也加入等量的CCK-8溶液作为阴性对照;在细胞培养箱内37℃孵育0.5-3小时,在0.5、1、2、3小时分别利用酶标仪在吸光度为450nm进行一次检测,选取吸光度范围比较适宜的时间点作为细胞存活率的参考。PRV-WT对各细胞的CCK-8检测结果参见表2,其中,“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异;“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50%,且与MOCK组相比具有显著性差异;“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50%,且与MOCK组相比具有显著性差异。
细胞存活率的计算方法为:
Figure BDA0001966065000000301
表2:PRV-WT体外抗肿瘤实验结果
Figure BDA0001966065000000311
注:“-”表示病毒处理后的细胞存活率与MOCK组相比无显著性差异;“+”表示病毒处理后的细胞数量减少但存活率仍大于50%,且与MOCK组相比具有显著性差异;“++”表示病毒处理后的细胞存活率小于50%,且与MOCK组相比具有显著性差异。
由表2可知,PRV-WT对大部分所检测的肿瘤细胞都有很好的杀伤作用,特别的,该病毒对肺癌、肝癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、宫颈癌、淋巴瘤、肾癌等细胞系杀伤十分显著。另一方面,PRV-WT对非肿瘤细胞系包括人胚肺成纤维细胞系MRC-5存在一定杀伤。
实施例3:野生型PRV的体内抗肿瘤实验
3.1病毒、细胞系与实验动物
(1)病毒:本实施例中使用实施例1所提供的PRV-WT。病毒的培养与病毒滴度测定方法分别参见实施例2.2和2.3。
(2)细胞系:人鼻咽癌细胞系CNE1、人Burkitt's淋巴瘤细胞Raji(
Figure BDA0001966065000000321
Number:CCL-86TM)、人神经胶质瘤细胞系GBM(病人肿瘤组织分离原代肿瘤细胞系)、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠肝癌细胞Hep1-6、小鼠肾癌细胞Renca和小鼠乳腺癌细胞4T1。以上细胞除Raji使用RPMI-1640培养基,其他细胞均使用DMEM培养基培养,并且上述培养基均添加入10%的胎牛血清、谷氨酰胺与青霉素-链霉素双抗。以上所有细胞均在37℃,5%CO2的标准条件下培养。
(3)实验动物:6-8周龄的雌性C.B17SCID小鼠或Bab/c小鼠来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司;根据厦门大学实验动物中心与伦理委员会所批准的方案,将该小鼠在SPF条件下饲养。
3.2病毒的体内抗肿瘤实验
对于人肿瘤移植模型,使用SCID小鼠,将用于皮下成瘤的肿瘤细胞用0.01%胰蛋白酶消化后,再使用含10%的胎牛血清的细胞培养基重悬成单细胞悬液;计数悬液的细胞密度,1000g,3min离心沉淀细胞,再用适量体积的PBS重悬细胞,使达到约106-107个细胞/100μl PBS;按照106-107个细胞/100μl PBS/点在SCID小鼠背部皮下用注射器接种肿瘤细胞,待14-21天左右、肿瘤细胞在SCID小鼠皮下形成大约100mm3的瘤块的时候,将荷瘤SCID小鼠随机分为实验组使用PRV-WT(BK61)与阴性对照组(Mock)进行治疗。对于小鼠肿瘤模型,使用Bab/c小鼠,皮下接种肿瘤细胞,7-14天后,选取100mm3左右的小鼠进行治疗。
使用106TCID50/100μl无血清培养基/每瘤块的溶瘤病毒PRV-WT或等量无血清培养基瘤内注射处理,每两天注射1次,共处理5次。
每两天用游标卡尺测量并记录肿瘤大小变化,肿瘤大小的计算方法为:
肿瘤大小(mm3)=肿瘤长度数值×(肿瘤宽度数值)2/2。
PRV-WT对人肿瘤移植模型和小鼠肿瘤模型的治疗结果分别如图3和图4所示。结果显示,使用PRV-WT进行治疗后,所检测的CNE1(图3A)、GBM(图3B)、Raji(图3C)以及CT26(图4A)、Hep1-6(图4B)、Renca(图4C)和4T1(图4D)肿瘤生长均出现逐渐变慢和停滞,甚至裂解消失;相比之下,阴性组(Mock)肿瘤则保持正常生长,其肿瘤大小显著大于实验组。
上述结果表明PRV-WT展现出显著有利的体内抗肿瘤活性。
实施例4:溶瘤病毒的安全性评价
4.1所用的病毒与实验动物
(1)病毒:本实施例使用由实施例1所提供的PRV-WT。病毒的培养与病毒滴度测定方法分别参照实施例2.2和2.3。
(2)实验动物:6-8周龄Bab/c小鼠来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司;根据厦门大学实验动物中心与伦理委员会所批准的方案,将该小鼠在清洁级条件下饲养,随后用于伪狂犬病毒的体内毒力评估。
4.2病毒在小鼠体内的安全性评价
(1)选取Bab/c小鼠,并对其单次静脉注射PRV-WT或PBS,攻毒滴度剂量为107TCID50/只(每组6只),随后每天监测攻毒组Bab/c小鼠的存活率和体重进行记录。注射PBS或PRV-WT后的小鼠体重统计结果分别如图5A-B所示,在攻毒后的15天内,攻毒组小鼠均未死亡,攻毒组动物体重增长趋势与PBS对照组一致,未见统计学差异(P>0.05)。这一结果表明,PRV-WT在小鼠静脉模型中具有十分好的安全性。
(2)选取Bab/c小鼠,并对其颅内注射不同剂量的PRV-WT,攻毒滴度剂量为2*106、2*105、2*104PFU/只(每组4只),随后每天对不同剂量攻毒组Bab/c小鼠的存活率进行记录。结果如图6所示,小鼠陆陆续续出现死亡的现象,并且这种现象存在剂量依赖关系,说明PRV-WT具有一定的神经毒性。
实施例5:修饰型PRV的抗肿瘤活性及安全性评价
5.1所用的病毒:
本实施例使用由实施例1所提供的PRV-del-EP0(SEQ ID NO:4)。病毒的培养与病毒滴度测定方法分别参照实施例2.2和2.3。
5.2 PRV-del-EP0的体外溶瘤活性评价
参照实施例2所描述的方法使用MOI=1的PRV-del-EP0(BK61-dEP0)处理目的细胞,并使用CCK8法检测经PRV-del-EP0(BK61-dEP0)处理后的细胞存活率。图7A显示了PRV-del-EP0(BK61-dEP0)对多种肿瘤细胞系的杀伤结果,结果显示,其基本保留了与母本毒株野生型PRV相当的杀伤效果。图7B显示了PRV-del-EP0(BK61-dEP0)对多种非肿瘤细胞系的杀伤结果,结果显示,与母本毒株野生型PRV相比,PRV-del-EP0对二倍体细胞系(类正常细胞系)显示出显著降低的杀伤活性。以上结果表明,PRV-del-EP0不仅保留了野生型PRV显著的肿瘤杀伤活性,并且在一定程度上能提升了安全性。
5.3 PRV-del-EP0的体内安全性评价
选取ICR小鼠并对其颅内注射不同剂量的PRV-WT与PRV-del-EP0,攻毒滴度剂量为1*106、1*105、1*104、1*103、1*102、1*101PFU/只(每组4只),随后每天对不同剂量攻毒组ICR小鼠的存活率进行记录。PRV-WT(BK61-WT)组的结果如图8A所示,PRV-del-EP0(BK61-dEP0)组的结果如图8B所示。结果显示,PRV-WT组小鼠陆陆续续出现死亡的现象,1*106和1*105组小鼠全部死亡,1*104PFU组小鼠的存活率仅为25%;相比之下,PRV-del-EP0组只有1*106组小鼠出现死亡现象,其生存率为50%。以上结果表明,相比于野生型PRV,PRV-del-EP0具有显著提高的体内安全性。
5.4 PRV-del-EP0的体内治疗效果评价
将用于免疫鼠C57/B6小鼠皮下成瘤的肿瘤细胞Hep1-6用0.01%胰蛋白酶消化后,再使用含10%的胎牛血清的细胞培养基重悬成单细胞悬液;计数悬液的细胞密度,1000g,3min离心沉淀细胞,再用适量体积的PBS重悬细胞,使达到约106-107个细胞/100μl PBS;按照106-107个细胞/100μl PBS/点在C57/B6小鼠背部皮下用注射器接种肿瘤细胞,待7-14天左右、肿瘤细胞在SCID小鼠皮下形成大约100mm3的瘤块的时候,将荷瘤SCID小鼠随机分为3组,分别使用PRV-WT(BK61-WT),PRV-del-EP0(BK61-dEP0)和PBS进行瘤内注射治疗,每两天注射1次,共处理3次。每两天用游标卡尺测量并记录肿瘤大小变化,肿瘤大小的计算方法为:
肿瘤大小(mm3)=肿瘤长度数值×(肿瘤宽度数值)2/2。
结果如图9所示,PRV-WT、PRV-del-EP0组小鼠的肿瘤均能完全清除,表明PRV-del-EP0展现出了与野生株同样显著的体内治疗效果。
同时检测小鼠生存率,根据动物伦理,当小鼠肿瘤尺寸达到2000mm3将其处死。结果如图10所示,经PRV-WT和PRV-del-EP0治疗均能够显著改善小鼠的生存率。
进一步对小鼠肿瘤复发率进行评估。具体而言,对上述PRV-WT和PRV-del-EP0组的治愈后小鼠再次进行肿瘤接种,接种细胞数为初始接种细胞量的10倍,同时以未经PRV-WT和PRV-del-EP0治疗过的小鼠为对照组(NC),接种同等量肿瘤细胞,监测小鼠肿瘤生长情况,对复发肿瘤的小鼠只数进行统计,计算肿瘤复发率,肿瘤复发率=(出现肿瘤的小鼠只数/进行肿瘤接种的小鼠总数)×100%。结果如图11所示,PRV-WT和PRV-del-EP0组小鼠均未复发肿瘤,而未经PRV-WT和PRV-del-EP0治疗过的对照组小鼠全部发现肿瘤。这一结果提示经PRV-WT和PRV-del-EP0治愈后的小鼠都具有很好的抗肿瘤免疫力,能预防肿瘤的复发。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
<120> 一种用于治疗肿瘤的伪狂犬病毒
<130> IDC180045
<150> 201810100861.5
<151> 2018-02-01
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 137764
<212> DNA
<213> Pseudorabies virus
<400> 1
ggcccagctc tcccccgagc gcggatctct gaaaaaaaaa tttcccgccc ccgcgttttc 60
cattggggtg aatggggagg gggtggggga tgggcactca ctaagaattg gcaaggtgcc 120
aatttatatt ctggcatggt gccaaactac atacctggct ccctgccaac cccaatcccc 180
ctcctacctt ggctccctgc caaccccaat ccccctccta ccctggcacc ctgccaaccc 240
caatccccca ccatcgtcgc ggtcttcatc cttggcacac agccaaccct agaaggcgag 300
ccgcgatgct gcggtcgggc ccacccgcgg caggaggttg tggatggcga tgggcgaggg 360
cgggcgcgcg tgtggtgggg acggtgtcgg tgcccgcgcc ggtggcgccc gcgagggttc 420
gccttgggtg cgctgggggc ccctccccat tcaccccaat ggaaaacgcg ggggcgggaa 480
attttttttt cagagatccg cgctcggggg agagctgggc cccagaccag agagttgtgg 540
gggggcccgg gggagagctg ggcccccggc cagagagttg tgggggcccg ggggagagct 600
gggccccaga ccagagagtt gtgggggggg ggggcccggg ggagagctgg gcccggctct 660
cggtggggga caaccccctg gggagagcct gaccaattgc cagactagag gagagccccg 720
ccgggaccgg agaggagagc gcgccttccc ccaaccccct cgttcccccc tttcccccaa 780
ccccctcgtt cccccctttc ccccttccaa agcgggcgcc gcgagcgcgc gggcccccat 840
acggcgctcg ctctcgtccc ggccggtctg gccgccggga cggggcgctc ctcgccgcga 900
tgaccgacgc ctcgtcgcga cccggcgagg aagagccgat ggaggtggac gagcacgtcg 960
agcccgagtc ggagcccatg gaggtggacg agccccctgc gccggcgcag gcatcgggcg 1020
ccatcctcgc ggtgggcttc acccagcccg cgcaggtcct gcgggcgtac cagatcggtt 1080
gatgtgcgaa cgatgggcgg gggaaccagg gggtcagatg cacccacgtg gtgccacacc 1140
cgccccacgc cgcgctcttt ttcccgggcc gcccgaccgg atcctcccgc agagccggac 1200
gtggggcgag agaccgggat ggacgtggag aggggagcgg ccgcggggcg cgtggaggtg 1260
gagctcgatg cccggccctc cggcaccaga gggcgcggcg cgagcccctc gcgtcgagcg 1320
cgggaccccc gaaccggccc gtgccctcgg ggcgggaccg acccgcgtcc ccgggacaga 1380
accggcgacg ccaccggggc gcgcgccccg cgcccctccg ccctgggtat taacgccccg 1440
ggcaccgccg tccgccgcca gccgccgtgg gaggcagaca tgcctccaca acgagcccgc 1500
ggggccccgc cgcgccgccg cggcagcgac ccgcccgatc ccggcagcct cgccgggcgg 1560
ctctcgcccg gggggaggag cggcggagga tcgcgccgga ccctctcgcg cagcagctcg 1620
ctcacgtccg tcgcctcggc ccccgtggag acgcccgtcg ccgcggaggc tctcggactc 1680
ggcgcccccg gctccagacc gccctcctac ggggacgtcg ttcgcgccgg gccgcgcccg 1740
caccgatcgc cggacacgcc gctgtttgcc cggggcccgc ccccgtccta ctcggagacg 1800
ctcctgtttg acccgcccgc gtacgcggtg accatcccgg acccgcccgc gtacgagccc 1860
accgtcatcg gaccgcagcc gccgaggccc cgcgactgga tctcctcgcc ctccgtggtg 1920
cagccgtcgc tgctgggccc cttcagccag tgcctcccgc agttgacctg ccccgactgc 1980
cgctaccccg aagaccgccc gatggtgctc gtgggcttcc tctggggggg gctgctcctg 2040
ctggtgggcc tcgtgtttct gatcctgctc ccggtgctcc gggagtctgt cgtgtttccc 2100
tgaccaataa actcggctcg ccagtcctat cgatatccgc gtctcgcgtg tggtgttgcg 2160
acgggggaga tggggagagg aggatgggga gaggaggatg gggagaggag atggggagat 2220
ggggagagga gatggggaga tggggagagg agatggggag atggggagag gagatgggga 2280
gatggggagg acgacagact cgtgcacacc agagaggtac ggttcaacag ttttattcaa 2340
aacaggtggt tgcagtaaaa gtacttcccg tgcatgtaca cggggacgag ggtgtagctg 2400
cacgtcaggc ggcaggtggg cgcgtcgcag ccggttttgt gggagtccag cgcgtccatg 2460
atcccgccga ggcaggcgcc gggcacgtac tcctccagcg ggacgggcga gtcccccagg 2520
tcctcgggca gcacgcagct cgagccgcgc tcgacgacgc gggcgatgcg agccagcatc 2580
accagggtgt aggtgacgat gcagcgcacg tcccgcaggc ggcgccggcg cacgagctcg 2640
tcgacgggcg cgtcgcggag gtagcagcgc aggaacggcc cgagcttcag gcgcaggttc 2700
tgcagcaccg cccccgcggt ggccacgatg gggtccagcg tgcgcagcgt gagccccttg 2760
gtgaggatga gcttgaccca cgtgagcgtc tcgtccgccg aggcgaggga ctccgtcagg 2820
ccctcgttca ggagcaccat ctcgcggagc acgcgcgccg cctcggtggc gtgcggccgc 2880
acctcaaaca ggcggtgcag gtcggccccg tggaacatga gcgtctccca cgtgacgcgc 2940
cgcccgtccg gggtgaactg ctcggcgccg aactcgagga cggcggccca cggcgacgag 3000
cccgcggcgc ggaagccgtc gttgaacacg gggcgggaga ggtcgtgccg cgccgaggca 3060
aagagctcgt tgacgcgggt cgcgccgacc cgcgcgtgcg tcgcggagac ggcggcgcgc 3120
gcgctctccg acagacgatc ggggggcgcg tcgggcccgc cgtccggacg atccgcctcc 3180
tgtcgccgcc gctggtgctg ctgctggcgc tgctgctgct gttgctgccg ccgccgctgc 3240
cgcagggcct gtcgggcggc gcgcccgccg cgacccccgc gccggcgccg gatggccccc 3300
agccgcgccc ggacgggccg ccgctcgggg gggcgcgagc ccaggcgctc acggaccggg 3360
cgccgctcct cgctccccga cctggacgcc tcgctgtcgc tgctgttgcc gctgtcctcc 3420
atgaccgtgg tgcgagcggg gccgcggtgt gcaggtggcg ggcggcgggg cgcctttaac 3480
ccgccgtccc cgcgcgacct tcatccaaat atggtaatgt gccgctcata gtgcagaaac 3540
agcaacacgc cccctaccag caggcagagg tacagcgcct tggcaaagat cccggcgagc 3600
acggtcgagc agcacgcgcc gcagacgccg agggcggcgc ggccgccgtc ggagcgcgcg 3660
ggcgtggccg tcgcgccgga gacgcgcgcg atgtgcggca gcgtcgccgc caggagctcc 3720
agcgccccga ccgccagcac aaagatccac acgagggcgc gggcgtacag cgggaagacg 3780
agggcgcacg gggcgcgtgt gacgccgagg gtcgtgaaca gcgccatgcg cgcccccagg 3840
cggagcccga gctcgaggag gatgagcgcg atcagcgtgg gatggcggtg tgccagcgta 3900
atggggtcct cgcggaggtc gcggctgagc gcggcgcggc gcgtcgcgag ctcggccatg 3960
taccaggcga acttggtgta gctgcagccg atgaccgtgg cggcgagcac gctcgccgcg 4020
tagttgagcg tgtacttctc cggggtcagg aactcggcgg ggtcgcggaa ggggccaaac 4080
atgcgccgct cctggcgcgc gtacacgaag gccgcgtaga ggagccacgc gacggccgcc 4140
aggcgaaagt gcacgtccca caggtaggcg cggcagtcgc ggcgcgcgta cacgacccgc 4200
gcgcggtcgc gcagcgccgg gctcagcgcg tccgtctcgt tgggggccac gtagatggcc 4260
gtggcgttga aggcctccca gtccggcgcg cccccggcgg cgtcctcgcc gagcggcagc 4320
gccgcgtaca cgacggggtg gggcaggcgg gcgacggtcg cgtagtacgc gcccaggccg 4380
gcgtacgcgc ccatcacccc gaggacgagg aggtgcagcg ggcgcccgcc gaggagcatg 4440
attgccccac ctccgcggtg aaaatggtgc gcgtcgcgtt gctgccgcac tttgtagcga 4500
agcactgctg actcagcgag atacacagcc ggtcgtgggc gtcgacgctc agggccacga 4560
aggtgcgggc cggcgggctg cgcgcgtgcc gggcccgcag gcagctgaag cgcgcggacc 4620
cgcagagctg gaagaggacc cagtcgggct tggccaccac ccgctgcgcg gtcgcgcccg 4680
cgtactcgtg cgcgcgcccg ttgaagtgcg cgtcgaggtg ccgcagcacg ggcgccatgg 4740
ccacgtccgc cacgaaggcc tcgagcgcgc gccggtcctc cgcgtccacg gccaggccgc 4800
gcagcatgtc caccagcggc gtgcgccggg cgaagaaggc ctcgcggttc cgcgccgcct 4860
tgcgctcgaa gaagctctcg tactcccccc cgaggctgtg cagcacgcgc gtgacggcgt 4920
gcgccgggcg ggcgtggaag tgaaagttgc gcgggtcgtc gaagcccggg ggcgcgtccc 4980
cgaaggggag caggcgcccg tggcagccgc cgccgtcgac cttggcgaag aagggcagcc 5040
gcaggctgcg cccgtgcgcg tacacgcccg tgtccacgaa ggtgaagtcc tggaggtacg 5100
ggcccatggg ctcgatgaag tcccgctcca gcagcacggc ctgctggagc acgcgcgcca 5160
ggccgcggac cgtgtcggcg ccggccaccg cgtacggcga cggcacgggc gtgcacacgc 5220
ggaagcccat cttggcgcgg cagccgcacg gcgggcgctc gtccgccggg acgggggcgc 5280
ggacgagggc ggaggcgccg gggtccccgc ccgcgccccc gatcccgacc ccgacctcgt 5340
cgtcgtcgca cgtgtacacc tcggcgggga cgcccgcgtc ccagtccgcc cagtcctcgt 5400
cgcccggcgc ggcgccaaag tcggcgaggg cggcgtcgtc gtcccagggc gcctcctcga 5460
ggccgtcgtc ggaggaggcc gcggaggcgg accccgcggc ggcggcgagg gcgccccccg 5520
