CN104162159B - 一种抗犬细小病毒组合物、冻干粉、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗犬细小病毒组合物、冻干粉、制备方法及应用，属于兽用饲料添加剂技术领域。该组合物由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95～97份，抗犬细小病毒转移因子1～5份。该冻干粉由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95～97份，抗犬细小病毒转移因子1～2份，灭活剂0.2～0.3份，防腐剂0.01～0.02份，耐热冻干保护剂2.05～3.6份；具有降低保存条件，延长保存时间，抗体效价高、生物活性良好等优点，抗犬细小病毒转移因子与抗犬细小病毒卵黄抗体配合使用具有防治犬细小病毒病的功效，能提高犬的免疫力和成活率，使用方便且成本低。

Description

一种抗犬细小病毒组合物、冻干粉、制备方法及应用

技术领域

本发明具体涉及一种饲料添加剂用抗犬细小病毒组合物，以及抗犬细小病毒冻干粉，同时还涉及该冻干粉的制备方法及应用，属于兽用饲料添加剂技术领域。

背景技术

养犬是近几年在我国发展比较快的，随着人们生活水平的提高，对于精神上的追求更上一层，犬是人类的伙伴，也是人们对宠物需求最多的一类动物，但是随着的养犬业的发展，随之而来的犬细小病毒病也在逐步上升。

犬细小病是由犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)引起的病毒性疾病。1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的犬细小病毒。从发现该病毒至今，世界各地均有流行，是危害犬类的最主要的烈性传染病之一。其后，美国、英国、德国、法国、意大利、俄罗斯和日本等国也相继发现了该病毒。血清学调查显示，CPV阳性血清在欧洲最早可以追溯到1974-1976年；在美国、加拿大、日本和澳大利亚可以追溯到1978年。于1967年由Binn等人从健康犬粪便中分离到的犬极细小病毒(Minutevirusofcanine，MVC现在也称为CPV-1)，而将后来发现的病毒命名为犬细小病毒2型(CPV-2)。临诊上，CPV-2有两个表现类型：肠炎型和心肌炎型。肠炎型主要表现为先呕吐，后急性出血性肠炎、白细胞显著减少，但目前临床上有相当大比例患犬白细胞表现正常或升高；心肌炎型主要见于8周龄以下的幼犬，常突然发病，数小时内死亡。试验证明，CPV-1可以导致小于4周龄的幼犬发病并可以致其死亡，也可以引起母犬的繁殖障碍。

在我国，梁士哲等于1982年首次报道了类似犬细小病毒感染性肠炎。次年，徐汉坤等正式报道了该病的流行。近年来，随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大疫病之一。目前，人们通过疫苗类对犬细小病毒病进行免疫，早期效果较好，但是需要多次接种，操作麻烦，成本较高，容易使畜禽产生应激反应，且疫苗对于保藏条件要求较为苛刻，需在低温下冷藏，室温条件下一段时间则失效。因此，迫切需要一种能够防治犬细小病毒病的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗犬细小病毒组合物。

同时，本发明还提供一种抗犬细小病毒冻干粉。

再者，本发明还提供一种抗犬细小病毒冻干粉的制备方法。

最后，本发明提供一种抗犬细小病毒冻干粉在制备饲料中的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种抗犬细小病毒组合物，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95～97份，抗犬细小病毒转移因子1～5份。

一种抗犬细小病毒冻干粉，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95～97份，抗犬细小病毒转移因子1～2份，灭活剂0.2～0.3份，防腐剂0.01～0.02份，耐热冻干保护剂2.05～3.6份。

所述的灭活剂为甲醛。

所述的防腐剂为硫柳汞。

优选的，所述的耐热冻干保护剂由以下重量份的组分组成：硒0.05～0.1份，维生素C0.5～1份，聚乙烯吡咯烷酮1～2份，甘氨酸0.5份。

一种抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，具体步骤如下：

(1)分离毒株制备疫苗：取犬细小病毒株增殖、灭活后制得疫苗备用；

(2)免疫健康鸡群制备高免蛋：取步骤(1)制备的疫苗免疫接种健康鸡群，当抗体效价达到1:256时，收集高免蛋清理、消毒后晾干备用；

(3)酸化处理：取步骤(2)制备的高免蛋分离卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌至颜色发白得卵黄溶液，在卵黄溶液中加入pH值为4.9～5.2的预冷酸化水，加入量为卵黄溶液体积的8倍，混匀后室温下静置沉淀；

