CN114796479A - 一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂及其制备方法和应用，属于生物制品类动物疫苗技术领域。提供的水包油包水佐剂的原料按质量百分比计包括：75wt％‑85wt％的注射用油、1wt％‑5wt％的精制司本‑80和10wt％‑24wt％的精制吐温‑80，还可包括1wt％‑3wt％的免疫刺激复合物。利用本发明提供的水包油包水佐剂制备的疫苗质量稳定、安全性高，且能够诱导机体产生持续期更长以及更高效的免疫反应，因此可用作畜类动物疫苗等的安全有效的佐剂。

Description

一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于兽用疫苗技术领域，具体涉及一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
免疫佐剂是指先于抗原或与抗原同时注射于动物体内，能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的成分。目前，在兽用疫苗中被广泛应用和研究的免疫佐剂主要包括无机佐剂，如氢氧化铝、明矾等；有机佐剂、微生物及其产物，如分枝杆菌、脂多糖、胞壁酞二肤、胞肤、脂溶性蜡质、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、内毒素等；合成佐剂，如左旋咪哩、左旋咪唑和脂质体等；油佐剂，如弗氏佐剂、矿物油、花生油乳剂、动物油佐剂等。在众多免疫佐剂中，油佐剂(例如矿物油)是兽用疫苗尤其是畜苗和禽苗中应用最多的佐剂。以油佐剂为免疫佐剂的疫苗在制备过程中通过乳化过程将抗原包覆于油滴中，油滴可以发挥抗原储库的作用，在注射部位持续释放抗原，防止抗原从注射部位的快速清除，因此油佐剂能诱导持续的免疫应答水平。
动物疫苗制备中常用的油佐剂可以分为三种剂型：油包水(W/O)型、水包油(O/W)型和水包油包水(W/O/W)型。其中，水包油包水(W/O/W)型佐剂由于其黏度小、易于乳化、安全有效更为广泛应用。
水包油包水(W/O/W)型佐剂是畜类动物灭活疫苗中的一种重要成分，每头份成品疫苗中约含佐剂1毫升，约占成品疫苗量的50％，在疫苗的持续免疫应答中发挥重要作用。然而，现有的由水包油包水(W/O/W)型佐剂制备的灭活疫苗仍有各方面的不足，主要体现在制备疫苗的质量稳定性、安全性较差以及免疫持续期较短，且免疫效力不足，在复杂的饲养环境中经常出现因机体个体差异的原因发病或死亡。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂，其由原料制备得到，所述原料按照重量百分比计包括：75wt％-85wt％的注射用油、1wt％-5wt％的精制司本-80和10wt％-24wt％的精制吐温-80；其中：
所述精制司本-80为通过以下方式对司本-80进行处理获得的产物：
1)使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物；
2)去除所述第一处理产物中未反应的H2O2，得到第二处理产物；
3)对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80；
所述精制吐温-80为通过以下方式对吐温-80进行处理获得的产物：
(1)使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物；
(2)去除所述第三处理产物中未反应的H2O2，得到第四处理产物；
(3)对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。
在一些实施方式中，所述原料按照重量百分比计包括：80wt％-85wt％的注射用油、2wt％-3wt％的精制司本-80、12wt％-18wt％的精制吐温-80。
在一些实施方式中，步骤3)和步骤(3)中所述过滤为首先使用过滤孔径为0.40μm-0.65μm的过滤装置进行粗滤，滤液再使用过滤孔径为0.10μm-0.22μm的过滤装置进行精滤。
在一些实施方式中，所述注射用油包括注射用矿物油、注射用植物油、或其组合；
可选地，所述注射用矿物油包括白油；
进一步可选地，所述白油包括Marcol-52白油、Primol 352白油、Total130#白油、Total150#白油、Total170#白油、Drakeol-5白油、Drakeol-7白油和Sonneborn 4#白油、Sonneborn 10#白油PARACOS KF40、PARACOS KF50、角鲨烯、角鲨烷。
在一些实施方式中，所述原料按重量百分比计还包括1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，所述免疫刺激复合物包括质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷。
本发明另一方面还提供一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1：将按照重量百分比计为75wt％-85wt％的注射用油加热至30℃-40℃；
S2：将按照重量百分比计为1wt％-5wt％的精制司本-80和10wt％-24wt％的精制吐温-80加入步骤S1中加热后的注射用油中，混匀后经过滤处理得到所述畜类动物疫苗用水包油包水佐剂；其中：