gcgggcaggc gctcttgtac acgtagcagg ggtgcgcggc ccagtcgccg tcggcctcgg 5580
ggaagagcag cgcgagcgcg tcgagcaccg cgcggcggaa cccgcgcatg gccgcctcga 5640
gcgtgcccgc gggcaccggg cgcgcgaggc gaaagtcgac gtcgaggacg atgttggtca 5700
cggccagccg ggcgttgaac acctcgtggc ggctcacgta catctgcgcc gccggctcgt 5760
gcgcggccat ctccggcgcc gcgtcgcggc gcgccgtcgc gcgcccccag gcgtccccgg 5820
ccagcaccgc gaaggcctgg cgccggtgcg ccagctccac gcggtacacc ggcgccgggg 5880
ggcacgcgtc cggcaggccg agcagggcgc ccagcgccgt gcgcgcgcgc ccgccgcccg 5940
gcgcggcggc cagctccagc aggcgacgca ggacggcgcc gtcggcgccc ggctgctgct 6000
gctcctcgtc gggggcgcgc acccagccgt ggggcgcgag gcgctcctcg acggcggtca 6060
cgcggcgcgc gaggccggcg gccgcgtcgc agagcccgcg cggcgcgtcg gccgcgagcg 6120
cggcgtacgt gcggtcctcc acgtagccgg cgcccatggc cggggcgagg cgcgcgacgc 6180
tcggcgtcac gttctgggcg acgtagtcgc ggatgttgag ctgcgcccgc acgtggcgga 6240
agaaggcggc ggccgcgcgc tccccgaggg gcgagcgccc cacgggcgcc gcggggtccg 6300
tgacgttgac ggcgtccagg tgctcgcgga gccgcgcgcg gttgaagctc tcaaagtggg 6360
ccaggtagac gtacgtcacg aactcgcggt cggggagctt gaggctgccc cggtcgtggg 6420
agatgtagtc ccggaggacg cccatctcgg cgcggtcggc gcgcacgcgc tcgtcgacgt 6480
agcgcgcggc gtgcgccgcc gcggggcccc gcgcgtagcc gctcaggcag cagaagcgcg 6540
agagcgccgc gaacgagagc agccccgcgg ggtccaggcc gctggggttg gggtccacgc 6600
gcgggttgta cgtgagcagc aggtccttga gggcccgcag gtcgtaggcc ggccgcgggt 6660
ggaagaggtg gaggcgcgtg gccagcacca gcgtcttctc ctcggggccg aagcgcgcca 6720
cgtaccagaa gggcgtgttg tggttcccgt agaggcgccg gaaggcggcc agcgtctggg 6780
tctcgtggtg cacaaagagc gaggtcagcc cgcggcgccc gaccgcgatg gagcgcagcg 6840
ggcgctccgg cgcgtactcg gcgttgccgg tgcgcgggcg cacctgctcg aggaccatgg 6900
tcagggccgc gatgaggccg tcgtggaggg cgaaggtggc cgcctcgtcc atggcctcga 6960
ggacgtcccg cgccgcgagg ggctccccgc ggcagagcgc gcgcacgacc gccggggtcg 7020
cggcggcgac gaacacgggc cgcacgcgga cgctggccac gtgcccggtg aggcagaacg 7080
tgacgccggg gcggcgcgct aaaagctcgg cctcggcgcg ctcgcccggc agtgagaagg 7140
cctcgtccag cccggcgccg tcccacgcgt acgagacgac gtagaccgcc cccgagggct 7200
cctggcccgt gagcagcatc agcgagtacg tgatcgcgca gccgtccgtg gcgtacagga 7260
cgcggatcat gctgggcggc atcttctccg ggtggtgcgg gcgccgcggc cgtgggaggg 7320
cttatgagcc gccggacgaa ctccgcctcc gggagtcgct ggccgtgctc aacgtgatcc 7380
tccccgcccc gctcgccgcc gaggacgtga tggcctcggc cgaggccgcg cgccgcctgg 7440
cccgcgcgga cacgctggcg cgcacctacc aggcctgcca gcgcaacctg gagtgcctgg 7500
cgcgccacga ggcctccggc gacgacggcc tggacgccgt ggtcgcggcg cacgcggcca 7560
acgcgcggcg gctcgcggac acgtgcctgg cggcgctcat gcacctgtac ctctcggtcg 7620
gcgccgtcga cgcggacacg gacgacctcg tcgagcaggc cctgcgcatg accgccgaga 7680
gcaacgtggt gatgtccgac gtggccgtcc tggagcggac gctgggactg gcccggcggc 7740
ggcagccggc gcccgtccgg gccgcgcccg ccgggctggg tctgcccgtc cccgcccagc 7800
ccgccccgcg cgctaccgcc gcccgcccgg ccccgccgcc cccgcccgag gaggcggggg 7860
aagacgagga gggggaccgc cccgaggacg acgcggcccc gctgctgccc ccccgcgccc 7920
ccgccaagac gcgcccgccc gagaaggccc ggaggctggc cgaggcctgc aagatgtagc 7980
cggagagggc gggagggaag gaagggacgg agaccgccgg ggttgtctgt gcccaataaa 8040
catctttatt gaaaaatgag aagagcgggt cccgcgtgtg tgcgcgcgcg gtcgccaccg 8100
tccgggtccg gcgcgggccg ccgcggcctc acaggcccgt ggagccgaag ccgcgggccc 8160
cgcgcgcgct gctcggggcg acaaagtccc gcgcgaagag ccacgcgggg cggtgctgca 8220
tcggggcgcg cggggtggcg gggaacgggg accgtcccgt gatccagccc agcggctcgc 8280
gcgtcagcac cagctgggcc acgcgctggc ccgactccag ggtcaccggg tgcgcgccgc 8340
ggttctggat ccggaagcgg cacgggccgc tctcccaggg cgtggggaag acgacgatgc 8400
cgcggaggtt gagggacgag cgcccgaaga cgtaggccca gtggcggccg tccgtgcggt 8460
gcaccggcag cgtcacggtc tcggcgcccc cggggggcag caccagctcg cgcgggcagg 8520
ggatgtcgta tccggcgtcc tcgtcgcgct tcggcgcaaa gacctcgaag aagggcacgt 8580
ccgtggcgat gcccggcgcg aggcgcagcg gcgtgcaata aaattgcgcc cgtgggcggc 8640
ccggggctac aatcgcctgc acctcgccgc gaaagcccgc gtccacgatc ccgttggtgg 8700
tgcgaccgcc cccgcgctgc gcgacgagca tcgcgtatcc ggtgggcagc gccaccttga 8760
ggcccagggg aaccttataa aatccctccg gccccggact ccggcacacc agcagccgcc 8820
ctccgtccac ggtcacgggc tcgctcgcac acaccaggat ggtctcctcc gccgggccct 8880
cgctgacgct cgtcgccgcg ctctgcgcgc tggtggcccc cgcgctctct tccatcgtct 8940
ccaccgaggg gccgctgccg ctgctgcgcg aggagtcgcg gatcaacttc tggaacgccg 9000
cctgcgccgc caggggagtc ccggtggatc agcccacggc cgccgccgtg acattttata 9060
tctgcctcct ggcggtgctc gtcgtggccc tgggttacgc cacccggacg tgcacccgga 9120
tgctgcacgc ctcccccgcg gggcggcgcg tataaagatc gatccgcacg cgcccgaccc 9180
cactcgctcg ccatgtccag ctcgagaaag acccgggtcg ccgccgacga gaccgcctcg 9240
ggggcgcgcc gccgcgccgg cagcgcctct cgcacccgga ccaccgcccc ggccgccgcg 9300
acccccagac gcccctcggc ctacgacgac tatgacgacg gcttctccta ccggtcggcg 9360
ccgtcctacg acgacgatga ctactacggc tacgatggct acggctcctc ccgcgccccc 9420
cgcgccgcca aggtgacgcc cgcggccgcc tcgcgggcct cgaccggggc caagagcgcc 9480
tcggccgcca agacccccgc gtccgcggcc aagaccaccc gctcggcccc ggccgccgcc 9540
ccggccgcca ccaccaccac caccaccgcc gccgccgccg cggaaccggc cgcccggcgc 9600
gcctcgacac gggccgcccc cggggagaac ctcgacgtgg gccgccgccg gctcgccttc 9660
agcgacaggc cgtgcgaggc caacgtgccc tggcgcggcg cgacgcacgc cttcaacaag 9720
cgcatcttct gcgcggccgt gggacgcgtg gccgaggccc acgcccgcgc cgccgccgag 9780
tccctctggg acatgaaccc cccgacgacg gacgcggcgc tcgaccgctt cctgcaggcc 9840
gcggtggtgc gcatcaccgt gtgcgagggg ctggacctga tcgaggcggc caacgccgtc 9900
ctggacgaga gcacccccgg gcggaaggga aaagtgtata aataaaggcg ttgcaaatgg 9960
caccccgctc agtcgtccgc tgtcttgctt gtgggggggt cggtgaggat gcgcgacgag 10020
gagtgcgtgg tcgcgttcga cgaggccctg ctggggggcg cggccccggg ccggccgccc 10080
gtggtggccg tcccgcgggc ggccagcccg gacgcgctgt accagcgcct catcagcgac 10140
ctggccttcg acgagggccc ggcgctgctg ggcgccatgg agcgctggaa cgaggacctg 10200
ttctcgtgcc tgcccggcaa cgaggacctg tacgcgcgcc tggtcatgct gtcggcctcc 10260
gcggacgagg tggcggccca ggtccgggcg ccgacggcgg acgcgagcgt cgacctgggg 10320
gtgcccgggg cggagcccat gccgcgggtc ccggccgtgg aggaggagct gcccgcgtac 10380
gtggcggccg tggagcgctt cttcgtgtcc acgctgcggg cgcgcgagga gcgctacgcg 10440
cgcctgctgg acgcctactg ccgcgcggtg ctgcgctacc tgcacgcgca ggcgcgccgc 10500
gacgagggca agctccggcg gctggtgcgc gggcgctact accgcgacgt cgcgcgcctg 10560
gcgcgcctgc tcttcctgca cctgtacgtg gccacggcgc gcgagctctc gtggcgcctg 10620
cacgcggacc aggtggtggc ccaggacgtg ttcatgtccc tgcgctacga gtgggaccag 10680
gcgcggcagc tgacgtgcct cttccacccg gtgctgttca accacggcgt ggtgctgctg 10740
tcgggcgcgc cggtgccggc cgcgcagctg cgcgccgtca accaccgccg gcgcgagctg 10800
ggcctgccgc tcgtgcgcgc cggcctcatc gaggaggacg gcgccgacct ggtcgaggag 10860
ccgccgttct ccgccgcgct gccgcgcgcc gccggctacc tctcgcacca ggtgcggatc 10920
aagatggagg cctactcgcg cgagtaccgc gaccacacgt actgccgccc gccctcgccc 10980
gtggccagct acggcagcac cgcggaggcc ctgctgccgc ccccgtcgcc ctcggccgtg 11040
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acgctggccg aggccgagga ggatggcgcg ctgacgacgg cggcgcccgc ggccgcggtc 11160
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agcgaccacc atgagcgacg cggggcccgc gcggcgcccg aggcgctcgc aagagcagcg 11400
cttccagccg ttcccccgcg cggggctcct ggtgcacctg caggacgtgc tcgtgggcga 11460
ggtgcggcgc ccggacttcc gcccgccgcc cgacgaggag agcagcgagg aggaggagcc 11520
cgtctggacc gacgacgacg aggaggaaga ggggggggcg gaggaggaga ggatgagcgg 11580
gggccggcgc gggggtgagg ggggggacga cgacggggac gaggaggagg aggagagcga 11640
ggggggcgcg tggtccgacg gggagctgta cgtggcggcc gaaggcgacg cgtgggacgc 11700
ggaggaggac gaggaggacg aggaggagga cgaggaagat gactacgacg atggggatga 11760
cggccacgac ggccgcggcg ccgcggtacc cgccgacgtg gactacctgt cgcgcgccct 11820
ccgcggcatg gagacggccc ccggtcccga cgagcgggag gccttcaccc gctacgccgg 11880
cacgctctac cgccgccagt ttcagcccgg gcggccgggg taccggcccc cgcgcccgcg 11940
cgaccccccg ccgcccccgc ccccgcgggc ccggccaccg acgacggcga cggccgccgc 12000
cgcccactgc ggccccgccc gcgccgccga cggcgacgac tccgcgccgc gcctcgagcg 12060
ggacccggac gccgcgtacg ccagctggac gcgcgacatg cccgacggga ccttcctggc 12120
catgccgtcg tgggtggcgc tgcgccgcga gccgcgcggg cccccgggcc gccccgtcgg 12180
gcccccggac atcctgcgcc gcgccccgcg ggcactgacg ttcacgccgc aggcggcctc 12240
ggcggcgctc gtgagccgcg accaggacgc ctgggaggcg ctggtgccgc tgcaccacct 12300
ccagatgcac tcgtggggcg gcagcgcgcc gccctcgcgc gggggcgtgt acgcgacgcc 12360
cgcgcccgag acgcgcggcg tgtggcgccg cgcgctgcgg caggccatcg ccctgcacca 12420
cgccatgttc ctggcgccgc tgcagtcctc gacggtcggc gcgcccgcgc tcgcgggcga 12480
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ggagctgcgc gtcctcagcg ggcaccccga ggacgtccgc ttcgcggcct tccacctggc 12720
cgtggcagag gtgtacctgc tggcgcgcgc ccacggccag aacccgggct tcacggccga 12780
ggagcgcgag ctgctcgcgc ccatgttcac gctgaccgtg ctcgcgatgc accacgcgct 12840
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ccgcgccgtg cgctcgcgcg tgccggcgtc gctggtgccg ctgggcagca tcgcgctctc 12960
ggacgccgag tacgccgtgc tgaacgcgac cgaggtggcg gcggcgcgcg acgccacggg 13020
cctgggccag gccgtgtcgc tgggctacgc cgccgcgcgc tccgcgctca cgggcctcat 13080
gcgggcccac gccggcggga gcgacgccct cgtcgccttc gcgctggtgc tgcagcgcct 13140
cgcgggccac gcgaacctgc tgctcaactg cctgctcggc gccgcggtcc acggcggccg 13200
gacggtgcgc gtgtacgagg cggcgctgga cgactacgcg gagctcatgg acgcgctcga 13260
cccgctggtg cgcgcgtgcc cgctcgcgga gttctgggag cagcgcgacg ccgtcatgcg 13320
ccagctgcgg ttgacggcgg ccccgggccc ccccgtcggc ggcaagcggc tcgtcatcgc 13380
gcccgcgctg ccctccgagg acctggacgg gctcgtcccg cccacggccg tgcgccccgc 13440
ccacttgggg ccggacgtcg acctcgccga atacgccgcg cgccacccgg agctggtggg 13500
cgtgccggaa ccccgagcgc atttatcggc gcgccggccg ccccggggcc gctaacccgc 13560
ctctgcctcc gccatgctcc gccgcgcccg aggaacgcgc cgcgcttcgt ggaaggatgc 13620
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gtccgtgatc acggcgtgct cggcggagcc gcaccgcgag gtgtacgcgc gcgcggccga 13860
cgccgcgctg aagggcatca cggcggacgt ggcccggcgc gcggtgctgg ccacctactg 13920
gcgctacctg aaggccagct cgggcgtgga ggtgcgctcg gacgacgagc gcgacgcccc 13980
caccgtcatg ctgctgtggt cgacgttcgg caagccgctg tcgaagcacc cgttcaagca 14040
caaggcccag agcgccgcgt acggggccac gcgcgccgcg ctcgccgagg cgaccgaggc 14100
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cacgagctcg tcgcacgcct ggggcgccat ggagcgcggc acgctcgcct ggttcaacta 14700
cgccatcgcg cgcagcctgg cctcgtacgg cgggcccacg gagcgcttcg cgcgcgtgct 14760
ggcgacgacg ggccagcggg acatgcgctt cctgtcggtc gcccccgcgc agccgccgct 14820
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gccgcccccg ctccccgagg ggcccccgag ctcggacgac gagctggagg tggacggcgg 15000
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gggacggagg ggagagggac ggaggggaga gggacggagg ggagagggac ggaggggaga 16020
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ctcctcgcgc gtgtacacct cgaggggcag gaactcgcgg tcctccagca gcgtcaggtt 16740
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cgccgcgggg gacgcggggc ccacgacgcc ggcgaggccg aggcgctcga gctcgcgcgc 17400
gtacagctgc gccagctcgt tcgagatcag cgggcggaag gccaccacga agcccccgcg 17460
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ctgcaggtcc agctgcgtga cgtcgctgac gaaggaggcg cccagggccc gcgacgtgaa 17640
gcggaaggac ccgtcgcgcg tctcgtcgcg gatcatctcc tcggcctcgc gccacttggc 17700
caggctgcac acgcgccgcg tcttgggggc ccagtcccag gccaccgtga agtgcggcgt 17760
gcgcagaaag ttgcgcgtca cgctctcgga ggcgcggagg cgcgagtcca ggtcgatggg 17820
