CN1729996A - 犬科动物抗犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种犬科动物抗犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺及制剂，是以一种或几种引起犬科动物重要疫病的病原，经犬、猴、猫等动物原代、传代细胞或细菌培养基培养增殖后，加入佐剂制成免疫原，按一定程序对犬科动物进行免疫，分离血清，灭活病毒，并按一定工艺制成单一或联合高免血清或抗体制剂。由于动物种属一致，不会出现异源蛋白过敏问题，在生产上可简化工艺，降低成本。本发明制剂使用后可使机体立即获得免疫保护能力，用于预防和治疗犬科动物重要疫病，具有疗效显著，临床症状消失迅速，无毒副作用特点，药物制剂容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。

Description

犬科动物抗犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺及制剂

技术领域：

本发明涉及犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺，尤其是提供了一种犬科动物抗犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺及制剂，用于犬科动物相应重要疫病的紧急预防与治疗，属于生物制品研制领域。

背景技术：

在我国随着犬、貉、狐等犬科毛皮动物养殖业不断发展，每年毛皮动物养殖数量达几百万只。但是，许多犬科动物重要疫病如犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎(狐狸脑炎)、犬传染性喉气管炎、犬流感、犬副流感、犬冠状病毒病、犬钩端螺旋体病等疫病的不断发生严重威胁着犬及毛皮经济动物的健康，每年为此造成的经济损失巨大。同时，一些人兽共患疾病也直接威胁着人类的健康。

在实际生活中控制这些疫病的有效办法是对动物进行疫苗的免疫预防接种，但由于现有疫苗保护率不高，免疫效果不理想，加之在饲养管理方面还存在不完善的环节，因此不能完全控制这些疾病在犬科动物中的发生和流行。

目前，国内外已有多种抗细菌毒素、抗病毒血清或免疫球蛋白制剂应用于临床，用于疾病的紧急预防与治疗，如抗狂犬病血清、破伤风抗毒素血清、白喉抗毒素血清等。我国已经有人研制了抗犬、貉、狐及猫的抗病毒免疫球蛋白制剂，但都是免疫马属动物制备的，必须经过酶切后去除免疫球蛋白的Fc片段，否则容易引起异源蛋白过敏，工艺复杂。另外，血液制品在制备过程中，由于病毒的复制或动物感染其它病毒性疾病，可能会造成血液污染某些病毒，如不进行适当处理，则会给使用血液制品制剂带来安全隐患，因此，在血液制品制备过程中必须有妥善的病毒灭活工艺步骤，但目前为此，在动物用血液制品的制备工艺上还未见有病毒去除、灭活的技术方法应用于生产。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种犬科动物抗犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺，适用于工业化生产。

本发明还提供了上述制备工艺生产的生物制剂，用于该科犬、貉、狐、狼等动物重要疫病的紧急预防与治疗。

本发明的技术解决方案如下：

以一种或几种引起犬科动物重要疫病的病原，如犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒I、II型、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬钩端螺旋体病原体等，经犬、猴、猫等动物原代、传代细胞或细菌培养基培养增殖后，经减毒或细菌灭活后，加入佐剂制成免疫原，按一定程序对犬科动物进行免疫，分离血清，灭活病毒，并按一定工艺制成单一或联合高免血清或抗体制剂。

所述犬科动物主要是指犬、貉、狐、狼等。

具体制备方法包括以下步骤：

1.免疫原的制备：以一种或几种引起犬科动物重要疫病的病原，如犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒I、II型、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬钩端螺旋体等病原体包括强毒株和弱毒株，经合适的细胞如犬、猫、猴原代细胞或传代细胞(MDCK细胞、F81细胞、Vero细胞)和细菌培养基(如柯索夫培养基等)进行培养增殖，使病毒滴度达10⁴个TCID₅₀/0.1mL以上或细菌细菌浓度达2×10⁹个/mL以上后，经减毒或细菌灭活处理，与免疫佐剂按1~9∶1的比例混合制成免疫原。制备单一或联合血清时将所制免疫原单独或几种混合后对犬、貉、狐等犬科动物进行免疫。