(4)取步骤(3)静置后的上清液，按体积加入0.8％的NaCl和Na₂SO₄混合物，以提高抗体的解离度，离心得含有抗犬细小病毒卵黄抗体的上清液；

(5)取步骤(4)中的上清液，上清液中抗犬细小病毒卵黄抗体的量为95～97份，再在上清液中加入1～2份的抗犬细小病毒转移因子，混匀后依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤；

(6)将步骤(5)的滤液浓缩得浓缩液，在浓缩液中依次加入0.2～0.3份的灭活剂、0.01～0.02份的防腐剂及2.05～3.6份的耐热冻干保护剂，混匀后经预冻、冻干处理即得抗犬细小病毒冻干粉。

所述步骤(2)中第一次使用灭活疫苗正常量，为10^3.8ELD₅₀/0.1ml犬细小病毒灭活疫苗1.5mL，间隔7天免疫1次，后续每次免疫增加1倍量，于第二次免疫后开始检测抗体效价。

所述步骤(4)中NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1。

所述的抗犬细小病毒转移因子可以为市售商品，也可以采用以下方法制备得到：

(1)用灭菌后的生理盐水清洗用犬细小病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面筋、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

(2)将步骤(1)处理后的猪脾脏破碎，加入2倍预冷的PBS缓冲液，用组织匀浆仪将其匀质得匀浆液；

(3)在将步骤(2)中的匀浆液用超声破碎仪处理10min得破碎液；

(4)将步骤(3)的破碎液调至pH值为5.3～5.7，6000rpm离心30min，收集上清液；

(5)将步骤(4)的上清液用微滤膜过滤，截留分子量7000道尔顿的物质，收集上清液；

(6)将步骤(5)的上清液用除菌滤膜过滤，得到抗犬细小病毒转移因子原液，4℃保存或冻干备用。

本发明冻干粉中加入的抗犬细小病毒转移因子可以将原液换算成转移因子的含量加入，也可以加入经冻干处理的转移因子粉末。

一种抗犬细小病毒冻干粉在制备饲料中的应用，步骤如下：取抗犬细小病毒冻干粉，按照重量百分比为0.2～0.6％加入饲料中，混匀即得。

本发明的有益效果：

本发明饲料添加剂用抗犬细小病毒冻干粉具有降低保存条件，延长保存时间，抗体效价高、生物活性良好等优点，将其按一定比例加入饲料配方中，可以预防和治疗犬细小病毒病，提高犬的免疫力和成活率，使用方便，能降低成本和劳动力。该混合冻干粉将两种具有不同生物活性的抗犬细小病毒的生物物质融合在一起，能提高防治犬细小病毒的能力。

其中，抗体是具有较强针对性的生物活性物质，是属于被动作用的生物活性物质，不能有效调动机体的有效主动的机能，只能对相应的病毒起到作用，转移因子是一种特异的调节免疫机能的活性物质，可以调节机体的有效的免疫系统机能，从而主动参与免疫，刺激淋巴细胞等体液主面的免疫。两者联用将大大提高攻守作用，提高机体的防治机能。

本发明中抗犬细小病毒卵黄抗体能有效预防犬细小病毒，对动物没有毒副作用，环保、无残留，将高免制得的抗犬细小病毒卵黄抗体作为添加组分加入饲料中，能在较大程度上预防犬细小病毒，加大添加量还能治疗犬细小病毒病；抗犬细小病毒转移因子配合抗犬细小病毒卵黄抗体使用能提高单方的防治效果。