gtagtagtgc tccacctgct ggaagcgccc gggcgcgtag ccgatgtgct ccccgtgggc 17880
cccctcgcgc aggccgtaga agggggacat gtacacaatg tcccccgtgg acagggcgaa 17940
ggagtcgtag gggtacacgg agcgcgcctc cacctcctcg acgatgcagt tgacggaggt 18000
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ggtgaggccg gggctgcccg ggacgggcgt cggcgaggcc gaggcggccc gcgtcacggc 18660
cgccgcgccg cacggcgggg ccgcggcgag cgccagcagc agcagcgcta gcgcgacggc 18720
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gtggtgcccg ggccgatgcc cgcggggccc gcgccaaaga ccgccaccag cgggcatgac 18840
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tatcgccagg cctgccgctg ggtggcggtt acgccggccg tctggaagcg gtagaagccg 19020
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cgctcggcgt cgcgcagcgc cgcggccggc aggtccgccc acgccacggc gtccgccggc 19560
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cggttggccc ggtccgggtc cagcatgcgc agcatgggcg tggacatgtg gtggtcgtag 19740
cacgcgcgga tgagcgcctc gaggcgctcg tcgggcgagg ccgcgcagcc gcccacgagc 19800
agcccgtcga tgatgtcgag ctcgcgggcc gcgcgggcgc ggtcaaagtg ctcgggccgc 19860
cgcccgaaga gcgcgagctc cacggccgcc gcgcgcacct cggcgcggcg ctcgcgccgc 19920
tccaggtcgt ccaggttgtg cgtgaacagg tcgagggccc gcaccgcctg gttcgtggac 19980
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cacggctgcg ccgggtcgta cagctccggc ggcaccacga gcccgccgcc gatcgtgcgc 20400
gcgaggaact cgtccacggc cgacaggtcc accgcgtggg gcgtgatcag gtggcagtag 20460
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ccgcgatcgg cgtcacgtac acgtagccca gcggcgcggc gcgcacggtc acggtcttgg 24540
ccgcggcctc catcgtcgcg ggggagacga ggtgggcgcg acgagccgag acgagacggg 24600
gcgggagcgg gagagagaag gcgcggcgga cggagtcgag tctcggcccc tcttcgggcg 24660
gacgggtccg gcggcggggt gaagagaggc ggaggtgtcg gcgccgaggg gcgaacgcga 24720
cgtcggcggc ggcggtggag cccggcccgc cccggccggg tcttaaagcg tggggccccg 24780
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ggactacaag gacatcccgc ggtactacgc cgcgggcccg cgcgagcgcg gcgtcatcgg 26280
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cggccagcag atccgcgtgt tcacgtgcct gctgaagctc gcgggctcgc gcggcttcgt 26460
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ggcgccgagc agcagcgccg cctgcgtcac cagctcctcc gcggaggcgg cccggtcgat 37620
gttgagcgag gccggcggcg gcgtcacccg cagcaggttc ttgaggttgg ccagctcgag 37680
ggccccgtcg cggtcgcgcg ccgccgccgc gtccaccacc tcgcgcagca ggcgcgtggc 37740
gcgctccgtc gccgcggcct ggtccgcctc cgccgcggcg aggccgtcgc gcgccgccgc 37800
caggtcgcgg cgcacgagcg cgcgcatggc ctccgcgtac gccgtgcgct cgaagcgcgc 37860
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caggtgcacc ccctcgtcga gcgcgcgcgc cgcgtcggcg gccgcgcgca cgtacgtcac 37980
ctcctcgagc gcgcggcaga tctcggcgcc gcggctgccg ccggcctgca gcacgtccgc 38040
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cgccgcgccg gcgttctcgg gcaggtgcgg gttgaaggcg aacacggcgt ccagcgccgt 38400
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cgccgccttc tccgccgtgt ccgcgtccgc cagcgccgcc gccaccgcgt cggcgtgcgc 39000
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gtcgtggggc aggaagaaca cgaaggcccc ggcccaccgg agctcgctgg cggcgtagcc 41040
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ggtagtgctt ctccatgagg gtgtacatga cgttccacag gtcgatggcg attggcgtga 50580
ggacccccgg cggcgtggag atggcctccg agcgcaccag acggtggcgg tgtgcgtact 50640
ttaaaaggcc aaagagcccc atgtctccgc tcgcacaccg aggcgccggt ctaaaatacg 50700
catgtggcgg ggcggggcca tccgcgcata taagccgggc ggtgattggt ctggcgcaca 50760
ccgcccgccc gagcccgctc gcccgccgcg atgtcgctgt tcgacgacgg cctcgaggac 50820
ctggaccgcc accccaccca cgcgcaccac ccggcgcagg tgatccacga cgggcccttc 50880
gtgctggagg acggcgagcc cctgcagcgc accggcatgc tggtgctcag cgacgagcac 50940
ctggagcacg cgcgcgccgc catcgccccg ctggccgcgc acctcgcgca cgccttcctc 51000
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accctggccc cggaccagtt cagcacgttc gtgtggagcg ggccccaggc cgtgttcctg 51120
ggcaacgtcg acggcagcgg cggcgtgctc gacgcgctca aggtcgaccg gcggcggacc 51180
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gtctacaagc acgagttcaa cgactactgc atcatgctcc cctcgcgggc gcccgacgtg 51360
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acggaggggg ttgccgcccc ggcgagccat gctggcgctg cgcgctcgag tccacccgct 52080
gcatcacgct gatgggcgtg ctcgtcgcgc tcctcgccgc ttgcatgctg tccgtcccgc 52140
ccgcggcgtc gacgatgctg ctcggcgtcg ccagcctcat ggccatgctg cgcctgccca 52200
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ccactagcat taaatccgtt tcctgattca cgcccacgct cgcgtcgttt ttaaaaccgc 53160
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gcccgggtga tggcgctcgg cggggcgctg tacgtgcccg agccgatggc gtactggcgc 58800
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cgagtcgccg aaggcggtca ggagcgccgc ctcggcgcag acggcggacg tgggccgcag 63780
cgcgcgcccc acgggcgccg tcgcggcgac gaggccccgg ccggcgtaga gcccgtccag 63840
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cgcgtcgctc atcatgaccg ccagctccag gcccgtcgcc gcgtcctccc gggcgtgctt 63960
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gaggaggcgg aggaggcgtg agccgggtcg cgctggcgcg gccgcccatc caccgcggca 76740
cgtccgcgcc gggcggcgcc atcgccgccg ccggcggcga cggggacggg gacgaggcct 76800
cccggctcct gggccgcgcg cagccgcgcg aggcccccta cctgatcccg cgcccggacg 76860
gggacctcgc cgtgccggac gacctgcagt acgcgaccct cgacctcacg ggcgaccccg 76920
tggccgtcgg ggccggatcg tacggcagcg tgctcgtgta cggctcggtg gccgtgaaga 76980
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gccgcccccg acgcggccgc ggcggccttt ggcggcgcgc gcccgccgcc cgcgcccgcg 78060
ggcgtccccg ccgcggcggc gcgcgccgcc atcctgacgg tggaggcggc cacgcgcgcg 78120
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tacctgttct cggcggacga cgcgagcccc acggcgcgcg cgtacgcgcg cctgctcgag 78660
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ttcttcgagg gcgccccggg gcccggcgag gcgctggcga cggcagaccc cgcctggcga 78780
cgcgggggcg ccgaggacgc cccgccgacg cgccggaggt gtggcgcctt cgacgggcgc 78840
cacgtcgccg cgaacgcgca cgcccagtcg gaggtctggc tatttagcga cccggtggac 78900
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tgggggagag gatgggggag aggatggggg agaggatggg ggagaggatg ggggagagga 79560
tgggggagag gatgggggag aggatggggg agaggatggg ggaagagagc cgtggggtgg 79620
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gggagtcagg gggagtccgg gggagtcagg gggagtcagg gggagtccgg gggagtccgg 116160
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attggtggga agggggagtg acgtcagggc agcgggggga aagggggggg aaagggggga 116280
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cggagacgga gagaccgccc gcccggccac caccgtcggt accggtatcg ccagtaacac 129180
ccgcaccacc gacacccaca cggaccctca cacccgcacc ggcccccata ctcgcaccgg 129240
ccctcacacc cacccacacg cacgcacgct ctctctcgca cacccccaca tcacacgctc 129300
cccgcgcaca gacacacaga cgacaccctc cccgcccgcc ccgtccgacc gaccatccgt 129360
cctcccgacc ctccacgaga gagagagagc gagccttccc tgcacacaca gcaaaaattg 129420
acccccccca tcccggaccc ccccgggggc gggggcctcg cgcctccgcg tccggcgggc 129480
gcgatcgagg cccgcgcgcc cccgggggct cggggcggga cgcggcgccc gcgcggggac 129540
acgctttccc ccggaggggc gtcccggcgc gccggcccgg ccctccccgc cgggaagggg 129600
gcccggccct cttcgtctcc cggagcgccc ccggggtccc ggcccgaggt ccattttggg 129660
ccccgcccct ttgcacccgc ccccccccac cgggcggggt ccgcgctccg accccccccc 129720
ctccccctct gccacgcccc gccacgcccc gtcgccatct tggctcccct ccccccaact 129780
ccctctctcc cgacgaggcc gagccggtct cgcgccccct cccgcccgcc cgaggtaccg 129840
cggaaggacg acacgagccg gaagacggtg caacgagaac aacttttatt tttttcactc 129900
tggggcgtgt ctcgtggggt gggagggggg accgggagag agagatagag gggggggggg 129960
agaggagggg gtgggtgggc gacaaaagta tccaaggcgt ggctgtccgg ctccttcctt 130020
ccgggtccgg gcgggtccgg gctcgaggtt cgggtccggt tctcccgccc cggcgtcgct 130080
tcccggttcg ggtccggtcg ccggtccccg gtccgacggc ggttccgctc gtctctccga 130140
ccggctgggg gcgccctcgg agcgcgcgcc gagcgcgcag gcgcgggtgg ggcgaccgcg 130200
ggggtcgcgg gagggtctcg ggggtctcag gggtctcggg gagggggaaa cgggggtctc 130260
ggggtctcgc gagtggcagg gggaggcggt gagaccacca cacaacacag agaccaccac 130320
aacacagaga ccaccacaca acacagagac caccacaaca cagagaccac cacacaacac 130380
atgcggacca ccacaacaca gagaccacca cacaacacat gcggaccacc acaacacaga 130440
gaccaccaca acacatgcgg accacgtgca gacacacgga agcttgcacc gtgaggcccc 130500
attggccgag ggcggccacg tggggcgagc atgcaaatga cgtgcacacg gaagcttccc 130560
cgaaaatcat ctgattggct cgctagcacc acggggtggg tcgcgtgccg agcatgcgcc 130620
tcgcgcccgc gcgagggatt ttcggacaat ctcattggcc gcccgcggcc aagatggccg 130680
cagagcgggc cgggcatgca aatcagaggc gcgcgggaga cgcctccgcg cgcccattgg 130740
cccgggcggg ccgagatggc cgccgcgggg gccgggcatg caaagtagac gcgagaggaa 130800
gtgggcgaga gaaatcccat tggccgtcga ggggccaaga tggcgccctc ggggccggac 130860
atgcaaagta gacgcgagag gaagtgggcg agagaaatcc cattggccgt cgagtgggca 130920
agatggccgc cgcgggggcc gggcatgcaa atggtcctcg cgaggaagtt cctcgcgaaa 130980
tcccattggc cggcggccgc catcttgggc cgggcatgca aagcagacgc gagaggaagc 131040
gggcgagaaa aatcccattg gccggccgtc ggggaagtcc gcggcgaaaa tcggccattg 131100
gtccgcttac ctgggggcgg gctctcctcg gggcgcttat aagcgcggtc tccatcgtag 131160
cacttcactg cggtgcaggt acggacagca tcgttctctg ccaacccgag gggatccgac 131220
cgtctccgct ccggcgcgga ctctgaagac tccggctctc cggcggctat cagccctcga 131280
cggacgcccg acccaccgag gctctcggcc caccagagaa gagtcttctt cttctcctcc 131340
tccggccgcc ttcctccttc ttctccgccg cccgctctcc gcgctcggcg cccagcctcg 131400
ctcaggcaga aagaccccga tcgagaccat ggccgacgat ctctttgact tcatcgagac 131460
cgagggcaac ttcagccagc tcctggcggc cgccgccgcc gcggccgagg aagagggcat 131520
cgcgtccggc cccgacggcg gcagccaggg ctcccggcgc cgcggctcct ccggcgagga 131580
tctcctcttc ggcccgggcg gcctcttctc cgacgacgcc gccgaggccg aggccgaggc 131640
cgccgtcctc gcggccgcgg ccggagccac gaggccgccc cgtcctcctt cggcccagca 131700
gcagcagccc cgccggggct cgggcgagat cgtggtgcta gacgacgaag acgaggagga 131760
ggacgagccc gggtccccgg ccgccgggtc ccccggtcgg gctctccatc agggctccga 131820
gcacggtcac ctcgtcctcg ggccccggtc ccgggccggc tccgggcccc ggccgccgac 131880
cccggcagca ctcgcagcgg cagaggccgg ggcccccggc ggccccgggc gctcgtcccc 131940
ctccgcggcc tccccggcct cctcctccgg ctcccccggc ccctcggcag ccccgcggag 132000
atggtccccc gcgggggacc cggtcggtga gcccgggccg gcggcgcggc ctcggacccc 132060
ggcgccacca gcacagccag cagcggtggc cgcagcgccg gcacggcggg ggcccgcttc 132120
cccagccccc cccgccgccg ggccggtctc ggcgcccggc ggcggcggcg ccccctccgc 132180
cggaggggac cgcggtcgtc accatcacca gcaccgcgag cccctgctcg acgagcccgc 132240
cgccgcgagg cggctcgatc ctcggccgct tggcgcccgg agccccgtct cctccaaccc 132300
caactccaac tccagctcca ccaccaccgt cgccgtcgag cccgtcgccc gcggccccga 132360
gaaggacgag gacggactcg gccccgccgg ggacggcggg gcgcccccgc agagacagcc 132420
ccgccggcgc cgcgccggag agggcgccct ccgccgcggc cgcggcttca gcagctccag 132480
cagcggcggc agcgactcgg acctctcccc ggcccgctcg ccctccgccc cccgggccct 132540
cgccgccgcc gccgcgcggc gctcggcctc ctcctcgtcc tcgtcctcct cgtcctcctc 132600
gtcctcgtcc tcctccgagg gagaagaaga cgaaggagtc cggcccggcg ccccactcgc 132660
ccgcgccggg ccgccaccgt ctccgccggc gcccgccgcg gccccgcggc cctcggcctc 132720
ctccgcctcc tcctccgccg cggcctcccc ggccccggcc ccggagcccg cccggccccc 132780
gcgcaggaag cgccgctcca ccaacaacca cctctcgctc atggccgacg ggcccccgcc 132840
gaccgacggg ccgctgctca ccccgctcgg ggagccctgg cccggctccg accctccggc 132900