2.动物免疫：选用经检查健康合格的犬科动物进行免疫。免疫分基础免疫和强化免疫两个阶段，一般基础免疫2针，强化免疫1针，采用肌肉或皮下多点注射途径，每个针次间隔14-30天，免疫原用量根据所用免疫原滴度而定。

3.采血及血清分离：一般在强化免疫后14-30之间进行试血，测定抗体效价，如达到要求，即可大量采血。采血采用颈静脉或股静脉放血法，用导管将血液采集到预先装有少量灭菌生理盐水的离心瓶中，待血块收缩完全后置4℃过夜，离心收取血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.成品制备及检定：将收获的高免血清经过滤除菌，制成半成品。将半成品进行效价测定后，按一定效价进行稀释或浓缩，直接分装冷藏，制成冷冻高免血清制剂，也可加入一定量的保护剂后分装冻干，制成冻干高免血清制剂；还可将半成品经盐析、透析的方法提取出抗体，并按前述方法制成冷藏抗体制剂及冻干抗体制剂。所制制剂经抽样进行无菌检验合格后可作为成品登记保存。

本发明采用犬科动物免疫制备犬科动物重要疫病高免血清及制剂，积极效果在于：由于动物种属一致，不会出现异源蛋白过敏问题，因此在生产上可直接使用高免血清，或经简单盐析方法制成抗体，而不需要酶解、消化等步骤，工艺简化，降低成本。本发明在制备工艺中还提出了一种血液制品去除、灭活病毒的工艺步骤，用此法对血清处理后，可灭活所有脂包膜病毒，消除了高免血清制剂因污染病毒可能带来的安全隐患。利用本发明提供的生产工艺制备的高免血清制剂，使用后可使机体立即获得免疫保护能力，用于预防和治疗犬科动物重要疫病，具有疗效显著，临床症状消失迅速，无毒副作用特点，药物制剂容易保存，便于运输，保质期限长，生产工艺简单，适合于工业化生产。

为表明本发明在紧急预防和治疗犬科动物重要疫病方面的积极效果，通过以下临床数据给予证明：

某犬队发生细小病毒性肠炎，全群64条犬，10条发病，确诊后立即对其余54条犬进行本发明血清紧急预防注射，每条犬肌肉注射2mL/天，连续注射2-3天，经观察未再发现犬发病。

本发明制剂可用于犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎、犬副流感等犬科动物重要疫病的紧急预防与治疗。

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1

以犬制备的犬科动物用抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清制剂

1.免疫原制备

将犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I、II型病毒接种MDCK细胞，犬细小病毒接种F81细胞，37℃转瓶培养。犬瘟热病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒培养3-5天收毒，犬细小病毒培养2-3天收毒，反复冻融后离心去除细胞碎片，取样测定病毒滴度。将5种病毒液分别稀释至病毒滴度均大于10^4.0个TCID₅₀/0.01mL后混匀，按病毒液∶佐剂＝1-9∶1的比例加入铝胶或弗氏佐剂，制成免疫原，4℃保存。

2.动物免疫：挑选经检验健康的犬作为受试动物。分基础免疫和强化免疫两个阶段进行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。

基础免疫：2针，第1针用量1-2mL/条，第2针2-3mL/条，间隔14天，第2针免疫1个月后试血测定抗体效价，根据效价确定加强免疫的时机及免疫剂量。

强化免疫：1针，一般在基础免疫结束后1个月进行，免疫剂量为3-5mL/条，在强化免疫后14天和30天时试血测定抗体效价，当抗体效价达峰值后安排采血。

3.采血及血清分离

采用颈静脉或股静脉放血，血液用灭菌离心瓶收集，采血前在离心瓶中加入少量灭菌生理盐水，采血时使生理盐水充分润壁。采血结束后将离心瓶置室温放置，待血块凝固并收缩后放入4℃冷室过夜，之后5000rpm离心30分钟，分离收获血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.半成品与成品制备及标准检测：