本发明采用健康鸡群作为免疫对象，能降低毒株返祖的可能性，同时可以快速提高抗体效价至1:256，通过鸡强化免疫后制成的卵黄抗体对犬细小病毒病防治效果突出，见效快、疗效显著，且针对性强。

本发明抗犬细小病毒冻干粉中耐热冻干保护剂采用硒、Vc、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和甘氨酸四种组分，其中，硒是一种微量元素，具抗突变作用、抗氧化作用、促进致癌物的体内灭活作用、抗细胞增殖作用、增强机体免疫力作用，调节并提高机体免疫功能的作用，使机体特异性免疫和非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫功能处于相对平衡状态，具有抗衰老作用，可以减缓生物活性物质的有效活性；Vc的作用具有很多种，具有抗氧化性和避免日晒后的一系列的变化，还可以调节温度变化对机体的适应能力，同时还可以促进铁质和钙质的吸收作用；PVP是药物的黏结剂、增溶剂、崩解剂、延效剂，利用PVP分子与药物分子间的氢键缔合作用可以起到与增溶、速效相反的延效、缓释作用、控制PVP分子与药物分子间的缔合程度，可以使缔合后药物分子在人体内缓慢地释放出来，延缓其溶解速度，起到延长药效地作用，同时具有明显的生物保护功能；甘氨酸具有防腐、缓冲作用，也可以起到稳定剂的作用。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例的抗犬细小病毒组合物，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95份，抗犬细小病毒转移因子2份。

本实施例的抗犬细小病毒冻干粉，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95份，抗犬细小病毒转移因子2份，甲醛0.2份，硫柳汞0.01份，硒0.05份，维生素C 0.5份，聚乙烯吡咯烷酮1份，甘氨酸0.5份。

本实施例中抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，具体步骤如下：

(1)毒株制备疫苗：取国家标准犬细小病毒株增殖、灭活后制得乳油剂疫苗备用；

(2)免疫健康鸡群制备高免蛋：取步骤(1)制备的乳油剂疫苗免疫接种健康鸡群，第一次使用灭活疫苗正常量，为10^3.8ELD₅₀/0.1ml犬细小病毒灭活疫苗1.5mL，间隔7天免疫1次，后续每次免疫增加1倍量，共免疫三次，于第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1:256时，开始收集高免蛋，高免蛋经清理、消毒后晾干备用；

(3)酸化处理：取步骤(2)制备的高免蛋分离卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌至颜色发白得卵黄溶液，在卵黄溶液中加入pH值为4.9的预冷酸化水，加入量为卵黄溶液体积的8倍，混匀后置于贮藏罐中于室温下静置沉淀；

(4)取步骤(3)静置后的上清液，按体积加入0.8％的NaCl和Na₂SO₄(NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1)混合物，以提高抗体的解离度，再在15000rpm/min下离心20min得含有抗犬细小病毒卵黄抗体的上清液；

(5)取步骤(4)中的上清液，上清液中抗犬细小病毒卵黄抗体的量为95份，再在上清液中加入2份抗犬细小病毒转移因子，混匀后用0.45μm滤膜过滤，以截流分子量大于200KD的大分子物质，取滤液用0.22μm滤膜二次过滤；

(6)将步骤(5)的滤液经超滤装置浓缩至卵黄抗体浓度为2.5mL/500头份，在浓缩液中依次加入0.2份甲醛、0.01份硫柳汞、0.05份硒、0.5份维生素C、1份聚乙烯吡咯烷酮、0.5份甘氨酸，混匀后置于-80℃下充分冷冻，而后置于冻干机中冻干即得。

本实施例中抗犬细小病毒转移因子的制备方法为：

(1)用灭菌后的生理盐水清洗用犬细小病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面筋、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