cgacggccgc gtccgctacg gcggcgccgg ggactcccgc gaggggctct gggacgagga 132960
cgacgtccgc caggccgcgg cccgctaccg cgccgcggcc gggcccgtgc ccgtcttcat 133020
cccggagatg ggggactcga ggaagcagca cgaggccctc gtgcgcctca tctacagcgg 133080
ggccgccggc gaggccatgt cctggctgca gaacccgcgg atgcaggccc ccgaccagcg 133140
cttcaaccag ttctgccagc gccgggtcca cgcgccccac ggccacggct ccttcatcac 133200
cggcagcgtg accccgccgc tgccgcacat cggggacgcc atggccgccc aggacccgct 133260
ctgggccctg ccgcacgcgg tgagcgccgt ggccatgagc cgccgctacg atcgcaccca 133320
gaagaccttc atcctgcaga gcctccgccg ggcctacgcc gacatggcct acccgggccg 133380
cgccgcggac ccccgcgccg gggaggcgac cgtcgaggcc ctctgcgccc gcgtccgcgc 133440
cgccttcgcc gccgcgcagc ccggccgcgt gccccgcgag ctggcggacg cctgcgtcct 133500
ggcctgccgc ggcgtcctcg agcgcctgct gccctgcccg ctccggctgc ccgcgcccgc 133560
ccgcgccccg gccgccctcg ggcccgcctg cctcgaggag gtgacggccg cgctgctcgc 133620
gctccgcgac gcgatccccg gggccggccc ggccgagcgg cagcaggccg cggacgctgt 133680
cgccctcgtc gcccgcaccg tggcgccgct ggtgcgctac agcgtggacg gggcccgcgc 133740
ccgcgaggcc gcctggacct acgccgcggc cctcttcgcc ccggccaacg tggccgcggc 133800
ccggctcgcc gaggccgccg cgcggcccgg gcccgcggag cccgcgcccg gcctgccccc 133860
gctctggccc gagcagcccg gcctcgtcgt cccagcgccg gcgccggcgg cggcgggcgc 133920
cccctccggc ctccccggct ccgggccctc cagccccgcc agcaccaagt ccagctccag 133980
caccgagtcc ggctccagca ccaagtccag ctccggcacc aagtccggcc tctccggctc 134040
ctccggctac gccagctccc ccgccgccgg cccggaccca gcgcccgagc ggcgcaagaa 134100
gaagcgccgc gcgcccgggg cccgccgccc cggggacggc gaggaggacg aggggctctc 134160
cggcgcggcc ctccgcgggg acggccacgg ccaccgcgac gacgaagagg accgggggcc 134220
ccggcgcaag cgccgctccc tcggactcgg gcccgctccg gaccccgctc ccgcgctgct 134280
gtcctcctcc tcctcctccg aggacgaccg gctccggcgc ccgctcgggc ccatgcccga 134340
gcaccccgcg cccgacggcg gcttccgccg cgtcccggcc ggcgagaccc acacgccgcg 134400
gccctccgag gcggccctcg ccgcctactg cccgcccgag gtggcccgcg ccctcgtgga 134460
ccaggaggtc ttccccgaac tctggcgccc ggcgctcacc ttcgacccgg ccgccctggc 134520
gcacatcgcc gcgcgccgcg gggccgcggg cgccccgctc cgccgccgcg ccgcctggat 134580
gcggcagata gccgaccccg aggacgtgcg cgtggtggtg ctctacgacc cgctgcccca 134640
cgaggagctc tgcgccgagc ccgccgaggg cgccccgcgc ccggcctggg acccgcgccg 134700
cggcggcctc tcggcgctgc tcgccgcctt cgcccaccgc ctctgcacgc cggactcgca 134760
cgcctgggcc gggaactgga ccgggcgccc cgacatcggc cgcctcaacg cccagggggt 134820
gctgctgctc tcggcgcggg acctcggctt cgccggcgcc gtggagtacc tctgctcgcg 134880
gctcggcgcg gcgcggcgcc ggctcatcgt gctggacacc atcgaggact ggcccgcgga 134940
cggcccggcc gtgggggact accacgtcta cgtccgcgcc cgcctggacc cggccgccca 135000
gtgcgccgtg cgctggcccg ggtgccgcga gctccgcgcg gccgtgctgg actctagctc 135060
catcgtgggc ccggcctgct tcgcccgcgc ggaggcctcc ttcgcccgcc tgcaccccgg 135120
ggccgagccg ctgcgcctct gccgccagga caacgtgcgc tacacggtga gcacccgcgc 135180
cgggccccgg accccggtcc cgctgccgcc gcgcgcctac cgccagcgcg tgctccccac 135240
cgtggacggc tgcaaggaca tggcccgcca gcgctccgcg ctcgggctcg gggacccgga 135300
ctttgacgcg ggcgccgcct tcgggcaccg cgcggccaac cgctgggggc tcggcgcccc 135360
gctgcggccc gtcttcgtct cctgcggccg ccggggcctc gccgagctcc gcggccccga 135420
gggcctgccg gccgagctgc gcgccttctg cgccgcggcg ctgctggagc ccgacgccga 135480
ggccgccccg ctggtgctga ccccgggcgc cgtcgccgcc gcgggcgccc cgccggccgt 135540
gctctgggac tttgcgccct tcgagaccag cgtccgcgcc gccgccgggg gcgccgtgga 135600
gacccgccgg cccgcggggg cctcgggcgc cggggccggc cccggcgagg acggggactc 135660
tgtggagatc gtcggcgtcc gcggcggcga cggccggccc cgcggcccgc tcgggcccat 135720
caaggtggag gccatctcgg acgacgagga ggccgaggac gccggcaacc cctacctgct 135780
gctccgctga gcggggcgcc ccctcggccc ggccggactc tgactctgac tctccggccc 135840
ctccgccggc tcctcgaggc ccttctcctc cgtcttctct cccctcgccc tcggcccggt 135900
cctcgtcctc gtccccgtcc tcctcctcct ctgcgtccgc ggcggcggcc tcggtcccct 135960
cggcccggcg gcgcttgcct ccccggcgcc tgcctccccg gcccggtggc cctcctcctc 136020
ctcctctcct tctcctccgc gcggatcccc cggccggagg tggctgcggc ggcggcggag 136080
gtggcggcgg tggtggaagc ggcggcggcg gccgcggcgg agggctcggc ggcggaggat 136140
cgtcccggtc cccttctcct cctcctcccg cggtcccccg gtccccttct cctccttctc 136200
ccatcgggtg agaaaagagt ttattttcag agcgagaaaa taaagtttgt gctgtatttt 136260
ctgaaccggc tcgagtctct gagatttttt ggggagatgg aggcggccat cttggcggtg 136320
gtctctgggg tggaggtggt cttgtggatg ggggtccctg gtgggaggaa gaagaagagg 136380
tggagggtct tggtgagggt gacgggggtc ctcctcctgg agggtcttgg tggtggtggt 136440
ggtggtggga agaagtggat gggggtcctc ctcctggagg gtcttggtgg tggtgggtct 136500
tagcagatgg gggtccctgg tgggtcttag cagatggggg ccctcctccc ggagggtctt 136560
ggtgggaaga agtagagggt cttggggatg ttgggggtcc ttgatggtgg tggtgggagg 136620
tggacggcgt tggtggtccc ggcgggtcct ggtgggaggt agatggtccc gagggtcccg 136680
gtggtcccgg gcgggagttg gacgatggtg gtcctgcggt ggtcgagggg ggtgggggga 136740
aagagagaaa gagagaaaaa aacacggtgg tggtcagtac agggaactgc cgttgcaacc 136800
atcgccccct ggtggtgata gtagtaaagc gtgtgcgtga gggggggggg ggggggtggt 136860
ggtgttgttg gtggtggtgg tcccgggtgg tcgtcgtgga ggggcgggaa aggcggtggg 136920
agagcgggcg gaacaggttc atctggcttc cgtcttccgt ccccactccc agcctccccc 136980
gctgccaccg attggccggc gggacgatga cgacggcgac cgcgtggcgc gaggggagcc 137040
aatggggcgg gcgccgcgga gcggaagccc ccgcccgcgg acccccggtg cgacggaagg 137100
ggcaggctcg gcgcgccgat gcgatccgcg gagcccgccc cggccgcgcc ccggaagccg 137160
gcgtcacgtc cgggggaagc ggaaggggcc ggcgcgatat gcagatgaga tccgtggggg 137220
ccggcgtcac gtccggcgga agttgcgcgc gggaagcggt catacgcaaa tgaggcggaa 137280
gtcgtcatcg gcaaaaacgt cacgtccggg aagcggtcat atgcaaatgg gggggggagg 137340
agcccggcgt cacgtccggg ggaagcggtc atatttaaat ggggggggag gggccagagc 137400
gtcacttccg gaggaagttg tcatatgcag attaggggga ggggttatgc agattagggg 137460
gaggggttat gcagattagg gggaggggtt atgcagatta gggggagggg ttatgcagat 137520
tagggggagg ggttatgcag attagggggc ggggctatgc aaatgtatgc aaatgagggg 137580
gtggggttat gcagatcagg gggaggggtt atgcaaatgc atgcaaatga gggggagggg 137640
ccatgctaat ttatgcaaat gagggggcgg ggctatgcaa atgtatgcaa atttatgcaa 137700
attagccccc cccctttaag ccccgccccc ttttttcgcg gcccccgggg agcggggggg 137760
tggg 137764
<210> 2
<211> 1104
<212> DNA
<213> Pseudorabies virus
<400> 2
atggactgcc ccatctgtct ggacgtcgcg gccaccgagg ctcagacgct gccgtgcatg 60
cacaagttct gtctggactg catccagcgc tggacccagt cgagcaccgc ctgcccgctg 120
tgcaaggccc gcgtcacctc catcctccac cacgtggaca gcgacgcttc gtttgtggag 180
acgcccgtgg agggggcgac ggatgtcgac ggggaagagg atgagccggt aggggggggc 240
ttcgcggtca tctggggtga agactatacc gaggaggtgc gccacgagga ggccgaaggg 300
cagggctccg ggtctgggtc tcgcgcccgc cccagagtcc ccgtcttcaa ctggctttat 360
gggcaggtct cgacggtcat cgagagcgac cccatccgcg aggccgtcgt ggacaacatc 420
gtcgagatta tccaggagca cgggatgaac cgccagcgcg tgaccgaggc catgctcccc 480
atgtttgggg caaacaccca cgccctcgtc gatgcgctgt ttgacatatc ggcgcagtgg 540
atgcggcgga tgcagaggcg agccccgatg agccaccagg gtgtgaacta tatcgacacg 600
tccgagtccg aggcacactc tgactctgag gtgtcttccc ccgacgagga agactcgggc 660
gcctcgagca gcggggtgca cacggaggat ctgacggagg cctccgagtc cgcggacgac 720
cagaggccgg cgcccaggcg ctccccgcgc agggcccgac gggcggccgt gctgaggcgc 780
gagcagagac ggacccgatg cctgcggcgc ggccggacgg gcggacaggc ccagggcgag 840
actccggagg cgccatcgtc cggcgagggg tcctctgcgc agcatggtgc ctcgggggcc 900
ggggccggcc cggggtcggc gaacaccgcc gcttcggctc gctcctcccc ctcgtcttca 960
ccctcctcct cgatgcggcg cccgtcgccc tctgcctctg cccccgagac cgccgccccc 1020
cggggcgggc ctccggcgtc tagctcgtcg ggatcccccc gctccgctac catcttcatc 1080
gacctcaccc aggacgacga ctga 1104
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP基因序列
<400> 3
atgtcgaagg gcgaggagct gttcaccggc gtcgtcccga tcctggtcga gctggacggt 60
gacgtcaacg gccacaagtt ctccgtctcc ggcgagggtg agggcgacgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggtaagctgc cggtcccgtg gccgaccctg 180
gtcaccaccc tgacctacgg cgtccagtgc ttctcccgct acccggacca catgaagcgc 240
cacgacttct tcaagtccgc catgccggag ggttacgtcc aggagcgcac catctccttc 300
aaggacgacg gtaactacaa gacgcgtgcc gaggtcaagt tcgagggcga caccctggtc 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gtaacatcct gggccacaag 420
ctggagtaca actacaactc ccacaacgtc tacatcaccg cggacaagca gaagaacggc 480
atcaaggcca acttcaagac ccgccacaac atcgaggacg gtggcgtcca gctagccgac 540
cactaccagc agaacacccc gatcggcgac ggcccggtcc tgctgccgga caaccactac 600
ctgtccaccc agtccgccct gtccaaggac ccgaacgaga agcgcgacca catggtcctg 660
ctggagttcg tcaccgccgc cggcatcacc cacggcatgg acgagctgta caagtaa 717
<210> 4
<211> 137377
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRV-del-EP0基因组序列
<400> 4
ggcccagctc tcccccgagc gcggatctct gaaaaaaaaa tttcccgccc ccgcgttttc 60
cattggggtg aatggggagg gggtggggga tgggcactca ctaagaattg gcaaggtgcc 120
aatttatatt ctggcatggt gccaaactac atacctggct ccctgccaac cccaatcccc 180
ctcctacctt ggctccctgc caaccccaat ccccctccta ccctggcacc ctgccaaccc 240
caatccccca ccatcgtcgc ggtcttcatc cttggcacac agccaaccct agaaggcgag 300
ccgcgatgct gcggtcgggc ccacccgcgg caggaggttg tggatggcga tgggcgaggg 360
cgggcgcgcg tgtggtgggg acggtgtcgg tgcccgcgcc ggtggcgccc gcgagggttc 420
gccttgggtg cgctgggggc ccctccccat tcaccccaat ggaaaacgcg ggggcgggaa 480
attttttttt cagagatccg cgctcggggg agagctgggc cccagaccag agagttgtgg 540
gggggcccgg gggagagctg ggcccccggc cagagagttg tgggggcccg ggggagagct 600
gggccccaga ccagagagtt gtgggggggg ggggcccggg ggagagctgg gcccggctct 660
cggtggggga caaccccctg gggagagcct gaccaattgc cagactagag gagagccccg 720
ccgggaccgg agaggagagc gcgccttccc ccaaccccct cgttcccccc tttcccccaa 780
ccccctcgtt cccccctttc ccccttccaa agcgggcgcc gcgagcgcgc gggcccccat 840
acggcgctcg ctctcgtccc ggccggtctg gccgccggga cggggcgctc ctcgccgcga 900
tgaccgacgc ctcgtcgcga cccggcgagg aagagccgat ggaggtggac gagcacgtcg 960
agcccgagtc ggagcccatg gaggtggacg agccccctgc gccggcgcag gcatcgggcg 1020
ccatcctcgc ggtgggcttc acccagcccg cgcaggtcct gcgggcgtac cagatcggtt 1080
gatgtgcgaa cgatgggcgg gggaaccagg gggtcagatg cacccacgtg gtgccacacc 1140
cgccccacgc cgcgctcttt ttcccgggcc gcccgaccgg atcctcccgc agagccggac 1200
gtggggcgag agaccgggat ggacgtggag aggggagcgg ccgcggggcg cgtggaggtg 1260
gagctcgatg cccggccctc cggcaccaga gggcgcggcg cgagcccctc gcgtcgagcg 1320
cgggaccccc gaaccggccc gtgccctcgg ggcgggaccg acccgcgtcc ccgggacaga 1380
accggcgacg ccaccggggc gcgcgccccg cgcccctccg ccctgggtat taacgccccg 1440
ggcaccgccg tccgccgcca gccgccgtgg gaggcagaca tgcctccaca acgagcccgc 1500
ggggccccgc cgcgccgccg cggcagcgac ccgcccgatc ccggcagcct cgccgggcgg 1560
ctctcgcccg gggggaggag cggcggagga tcgcgccgga ccctctcgcg cagcagctcg 1620
ctcacgtccg tcgcctcggc ccccgtggag acgcccgtcg ccgcggaggc tctcggactc 1680
ggcgcccccg gctccagacc gccctcctac ggggacgtcg ttcgcgccgg gccgcgcccg 1740
caccgatcgc cggacacgcc gctgtttgcc cggggcccgc ccccgtccta ctcggagacg 1800
ctcctgtttg acccgcccgc gtacgcggtg accatcccgg acccgcccgc gtacgagccc 1860
accgtcatcg gaccgcagcc gccgaggccc cgcgactgga tctcctcgcc ctccgtggtg 1920
cagccgtcgc tgctgggccc cttcagccag tgcctcccgc agttgacctg ccccgactgc 1980
cgctaccccg aagaccgccc gatggtgctc gtgggcttcc tctggggggg gctgctcctg 2040
ctggtgggcc tcgtgtttct gatcctgctc ccggtgctcc gggagtctgt cgtgtttccc 2100
tgaccaataa actcggctcg ccagtcctat cgatatccgc gtctcgcgtg tggtgttgcg 2160
acgggggaga tggggagagg aggatgggga gaggaggatg gggagaggag atggggagat 2220