所述精制司本-80为通过以下方式对司本-80进行处理获得：
1)使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物；
2)去除所述第一处理产物中未反应的H2O2(例如通过抽真空脱水方式)，得到第二处理产物；
3)对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80；
所述精制吐温-80为通过以下方式对吐温-80进行处理获得：
(1)使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物；
(2)去除所述第三处理产物中未反应的H2O2(例如通过抽真空脱水方式)，得到第四处理产物；
(3)对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。
在一些实施方式中，步骤3)和步骤(3)中所述过滤为首先使用过滤孔径为0.40μm-0.65μm的过滤装置进行粗滤，滤液再使用过滤孔径为0.10μm-0.22μm的过滤装置进行精滤。
在一些实施方式中，在步骤S2中还向所述加热后的注射用油中加入按照重量百分比计为1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，所述免疫刺激复合物包括质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷。
在一些实施方式中，所述免疫刺激复合物的制备方式包括以下步骤：
T1：将质量百分比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷组成的混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液；可选地，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为20:60:20的氯仿、甲醇和超纯水组成；
T2：去除步骤T1获得的类脂的有机溶液中的有机溶剂，得到固形物；
T3：用PBS溶液溶解步骤T2得到的固形物，得到第一混合溶液；
T4：对步骤T3得到的第一混合溶液进行超声处理，得到第二混合溶液；
T5：对步骤T4得到的第二混合溶液进行过滤处理，得到所述免疫刺激复合物。
在一些实施方式中，步骤T4中所述超声处理的条件包括：温度为20-30℃，功率为50-70W，总超声处理的时间为5-15min，超声方式为：超声10s，暂停10s。
本发明再一方面还提供一种畜类动物疫苗，其包含上述的畜类动物疫苗用水包油包水佐剂。
基于以上技术方案提供的畜类动物疫苗用水包油包水佐剂的原料中使用了精制司本-80和精制吐温-80，还可进一步使用免疫刺激复合物，使得利用本发明提供的水包油包水佐剂制备得到的疫苗产品质量稳定、安全性高，且令人惊讶的是还能够诱发机体产生持续期更长(例如使用其制备得到的口蹄疫O型灭活疫苗对仔猪的免疫保护期可长达150天以上)以及更高效(例如使用其制备得到的口蹄疫O型灭活疫苗免疫仔猪后抗体效价最高可达到1:2880)的特异性免疫反应。因此，本发明提供的水包油包水佐剂可有助于开发稳定性和安全性更好，且免疫持续期更长以及免疫效果更好的畜类动物疫苗产品。
附图说明
图1为实施例1制得的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图。
具体实施方式
针对由现有的水包油包水型佐剂制备的疫苗可能存在稳定性、安全性较差以及免疫持续期较短和免疫效力不足等缺陷，本发明旨在提供一种畜类动物疫苗用水包油包水型佐剂，将其用于制备疫苗时，能够有效提高疫苗的质量稳定性、安全性，且能够有效提高疫苗的免疫持续期，并增强机体对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平。本发明还提供了该水包油包水型佐剂的制备方法。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。文中“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等适用于区分类似的对象，不作为特定顺序或先后次序的限定，也不作为对象个数的限定。
在本发明的第一方面，提供一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂，其原料按照重量百分比计可包括：75wt％-85wt％的注射用油、1wt％-5wt％的精制司本-80和10wt％-24wt％的精制吐温-80；其中：
所述精制司本-80可为通过以下方式对司本-80进行处理获得的产物，其中司本-80可为商售获得，也可以按照常规的司本-80制备方法获得：
1)使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物。该步骤具体可包括以下操作：称取司本-80投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700mmHg，釜内压力0.15-0.25MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内司本-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15min；
