CN110862451A - 马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法及应用 - Google Patents

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王甜
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张永欣
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Abstract

本发明提供了马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法，该方法首先制备犬细小病毒免疫原，然后将其接种至健康马，收获马血浆，提取马血浆中的免疫球蛋白，最后通过纯化，超滤等手段获取马源抗犬细小病毒免疫球蛋白，此外，本发明制备的马源抗犬细小病毒免疫球蛋白免疫保护效果显著，而且采用了马源而非同源动物，克服了同源动物提取的免疫球蛋白会引入外源病毒的问题，同时还可以提高免疫球蛋白的产量，实现免疫球蛋白制剂的规模化生产的目的。

Description

马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法及应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法及应用。
背景技术
犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)病以其发病率高，传染性强、死亡率高等特点已成为危害我国养犬业最为严重的传染病之一，该病临床上以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特征，多发于3～6月幼龄犬。
目前，防治犬细小病毒病的临床药物主要是抗病毒药物和免疫球蛋白等生物制剂。其中，抗病毒药物效果并不显著，而免疫球蛋白经静脉注射后，能迅速提高血液中的免疫球蛋白含量，通过特异性中和及免疫调节等功能达到预防和治疗的目的，对挽回犬病造成的严重经济损失起到了积极作用，因此，近年来被广泛应用，但由于免疫球蛋白在研制过程中，不可避免的会引入外源病毒，导致研究者无法获得单纯感染犬细小病毒的试验样本，从而无法排除其他病毒的干扰，而且由于受到样本动物的限制，规模化生产免疫球蛋白制剂目前难以实现。
发明内容
本发明的目的是提供一种马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法，以解决同源动物提取的免疫球蛋白会引入外源病毒的问题。
本发明的目的是提供一种马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的应用，以实现免疫球蛋白制剂的规模化生产。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
选择马源动物的抗血清，一方面考虑到成本的因素，另一方面也考虑到大型动物中猪、牛、羊都易感染细小病毒，或者与细小病毒有亲缘关系的病毒，因此并没有采集猪、牛、羊等大型动物的血清。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
1.本发明首次提出了马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法，以解决同源动物提取的免疫球蛋白会引入外源病毒的问题。
2.本发明克服了现有技术难以规模化生产免疫球蛋白制剂的缺陷。
3.本发明提供的马源抗犬细小病毒免疫球蛋白能够抵抗犬细小病毒的感染，对犬细小病毒病起到有效的免疫保护作用。
具体实施方式
实施例中除特殊注明，其余使用的试剂盒、载体、酶、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。
实施例1：马源动物的筛选
1、犬的筛选
1.1、实验动物：实验犬(比格犬)和普通犬各5只。
1.2、犬源相关病毒的检测：分别设计犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒引物，应用PCR及RT-PCR方法检测犬粪便中是否含有以上5种病原，检测结果均为阴性判为合格。
1.3、犬源病毒相关抗体的检测：采集犬血清，应用中和实验法分别测定犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒中和抗体效价，以上抗原中和抗体效价＜1:2判定为合格。
1.4、筛选结果(见表1、表2)。
表1犬粪便中相关病毒PCR或者RT-PCR检测结果
Figure RE-GDA0002342238620000021
表2犬源相关病毒血清中和抗体检测结果
Figure RE-GDA0002342238620000022
Figure RE-GDA0002342238620000031
2、马的筛选
2.1、选择健康状况良好的母马5匹；
2.2、犬源相关病毒的检测：根据设计的5种犬源病毒引物，应用PCR及RT-PCR 方法检测马粪便中是否含有以上5种病原，检测结果均为阴性判为合格。
2.3、犬源病毒相关抗体的检测：采集马血清，应用中和实验法分别测定犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒中和抗体效价。以上抗原中和抗体效价＜1:2判定为合格。
2.4、筛选结果(见表3、表4)。
表3马粪便中犬相关病毒PCR或者RT-PCR检测结果
Figure RE-GDA0002342238620000032
表4马血清中犬源相关病毒血清中和抗体检测结果
Figure RE-GDA0002342238620000033
3、结果：经过对普通犬、比格犬、马粪便中抗原的筛选结果可以看出，5只普通犬粪便中5种抗原检出的阳性率比较高，5只比格犬均未检出相应的抗原；普通犬和比格犬均能不同程度的检出相应的抗体，达不到使用要求。而在5匹马粪便中均检测不到犬的5种病原，且马血清中抗体效价均＜1:2，符合使用要求。
实施例2.马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备
1、犬细小病毒免疫原的制备
向病毒液中按2‰比例加入甲醛溶液，37℃作用灭活18小时即可；取灭活后抗原经截留分子量30kDa超滤膜堆进行40～50倍浓缩。
灭活浓缩抗原与油佐剂乳化比例为1:1(V/V)，先将油相导入胶体磨，2500 r/min搅拌，再缓慢加入灭活浓缩抗原，加完后10000r/min乳化15分钟。
2、高免马血浆的制备
选择健康状况良好的母马，免疫原采用多次强化免疫，接种方法为皮下或肌肉多点注射，接种部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的10头份逐次递增至15～25头份，最后一次免疫剂量增加至25头份，每次免疫间隔3周，最后一次免疫后3周，然后进行心脏采血，收获马血浆。
3、免疫球蛋白的提取、超滤浓缩和过滤除菌
以0.5mol/L的冰醋酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调整马血清pH值 7.0～7.5，加入相应体积-20℃的无水乙醇，再加入NaCl调整离子强度，置于4℃的冰箱中静置2h后4℃、4000r/min下离心30min，然后加入等体积的8mg/mL 的EDTA盐溶液，充分混匀，其蛋白纯度可达95％。
然后采用中空纤维膜组件(截留分子量100KD)进行超滤浓缩，并过滤除菌、分装。
实施例3.马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的检测
1.免疫球蛋白体外抗体效价测定：
将分装后的免疫球蛋白用无血清MEM 2倍系列稀释，稀释成不同的稀释度的免疫球蛋白，与200TCID50/0.1ml的毒液等量混合，在37℃下中和60min后，同步接种猫肾细胞(F81)，每个稀释度接种6孔，置37℃培养，连续观察5日，判定结果。结果见表5。结果表明免疫球蛋白中和抗体效价可高达1:215。
表5不同浓度免疫球蛋白保护性(细胞)试验结果
Figure RE-GDA0002342238620000041
2.免疫球蛋白体内抗体效价测定：
建立犬细小病毒模型(符合发病标准)，发病犬需25只犬，分成5组，5只/组，其中1组作为病毒对照，设立1组空白对照，其余4组将免疫球蛋白以28、29、 210、211倍稀释后治疗已发生犬细小病毒的病犬，连续注射3天，1次/天，然后观察14天并记录结果(见表6)。
表6不同浓度免疫球蛋白保护性(动物)试验结果
Figure RE-GDA0002342238620000051
结果表明，当免疫球蛋白稀释至210时，犬的治愈率达100％，因此，犬免疫球蛋白的体内中和抗体效价大于等于1:1024时即能治愈发病的犬细小病毒病犬。
3.免疫球蛋白特异性检测：
采用免疫双扩散法进行特异性检测，结果表明马源抗犬细小病毒免疫球蛋白与抗牛，抗鼠等血清不产生沉淀线。
4.外源病毒检验中和试验：
取1瓶卫佳细活疫苗(只含犬细小病毒CPV)，107.0TCID50/头份，10000rpm离心10min，取上清与等量马源抗犬细小病毒免疫球蛋白混匀，置37℃中和60min，然后取适量的中和物同步接种猫肾细胞，盲传3代，各代次均未出现细胞病变，表明中和完全，即免疫球蛋白可满足外源性病毒检验的需要。
实施例4.马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的临床应用
选取犬细小病毒感染的犬只进行治疗，分别用上述方法制备的马源免疫球蛋白、购买的犬细小病毒单克隆抗体(购自威特瑞长春军需大学兽药研究中心)、卫佳细活疫苗各治疗50只犬，肌肉注射，0.5-1ml/kg，连用3天，结果见表7。
表7犬群体治疗效果统计结果
Figure RE-GDA0002342238620000052
Figure RE-GDA0002342238620000061
临床效力试验中，发病犬连续注射马源免疫球蛋白3天后，50只犬种48只发病犬均被治愈，治愈率为96％；而发病犬连续注射威特瑞3天后，50只犬种 43只发病犬均被治愈，治愈率为86％，卫佳细活疫苗的治愈率为84％，说明马源免疫球蛋白可在连续注射3日后对临床发病犬提供更好的治疗效果。