ggggagagga gatggggaga tggggagagg agatggggag atggggagag gagatgggga 2280
gatggggagg acgacagact cgtgcacacc agagaggtac ggttcaacag ttttattcaa 2340
aacaggtggt tgcagtaaaa gtacttcccg tgcatgtaca cggggacgag ggtgtagctg 2400
cacgtcaggc ggcaggtggg cgcgtcgcag ccggttttgt gggagtccag cgcgtccatg 2460
atcccgccga ggcaggcgcc gggcacgtac tcctccagcg ggacgggcga gtcccccagg 2520
tcctcgggca gcacgcagct cgagccgcgc tcgacgacgc gggcgatgcg agccagcatc 2580
accagggtgt aggtgacgat gcagcgcacg tcccgcaggc ggcgccggcg cacgagctcg 2640
tcgacgggcg cgtcgcggag gtagcagcgc aggaacggcc cgagcttcag gcgcaggttc 2700
tgcagcaccg cccccgcggt ggccacgatg gggtccagcg tgcgcagcgt gagccccttg 2760
gtgaggatga gcttgaccca cgtgagcgtc tcgtccgccg aggcgaggga ctccgtcagg 2820
ccctcgttca ggagcaccat ctcgcggagc acgcgcgccg cctcggtggc gtgcggccgc 2880
acctcaaaca ggcggtgcag gtcggccccg tggaacatga gcgtctccca cgtgacgcgc 2940
cgcccgtccg gggtgaactg ctcggcgccg aactcgagga cggcggccca cggcgacgag 3000
cccgcggcgc ggaagccgtc gttgaacacg gggcgggaga ggtcgtgccg cgccgaggca 3060
aagagctcgt tgacgcgggt cgcgccgacc cgcgcgtgcg tcgcggagac ggcggcgcgc 3120
gcgctctccg acagacgatc ggggggcgcg tcgggcccgc cgtccggacg atccgcctcc 3180
tgtcgccgcc gctggtgctg ctgctggcgc tgctgctgct gttgctgccg ccgccgctgc 3240
cgcagggcct gtcgggcggc gcgcccgccg cgacccccgc gccggcgccg gatggccccc 3300
agccgcgccc ggacgggccg ccgctcgggg gggcgcgagc ccaggcgctc acggaccggg 3360
cgccgctcct cgctccccga cctggacgcc tcgctgtcgc tgctgttgcc gctgtcctcc 3420
atgaccgtgg tgcgagcggg gccgcggtgt gcaggtggcg ggcggcgggg cgcctttaac 3480
ccgccgtccc cgcgcgacct tcatccaaat atggtaatgt gccgctcata gtgcagaaac 3540
agcaacacgc cccctaccag caggcagagg tacagcgcct tggcaaagat cccggcgagc 3600
acggtcgagc agcacgcgcc gcagacgccg agggcggcgc ggccgccgtc ggagcgcgcg 3660
ggcgtggccg tcgcgccgga gacgcgcgcg atgtgcggca gcgtcgccgc caggagctcc 3720
agcgccccga ccgccagcac aaagatccac acgagggcgc gggcgtacag cgggaagacg 3780
agggcgcacg gggcgcgtgt gacgccgagg gtcgtgaaca gcgccatgcg cgcccccagg 3840
cggagcccga gctcgaggag gatgagcgcg atcagcgtgg gatggcggtg tgccagcgta 3900
atggggtcct cgcggaggtc gcggctgagc gcggcgcggc gcgtcgcgag ctcggccatg 3960
taccaggcga acttggtgta gctgcagccg atgaccgtgg cggcgagcac gctcgccgcg 4020
tagttgagcg tgtacttctc cggggtcagg aactcggcgg ggtcgcggaa ggggccaaac 4080
atgcgccgct cctggcgcgc gtacacgaag gccgcgtaga ggagccacgc gacggccgcc 4140
aggcgaaagt gcacgtccca caggtaggcg cggcagtcgc ggcgcgcgta cacgacccgc 4200
gcgcggtcgc gcagcgccgg gctcagcgcg tccgtctcgt tgggggccac gtagatggcc 4260
gtggcgttga aggcctccca gtccggcgcg cccccggcgg cgtcctcgcc gagcggcagc 4320
gccgcgtaca cgacggggtg gggcaggcgg gcgacggtcg cgtagtacgc gcccaggccg 4380
gcgtacgcgc ccatcacccc gaggacgagg aggtgcagcg ggcgcccgcc gaggagcatg 4440
attgccccac ctccgcggtg aaaatggtgc gcgtcgcgtt gctgccgcac tttgtagcga 4500
agcactgctg actcagcgag atacacagcc ggtcgtgggc gtcgacgctc agggccacga 4560
aggtgcgggc cggcgggctg cgcgcgtgcc gggcccgcag gcagctgaag cgcgcggacc 4620
cgcagagctg gaagaggacc cagtcgggct tggccaccac ccgctgcgcg gtcgcgcccg 4680
cgtactcgtg cgcgcgcccg ttgaagtgcg cgtcgaggtg ccgcagcacg ggcgccatgg 4740
ccacgtccgc cacgaaggcc tcgagcgcgc gccggtcctc cgcgtccacg gccaggccgc 4800
gcagcatgtc caccagcggc gtgcgccggg cgaagaaggc ctcgcggttc cgcgccgcct 4860
tgcgctcgaa gaagctctcg tactcccccc cgaggctgtg cagcacgcgc gtgacggcgt 4920
gcgccgggcg ggcgtggaag tgaaagttgc gcgggtcgtc gaagcccggg ggcgcgtccc 4980
cgaaggggag caggcgcccg tggcagccgc cgccgtcgac cttggcgaag aagggcagcc 5040
gcaggctgcg cccgtgcgcg tacacgcccg tgtccacgaa ggtgaagtcc tggaggtacg 5100
ggcccatggg ctcgatgaag tcccgctcca gcagcacggc ctgctggagc acgcgcgcca 5160
ggccgcggac cgtgtcggcg ccggccaccg cgtacggcga cggcacgggc gtgcacacgc 5220
ggaagcccat cttggcgcgg cagccgcacg gcgggcgctc gtccgccggg acgggggcgc 5280
ggacgagggc ggaggcgccg gggtccccgc ccgcgccccc gatcccgacc ccgacctcgt 5340
cgtcgtcgca cgtgtacacc tcggcgggga cgcccgcgtc ccagtccgcc cagtcctcgt 5400
cgcccggcgc ggcgccaaag tcggcgaggg cggcgtcgtc gtcccagggc gcctcctcga 5460
ggccgtcgtc ggaggaggcc gcggaggcgg accccgcggc ggcggcgagg gcgccccccg 5520
gcgggcaggc gctcttgtac acgtagcagg ggtgcgcggc ccagtcgccg tcggcctcgg 5580
ggaagagcag cgcgagcgcg tcgagcaccg cgcggcggaa cccgcgcatg gccgcctcga 5640
gcgtgcccgc gggcaccggg cgcgcgaggc gaaagtcgac gtcgaggacg atgttggtca 5700
cggccagccg ggcgttgaac acctcgtggc ggctcacgta catctgcgcc gccggctcgt 5760
gcgcggccat ctccggcgcc gcgtcgcggc gcgccgtcgc gcgcccccag gcgtccccgg 5820
ccagcaccgc gaaggcctgg cgccggtgcg ccagctccac gcggtacacc ggcgccgggg 5880
ggcacgcgtc cggcaggccg agcagggcgc ccagcgccgt gcgcgcgcgc ccgccgcccg 5940
gcgcggcggc cagctccagc aggcgacgca ggacggcgcc gtcggcgccc ggctgctgct 6000
gctcctcgtc gggggcgcgc acccagccgt ggggcgcgag gcgctcctcg acggcggtca 6060
cgcggcgcgc gaggccggcg gccgcgtcgc agagcccgcg cggcgcgtcg gccgcgagcg 6120
cggcgtacgt gcggtcctcc acgtagccgg cgcccatggc cggggcgagg cgcgcgacgc 6180
tcggcgtcac gttctgggcg acgtagtcgc ggatgttgag ctgcgcccgc acgtggcgga 6240
agaaggcggc ggccgcgcgc tccccgaggg gcgagcgccc cacgggcgcc gcggggtccg 6300
tgacgttgac ggcgtccagg tgctcgcgga gccgcgcgcg gttgaagctc tcaaagtggg 6360
ccaggtagac gtacgtcacg aactcgcggt cggggagctt gaggctgccc cggtcgtggg 6420
agatgtagtc ccggaggacg cccatctcgg cgcggtcggc gcgcacgcgc tcgtcgacgt 6480
agcgcgcggc gtgcgccgcc gcggggcccc gcgcgtagcc gctcaggcag cagaagcgcg 6540
agagcgccgc gaacgagagc agccccgcgg ggtccaggcc gctggggttg gggtccacgc 6600
gcgggttgta cgtgagcagc aggtccttga gggcccgcag gtcgtaggcc ggccgcgggt 6660
ggaagaggtg gaggcgcgtg gccagcacca gcgtcttctc ctcggggccg aagcgcgcca 6720
cgtaccagaa gggcgtgttg tggttcccgt agaggcgccg gaaggcggcc agcgtctggg 6780
tctcgtggtg cacaaagagc gaggtcagcc cgcggcgccc gaccgcgatg gagcgcagcg 6840
ggcgctccgg cgcgtactcg gcgttgccgg tgcgcgggcg cacctgctcg aggaccatgg 6900
tcagggccgc gatgaggccg tcgtggaggg cgaaggtggc cgcctcgtcc atggcctcga 6960
ggacgtcccg cgccgcgagg ggctccccgc ggcagagcgc gcgcacgacc gccggggtcg 7020
cggcggcgac gaacacgggc cgcacgcgga cgctggccac gtgcccggtg aggcagaacg 7080
tgacgccggg gcggcgcgct aaaagctcgg cctcggcgcg ctcgcccggc agtgagaagg 7140
cctcgtccag cccggcgccg tcccacgcgt acgagacgac gtagaccgcc cccgagggct 7200
cctggcccgt gagcagcatc agcgagtacg tgatcgcgca gccgtccgtg gcgtacagga 7260
cgcggatcat gctgggcggc atcttctccg ggtggtgcgg gcgccgcggc cgtgggaggg 7320
cttatgagcc gccggacgaa ctccgcctcc gggagtcgct ggccgtgctc aacgtgatcc 7380
tccccgcccc gctcgccgcc gaggacgtga tggcctcggc cgaggccgcg cgccgcctgg 7440
cccgcgcgga cacgctggcg cgcacctacc aggcctgcca gcgcaacctg gagtgcctgg 7500
cgcgccacga ggcctccggc gacgacggcc tggacgccgt ggtcgcggcg cacgcggcca 7560
acgcgcggcg gctcgcggac acgtgcctgg cggcgctcat gcacctgtac ctctcggtcg 7620
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gcaacgtggt gatgtccgac gtggccgtcc tggagcggac gctgggactg gcccggcggc 7740
ggcagccggc gcccgtccgg gccgcgcccg ccgggctggg tctgcccgtc cccgcccagc 7800
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ccgccaagac gcgcccgccc gagaaggccc ggaggctggc cgaggcctgc aagatgtagc 7980
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catctttatt gaaaaatgag aagagcgggt cccgcgtgtg tgcgcgcgcg gtcgccaccg 8100
tccgggtccg gcgcgggccg ccgcggcctc acaggcccgt ggagccgaag ccgcgggccc 8160
cgcgcgcgct gctcggggcg acaaagtccc gcgcgaagag ccacgcgggg cggtgctgca 8220
tcggggcgcg cggggtggcg gggaacgggg accgtcccgt gatccagccc agcggctcgc 8280
gcgtcagcac cagctgggcc acgcgctggc ccgactccag ggtcaccggg tgcgcgccgc 8340
ggttctggat ccggaagcgg cacgggccgc tctcccaggg cgtggggaag acgacgatgc 8400
cgcggaggtt gagggacgag cgcccgaaga cgtaggccca gtggcggccg tccgtgcggt 8460
gcaccggcag cgtcacggtc tcggcgcccc cggggggcag caccagctcg cgcgggcagg 8520
ggatgtcgta tccggcgtcc tcgtcgcgct tcggcgcaaa gacctcgaag aagggcacgt 8580
ccgtggcgat gcccggcgcg aggcgcagcg gcgtgcaata aaattgcgcc cgtgggcggc 8640
ccggggctac aatcgcctgc acctcgccgc gaaagcccgc gtccacgatc ccgttggtgg 8700
tgcgaccgcc cccgcgctgc gcgacgagca tcgcgtatcc ggtgggcagc gccaccttga 8760
ggcccagggg aaccttataa aatccctccg gccccggact ccggcacacc agcagccgcc 8820
ctccgtccac ggtcacgggc tcgctcgcac acaccaggat ggtctcctcc gccgggccct 8880
cgctgacgct cgtcgccgcg ctctgcgcgc tggtggcccc cgcgctctct tccatcgtct 8940
ccaccgaggg gccgctgccg ctgctgcgcg aggagtcgcg gatcaacttc tggaacgccg 9000
cctgcgccgc caggggagtc ccggtggatc agcccacggc cgccgccgtg acattttata 9060
tctgcctcct ggcggtgctc gtcgtggccc tgggttacgc cacccggacg tgcacccgga 9120
tgctgcacgc ctcccccgcg gggcggcgcg tataaagatc gatccgcacg cgcccgaccc 9180
cactcgctcg ccatgtccag ctcgagaaag acccgggtcg ccgccgacga gaccgcctcg 9240
ggggcgcgcc gccgcgccgg cagcgcctct cgcacccgga ccaccgcccc ggccgccgcg 9300
acccccagac gcccctcggc ctacgacgac tatgacgacg gcttctccta ccggtcggcg 9360
ccgtcctacg acgacgatga ctactacggc tacgatggct acggctcctc ccgcgccccc 9420
cgcgccgcca aggtgacgcc cgcggccgcc tcgcgggcct cgaccggggc caagagcgcc 9480
tcggccgcca agacccccgc gtccgcggcc aagaccaccc gctcggcccc ggccgccgcc 9540
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gcctcgacac gggccgcccc cggggagaac ctcgacgtgg gccgccgccg gctcgccttc 9660
agcgacaggc cgtgcgaggc caacgtgccc tggcgcggcg cgacgcacgc cttcaacaag 9720
cgcatcttct gcgcggccgt gggacgcgtg gccgaggccc acgcccgcgc cgccgccgag 9780
tccctctggg acatgaaccc cccgacgacg gacgcggcgc tcgaccgctt cctgcaggcc 9840
gcggtggtgc gcatcaccgt gtgcgagggg ctggacctga tcgaggcggc caacgccgtc 9900
ctggacgaga gcacccccgg gcggaaggga aaagtgtata aataaaggcg ttgcaaatgg 9960
caccccgctc agtcgtccgc tgtcttgctt gtgggggggt cggtgaggat gcgcgacgag 10020
gagtgcgtgg tcgcgttcga cgaggccctg ctggggggcg cggccccggg ccggccgccc 10080
gtggtggccg tcccgcgggc ggccagcccg gacgcgctgt accagcgcct catcagcgac 10140
ctggccttcg acgagggccc ggcgctgctg ggcgccatgg agcgctggaa cgaggacctg 10200
ttctcgtgcc tgcccggcaa cgaggacctg tacgcgcgcc tggtcatgct gtcggcctcc 10260
gcggacgagg tggcggccca ggtccgggcg ccgacggcgg acgcgagcgt cgacctgggg 10320
gtgcccgggg cggagcccat gccgcgggtc ccggccgtgg aggaggagct gcccgcgtac 10380
gtggcggccg tggagcgctt cttcgtgtcc acgctgcggg cgcgcgagga gcgctacgcg 10440
cgcctgctgg acgcctactg ccgcgcggtg ctgcgctacc tgcacgcgca ggcgcgccgc 10500
gacgagggca agctccggcg gctggtgcgc gggcgctact accgcgacgt cgcgcgcctg 10560
gcgcgcctgc tcttcctgca cctgtacgtg gccacggcgc gcgagctctc gtggcgcctg 10620
cacgcggacc aggtggtggc ccaggacgtg ttcatgtccc tgcgctacga gtgggaccag 10680
gcgcggcagc tgacgtgcct cttccacccg gtgctgttca accacggcgt ggtgctgctg 10740
tcgggcgcgc cggtgccggc cgcgcagctg cgcgccgtca accaccgccg gcgcgagctg 10800
ggcctgccgc tcgtgcgcgc cggcctcatc gaggaggacg gcgccgacct ggtcgaggag 10860
ccgccgttct ccgccgcgct gccgcgcgcc gccggctacc tctcgcacca ggtgcggatc 10920
aagatggagg cctactcgcg cgagtaccgc gaccacacgt actgccgccc gccctcgccc 10980
gtggccagct acggcagcac cgcggaggcc ctgctgccgc ccccgtcgcc ctcggccgtg 11040
ctgccctgcg acccgacgcc gccggcgcgc gtctcggccg ccccgctcat caccacggtg 11100
acgctggccg aggccgagga ggatggcgcg ctgacgacgg cggcgcccgc ggccgcggtc 11160
gcggccgcga cggtcgcctc gcccgggccc gccacccccg cctaccacct catcccccgc 11220
gacgcgctca accggatgtt tgagatgtga cgccgcgcgc ggtcggatct gcggcgcccg 11280
accacctgtg ggcggggcgt ataaagccgc gggccggccc ggaggggggg catttgccgc 11340
agcgaccacc atgagcgacg cggggcccgc gcggcgcccg aggcgctcgc aagagcagcg 11400
cttccagccg ttcccccgcg cggggctcct ggtgcacctg caggacgtgc tcgtgggcga 11460
ggtgcggcgc ccggacttcc gcccgccgcc cgacgaggag agcagcgagg aggaggagcc 11520
cgtctggacc gacgacgacg aggaggaaga ggggggggcg gaggaggaga ggatgagcgg 11580