a.将同一批收获的高免血清混合后，用0.22μm滤膜过滤除菌，即获得制品原液。

b.通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测制品原液抗体效价，并根据效价稀释或浓缩血清，使血清中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒和副流感病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。此即为制备联合高免血清的半成品。

c.将同一批收获的高免血清混合后，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达50％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，用与血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达33％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小时，再用PBS透析24小时，收获透析袋内液体，用0.22μm滤膜过滤除菌，此即为制备联合抗体制剂的半成品。通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测抗体效价，并根据效价稀释或浓缩抗体溶液，使抗体溶液中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒和副流感病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。

d.上述半成品经检定合格后，可直接分装或加入保护剂后制成冷藏制剂或冻干制剂。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冻干注射剂

取半成品按血清∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。

保护剂配方：10-20％明胶+40-50％蔗糖

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冻干注射剂

取半成品按抗体∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。保护剂同上。

其它项应符合中华人民共和国药典2000年版冻干注射液项。

实施例2

以狐狸制备的犬科动物用抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清制剂

1.免疫原制备

将犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I、II型病毒接种MDCK细胞，犬细小病毒接种F81细胞，37℃转瓶培养。犬瘟热病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒培养3-5天收毒，犬细小病毒培养2-3天收毒，反复冻融后离心去除细胞碎片，取样测定病毒滴度。将5种病毒液分别稀释至病毒滴度均大于10^4.0个TCID₅₀/0.01mL后混匀，按病毒液∶佐剂＝1-9∶1的比例加入铝胶或弗氏佐剂，制成免疫原，4℃保存。

2.动物免疫：挑选经检验健康的狐狸作为受试动物。分基础免疫和强化免疫两个阶段进行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。

基础免疫：2针，第1针用量1-2mL/条，第2针2-3mL/条，间隔14天，第2针免疫1个月后试血测定抗体效价，根据效价确定加强免疫的时机及免疫剂量。

强化免疫：1针，一般在基础免疫结束后1个月进行，免疫剂量为3-5mL/条，在强化免疫后14天和30天时试血测定抗体效价，当抗体效价达峰值后安排采血。

3.采血及血清分离

采用颈静脉或股静脉放血，血液用灭菌离心瓶收集，采血前在离心瓶中加入少量灭菌生理盐水，采血时使生理盐水充分润壁。采血结束后将离心瓶置室温放置，待血块凝固并收缩后放入4℃冷室过夜，之后5000rpm离心30分钟，分离收获血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.半成品与成品制备及标准检测：

a.将同一批收获的高免血清混合后，用0.22μm滤膜过滤除菌，即获得制品原液。

b.通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测制品原液抗体效价，并根据效价稀释或浓缩血清，使血清中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒和副流感病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。此即为制备联合高免血清的半成品。

c.将同一批收获的高免血清混合后，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达50％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，用与血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达33％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小时，再用PBS透析24小时，收获透析袋内液体，用0.22μm滤膜过滤除菌，此即为制备联合抗体制剂的半成品。通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测抗体效价，并根据效价稀释或浓缩抗体溶液，使抗体溶液中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒和副流感病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。

d.上述半成品经检定合格后，可直接分装或加入保护剂后制成冷藏制剂或冻干制剂。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冻干注射剂

取半成品按血清∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。

保护剂配方：10-20％明胶+40-50％蔗糖。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冻干注射剂

取半成品按抗体∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。保护剂同上。

其它项应符合中华人民共和国药典2000年版冻干注射液项。

实施例3

以貉制备的犬科动物用抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清制剂

1.免疫原制备

将犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I、II型病毒接种MDCK细胞，犬细小病毒接种F81细胞，37℃转瓶培养。犬瘟热病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒培养3-5天收毒，犬细小病毒培养2-3天收毒，反复冻融后离心去除细胞碎片，取样测定病毒滴度。将5种病毒液分别稀释至病毒滴度均大于10^4.0个TCID₅₀/0.01mL后混匀，按病毒液∶佐剂＝1-9∶1的比例加入铝胶或弗氏佐剂，制成免疫原，4℃保存。