2)除去所述第一处理产物中未反应的H2O2(例如可通过抽真空脱水的方式)，得到第二处理产物。该步骤具体可包括以下操作：待反应釜内司本-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时，将反应釜升温至110±5℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3-5min；
3)对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80。该步骤具体可包括以下操作：停止步骤2)的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第二处理产物从反应釜中出料；出料连接0.40μm-0.65μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.10μm-0.22μm滤膜过滤除菌得到精制司本-80。
所述精制吐温-80可为通过以下方式对吐温-80进行处理获得的产物，其中吐温-80可为商售获得，也可以按照常规的吐温-80制备方法获得：
(1)使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物。该步骤具体可包括以下操作：称取吐温-80投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700mmHg，釜内压力0.15-0.25MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内吐温-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15min；
(2)除去所述第三处理产物中未反应的H2O2(例如可通过抽真空脱水的方式)，得到第四处理产物。该步骤具体可包括以下操作：待反应釜内吐温-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时，将反应釜升温至110±5℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3-5min；
(3)对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。该步骤具体可包括以下操作：停止步骤(2)的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第四处理物从反应釜中出料；出料连接0.40μm-0.65μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.10μm-0.22μm滤膜过滤除菌得到精制吐温-80。
在本发明中，相对于使用市售的未经处理的司本-80和/或吐温-80配制的疫苗佐剂以及ISA206佐剂，使用精制司本-80和精制吐温-80配制的疫苗佐剂能够有效提高制备得到的疫苗的质量稳定性、安全性，并能够进一步增强动物机体对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平。可能的原因是去除了由原料引入的多余的副产物及杂质，从而提升了疫苗的稳定性和安全性，并同时提升了疫苗的免疫效力。
在一些实施方式中，所述注射用油可包括注射用矿物油、注射用植物油、或其组合。
在一些实施方式中，所述注射用矿物油可包括白油。
在一些实施方式中，所述白油包括但不限于Marcol-52白油、Primol 352白油、Total130#白油、Total150#白油、Total170#白油、Drakeol-5白油、Drakeol-7白油和Sonneborn 4#白油、Sonneborn 10#白油PARACOS KF40、PARACOS KF50、角鲨烯、角鲨烷，这些组分可从任何商业来源获得。
在优选的实施方式中，疫苗佐剂的原料按照重量百分比计可包括：80wt％-85wt％的注射用油、2wt％-3wt％的精制司本-80、12wt％-18wt％的精制吐温-80；在这种情况下获得的水包油包水疫苗佐剂可进一步提供增强动物机体对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平。
由本发明提供的水包油包水佐剂制备的动物疫苗产品为水包油包水颗粒，该颗粒为水包油包水的三层结构：最外层为水相(即抗原)，中间层为油相(即本发明佐剂)，内层为水相(即抗原)。当疫苗注射入机体后，颗粒随动物体体温而破裂，释放其中的抗原物质，进而将抗原递呈给抗原递呈细胞，经抗原递呈细胞处理后递呈给T细胞，诱导机体产生特异性免疫反应。
在一些实施方式中，疫苗佐剂的原料按重量百分比计还可包括1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，所述免疫刺激复合物包括质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷。疫苗佐剂中进一步包括1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，可进一步增强机体对包含其的疫苗中抗原的特异性免疫应答水平。