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ggaggaggac gaggaggacg aggaggagga cgaggaagat gactacgacg atggggatga 11760
cggccacgac ggccgcggcg ccgcggtacc cgccgacgtg gactacctgt cgcgcgccct 11820
ccgcggcatg gagacggccc ccggtcccga cgagcgggag gccttcaccc gctacgccgg 11880
cacgctctac cgccgccagt ttcagcccgg gcggccgggg taccggcccc cgcgcccgcg 11940
cgaccccccg ccgcccccgc ccccgcgggc ccggccaccg acgacggcga cggccgccgc 12000
cgcccactgc ggccccgccc gcgccgccga cggcgacgac tccgcgccgc gcctcgagcg 12060
ggacccggac gccgcgtacg ccagctggac gcgcgacatg cccgacggga ccttcctggc 12120
catgccgtcg tgggtggcgc tgcgccgcga gccgcgcggg cccccgggcc gccccgtcgg 12180
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ggcggcgctc gtgagccgcg accaggacgc ctgggaggcg ctggtgccgc tgcaccacct 12300
ccagatgcac tcgtggggcg gcagcgcgcc gccctcgcgc gggggcgtgt acgcgacgcc 12360
cgcgcccgag acgcgcggcg tgtggcgccg cgcgctgcgg caggccatcg ccctgcacca 12420
cgccatgttc ctggcgccgc tgcagtcctc gacggtcggc gcgcccgcgc tcgcgggcga 12480
ggcgctggcc ttcgcgctgg acgccgcggc gcgcgcggcc gtcaaccacg acgccgcggc 12540
gcgcgagctc cccgagcgcg cggcgcgcgc gctccgcgcc gtcggccggc gcgcggccgc 12600
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ccgcgccgtg cgctcgcgcg tgccggcgtc gctggtgccg ctgggcagca tcgcgctctc 12960
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gcgggcccac gccggcggga gcgacgccct cgtcgccttc gcgctggtgc tgcagcgcct 13140
cgcgggccac gcgaacctgc tgctcaactg cctgctcggc gccgcggtcc acggcggccg 13200
gacggtgcgc gtgtacgagg cggcgctgga cgactacgcg gagctcatgg acgcgctcga 13260
cccgctggtg cgcgcgtgcc cgctcgcgga gttctgggag cagcgcgacg ccgtcatgcg 13320
ccagctgcgg ttgacggcgg ccccgggccc ccccgtcggc ggcaagcggc tcgtcatcgc 13380
gcccgcgctg ccctccgagg acctggacgg gctcgtcccg cccacggccg tgcgccccgc 13440
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cgtgccggaa ccccgagcgc atttatcggc gcgccggccg ccccggggcc gctaacccgc 13560
ctctgcctcc gccatgctcc gccgcgcccg aggaacgcgc cgcgcttcgt ggaaggatgc 13620
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ggtgctgacg gcggccgtgg cggccctgcg cgacgtggcc gagagccagt gcgcgccggc 13740
gctctttggc gcccagcgcg cctcggccct ggcgctcgtg cgcagcaact acgcccccga 13800
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gcgctacctg aaggccagct cgggcgtgga ggtgcgctcg gacgacgagc gcgacgcccc 13980
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cgtggagcgg tacgcctact acatgcgccc gctcgacccc atggtctcca gcccccagac 14160
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gcgcgggccg cgcgagacga tgtcgcccga ggcgctcttt gggcggcacc gcgccggcgg 14340
gcccgccgtg gcctcgggct cgggcgaggt gctcgtgctg acgagccaca cggcgacggt 14400
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gtgcggcctc acggccgccg tggacctcgt gaccttcgtg caccaccacg cgcagaccct 14520
catcaacctg acgctggccg gctacgtgtg ctggctcgac gacgggatgg aggacccgta 14580
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cacgagctcg tcgcacgcct ggggcgccat ggagcgcggc acgctcgcct ggttcaacta 14700
cgccatcgcg cgcagcctgg cctcgtacgg cgggcccacg gagcgcttcg cgcgcgtgct 14760
ggcgacgacg ggccagcggg acatgcgctt cctgtcggtc gcccccgcgc agccgccgct 14820
gccgccgctg ccgcgggcgt cgcagacgcc gtcgccgccg ccccgcgacc gcgacgcgga 14880
gccgccgcac gagtacgtgg accccttcgc cgagtacctg aactggcccg tgcccgtctc 14940
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cggcggccac gacgacgacg ccccctgggc cccgctgacg cgccacggga gcatgcgcac 15360
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gcggacccgc gcggacgacg gcctgtacca gcacccccga cccgtcatcg acctcaccgg 15600
ccaccgcgcg tcgcgccgca agagctggcg cgtgtgacgg ccccgcggac cccccgttgt 15660
atggtttccc cccgttgccc ccgtgtgtgg aaataaagtt tttttctaat tctgtacaca 15720
cggcgtgcgt gtcatcgtgg tcgcggtcgc gggacggagg ggagagggac ggaggggaga 15780
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gggacggagg ggagagggac ggaggggaga gggacggagg ggagagggac ggaggggaga 16020
gggacgagac ggacgcgaga cgtgttgcca aacaagcgca tctttattgt ttcccgcggg 16080
agggggctac agggcgtcgg ggtcctcgct ctcgaggcgc tggtagtgcc ggcggcgcgt 16140
ggccatcgcc ccgacgcggc tggccagcag cgcgggcccg ctgttcttct tgcgcgcctt 16200
gtgctcctgc tgctcgaggg ccgacacgat ggacatgtac cggatcatgt cccgggcctg 16260
gtccagcttg gcctcgtcca cgtcgccctc gtcgacgccg tcctccttga gcgtcttcgt 16320
cgtgacgggg tacagggcct tcatggggtt gcgacgcagg cgcgagatgt gccggtaggc 16380
caggaaggcc gcgaccaggc cggccagcac cagcagcccg atggcgagcg ccccgaaggg 16440
gttggacagg aaggacacca tgccgccgac ggccgagatc acggcccccg tggcgcccag 16500
gaccaccttg ccgacggcgg cgcccacgtc gccgaggccc tggaagaagt tggcgatgcc 16560
gcgcagcagc accacgttgt ggtccacctt gaccacgcgg tcgatgtcgt agaacttgag 16620
cgcgtgcagc tggttgcggc gctggatctc gctgtagtcc aggaggcccg tgtcggcgag 16680
ctcctcgcgc gtgtacacct cgaggggcag gaactcgcgg tcctccagca gcgtcaggtt 16740
cagggtcacc cgcgtgctga tcgtctcggg cacctccacc atgcgcacgt agctgtagtc 16800
ctcgtagtac acgtacccgc tccccagctt aaagtagcgc cggtggttgc cggtgcaggg 16860
ctcgatgagg tcgcgcgaga tgaggagctc gttgtcgtcg ccgagctggc cctcgatcac 16920
gcccgtgccg ttgtgctcga aggtgaccag cgggcggctg tagcacgtgc cgcgctcgcc 16980
gggcacgcgc atggagttct gcacgtacac gccgccgcgc acctccacgc accgcgagat 17040
ggccatcacg tcgccgagca tgcgcgccga gacgcgctgg ccgagcgcgg ccgtggccac 17100
ggcgctgggg ttcaggcgcg acatctcgct ccacagggtg cggtccttgt tctgcagctc 17160
gcaccaggcg gccgcgatgc ggcccagcat gtcgttcacg tgcgcctgga tgtggtcgta 17220
ggtgaactgc aggcgcgcaa actccgccga gcccgtggtg atgcgcaggt gccccgtgcc 17280
gttgacggcc ggcggctcgg gcgtccccgc ctgtccggcg gcgcgccggg cccgccgggc 17340
cgccgcgggg gacgcggggc ccacgacgcc ggcgaggccg aggcgctcga gctcgcgcgc 17400
gtacagctgc gccagctcgt tcgagatcag cgggcggaag gccaccacga agcccccgcg 17460
ggcgaggtac acctcgggcc tgtcgccggc cagcacgtgc gtgttgttgt agcgccgctg 17520
gtagatggcg tcgatggcct ccgaggcctc gcggaggacg cagtcgccca ggtgcacgcg 17580
ctgcaggtcc agctgcgtga cgtcgctgac gaaggaggcg cccagggccc gcgacgtgaa 17640
gcggaaggac ccgtcgcgcg tctcgtcgcg gatcatctcc tcggcctcgc gccacttggc 17700
caggctgcac acgcgccgcg tcttgggggc ccagtcccag gccaccgtga agtgcggcgt 17760
gcgcagaaag ttgcgcgtca cgctctcgga ggcgcggagg cgcgagtcca ggtcgatggg 17820
gtagtagtgc tccacctgct ggaagcgccc gggcgcgtag ccgatgtgct ccccgtgggc 17880
cccctcgcgc aggccgtaga agggggacat gtacacaatg tcccccgtgg acagggcgaa 17940
ggagtcgtag gggtacacgg agcgcgcctc cacctcctcg acgatgcagt tgacggaggt 18000
gcccgtgtgg tagaagcccg cggcgccgat cttggtgtgg gtgtcgttgg tggtgtgcca 18060
gccgcgggtg ccgagcgcgt tcaggcgcga ggggcgcagg tccacctcga cggggttctc 18120
gtcgcggtcg aaggcggtca ccttgtggtt gttgcgcacg tactcggcct tggagacgca 18180
cttgccgcgg cggtcgatca cgtccgtgat ctcctgcacg gggacgggca cgcggtccgt 18240
gaagcggttc gtgatggccg cgtacgtgct cccggaccac acggtcgtga cgatgacgtt 18300
cttgtagtag atgtgggcct tgaacttgtg cggggcgatg ttctccttga agagcacggc 18360
gatcccctcc gtgaagttgc gcccctgcga gtactcgggg caggcctgct cgggctccag 18420
gcgcaccacc gtggagccgg acggcggcgg gcagacgtag aagcggtccc gctcggtcgc 18480
ggccgcgcgc acggccgtgc gcgcgtccag gtcgccgtac tcgccgtcgg gggcctccga 18540
ggggccgggg gtgaacgcct cgatctcctc gagggacgcc tccgcggaga cgtcgttggg 18600
ggtgaggccg gggctgcccg ggacgggcgt cggcgaggcc gaggcggccc gcgtcacggc 18660
cgccgcgccg cacggcgggg ccgcggcgag cgccagcagc agcagcgcta gcgcgacggc 18720
gccccgcgca gctgcagcgt ggtgtggagc aggccaaaga cgtccgaggc cagcaccgcc 18780
gtggtgcccg ggccgatgcc cgcggggccc gcgccaaaga ccgccaccag cgggcatgac 18840
gcctcgtagg tcaggtacag cccgtcgcgt ccggcgaagc gatccgcgcg gaggacctcg 18900
acgtccccgc agtggaagac ggacctgaag actgcaaccg ccagcaccag ctcgcggata 18960
tatcgccagg cctgccgctg ggtggcggtt acgccggccg tctggaagcg gtagaagccg 19020
cggaactcac tgacgcacca atcgcgggcc accatgaagc gcgccagctc ctccttcagg 19080
tgcggcagga ggcccacgtt ctccaccgca aagtagagcg ccgtgttggg gggctgggcg 19140
aaggcgtgcg tgtcgtgcgc gaagagcggc ccgttgacga gctcgaagaa cttgtgcgtg 19200
agcgccggga ggagcgcggc gtccacgggg tggcgctgca ccgtggcctt catgaagctg 19260
tgcgcgtcga agcagcccgt ctcgcgctcg tccacgacgg tgcccgcgcg cgcgacggcc 19320
tcgcagaacg cgcgccgcgc gcggaacccg gcggccaccg ccacgtacgt gtgcagcagc 19380
gcgtcgccgt acacgttcac gcgcagggtc ttctccagct cgcgccgctg ctcgcgcacg 19440
cactgcgcca ggctcgccgc cgagcgccgc gagaggcggt ccgcgtacag gcgccgccgg 19500
cgctcggcgt cgcgcagcgc cgcggccggc aggtccgccc acgccacggc gtccgccggc 19560
gggggcgcgc cgggcccgtc ttcgtcgccg acgcccccgt cgccggcgtc cgcgcccccc 19620
gcggcgccgc cgtcggcgtc cgcgtcgtcg ccgccctcga ggaggcgctc gagggcgtcg 19680
cggttggccc ggtccgggtc cagcatgcgc agcatgggcg tggacatgtg gtggtcgtag 19740
cacgcgcgga tgagcgcctc gaggcgctcg tcgggcgagg ccgcgcagcc gcccacgagc 19800
agcccgtcga tgatgtcgag ctcgcgggcc gcgcgggcgc ggtcaaagtg ctcgggccgc 19860
cgcccgaaga gcgcgagctc cacggccgcc gcgcgcacct cggcgcggcg ctcgcgccgc 19920
tccaggtcgt ccaggttgtg cgtgaacagg tcgagggccc gcaccgcctg gttcgtggac 19980
gccagccaaa actgcagctc gctcacggcg tacaggcgcc gcgaggcggg ccggaacacg 20040
tcgtgcgcgt ccaggagcgc gtccgcgcgc cggcgcgccg tctcgcccgc gtccccggcc 20100
tcggcgcccg cctccgcctc ccgggcctcg gcggcgtcca cggcggcgag cgccgccagc 20160
gcgcgcccgc ggcgcgcctc gtcgagcccg cgcacgtgcg gcaggttctt ggccacgtcc 20220
tcggggtcca cgcgcaccgc cagctgccgc gtgaggtggt cgcacacgca gccgagcagg 20280
cgccggtgcg tggcctcgcc ctggttggcc gtcacgcaca gctcctcgaa gcacaccgcg 20340
cacggctgcg ccgggtcgta cagctccggc ggcaccacga gcccgccgcc gatcgtgcgc 20400
gcgaggaact cgtccacggc cgacaggtcc accgcgtggg gcgtgatcag gtggcagtag 20460
ttgagctgct tgagcaggtt ctcggcgtcg tggaggaact gcagctccgt ctccacgcgc 20520
ccgccgtacg tgtcgagcgc gacgcgcgcg tggaagcggc acgcgccgcc catggtgcgc 20580
tcaaagtagg cctcggcgtc gtcgccggcg gcggccagcg cccccagcac gcggtccccc 20640
tcggcccgcg cgtacgcgag cgccaggcgc agcgcgcacg tgagcggcgt catctgcgcc 20700
tccagcggca gccgccgcgc gaggtagcgg cacatcagcg cgttcagctt gacgcgcggg 20760
gccagctcgc gcaccaccgc ggggtcgcag cgcttcagca tctccagctg aaacacgtac 20820
gtctgcacct gccccaggac cgccacgagc cgccgctccg ccatggccga gtccgcccgc 20880
tcgctccctc cctccgcccg cccgcccgtc cgccgcgaga gaggccacgg gacgcgcgtg 20940
tgtgtctgtc aaacgcggtc atctttattg atacagccgg ggcgccccgc gcccgtcccc 21000
ccttcccctc ctcctcccct cacagcatgt cgaaggtcag ccgcttctcg ggcggggcgc 21060
ccatgtcaaa caggtcgtcc tccgggggcg ggcgcttgcc ccccagctcc gcgggcgcca 21120
gcgaggccgg cgcgagcccc gcgacgtccc cgcccgcgcc gcaggcccca aagtcgaagg 21180
cggtctcctc gccgccgtcc gcgcccgtct ggccctcgag gtcgcgcacc agctcggcgg 21240
ccgcctccac gctccagcgc ccgtcgcggt cggccacgcg cccgttgatc tccgccagcg 21300
cggccgccag gaactcgtcg tccacgatcg cccgccagtc gtcgggctcc aggtgctgcg 21360
tgcgggcgcc gagcgcgtgc agcacggccg cgtacacggc cgtctgcacc agcggcccgc 21420
cgtcggccag gatggtcttg acgtgctccc cgagggagtg gtcgtgcagc ccggcgccgc 21480
cgcccgtctg cgagcacgtg aagcccacgc gcgggcaggc cagcacaaag tgccgcgtgc 21540
ggtcaaacac catcaggggg cacacgtgct tgccgccgtt gagcccgctc cagttccccg 21600
cctggaagac gcggttgttg ccggccatgc cgtggtactt gctgacgccc aggcccagca 21660
ccaccagcgg gcgcgaggcc atgacggagc ggagcaggtg gctggacgtg tacgtggcca 21720
cccacgtgtc gtcgcgcggc gcgtccagca cctcgcgcgc cgcgcgctcc gcgtcggccg 21780
cgtccgccag cggccgccgc acccaggcca tgacggcggc cgggtcccgc gggcgcttcg 21840
actgcatcgt gatccccgtg aggctgttga tgaagaactg cttgtggtcg cagtagcgca 21900
ggatcaggtt ggccaggtag aactgggcca gctccgccac ggtgcccggg gtcaggttca 21960