2.动物免疫：挑选经检验健康的貉作为受试动物。分基础免疫和强化免疫两个阶段进行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。

基础免疫：2针，第1针用量1-2mL/条，第2针2-3mL/条，间隔14天，第2针免疫1个月后试血测定抗体效价，根据效价确定加强免疫的时机及免疫剂量。

强化免疫：1针，一般在基础免疫结束后1个月进行，免疫剂量为3-5mL/条，在强化免疫后14天和30天时试血测定抗体效价，当抗体效价达峰值后安排采血。

3.采血及血清分离

采用颈静脉或股静脉放血，血液用灭菌离心瓶收集，采血前在离心瓶中加入少量灭菌生理盐水，采血时使生理盐水充分润壁。采血结束后将离心瓶置室温放置，待血块凝固并收缩后放入4℃冷室过夜，之后5000rpm离心30分钟，分离收获血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.半成品与成品制备及标准检测：

a.将同一批收获的高免血清混合后，用0.22μm滤膜过滤除菌，即获得制品原液。

b.通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测制品原液抗体效价，并根据效价稀释或浓缩血清，使血清中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒和副流感病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。此即为制备联合高免血清的半成品。

c.将同一批收获的高免血清混合后，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达50％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，用与血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达33％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小时，再用PBS透析24小时，收获透析袋内液体，用0.22μm滤膜过滤除菌，此即为制备联合抗体制剂的半成品。通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测抗体效价，并根据效价稀释或浓缩抗体溶液，使抗体溶液中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒和副流感病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。

d.上述半成品经检定合格后，可直接分装或加入保护剂后制成冷藏制剂或冻干制剂。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冻干注射剂

取半成品按血清∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。

保护剂配方：10-20％明胶+40-50％蔗糖。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬副流感、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冻干注射剂

取半成品按抗体∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。保护剂同上。

其它项应符合中华人民共和国药典2000年版冻干注射液项。

实施例4

以犬制备的犬科动物用抗犬瘟热、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清制剂

1.免疫原制备

将犬瘟热病毒、犬腺病毒I、II型病毒接种MDCK细胞，犬细小病毒接种F81细胞，37℃转瓶培养。犬瘟热病毒、犬腺病毒培养3-5天收毒，犬细小病毒培养2-3天收毒，反复冻融后离心去除细胞碎片，取样测定病毒滴度。将4种病毒液分别稀释至病毒滴度均大于10^4.0个TCID₅₀/0.01mL后混匀，按病毒液∶佐剂＝1-9∶1的比例加入铝胶或弗氏佐剂，制成免疫原，4℃保存。

2.动物免疫：挑选经检验健康的犬作为受试动物。分基础免疫和强化免疫两个阶段进行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。

基础免疫：2针，第1针用量1-2mL/条，第2针2-3mL/条，间隔14天，第2针免疫1个月后试血测定抗体效价，根据效价确定加强免疫的时机及免疫剂量。

强化免疫：1针，一般在基础免疫结束后1个月进行，免疫剂量为3-5mL/条，在强化免疫后14天和30天时试血测定抗体效价，当抗体效价达峰值后安排采血。

3.采血及血清分离

采用颈静脉或股静脉放血，血液用灭菌离心瓶收集，采血前在离心瓶中加入少量灭菌生理盐水，采血时使生理盐水充分润壁。采血结束后将离心瓶置室温放置，待血块凝固并收缩后放入4℃冷室过夜，之后5000rpm离心30分钟，分离收获血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.半成品与成品制备及标准检测：

a.将同一批收获的高免血清混合后，用0.22μm滤膜过滤除菌，即获得制品原液。

b.通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测制品原液抗体效价，并根据效价稀释或浓缩血清，使血清中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。此即为制备联合高免血清的半成品。