当使用包含免疫刺激复合物的疫苗佐剂制备疫苗时，疫苗成品为含免疫刺激复合物的水包油包水颗粒，该颗粒为水包油包水的三层结构：最外层为水相(即抗原和免疫刺激复合物的结合体)，中间层为油相(即本发明佐剂)，内层为水相(即抗原和免疫刺激复合物的结合体)。当该疫苗注射入机体后，颗粒随动物体体温而破裂，释放由免疫刺激复合物结合的抗原物质，免疫刺激复合物是一种高效的免疫递呈系统，激活抗原递呈细胞，通过水包油包水佐剂在抗原注射部位产生各类炎性细胞，可以进一步提高抗原物质的摄入量。
在本发明的第二方面，提供一种疫苗佐剂的制备方法，其可包括以下步骤：
S1：将按照重量百分比计为75wt％-85wt％的注射用油加热至30℃-40℃；
S2：将按照重量百分比计为1wt％-5wt％的精制司本-80和10wt％-24wt％的精制吐温-80加入步骤S1中加热后的注射用油中，混匀后经过滤处理得到疫苗佐剂；其中：
所述精制司本-80和精制吐温-80均可为按照本发明的第一方面中描述的处理方法获得。
在一些实施方式中，在步骤S2中还可向所述加热后的注射用油中加入按照重量百分比计为1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，所述免疫刺激复合物包括质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷。
在一些实施方式中，所述免疫刺激复合物的制备方式包括以下步骤：
T1：将质量百分比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷组成的混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液；可选地，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为20:60:20的氯仿、甲醇和超纯水组成；
T2：去除步骤T1获得的类脂的有机溶液中的有机溶剂，得到固形物；
T3：用PBS溶液溶解步骤T2得到的固形物，得到第一混合溶液；
T4：对步骤T3得到的第一混合溶液进行超声处理，得到第二混合溶液；
T5：对步骤T4得到的第二混合溶液进行过滤处理，得到所述免疫刺激复合物。
在优选的实施方式中，步骤T4中所述超声处理的条件包括：温度为20-30℃，功率为50-70W，总超声处理的时间为5-15min，超声方式为：超声10s，暂停10s。
实施例
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1：
该实施例制备一种水包油包水型佐剂作为疫苗佐剂，并利用该疫苗佐剂和口蹄疫O型全病毒灭活抗原MYA98株(由金宇保灵生物药品有限公司提供)按照质量1:1配制成口蹄疫O型灭活疫苗。
1.1、疫苗佐剂的制备方法包括以下步骤：
S1：将按照重量百分比计为80wt％的Marcol-52白油加热至35℃；
S2：将按照重量百分比计为3wt％的精制司本-80和17wt％的精制吐温-80加入步骤S1中加热后的注射用油中，混匀后经过滤处理(例如用0.22μm滤膜过滤)得到疫苗佐剂。其中：
步骤S2中所述精制司本-80通过以下方式获得：
1)称取司本-80(购自广州俏灵儿生物科技有限公司)，投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700mmHg，釜内压力0.2MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内司本-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15min。
2)待反应釜内司本-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时(得到第一处理产物)，将反应釜升温至110℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3min，得到第二处理产物。
3)停止步骤2)的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第二处理产物从反应釜中出料。出料连接0.45μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.22μm滤膜过滤除菌得到精制司本-80。
步骤S2中所述精制吐温-80通过以下方式获得：
(1)称取吐温-80(购自广州俏灵儿生物科技有限公司)，投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700mmHg，釜内压力0.2MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内吐温-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15min。
(2)待反应釜内吐温-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时(得到第三处理产物)，将反应釜升温至110℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3min(得到第四处理产物)。