(2)将步骤(1)处理后的猪脾脏破碎，加入2倍预冷的PBS缓冲液，用组织匀浆仪将其匀质得匀浆液；

(3)在将步骤(2)中的匀浆液用超声破碎仪处理10min得破碎液；

(4)将步骤(3)的破碎液调至pH值5.5，6000rpm离心30min，收集上清液；

(5)将步骤(4)的上清液用微滤膜过滤，截留分子量7000道尔顿的物质，收集上清液；

(6)将步骤(5)的上清液用除菌滤膜过滤，得到抗犬细小病毒转移因子原液，冻干备用。

本实施例的抗犬细小病毒冻干粉在制备饲料中的应用，步骤如下：取抗犬细小病毒冻干粉，按照重量百分比为0.6％加入饲料中，混匀即得。

实施例2

本实施例的抗犬细小病毒组合物，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体97份，抗犬细小病毒转移因子1份。

本实施例的抗犬细小病毒冻干粉，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体97份，抗犬细小病毒转移因子1份，甲醛0.3份，硫柳汞0.02份，硒0.1份，维生素C 1份，聚乙烯吡咯烷酮2份，甘氨酸0.5份。

本实施例中抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，具体步骤如下：

(1)毒株制备疫苗：取国家标准犬细小病毒株增殖、灭活后制得乳油剂疫苗备用；

(2)免疫健康鸡群制备高免蛋：取步骤(1)制备的乳油剂疫苗免疫接种健康鸡群，第一次使用灭活疫苗正常量，为10^3.8ELD₅₀/0.1ml犬细小病毒灭活疫苗1.5mL，间隔7天免疫1次，后续每次免疫增加1倍量，共免疫三次，于第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1:256时，开始收集高免蛋，高免蛋经清理、消毒后晾干备用；

(3)酸化处理：取步骤(2)制备的高免蛋分离卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌至颜色发白得卵黄溶液，在卵黄溶液中加入pH值为4.9的预冷酸化水，加入量为卵黄溶液体积的8倍，混匀后置于贮藏罐中于室温下静置沉淀；

(4)取步骤(3)静置后的上清液，按体积加入0.8％的NaCl和Na₂SO₄(NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1)混合物，以提高抗体的解离度，再在15000rpm/min下离心20min得含有抗犬细小病毒卵黄抗体的上清液；

(5)取步骤(4)中的上清液，上清液中抗犬细小病毒卵黄抗体的量为97份，再在上清液中加入1份抗犬细小病毒转移因子(制备方法同实施例1)，混匀后用0.45μm滤膜过滤，以截流分子量大于200KD的大分子物质，取滤液用0.22μm滤膜二次过滤；

(6)将步骤(5)的滤液经超滤装置浓缩至卵黄抗体浓度为2.5mL/500头份，在浓缩液中依次加入0.3份甲醛、0.02份硫柳汞、0.1份硒、1份维生素C、2份聚乙烯吡咯烷酮、0.5份甘氨酸，混匀后置于-80℃下充分冷冻，而后置于冻干机中冻干即得。

本实施例的抗犬细小病毒冻干粉在制备饲料中的应用，步骤如下：取抗犬细小病毒冻干粉，按照重量百分比为0.2％加入饲料中，混匀即得。

实施例3

本实施例的抗犬细小病毒组合物，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体96份，抗犬细小病毒转移因子1.5份。

本实施例的抗犬细小病毒冻干粉，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体96份，抗犬细小病毒转移因子1.5份，甲醛0.25份，硫柳汞0.015份，硒0.075份，维生素C0.75份，聚乙烯吡咯烷酮1.5份，甘氨酸0.5份。

本实施例中抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，具体步骤如下：

(1)毒株制备疫苗：取国家标准犬细小病毒株增殖、灭活后制得乳油剂疫苗备用；

(2)免疫健康鸡群制备高免蛋：取步骤(1)制备的乳油剂疫苗免疫接种健康鸡群，第一次使用灭活疫苗正常量，为10^3.8ELD₅₀/0.1ml犬细小病毒灭活疫苗1.5mL，间隔7天免疫1次，后续每次免疫增加1倍量，共免疫三次，于第二次免疫后开始检测抗体效价，当抗体效价达到1:256时，开始收集高免蛋，高免蛋经清理、消毒后晾干备用；

