CN1947727A - 抗蝰蛇毒血清及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗蝰蛇咬伤的生物药品及其制备方法，它是由园斑蝰蛇蛇毒免疫马匹获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的液体或冻干免疫球蛋白制剂，具有特异性中和蝰蛇毒素的作用；本发明的抗蝰蛇毒血清效价高，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD₅₀以上，相当于4mg干毒，高于英国药典之规定；在临床试验中有效率为98.5％，治愈率达91％，没有出现不良反应，洗明本发明的抗蝰蛇毒血清疗效好，安全性高。

Description

抗蝰蛇毒血清及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗蛇毒血清及其制备方法，尤其涉及抗蝰蛇毒血清及其制备方法。

背景技术

抗蛇毒血清的研究已有100多年的历史。首先应用于临床的是在印度制备的抗眼镜蛇毒血清。以后，世界上就有许多科学工作者从事这一研究工作，均因免疫效价低，纯化技术等问题而未能被广泛应用于临床。高效价、高纯度并广泛用于临床的抗蛇毒血清也才数十年的历史。目前，世界上有20多个国家30多个机构利用60多种毒蛇的蛇毒生产抗蛇毒血清，现有近百种单价和多价抗蛇毒血清。

我国早在1923年，首先在台湾研制抗蛇毒血清。1969年，上海生物制品研究所开展抗蛇毒血清的研制工作。首先对分布广、危害大、占蛇伤大多数的蝮蛇进行研究，对抗原(蛇毒)进行减毒处理，然后对马匹进行免疫，获得满意的效价。在1970年，由浙江医科大学和浙江省中医研究所承担了临床验证，结果证明精制抗蝮蛇毒血清反应小、疗效显著，深受病者和医务工作者的欢迎。以后又相继研制成抗五步蛇、抗银环蛇、抗眼镜蛇血清。抗蛇毒血清的研制成功，为我国填补了空白，克服了中草药治疗蛇伤的严重缺点，极大地保护了蛇伤病人的生命，取得了巨大的社会效益。

蝰蛇属蝰科，主要分布于我国华南地区、国外马来半岛及印支诸国，它是我国主要毒蛇之一。对野外、山林及农业生产工作者危害极大。近几年来，食蛇人数不断扩大，食蛇饲养咬伤者亦日益增多，特别是我国广东、福建一带蝰蛇咬伤病人的大大增加。

国外已有抗蝰蛇毒血清产品上市，主要针对分布于欧洲的蝰蛇种类制备，已生产使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清等。英国药典1993年版第二卷记载的河蝰、毒蝰、极北蝰、草原蝰抗血清的效价为：

抗Vipera ammodytes Venom(河蝰)血清每毫升中和效价不低于100LD₅₀；

抗Vipera aspis Venom(毒蝰)血清每毫升中和效价不低于100LD₅₀；

抗Vipera berus Venom(极北蝰)血清每毫升中和效价不低于50LD₅₀；

抗Vipera ursinsi Venom(草原蝰)血清每毫升中和效价不低于50LD₅₀；

国外现有的产品主要是基于欧洲分布的蝰蛇种类制备的，由于不同种类的蝰蛇蛇毒抗原特异性具有种属差异，国外现有的抗血清用于治疗我国蝰蛇咬伤患者，针对性差；另外蝰蛇排毒量多，毒性强，咬伤后发病迅速，死亡率高，国外现有的抗血清效价偏低。因此，本领域迫切需要高效价、针对国内分布的蝰蛇蛇毒的抗血清。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效价抗蝰蛇毒血清，以克服现有抗血清效价低、针对性不强的问题。

本发明的另一目的是提供上述抗蝰蛇毒血清的制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种以园斑蝰蛇(Vipera russelli SiamensisSmith)蛇毒为抗原，免疫马匹获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制得的抗蝰蛇毒血清，蛋白含量≤170g/l、pH 6.0-7.0、氯化钠含量7.5-9.5g/l、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)₂≥60％、中和效价≥500LD₅₀/ml、类A型物质≤4μg。

本发明的第二方面，提供了抗蝰蛇毒血清的制备方法，包括如下步骤：

1.制备免疫血浆：

园斑蝰蛇取毒，新鲜毒液经2000-2500转离心处理10~20分钟左右，取上清冻干，用福尔马林处理减毒，作为免疫用抗原；选择健康马匹，用常规方法进行基础免疫、超免疫待血浆效价超过100U/ml后采血，分离血浆；