(3)停止步骤(2)的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第四处理产物从反应釜中出料。出料连接0.45μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.22μm滤膜过滤除菌得到精制吐温-80。
1.2、口蹄疫O型灭活疫苗的配制方法包括以下步骤：
将疫苗佐剂与口蹄疫O型灭活疫苗按照1:1的质量比混合，在30-32℃，600rpm/min下乳化15分钟，制备成口蹄疫O型灭活疫苗。如图1所示，示出了该实施例1获得的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.100-0.500μm。
实施例2-3
实施例2-3按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，具体地：
实施例2制备疫苗佐剂的原料为：75wt％的Marcol-52白油、1wt％的精制司本-80和24wt％的精制吐温-80。
实施例3制备疫苗佐剂的原料为：85wt％的Marcol-52白油、5wt％的精制司本-80和10wt％的精制吐温-80。
实施例4
实施例4按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型灭活疫苗，不同之处在于在步骤S2中还向加热后的注射用油中加入按照重量百分比计为2wt％的免疫刺激复合物，制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、3wt％的精制司本-80、15wt％的精制吐温-80和2wt％的免疫刺激复合物，其中免疫刺激复合物包括质量比为1:0.5:0.5:1的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷，该免疫刺激复合物的制备方法包括以下步骤：
T1.称取大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、ɑ-生育酚、皂苷，按质量分数1:0.5:0.5:1的比例制成混合物A。将所得混合物A与氯仿/甲醇溶剂以1:2的比例溶解得到类脂的有机溶液备用，制得混合物B，所述氯仿甲醇溶剂由体积比为20:60:20的氯仿、甲醇和超纯水组成。
T2.将步骤T1中的混合物B转移至250ml圆底烧杯中，将圆底烧瓶置于旋转蒸发仪上，在恒温水浴的条件下进行真空旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成固形物C，其中旋转蒸发温度为30-40℃，转速为80-150r/min，旋转蒸发时间为60-90min。
T3.步骤T2中有机溶剂旋蒸完全后，取下圆底烧瓶，用0.01mol/L的PBS液溶解固形物C，得到混合溶液D。
T4.将步骤T3中得到的混合溶液D在温度为20-30℃，功率为60W的条件下超声处理，得到混合溶液E，其中超声处理的条件为：超声10分钟，超声10s，暂停10s。
T5.将得到的混合溶液E用0.22μm滤膜过滤除菌，置于-70℃下密封保存，得到免疫刺激复合物。
比较例1-3
比较例1-3按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型灭活疫苗，不同之处在于制备疫苗佐剂使用的原料不同，具体地：
比较例1制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、3wt％的司本-80和17wt％的吐温-80。
比较例2制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、3wt％的精制司本-80(实施例1制备获得)和17wt％的吐温-80。
比较例3制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、3wt％的司本-80和17wt％的精制吐温-80(实施例1制备获得)。
比较例4
该比较例4将SEPPIC ISA206疫苗佐剂与口蹄疫O型灭活疫苗按照1:1的质量比混合，在30-32℃，600rpm/min下乳化15分钟，制备成口蹄疫O型灭活疫苗。
挑选28日龄抗体阴性的仔猪40头，分为8组，每组5头，作为试验组，按照5μg/头份抗原的量分别对各组仔猪注射(单点臀部肌肉注射)上述实施例1-4和比较例1-4制得的口蹄疫O型灭活疫苗，另挑选28日龄抗体阴性的仔猪5头作为空白对照组。分别于注射后第28天、60天、90天、120天、150天、180天，用液相阻断ELISA试剂盒(兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性)对各试验组仔猪测定抗体效价，并分别于注射前三天、注射后第1天、注射后第2天、注射后第3天，到注射后第14天的上午和下午监测各试验组和空白对照组仔猪的体温，同时观察各组仔猪的采食活动及注射后部位有无肿胀、结节、溃烂等情况并记录。各试验组仔猪的抗体效价测定结果如下表1所示，各组仔猪的体温监测结果如下表2所示。
表1：各组仔猪的抗体效价测定结果
Figure BDA0003676005910000091
Figure BDA0003676005910000101
表2：各组仔猪的体温监测结果(以各组仔猪监测体温的平均值计，单位℃)