(3)酸化处理：取步骤(2)制备的高免蛋分离卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌至颜色发白得卵黄溶液，在卵黄溶液中加入pH值为5.0的预冷酸化水，加入量为卵黄溶液体积的8倍，混匀后置于贮藏罐中于室温下静置沉淀；

(4)取步骤(3)静置后的上清液，按体积加入0.8％的NaCl和Na₂SO₄(NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1)混合物，以提高抗体的解离度，再在15000rpm/min下离心20min得含有抗犬细小病毒卵黄抗体的上清液；

(5)取步骤(4)中的上清液，上清液中抗犬细小病毒卵黄抗体的量为96份，再在上清液中加入1.5份抗犬细小病毒转移因子(制备方法同实施例1)，混匀后用0.45μm滤膜过滤，以截流分子量大于200KD的大分子物质，取滤液用0.22μm滤膜二次过滤；

(6)将步骤(5)的滤液经超滤装置浓缩至卵黄抗体浓度为2.5mL/500头份，在浓缩液中依次加入0.25份甲醛、0.015份硫柳汞、0.075份硒、0.75份维生素C、1.5份聚乙烯吡咯烷酮、0.5份甘氨酸，混匀后置于-80℃下充分冷冻，而后置于冻干机中冻干即得。

本实施例的抗犬细小病毒冻干粉在制备饲料中的应用，步骤如下：取抗犬细小病毒冻干粉，按照重量百分比为0.4％加入饲料中，混匀即得。

对比例1

本对比例的饲料添加剂用抗犬细小病毒卵黄抗体冻干粉，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体97.5份，甲醛0.25份，硫柳汞0.015份，硒0.075份，维生素C 0.75份，聚乙烯吡咯烷酮1.5份，甘氨酸0.5份。冻干粉的制备方法和应用同实施例3。

对比例2

本对比例的饲料添加剂用抗犬细小病毒转移因子冻干粉，由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒转移因子97.5份，甲醛0.25份，硫柳汞0.015份，硒0.075份，维生素C 0.75份，聚乙烯吡咯烷酮1.5份，甘氨酸0.5份。

试验例1

预防效果试验：使用2月龄犬210只，其中30只作为对照隔离养，使用普通的饲料；30只作为空白组，采用普通饲料；另150只试验用隔离饲养，随机分为5组，每组30只，使用实施例1～3及对比例1～2制备的饲料，饲料成分与对照组和空白组一致。饲养方式为自由采食，自由饮水，24h后，取试验组和对照组中的犬肌注接种稀释后CPV病毒液，记录120h死亡情况，试验结果详见下表1。

治疗效果试验：使用2月龄犬180只，180只点眼接种稀释后的CPV病毒液，饲养方式为自由采食和自由饮水，感染12h后，其中30只作为阳性对照组，使用普通饲料；另外150只为试验组，随机分为5组，每组30只，使用实施例1～3及对比例1～2制备的饲料，饲料成分与阳性对照组一致，连续记录120h各组的死亡情况，试验结果详见下表1。

表1 各处理组防治犬细小病毒的结果

结论：由表1可知，实施例1～3制备的饲料对犬细小病毒具有良好的防治功效，保护率和存活率均在86％以上，而对比例1～2制备的饲料的保护率和存活率在80％以下，效果远不如实施例。

试验例2

将实施例1～3及对比例1制备的冻干粉保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别于放置后的1周、2周、1月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月，采用琼脂扩散法(AGP)测定每个时间点样品中抗犬细小病毒卵黄抗体的效价，检测结果详见下表2。

表2 37℃放置冻干粉在不同时间段抗体效价的变化

组别/效价

1周

2周

1月

2月

4月

8月

12月

16月

20月

24月

实施例1

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：16

1：16

1：16

1：16

1：16

实施例2

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：16

1：16

1：16

1：16

实施例3

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：16

1：16

1：16

1：16

1：16

对比例1

1：32

1：32

1：32

1：32

1：32

1：16

1：16

1：16

1：16

1：16

结论，由表2可知，本发明实施例1～3制备的混合冻干粉有效效价的保存期至少两年。

质量标准

实施例1～3制备的混合冻干粉的质量标准详见下述几项：

性状：淡黄色，呈致密的团块。

支原体检验：按《中国兽药典》进行，无支原体生长。

外源病毒检验：按《中国兽药典》进行，符合规定。

安全检验：用7日龄雏鸡5只，肌肉注射5羽份，观察2周，全部健活，注射部位没有病变。

剩余水分测定：按《中国兽药典》进行，符合兽用生物制品通则规定。

保质期：根据常温效价检测实验结果，可以存放2年。

Claims (8)