c.将同一批收获的高免血清混合后，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达50％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，用与血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达33％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小时，再用PBS透析24小时，收获透析袋内液体，用0.22μm滤膜过滤除菌，此即为制备联合抗体制剂的半成品。通过微量细胞中和试验和微量血凝抑制试验检测抗体效价，并根据效价稀释或浓缩抗体溶液，使抗体溶液中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，犬腺病毒、犬细小病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。

d.上述半成品经检定合格后，可直接分装或加入保护剂后制成冷藏制剂或冻干制剂。

抗犬瘟热、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合高免血清冻干注射剂

取半成品按血清∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。

保护剂配方：10-20％明胶+40-50％蔗糖。

抗犬瘟热、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎和犬细小病毒性肠炎联合抗体冻干注射剂

取半成品按抗体∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。保护剂同上。

其它项应符合中华人民共和国药典2000年版冻干注射液项。

实施例5

以犬制备的犬科动物用抗犬瘟热高免血清制剂

1.免疫原制备

将犬瘟热病毒接种MDCK细胞，37℃转瓶培养3-5天收毒，反复冻融后离心去除细胞碎片，取样测定病毒滴度。将病毒液稀释至病毒滴度大于10^4.0个TCID₅₀/0.01mL后，按病毒液∶佐剂＝9∶1的比例加入铝胶佐剂，制成免疫原，4℃保存。

2.动物免疫：挑选经检验健康的犬作为受试动物。分基础免疫和强化免疫两个阶段进行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。

基础免疫：2针，第1针用量0.5-1mL/条，第2针1-2mL/条，间隔14天，第2针免疫1个月后试血测定抗体效价，根据效价确定加强免疫的时机及免疫剂量。

强化免疫：1针，一般在基础免疫结束后1个月进行，免疫剂量为2-3mL/条，在强化免疫后14天和30天时试血测定抗体效价，当抗体效价达峰值后安排采血。

3.采血及血清分离

采用颈静脉或股静脉放血，血液用灭菌离心瓶收集，采血前在离心瓶中加入少量灭菌生理盐水，采血时使生理盐水充分润壁。采血结束后将离心瓶置室温放置，待血块凝固并收缩后放入4℃冷室过夜，之后5000rpm离心30分钟，分离收获血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.半成品与成品制备及标准检测：

a.将同一批收获的高免血清混合后，用0.22μm滤膜过滤除菌，即获得制品原液。

b.通过微量细胞中和试验检测制品原液抗体效价，并根据效价稀释或浓缩血清，使血清中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256，此即为制备联合高免血清的半成品。

c.将同一批收获的高免血清混合后，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达50％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，用与血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达33％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小时，再用PBS透析24小时，收获透析袋内液体，用0.22μm滤膜过滤除菌，此即为制备联合抗体制剂的半成品。通过微量细胞中和试验检测抗体效价，并根据效价稀释或浓缩抗体溶液，使抗体溶液中犬瘟热病毒中和抗体效价不低于1∶256。

d.上述半成品经检定合格后，可直接分装或加入保护剂后制成冷藏制剂或冻干制剂。

抗犬瘟热高免血清冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热高免血清冻干注射剂

取半成品按血清∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。

保护剂配方：10-20％明胶+40-50％蔗糖。

抗犬瘟热抗体冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬瘟热抗体冻干注射剂

取半成品按抗体∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。保护剂同上。

其它项应符合中华人民共和国药典2000年版冻干注射液项。

实施例6

以犬制备的犬科动物用抗犬细小病毒性肠炎高免血清制剂

1.免疫原制备

将犬细小病毒接种F81细胞，37℃转瓶培养2-3天收毒，反复冻融后离心去除细胞碎片，取样测定病毒滴度。将病毒液稀释至病毒滴度大于10^4.0个TCID₅₀/0.01mL后，按病毒液∶佐剂＝9∶1的比例加入铝胶佐剂，制成免疫原，4℃保存。

2.动物免疫：挑选经检验健康的犬作为受试动物。分基础免疫和强化免疫两个阶段进行免疫，免疫采取皮下、肌肉注射途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。