Figure BDA0003676005910000102
由上表1所记载的结果可知，在抗原的免疫含量为5μg/头份的情况下，实施例1-4和比较例1-4的口蹄疫O型灭活疫苗在免疫后28天均能够引发仔猪对疫苗中抗原的特异性免疫反应，使得抗体效价大于1:180。然而，比较例1-3的口蹄疫O型灭活疫苗在免疫后的抗体效价水平整体偏低，最高仅达到1:720，并且在免疫后90天即出现抗体效价水平明显下降的情况，疫苗的持续期较短，且均匀度较差；比较例4为使用ISA206免疫佐剂制备的疫苗，虽然其相较比较例1-3的口蹄疫O型灭活疫苗在免疫保护效果上有一定的改善，抗体效价最高达到1:1024，在免疫后120天才出现抗体效价水平明显下降的情况，但其免疫保护效果仍有不足，且均匀度也较差；相对于比较例1-4的口蹄疫O型灭活疫苗，实施例1-4的口蹄疫O型灭活疫苗的免疫保护效果有显著的提升，其在免疫后的抗体效价最高可达到1:2880，并且在免疫后150天仍维持在较高的抗体效价水平，为1:360以上，表现出免疫持续期长的特点，并且还具有均匀度好(表现出疫苗质量稳定)的优点。结果证明，相对于比较例1-3中使用含有司本-80和/或吐温-80的疫苗佐剂制备的疫苗，以及比较例4中使用ISA206免疫佐剂制备的疫苗，本发明的实施例1-4中使用含有精制司本-80和精制吐温-80的疫苗佐剂制备的疫苗产品更能增强仔猪对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平，并且免疫持续期长，且均匀度好。
另外，相对于实施例1-3，实施例4中使用进一步含有免疫刺激复合物的疫苗佐剂制备的疫苗产品可以进一步增强仔猪对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平，其在免疫后的抗体效价最高可达到1:2880，并且在免疫后180天仍维持在较高的水平，为1:360以上。
由上表2所记载的结果可知，比较例1-3的口蹄疫O型灭活疫苗免疫仔猪后1-4天体温升高明显，且时间长，注射部位有轻微的肿胀，伴有采食活动下降的症状；比较例4的口蹄疫O型灭活疫苗免疫仔猪后第一天有短暂轻微体温升高，第二天即恢复正常，无其他不良反应；实施例1-4的口蹄疫O型灭活疫苗免后体温基本趋于正常，无明显的升高，未出现疫苗引起的局部或全身不良反应，注射部位正常。因此，相对于比较例1-4的口蹄疫O型灭活疫苗，实施例1-4的口蹄疫O型灭活疫苗具有更高的安全性。
实施例5-6
实施例5-6按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，具体地：
实施例5制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、2wt％的精制司本-80和18wt％的精制吐温-80。
实施例6制备疫苗佐剂的原料为：85wt％的Marcol-52白油、3wt％的精制司本-80和12wt％的精制吐温-80。
实施例7-8
实施例7-8按照实施例4的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，具体地：
实施例7制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、4wt％的精制司本-80、15wt％的精制吐温-80和1wt％的免疫刺激复合物。
实施例8制备疫苗佐剂的原料为：80wt％的Marcol-52白油、3wt％的精制司本-80、14wt％的精制吐温-80和3wt％的免疫刺激复合物。
挑选28日龄抗体阴性的仔猪12头，分为4组，每组3头，作为试验组，按照5μg/头份抗原的量分别对各组仔猪注射(单点臀部肌肉注射)上述实施例5-8制得的口蹄疫O型灭活疫苗，分别于注射后第28天、60天、90天、120天、150天、180天，用液相阻断ELISA试剂盒(兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性)对各试验组仔猪测定抗体效价。各试验组仔猪的抗体效价测定结果如下表3所示。
表3：各组仔猪的抗体效价测定结果
Figure BDA0003676005910000121
由上表3所记载的结果可知，在抗原的免疫含量为5μg/头份的情况下，实施例5-8的口蹄疫O型灭活疫苗在免疫后28天均能够引发仔猪对疫苗中抗原的显著的特异性免疫反应，在免疫后的抗体效价最高可达到1:2880，并且在免疫后150天仍维持在较高的抗体效价水平，为1:360以上，表现出免疫持续期长的特点，并且还具有均匀度好的优点。另外，相对于实施例5-6，实施例7-8中使用进一步含有免疫刺激复合物的疫苗佐剂制备的疫苗产品可以进一步增强仔猪对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平，其在免疫后的抗体效价最高可达到1:2880，并且在免疫后180天仍基本上维持在较高的水平。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂，其由原料制备得到，所述原料按照重量百分比计包括：75wt％-85wt％的注射用油、1wt％-5wt％的精制司本-80和10wt％-24wt％的精制吐温-80；其中：
所述精制司本-80为通过以下方式对司本-80进行处理获得的产物：