cgtagttgat ggcgccgtag tccaccgaga agcgcttcac ggccgcgatg gtctcgatgt 22020
cgtccttggt cagcagccgc gccggcagct ggttgcgctg cagcagcgtc cagaaccact 22080
gcgggttggg gctctgcccg ccgggcggct tgccgcgggg gaacagcgtc gcgtggtgct 22140
gcttcagcag gaagcccagc gggccgttga gcacgtccac ggccgtgtcc gggcgctggt 22200
aggcgcccgc gagcccggcc acgcgggcgc gcgcggcgtc cgagaggctg cccgagcccg 22260
tcgagaacat gacccggctc ttgacgcgca gctcccgcag cacctcgaag ctcacgcgcg 22320
ccaggtcccc gtcgtggtcg cgcgccgggg gctccgcgct gcccttggtg gggtccgggg 22380
ccacgatgcc gtcggcgagc gtcaccgtca ccgtcttggc cgtgacgaag cccccgttga 22440
gcatgtccac cacgcggcgg cgcagcaccg gctggaactg attgcggaag ttgcgcccct 22500
ccacgggctg cccgtggagc acgccgtggc actggctcag ggccaggtcc tgcagcaccg 22560
ccagcagcgt gcgccgcgcc aggaagctcg tcgccgggca cagcgcgccc gagtacgggt 22620
ccagcgagag ggacatggtg tggttggcgt cgtagagcgc gtcgcggagc ttgaagtcgc 22680
gcgtctccac gagcgtgcgc acgaagcggt ccgccgcctg ctccaccgtg tcgcgcaggg 22740
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ggggctcgct gtcgttgggg cgcttgaggg ccccgtacga ggcgtagttg ccgagcacgt 22920
cgcagtcgct gtaggcgctg ttcatggtcc cgaagacgcc catggggctg cgcgtcggcg 22980
cgccgaagcg cgggaggcgg tggcgcaggc ggtgcagggt cgtgtgcgcg caggcggggc 23040
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cgaagtcgtg gttgcccggg gccgtcgcgg gctgcgaggc cgtgtgcggc agcacgcgcc 23280
cgtccttgtc cgtctgcggg ttcccggcca ggtagggcgc cgccacctgg tagaagcggt 23340
taaacgaggg gccggcgccc tccttgccgc cgccgtcggc ggcgcccgcg tcgtccacct 23400
ccgtcaggta cagcaccgag ttggagctaa acaccagcgc ccccacgagg ccggccgcgc 23460
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cggccgccgg gcccagcacg tagccgtgca gcaggcggca gagcgcgccg ttgaagaagg 23880
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cgagccggtt gacgtccggc atgaagaggt gcacggggta gagcggcacg cgccacgcct 24000
cgtgcccgtt gatggacacc gtgcccgcgc ccccgtagtg caggaaggcg ttgcacaggt 24060
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ggccgagccg cgcgcacacc tccgcgcccg tcgtctcctc ggcgttgtcc accggcgtcc 24180
ggtaggccga gaacccgaag cgggcgcgcg ccgcctcgca ggcgcgcgag agggcgggcg 24240
cggcgctgct cgggggcacg cagtccccgt tgtggaagaa gaacacgttg gggtggaagt 24300
ggttgggcgt cagcttcagc gtgagcccgc cgccgagccc ggtggtccgg gcgcccgcca 24360
ccacggccac gtgcccggcg aagccggcct cgacggtgag gccgcgcacc agcggcgcca 24420
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cgcgaccacg cgcctgctgc tcgaccacga cctgcccagc ttcggctggt accgcctgcg 25560
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ggaggtcaac tgcacgcccc tcaacctggc ccgcgacgag gacggcccgt ggcccgacta 25680
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ccacaccaag ctcacgaccg tctacgggct ggccctcgac ggctacgggc gcttcaaccg 26040
cggcggccag ttccgcgtct acgacgcggg ccagaacagc ttccagaagc gcagcaaggt 26100
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gcgctactgc gtgcaggact cggcgctcgt gggcaagctc ttcttcaagt tcctgccgca 26340
cctcgagctc tcggccgtgg cgcggctcgc caacatcacg ctcgcgcgcg ccatctacga 26400
cggccagcag atccgcgtgt tcacgtgcct gctgaagctc gcgggctcgc gcggcttcgt 26460
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cagcctgtac ccgagcatca tccaggcgca caacctgtgc ttcacgacgc tcgcgctcgc 26640
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ctactttgtg cacgcggggg tgcgcgagag cctgctctcg atcctgctgc gcgactggct 26760
ggccatgcgc aaggccatcc gcgcgcgcat cccgacgagc gcgcccgagg aggccgtgct 26820
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gcgcgacgcg cgggccgtgc gcccgggcct cgcgcccggg aagctgctcg tcagcgacct 27720
ggccgaggac cccgcctacg tggtcgcgca cggcgtgccc ctcaacaccg agtactactt 27780
ctcccacctg ctgagcacgc tcagcgtcac cttcaaggcc ctctttggaa atgacaccaa 27840
gatcacggaa aggttgctca agcgctttat tccggaaacc gcccccgggg acgcgccctt 27900
cgagcacgag gccttcgcgg cgctcacggg cgaggggggc gaaagtcttc aaacgctgcg 27960
tacaatcttt tgtactccaa cagcagctcc ccgtcgaagc tgatgtcccg catcttgcaa 28020
taaatgtcgc tcgcgctgac ggcgggcacg tcgtccgcgg gtctcccgtc tcccttcttt 28080
cgcaccacca acacgaacat ggtctgccac acgtgcgcga cgatgcggtg gccggcgcag 28140
gccccgagca ggcggtccag cacgcggtgg tgcacgtgca ccgacttctc ggggaacacc 28200
acgtacatca tgagcgcgcc ctgcgcgtcg gggtcctcga agaagagcac gcgcacgtcg 28260
cgcaggcccc cgtcgcgcag cacgtagtag gcgaaaaaga gctccgggtg cgcgagcacc 28320
tcctcgaggg cgcgctccga ggggtcccgc gcggccaccg aggccaggaa cacgcggtac 28380
tcgtagatgc tgttgagctg ctgcacgtag gccagcacga gggccgcgcg gtcgctgcgc 28440
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cccatgcccg agagcgacag gcagttgtcg gccaccgcct ggccgaggtc gaagggcagc 28560
gtcacggggg ccgtcttgat gagcgggttc gagaggccgc gcacggtggt cacctcgtcc 28620
gagggctgcg cggccgcgta ggcaaagtag ggcgcgtagc gatcgcgggc cgcgcgcgtc 28680
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tgcgtcgcgc aggaaggcgg ctcgggcagt gggcttcggc gggaacagct ggtacgcttt 28860
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ggcgatctgc gccttgcgca gcgcgtcgcc gcgctcaaag agcacgcgcg ggtccgcctg 28980
gcgctcggcc acggcgcaca gggggtcgca gaagaggtgc ttgtagacgg cgcgcgggcc 29040
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cgccgcgcag cgcccccgcg tcggcgcgca tgtccgagcg gtgcgtgttg acctcggcgc 42240
ggaaggcgcc cacggcgtcc acgacgtccg ccagacgcca cgtgcccagg cagggcccac 42300
cctccccggg cgcgaagacg gaggccgtgc gcccgcggaa gacgaagcgg caggtgaaga 42360
ggcgctcgag cgccaccacg cgctcggcca cggcgcccgc ggccgtggcc atcgagtcca 42420
gcaggtcgcc cgtgtgggtg gccatgtcct ccaggcggcg ccggagggcg cgcgccagca 42480
ggtccccgag gaaggcgctg gcggccagcg agggcggcgc cggcgccggc gcctcgagca 42540
cctcggcggc cgcgcgcacg accccgtgca gctcgtgcgc gagcgcctcg acgttgcgcg 42600
cgtgcgccac cgtcaggtcc tcgcgcgcca gcgccgccac gagcgcggcg agcttggtgc 42660
ggtagccgct gacgttgggg atgaggccgg cgccgtagtc gcgcgcccac gtcagcacct 42720
gcgccaggtc cgcgcggcgg tcgtaggagg ccgtcaggag gcagttgtag gcgtcggcca 42780
cggccgtcac gacgaagaag ggcgcgaagg acgggtcggc catggcctcg aggtgcacca 42840
tggacgggta gttcacgagg tccgcggcgg cggcgaggtc gacgagcgcc gcgctcgtcg 42900
gcgcctccat gggcgtctcc ccggcgccgt cggcgcgcag gccccagcgg ctctgcgcgc 42960
ggaaggcgag ccacgtgttg agggcctcgc gcgcggcgct gtgcgccagc ccggcgcggc 43020
gctcggccgc cgccacctcg cgcagcagcg ccgcgcgcgc cgcgcccacg tgctccgtgg 43080
gcgggcgcgg cgccatgcag tggcgcacca cgtgctccac gcccttctcg gggagcccca 43140
gcgccgccgt cacgtccccg tagaggggct ccagcgtgtc cgcgacgtcc gtgtaggcgc 43200
gcacgtagtc cagcccgggc ccgtagtcgt cgaggaggcg gtgcacgacg ccgccgacga 43260
ccgccgtgca gccgacggcg cgctgcgcgt ccgtcaggcg gggcgcgcgg tccagcacgg 43320
cgcgctcgag gaggtcgcag tggcggcgcg tgaagcccgc ggtcacgagc gcctccacga 43380
cctgcagcgg cgaggcgctg gcctgcaccg cctcccacac gcccgtggcg tccacctgcg 43440
tgtggtcgag gtccgcggcg gcggccacgt gcacggcctg cgccccgggg tccagcagcg 43500
ccagcacgcc ctggtccgtg cgcaggcgcc gcgccacggt gcccgggcgc agctcgcgca 43560
cgtacgcgtc cccgtgcgcg agggccgcgg agacgcgcac ctcgacggcc gtgcgcggcg 43620
tggcgttgac ctcgcccacg ggcaccagcg ccgcctcgtc cacggcccgc gccgcctcgg 43680
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ccaggagctc cagcagcggg gccgtgccct cgtcccagtc gtggcgcagg cgccacagcg 44160
ccaggccggc caggttctcg gcgagcacgg ccgcctcgca ggtgcccgtc tcgacgtagg 44220
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ggcccgcggc catgaagaac tccaggatgc gcgactgcac caccgtggcg acggcgtggt 44340
cggcctcctc gagcgcgcgc acgagcgcct ccattataag agggtccgcg cgcgggcgcc 44400
gccgcgcact cgaccccgcg cggcgcgacg atgagcgtgc agatcggcaa cgggctgctg 44460
atggtggtcg cgccgggcac actaaccgtg ggctcggcgc gcgcgcgcct tatacgccag 44520
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ctcgagcgct tcgcgaccgt gctgcgcgcc atgatccgga gccacgtgtt cccgcaccgc 44880
gcgctgcacg tcctcggggg gctcctgggc cacgtgacgc aagaccggct ggccagcgtc 44940
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tcgcaggtgc acgtgcccgc gtgcgcgctg atggacgtgg accgcgagct gcgcctcggc 45060
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cccgccgcgc ccgccgccgc cgcggccttc cccgcgtacc tgttcaacga cccgcgcagc 45300
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ggcaccgtcg agcgcgtcgt gcgccgggcc gagcgctgcg gctcggtgga cctgccgctg 45480
gcccacatgg agcgcttcac ctgggacgtg ggggcgtggg aggagtgttt cttctgaaaa 45540
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cacctccccg cgtcgagcac acgccgccat ggcctccgtc gtcgcgcccg ccgcctcctc 45900
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ctcgctccgc gagccgatgc gctgggacgc gctgcgcgtc cgcatcgcgg agcacggcgt 47700
gtacaacgcg cagtttgtgg cgctgatgcc caccgtgtcc tcgtcgcagg tcaccgagag 47760
cagcgagggc ttctcgccca ccttcaccaa catgttcagc aaggtcacca tctcggggga 47820
gctcctgcgc cccaacctgc cgctcatgga gacgctgcgg cgcctgtttc cgcgcgagtg 47880
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cggggagctg cccgccgggc acccgctggc caagttcaag acggccttcg agtacgacca 48000
ggagctgctc atcgacatgt gcgcggaccg cgcccccttt gtggaccaca gccagtccat 48060
gtccctcttc ctgaccgagc ccgccgacgg gaagttacac gcctcccgcg tcatgggcct 48120
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ggccaccaac aacggggtgt tcaccggcgg ggacctggtc tgcacgagct gccacctgtg 48240
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gctgagcgtg gccaaccgct ggctcgagac ggacctgccg ctgggcgacg acgccaagga 48360
cgtggccgcg ctcagcgagg ccgagctcga gttctaccgc ttcctcttcg ccttcctctc 48420
cgccgcggac gacctcgtca acgtcaacct gggcagcctc tcggagctct tcacgcagaa 48480
ggacatcctg cactactaca tcgagcagga gtgcatcgag gtggtgcact cgcgcgtgta 48540
cagcgccatc cagctgatgc tgttccgcgg cgacgccgcg gcgcgcgagc gctacgtgcg 48600
cgcggcgctg cgggacgagg ccatccgccg caaggtggag tggctcgact cgcgcgtcgc 48660
cgagtgcgcc tccgtcgcgg aaaagtacct gctcatgatc ctcatcgagg gcatcttctt 48720
cgcctcctcg ttcgcctcca tctcgtacct ccgcacgcac aacctctttg tggtgacctg 48780
ccagtccaac gacttcatca gccgcgacga ggccatccac acctcggcct cgtgctgcat 48840
ctacaacaac tacctggggg acgccccgcg ccccgacgag gcccgcatcc accagctctt 48900
cgccgaggcg gtggagatcg agtgcgagtt tctgcgggcg cgcgccccgc gcgacagcct 48960
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ggccatcggc gcgagcccgc tctttgacgc gcccgccccc gcggcggact ttcccatggc 49080
gctgatggtc gccgagaaac acaccaactt tttcgagcgg cgcagcacca actacacggg 49140
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cggcaaaaca ctaataaagc gttgagacac tagcgcgcgc ctccggccgt catccttggg 49260
gcgagggtga gacgggaacg gggatgggag agtgggatgg ggaaatgggg gatgatgacg 49320
ggggaaggga gatggggccg gcgggggtgg acttggactg gggaaggatg gtggcggccg 49380
gcgcagagtg ggaggcggtg aggtggacgg aggggaggac cgatgtggga cggcggaggg 49440
acggcggagg gacggcggag ggacggcgga gggacggcgg agggacggcg acgacggaga 49500
gagaaggtgg gggagagggc gagcatcaca cgggccgcac aaccgaggat tttttcaagt 49560
ttttttattt tctcctatgg gcgttacagt cgtcccagta cgccacgagg acggcctggt 49620
agttcggggg cgggggtatg tgtttccaaa acaggcccgc cagctccttc gcccgcgtct 49680
cgttcttcac gtgccgcagc agcgagccaa agaccttgtt cacgtccgag ggctcctgca 49740
cgatggggac gcgccgcagc acgctcaggt gcccgtgccg cgccggcgtg agcatggcca 49800
ccacgtgctg gatgaactcg cgctcggcgc ggcgcgagcg cgcgtccccg gccgccggca 49860
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cgttcccgaa gatgccgcgg tccgagacga agatggggaa gtaggtgcgc ttgtgcagca 50460
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cgccgccctc ggtctcgcgc aggaagcccc cgcggaacaa caaccggacg cgcgtccacg 53460