1.一种抗犬细小病毒冻干粉，其特征在于：由以下重量份的组分组成：抗犬细小病毒卵黄抗体95～97份，抗犬细小病毒转移因子1～2份，灭活剂0.2～0.3份，防腐剂0.01～0.02份，耐热冻干保护剂2.05～3.6份；

所述的耐热冻干保护剂由以下重量份的组分组成：硒0.05～0.1份，维生素C 0.5～1份，聚乙烯吡咯烷酮1～2份，甘氨酸0.5份。

2.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒冻干粉，其特征在于：所述的灭活剂为甲醛。

3.根据权利要求1所述的抗犬细小病毒冻干粉，其特征在于：所述的防腐剂为硫柳汞。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）分离毒株制备疫苗：取犬细小病毒株增殖、灭活后制得疫苗备用；

（2）免疫健康鸡群制备高免蛋：取步骤（1）制备的疫苗免疫接种健康鸡群，当抗体效价达到1:256时，收集高免蛋清理、消毒后晾干备用；

（3）酸化处理：取步骤（2）制备的高免蛋分离卵黄，加入等体积的无菌水，充分搅拌至颜色发白得卵黄溶液，在卵黄溶液中加入pH值为4.9～5.2的酸化水，加入量为卵黄溶液体积的8倍，混匀后静置沉淀；

（4）取步骤（3）静置后的上清液，按体积加入0.8% 的NaCl和Na₂SO₄混合物，离心得含有抗犬细小病毒卵黄抗体的上清液；

（5）取步骤（4）中的上清液，上清液中抗犬细小病毒卵黄抗体的量为95～97份，再在上清液中加入1～2份的抗犬细小病毒转移因子，混匀后依次用0.45mm和0.22mm的滤膜过滤；

（6）将步骤（5）的滤液浓缩得浓缩液，在浓缩液中依次加入0.2～0.3份的灭活剂、0.01～0.02份的防腐剂及2.05～3.6份的耐热冻干保护剂，混匀后经预冻、冻干处理即得抗犬细小病毒冻干粉。

5.根据权利要求4所述的抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中第一次使用灭活疫苗正常量，为10^3.8ELD₅₀/0.1 ml犬细小病毒灭活疫苗1.5mL，间隔7天免疫1次，后续每次免疫增加1倍量，于第二次免疫后开始检测抗体效价。

6.根据权利要求4所述的抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中NaCl与Na₂SO₄的质量比为4:1。

7.根据权利要求4所述的抗犬细小病毒冻干粉的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中的抗犬细小病毒转移因子采用以下方法制备得到：

（1）用灭菌后的生理盐水清洗用犬细小病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面筋、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；

（2）将步骤（1）处理后的猪脾脏破碎，加入2倍预冷的PBS缓冲液，用组织匀浆仪将其匀质得匀浆液；

（3）在将步骤（2）中的匀浆液用超声破碎仪处理10min得破碎液；

（4）将步骤（3）的破碎液调至pH值为5.3～5.7，6000rpm离心30min，收集上清液；

（5）将步骤（4）的上清液用微滤膜过滤，截留分子量7000道尔顿的物质，收集上清液；

（6）将步骤（5）的上清液用除菌滤膜过滤，得到抗犬细小病毒转移因子原液，4℃保存或冻干备用。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的抗犬细小病毒冻干粉在制备饲料中的应用，其特征在于：步骤如下：取抗犬细小病毒冻干粉，按照重量百分比为0.2～0.6%加入饲料中，混匀即得。