1)使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物；
2)去除所述第一处理产物中未反应的H2O2，得到第二处理产物；
3)对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80；
所述精制吐温-80为通过以下方式对吐温-80进行处理获得的产物：
(1)使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物；
(2)去除所述第三处理产物中未反应的H2O2，得到第四处理产物；
(3)对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。
2.根据权利要求1所述的畜类动物疫苗用水包油包水佐剂，所述原料按照重量百分比计包括：80wt％-85wt％的注射用油、2wt％-3wt％的精制司本-80、12wt％-18wt％的精制吐温-80。
3.根据权利要求1或2所述的畜类动物疫苗用水包油包水佐剂，其中所述注射用油包括注射用矿物油、注射用植物油、或其组合；
可选地，所述注射用矿物油包括白油；
进一步可选地，所述白油包括Marcol-52白油、Primol 352白油、Total130#白油、Total150#白油、Total170#白油、Drakeol-5白油、Drakeol-7白油和Sonneborn 4#白油、Sonneborn 10#白油PARACOS KF40、PARACOS KF50、角鲨烯、角鲨烷。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的畜类动物疫苗用水包油包水佐剂，所述原料按重量百分比计还包括1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，所述免疫刺激复合物包括质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷。
5.一种畜类动物疫苗用水包油包水佐剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1：将按照重量百分比计为75wt％-85wt％的注射用油加热至30℃-40℃；
S2：将按照重量百分比计为1wt％-5wt％的精制司本-80和10wt％-24wt％的精制吐温-80加入步骤S1中加热后的注射用油中，混匀后经过滤处理得到所述畜类动物疫苗用水包油包水佐剂；其中：
所述精制司本-80为通过以下方式对司本-80进行处理获得：
1)使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物；
2)去除所述第一处理产物中未反应的H2O2，得到第二处理产物；
3)对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80；
所述精制吐温-80为通过以下方式对吐温-80进行处理获得：
(1)使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物；
(2)去除所述第三处理产物中未反应的H2O2，得到第四处理产物；
(3)对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中步骤3)和步骤(3)中所述过滤为首先使用过滤孔径为0.40μm-0.65μm的过滤装置进行粗滤，滤液再使用过滤孔径为0.10μm-0.22μm的过滤装置进行精滤。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其中在步骤S2中还向所述加热后的注射用油中加入按照重量百分比计为1wt％-3wt％的免疫刺激复合物，所述免疫刺激复合物包括质量比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述免疫刺激复合物的制备方式包括以下步骤：
T1：将质量百分比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2):(0.5-3)的磷脂、胆固醇、生育酚和皂苷组成的混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液；可选地，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为20:60:20的氯仿、甲醇和超纯水组成；
T2：去除步骤T1获得的类脂的有机溶液中的有机溶剂，得到固形物；
T3：用PBS溶液溶解步骤T2得到的固形物，得到第一混合溶液；
T4：对步骤T3得到的第一混合溶液进行超声处理，得到第二混合溶液；
T5：对步骤T4得到的第二混合溶液进行过滤处理，得到所述免疫刺激复合物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中步骤T4中所述超声处理的条件包括：温度为20-30℃，功率为50-70W，总超声处理的时间为5-15min，超声方式为：超声10s，暂停10s。
10.一种畜类动物疫苗，其包含权利要求1-4中任一项所述的畜类动物疫苗用水包油包水佐剂。
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