基础免疫：2针，第1针用量0.5-1mL/条，第2针1-2mL/条，间隔14天，第2针免疫1个月后试血测定抗体效价，根据效价确定加强免疫的时机及免疫剂量。

强化免疫：1针，一般在基础免疫结束后1个月进行，免疫剂量为2-3mL/条，在强化免疫后14天和30天时试血测定抗体效价，当抗体效价达峰值后安排采血。

3.采血及血清分离

采用颈静脉或股静脉放血，血液用灭菌离心瓶收集，采血前在离心瓶中加入少量灭菌生理盐水，采血时使生理盐水充分润壁。采血结束后将离心瓶置室温放置，待血块凝固并收缩后放入4℃冷室过夜，之后5000rpm离心30分钟，分离收获血清。

4.病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时。

5.半成品与成品制备及标准检测：

a.将同一批收获的高免血清混合后，用0.22μm滤膜过滤除菌，即获得制品原液。

b.通过微量血凝抑制试验检测制品原液抗体效价，并根据效价稀释或浓缩血清，使血清中犬细小病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。此即为制备联合高免血清的半成品。

c.将同一批收获的高免血清混合后，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达50％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，用与血清等量的PBS(0.015M，PH7.4)溶解，加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵浓度达33％，室温静置1小时后4000rpm离心15分钟，取沉淀，透析袋包裹后流水透析48小时，再用PBS透析24小时，收获透析袋内液体，用0.22μm滤膜过滤除菌，此即为制备联合抗体制剂的半成品。通过微量血凝抑制试验检测抗体效价，并根据效价稀释或浓缩抗体溶液，使抗体溶液中犬细小病毒血凝抑制抗体效价不低于1∶128。

d.上述半成品经检定合格后，可直接分装或加入保护剂后制成冷藏制剂或冻干制剂。

抗犬细小病毒高免血清冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬细小病毒高免血清冻干注射剂

取半成品按血清∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。

保护剂配方：10-20％明胶+40-50％蔗糖。

抗犬细小病毒抗体冷藏注射剂

取半成品经无菌分装后即得，每瓶5ml，封口，置0-4℃冷藏保存。

抗犬细小病毒抗体冻干注射剂

取半成品按抗体∶保护剂＝7∶1的比例加入保护剂后无菌分装，每瓶5ml，经冷冻干燥后封口即得。保护剂同上。

其它项应符合中华人民共和国药典2000年版冻干注射液项。

Claims (3)

1、一种犬科动物抗犬科动物重要疫病高免血清的制备工艺，包括以下步骤：

1)免疫原的制备：以一种或几种引起犬科动物重要疫病的病原，经与病毒增殖相适应的犬或猫、猴原代细胞或传代细胞以及与细菌增殖相适应的细菌培养基进行培养增殖，使病毒滴度达104个TCID50/0.1mL以上或细菌细菌浓度达2×109个/mL以上后，经减毒或细菌灭活处理，与免疫佐剂按1~9∶1的比例混合制成免疫原，制备单一或联合血清时将所制免疫原单独或几种混合后对犬、貉、狐等犬科动物进行免疫；

2)动物免疫：选用经检查健康合格的犬科动物进行免疫；

3)采血及血清分离：强化免疫后14-30天之间进行试血，测定抗体效价并采血；

4)病毒灭活：在收获的高免血清中加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的吐温80，在24℃放置至少6小时，或加入终浓度为0.3％-0.5％的TNBP和1％-3％的Triton X-100，在24℃放置至少4小时；

5)成品制备及检定：将收获的高免血清经过滤除菌后，进行效价测定并按一定效价进行稀释或浓缩，或经硫酸铵盐析法提取抗体，得本发明产物。

2、根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤1)中犬科动物重要疫病的病原选自犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒I、II型、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬钩端螺旋体等病原体，包括强毒株和弱毒株。

3、根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤2)中的免疫分基础免疫和强化免疫两个阶段，一般基础免疫2针，强化免疫1针，采用肌肉或皮下多点注射途径，每个针次间隔14-30天，免疫原用量根据所用免疫原滴度而定。