Claims (8)

1.马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备犬细小病毒免疫原；
(2)将步骤(1)中免疫原接种至健康马，收获马血浆；
(3)在步骤(2)收获的马血浆中提取免疫球蛋白；
(4)纯化步骤(3)中提取物，获得马源抗犬细小病毒免疫球蛋白。
2.如权利要求1所述方法制备的马源抗犬细小病毒免疫球蛋白，其特征在于：所述马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的含量，纯度，中和抗体效价。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述制备犬细小病毒免疫原的过程为：先制备犬细小病毒液，然后经灭活、超滤后加入油佐剂，最后乳化而成。
4.根据权利要求3所述的制备犬细小病毒免疫原的过程，其特征在于，犬细小病毒液的灭活过程为：在病毒液中加入终浓度为2‰的甲醛溶液，37℃灭活18小时。
5.根据权利要求3所述的制备犬细小病毒免疫原的过程，其特征在于，犬细小病毒液灭活后，采用截留分子量30kDa超滤膜浓缩至40～50倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)提取马源抗犬细小病毒免疫球蛋白的方法为：
(a)调整马血清pH至7.0-7.5，加入等体积-20℃的无水乙醇混匀，置于4℃环境下静置2小时；
(b)静置后在4℃条件下，4000r/min，离心30min，去上清；
(c)将(b)中获得的沉淀用纯水配置成10mg/mL的溶液，然后加入等体积的8mg/mL的EDTA盐溶液，充分混匀；
(d)将(c)中获得的溶液用中空纤维膜进行超滤浓缩，然后除菌，最后获得马源抗犬细小病毒免疫球蛋白。
7.根据权利要求6所述的提取免疫球蛋白的方法，其特征在于：步骤(a)调整马血清pH所用试剂为0.5mol/L的冰醋酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液。
8.根据权利要求6所述的提取免疫球蛋白的方法，其特征在于：步骤(d)所述中空纤维膜截留分子量为100KD。
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