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gctggggggc gtacatcggc gggtacagcg ccccggctgc gtggtgcggg tgcgggtgtc 55320
ccacgacggc cccgggtggc agcagctgct gcggcggcgc cgcgggcgcg tagtacggcg 55380
tcgggtagcg gagctgctgg gcgcgcaggt ggctgatctc gcgctggagc gacgagacca 55440
cggcggcgag gtcgctcgcg gggggcggcg cctccccggg gtagtacgcg ttgtcctggg 55500
cgtagtcgtc gtagcggcgc ttcctggcgg ggggccgggg ctcgggcgag ggcgagcggc 55560
ggtggcggcg gtccatggcg gccgagacga tggcgccgag ctgggactcc aggctgggcg 55620
ccgggcgctg gttgaccacc agctggttgt actgcgccgc gggcacgaag atgtagtcgc 55680
cgggcgctgc gctcggcggg gctgccatgg ccgcactggg cccgggcgcc ggggaggccc 55740
cgcttttagg cagaagcccc gcccacatcg tcgcctgcag gtaggtgtgt ccgcgcacgc 55800
cggcctcgcg gcggcgcgcc gcgaccagct cccagcggtc gcgcagcagc atgttgttca 55860
cggccgtcga gagcagcgcg cgcgtgagcg cctcctcgct catgtgccac acgcgctcgc 55920
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gcccgatcac gcagagcgcc acgtgcgcaa agagcgtctc gtcgggggcc tcgccgggcg 56100
ccaggcgccg cgaggacagg gacgccgagg gcaggtagtt gctcagcagg tacagcagcc 56160
gctcctcgtc cgagagccgc atgtccccga agaagtccgg gcccacggcg cgggcgagca 56220
cggcccccag ctgcgggcag ttgacgacgc cgaggaagaa ggggccgcgg tcgtcgtcga 56280
ccacggccag cacggcgccg atgtcgcagc gcgggcggtg gtcgatgttg atgggcagcg 56340
ggcccgccgg gggcagcgcg gcggccacga tctcgcgcgt cagcgcgagc tccccgccgt 56400
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tacaggaggt cgtagtcgct ggagacgcca aactgcccga ggcgcttgtc cgccgcgttg 56580
cgcaggtgcg gctgctgcag cagcaggccc agcccctcct cgtactgcac ggccacggcg 56640
tcgtgcgccg cgatgacctc gttgacgggg gccgtcacgc gctggcggtt ctgcagctcc 56700
agcgccacca ggcgcaccag gttgagctgg tggcgctgca cgcgcgcgcg gatcgagtgc 56760
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cgcagcagca gcaggcccgt gatggtgttc accgtggcgc gcagcagcgg cgcgtcctcg 57060
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ctcagcgcgt ccaggtactc ggggacccgc tccagcaggt ccgcgatgcc cagcggggcg 57360
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gcgctctcga gcgccgagta gtgccggttg cccacgtaca gacgcccgca ggcctgcagc 57480
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atgaagtggc gcgcgctgcc cgggatcgca gcggcctcga aggcgaacca cgcgcggtcc 58080
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ccgcccgaga tgacggtcgt ctttgaccgc cacccggtgg ccgcgacggt gtgcttcccg 59040
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gacgacggcg tgggaggggg ctcggggcgc gtataaagcc atgtgtatgt catcccaata 59760
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accctgttcg tcctggacgg cgacggctcc gcgtggttcg tcttccagct cggcgggctg 60000
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cgccggcgcc cggactgcgg cccggcgtac acgctcggcg gcgtggacat cgccaacccg 61380
ctcgtgctcg ccctcgtcag caacgacagc gccgcgtgcg actacacgga ccgcatgccc 61440
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ttcgtgcgct actcctccgc gggcacgatc ctggagaccg tcctcatcga gtccaaggac 61560
atggaggagc agctcatggc cggcgccaac tccaccatcc ccagcttcaa cccgacgctg 61620
cacggcggcg acgtcaaggc cctgatgctc ttccccaacg gcaccgtggt cgacctgctg 61680
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cacagccctc tctcccacag ccctctctcc cacagccctc tctcccacag ccctctctcc 62340
cacagccctc tctcccacag ccagactccc gcctcccccg tccccgatcg ccgaacgcct 62400
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gtggcgccgg acgcgggcat ggccacggtg gccacgcggg acatgcgcac gcacgacggc 68580
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aactacgacg tgctcgtcgt cgacgaggtc atgtccacgc tcgggcagct ctactcgccc 81480
accatggcgc ggctggcccg cgtggacgcc ctgctcgcgc ggctgctgcg cggctgcccg 81540
cgggtcctcg tcatggacgc cacgatcaac gcgcagctcg tggagctgct cgtggagctg 81600
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ccacgtgccg gggggcgggg caactggagc gtggcgaagc ggaacggggc gcgatggggc 94500
gcatcgaggc gcggacgcgt cccgggggag tcggggggga gtcggggggg agtcgggggg 94560
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cctgacccgg cggcggcccg ggctgacgga cgccgacgcc ctggacgtga tcgtcgccgg 120900
gatcccggcc acccgcgcca tgttcgcgcg ggtccacaac cgctcctggc gccacgccgg 120960
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aggcgggcgc ggcaacggac gcgagcgcgc cccgcgatgt accatctcct agacggcagg 121080
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cgggcccgct ccggaccccg ctcccgcgct gctgtcctcc tcctcctcct ccgaggacga 133920
ccggctccgg cgcccgctcg ggcccatgcc cgagcacccc gcgcccgacg gcggcttccg 133980
ccgcgtcccg gccggcgaga cccacacgcc gcggccctcc gaggcggccc tcgccgccta 134040
ctgcccgccc gaggtggccc gcgccctcgt ggaccaggag gtcttccccg aactctggcg 134100
cccggcgctc accttcgacc cggccgccct ggcgcacatc gccgcgcgcc gcggggccgc 134160
gggcgccccg ctccgccgcc gcgccgcctg gatgcggcag atagccgacc ccgaggacgt 134220
gcgcgtggtg gtgctctacg acccgctgcc ccacgaggag ctctgcgccg agcccgccga 134280
gggcgccccg cgcccggcct gggacccgcg ccgcggcggc ctctcggcgc tgctcgccgc 134340
cttcgcccac cgcctctgca cgccggactc gcacgcctgg gccgggaact ggaccgggcg 134400
ccccgacatc ggccgcctca acgcccaggg ggtgctgctg ctctcggcgc gggacctcgg 134460
cttcgccggc gccgtggagt acctctgctc gcggctcggc gcggcgcggc gccggctcat 134520
cgtgctggac accatcgagg actggcccgc ggacggcccg gccgtggggg actaccacgt 134580
ctacgtccgc gcccgcctgg acccggccgc ccagtgcgcc gtgcgctggc ccgggtgccg 134640
cgagctccgc gcggccgtgc tggactctag ctccatcgtg ggcccggcct gcttcgcccg 134700
cgcggaggcc tccttcgccc gcctgcaccc cggggccgag ccgctgcgcc tctgccgcca 134760
ggacaacgtg cgctacacgg tgagcacccg cgccgggccc cggaccccgg tcccgctgcc 134820
gccgcgcgcc taccgccagc gcgtgctccc caccgtggac ggctgcaagg acatggcccg 134880
ccagcgctcc gcgctcgggc tcggggaccc ggactttgac gcgggcgccg ccttcgggca 134940
ccgcgcggcc aaccgctggg ggctcggcgc cccgctgcgg cccgtcttcg tctcctgcgg 135000
ccgccggggc ctcgccgagc tccgcggccc cgagggcctg ccggccgagc tgcgcgcctt 135060
ctgcgccgcg gcgctgctgg agcccgacgc cgaggccgcc ccgctggtgc tgaccccggg 135120
cgccgtcgcc gccgcgggcg ccccgccggc cgtgctctgg gactttgcgc ccttcgagac 135180
cagcgtccgc gccgccgccg ggggcgccgt ggagacccgc cggcccgcgg gggcctcggg 135240
cgccggggcc ggccccggcg aggacgggga ctctgtggag atcgtcggcg tccgcggcgg 135300
cgacggccgg ccccgcggcc cgctcgggcc catcaaggtg gaggccatct cggacgacga 135360
ggaggccgag gacgccggca acccctacct gctgctccgc tgagcggggc gccccctcgg 135420
cccggccgga ctctgactct gactctccgg cccctccgcc ggctcctcga ggcccttctc 135480
ctccgtcttc tctcccctcg ccctcggccc ggtcctcgtc ctcgtccccg tcctcctcct 135540
cctctgcgtc cgcggcggcg gcctcggtcc cctcggcccg gcggcgcttg cctccccggc 135600
gcctgcctcc ccggcccggt ggccctcctc ctcctcctct ccttctcctc cgcgcggatc 135660
ccccggccgg aggtggctgc ggcggcggcg gaggtggcgg cggtggtgga agcggcggcg 135720
gcggccgcgg cggagggctc ggcggcggag gatcgtcccg gtccccttct cctcctcctc 135780
ccgcggtccc ccggtcccct tctcctcctt ctcccatcgg gtgagaaaag agtttatttt 135840
cagagcgaga aaataaagtt tgtgctgtat tttctgaacc ggctcgagtc tctgagattt 135900
tttggggaga tggaggcggc catcttggcg gtggtctctg gggtggaggt ggtcttgtgg 135960
atgggggtcc ctggtgggag gaagaagaag aggtggaggg tcttggtgag ggtgacgggg 136020
gtcctcctcc tggagggtct tggtggtggt ggtggtggtg ggaagaagtg gatgggggtc 136080
ctcctcctgg agggtcttgg tggtggtggg tcttagcaga tgggggtccc tggtgggtct 136140
tagcagatgg gggccctcct cccggagggt cttggtggga agaagtagag ggtcttgggg 136200
atgttggggg tccttgatgg tggtggtggg aggtggacgg cgttggtggt cccggcgggt 136260
cctggtggga ggtagatggt cccgagggtc ccggtggtcc cgggcgggag ttggacgatg 136320
gtggtcctgc ggtggtcgag gggggtgggg ggaaagagag aaagagagaa aaaaacacgg 136380
tggtggtcag tacagggaac tgccgttgca accatcgccc cctggtggtg atagtagtaa 136440
agcgtgtgcg tgaggggggg gggggggggt ggtggtgttg ttggtggtgg tggtcccggg 136500
tggtcgtcgt ggaggggcgg gaaaggcggt gggagagcgg gcggaacagg ttcatctggc 136560
ttccgtcttc cgtccccact cccagcctcc cccgctgcca ccgattggcc ggcgggacga 136620
tgacgacggc gaccgcgtgg cgcgagggga gccaatgggg cgggcgccgc ggagcggaag 136680
cccccgcccg cggacccccg gtgcgacgga aggggcaggc tcggcgcgcc gatgcgatcc 136740
gcggagcccg ccccggccgc gccccggaag ccggcgtcac gtccggggga agcggaaggg 136800
gccggcgcga tatgcagatg agatccgtgg gggccggcgt cacgtccggc ggaagttgcg 136860
cgcgggaagc ggtcatacgc aaatgaggcg gaagtcgtca tcggcaaaaa cgtcacgtcc 136920
gggaagcggt catatgcaaa tggggggggg aggagcccgg cgtcacgtcc gggggaagcg 136980
gtcatattta aatggggggg gaggggccag agcgtcactt ccggaggaag ttgtcatatg 137040
cagattaggg ggaggggtta tgcagattag ggggaggggt tatgcagatt agggggaggg 137100
gttatgcaga ttagggggag gggttatgca gattaggggg aggggttatg cagattaggg 137160
ggcggggcta tgcaaatgta tgcaaatgag ggggtggggt tatgcagatc agggggaggg 137220
gttatgcaaa tgcatgcaaa tgagggggag gggccatgct aatttatgca aatgaggggg 137280
cggggctatg caaatgtatg caaatttatg caaattagcc cccccccttt aagccccgcc 137340
cccttttttc gcggcccccg gggagcgggg gggtggg 137377

Claims (28)

1.野生型伪狂犬病毒(PRV)或经修饰的PRV或一种核酸分子用于制备在受试者中抑制肿瘤复发的药物的用途,其中,所述肿瘤是肝癌,所述经修饰的PRV的基因组与野生型PRV相比仅包含下述修饰:EP0基因包含功能丧失性突变或者被缺失或者被置换为外源核酸;其中,所述核酸分子的核苷酸序列包含选自下列的序列:
(1)野生型PRV或经修饰的PRV的基因组序列或cDNA序列;
(2)所述cDNA序列的互补序列。
2.权利要求1所述的用途,其中,所述野生型PRV是从感染伪狂犬病毒(PRV)的动物体内分离得到的毒株。
3.权利要求1所述的用途,其中,所述野生型PRV的基因组序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的用途,其中,所述外源核酸的核苷酸序列为编码外源蛋白的核苷酸序列。
5.权利要求4所述的用途,其中,所述外源蛋白是荧光蛋白。
6.权利要求1所述的用途,其中,所述功能丧失性突变选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合。
7.权利要求1所述的用途,其中,所述经修饰的PRV的基因组序列如SEQ ID NO:4所示。
8.权利要求1-7任一项所述的用途,其中,所述药物包括所述野生型PRV以及经修饰的PRV中的一种或数种。
9.权利要求1-7任一项所述的用途,其中,所述核酸分子的核苷酸序列为所述野生型PRV或经修饰的PRV的基因组序列。
10.权利要求9所述的用途,其中,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或4所示。
11.权利要求1-7任一项所述的用途,其中,所述核酸分子为包含所述野生型PRV或经修饰的PRV的cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的载体。
12.权利要求11所述的用途,其中,所述载体是克隆载体或表达载体。
13.权利要求1-7任一项所述的用途,其中,所述药物包含治疗有效量的所述野生型PRV和/或经修饰的PRV,或治疗有效量的所述核酸分子。
14.经修饰的伪狂犬病毒(PRV)或一种核酸分子用于制备在受试者中治疗肿瘤的药物的用途;其中,所述经修饰的PRV的基因组与野生型PRV相比仅包含下述修饰:EP0基因包含功能丧失性突变或者被缺失或者被置换为外源核酸,并且,所述核酸分子的核苷酸序列包含选自下列的序列:
(1)所述经修饰的PRV的基因组序列或cDNA序列;
(2)所述cDNA序列的互补序列;
其中,所述肿瘤选自神经胶质瘤、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、鼻咽癌和喉癌。
15.权利要求14所述的用途,其中,所述外源核酸的核苷酸序列为编码外源蛋白的核苷酸序列。
16.权利要求15所述的用途,其中,所述外源蛋白是荧光蛋白。
17.权利要求14所述的用途,其中,所述功能丧失性突变选自错义突变、无义突变、移码突变、碱基缺失、碱基置换、碱基添加、以及其任何组合。
18.权利要求14所述的用途,其中,所述经修饰的PRV的基因组序列如SEQ ID NO:4所示。
19.权利要求14所述的用途,其中,所述药物包括所述经修饰的PRV中的一种或数种。
20.权利要求14所述的用途,其中,所述核酸分子的核苷酸序列为所述经修饰的PRV的基因组序列。
21.权利要求20所述的用途,其中,所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
22.权利要求14所述的用途,其中,所述核酸分子为包含所述经修饰的PRV的cDNA序列,或所述cDNA序列的互补序列的载体。
23.权利要求22所述的用途,其中,所述载体是克隆载体或表达载体。
24.权利要求14所述的用途,其中,所述药物包含治疗有效量的所述经修饰的PRV,或治疗有效量的所述核酸分子。
25.权利要求1或14所述的用途,其中,所述药物还包含具有抗肿瘤活性的另外的药学活性剂。
26.权利要求25所述的用途,其中,所述另外的药学活性剂选自另外的溶瘤病毒、化学治疗剂或免疫治疗剂。
27.权利要求26所述的用途,其具备以下特征中的一项或多项:
(i)所述另外的溶瘤病毒选自腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒或其任意组合;
(ii)所述化学治疗剂选自5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类、依托泊苷、铂类化合物、紫杉烷类或其任意组合;
(iii)所述免疫治疗剂选自免疫检查点抑制剂、肿瘤特异性靶向抗体或其任意组合。
28.权利要求1或14所述的用途,其中,所述受试者为人。
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Evaluation of pseudorabies virus as a gene transfer vector and an oncolytic agent for human tumor cells;Boldogkoi, Z. et al.;《Anticancer research》;20020731;第22卷(第4期);第2153页摘要,材料与方法,第2158页左栏倒数第2段,右栏倒数第1段 *
伪狂犬病毒VP22蛋白缺失突变体的构建及其功能研究;姚琳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)农业科技辑》;20070215(第2期);D050-138 *

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