2.精制提纯：

消化：将制得的免疫血浆2-4倍稀释，调温至29-31℃，调节pH至3.0-3.3之间，加入溶化胃酶，消化1-1.5小时；

第一次沉淀及加热处理：上述消化液加18~22％(g/ml)硫酸铵，调pH至4.8-5.2，加温至56~60℃并保温20~40分钟，降温过滤分离，取清液，弃沉淀；

盐析：上述清液调节pH至7.2-7.4之间，每100ml加硫酸铵15~25g，取沉淀，弃清液；

明矾沉淀：上述沉淀稀释至蛋白含量约1~3％(g/ml)，使沉淀完全溶解，在温度不高于10~30℃下加入明矾溶液使最终含量为0.8-1.2％(g/ml)，调节pH至7.7-7.9，吸附05~1.5小时，过滤分离，取清液，弃沉淀；

浓缩：将上述清液用原体积1~4倍的注射用水多次稀释，用3~5万分子量的滤膜超滤浓缩至原体积的5~20％使硫酸铵含量在0.1％(g/ml)以下；

原液处理：将上述浓缩液加入注射用水，调整固体总量不超过20％(g/ml)；加氯化钠使最终含量为0.85-0.95％(g/ml)；加入氯仿使最终含量为0.4~0.6％(ml/ml)；调pH至6.0-7.0，得抗蝰蛇毒血清原液。

本发明的有益效果体现在：

本发明以国内园斑蝰蛇(Vipera russelli Siamensis Smith)蛇毒为抗原，其抗原性较好；获得的抗蝰蛇毒血清免疫效价高，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD₅₀以上，相当于4mg干毒，高于英国药典之规定；在临床试验中有效率为98.5％，治愈率达91％，没有出现不良反应，说明本发明的抗蝰蛇毒血清疗效好，安全性高。

具体实施方式

基础免疫、超免疫

马匹免疫从马体初次接受免疫原刺激，到产生少量抗毒素即第一次免疫应答的出现，需要一定的时间。这一阶段在制造抗血清的工作中被称作“基础免疫”。基础免疫对于以后的强化免疫即所谓“超免疫”影响很大。有了第一次免疫应答后，再次接触同一免疫原就会迅速出现第二次免疫应答，抗毒素效价将会急剧上升。由第一次应答到第二次应答之间的有效间隔期，将视马体状态与免疫原的种类、性状及剂量等而异，一般需要1-2个月以上，也可至半年以上。即使超过一年，对首次刺激的记忆也不会完全消失，对再次刺激仍会出现水平相当高的第二次应答。对超免疫成功的马匹予以采血并开始再次免疫注射，如此反复的每一循环通称“1程”、“2程”……超免疫。

基础免疫水平、免疫原的强度、注射次数及注射间隔时间、前后程间的间隔时间等都是对超免疫的成败、免疫应答水平的持久性以及马体健康状态有影响的因素，须根据实践经验与具体条件适当调节，制订最佳免疫实施方案。

抗蛇毒血清的制备首要条件是蛇毒(抗原)、动物(免疫对象)和纯化设备(抗体提纯)。选择健康蛇取毒，新鲜毒液经2000-2500转离心处理15分钟左右，以除去杂质，上清经冻干成粉状备用。干燥蛇毒需测定其毒力，应选择毒性强、抗原谱广(免疫电泳检验)的蛇毒作为抗原。

在作免疫抗原时，必须除菌处理，因为蛇毒中常混有使动物致病的厌氧菌。由于蛇毒的毒性强，抗原性较差，加大剂量以增强免疫刺激性，在免疫过程中会造成动物死亡，所以对免疫用的蛇毒需减毒处理。减毒处理方法较多，较好的也常用的方法是福尔马林减毒法。

为加强对动物的免疫刺激性，通常在抗原中加进非特异性刺激剂，称佐剂。可采用不完全佐剂，其配比为羊毛脂1份、石蜡油2份，置玻璃瓶中摇匀(加温)，经高压灭菌，然后将灭菌佐剂与等体积抗原混合便成免疫用抗原。

作为免疫用马，必须经检疫合格之健康。免疫剂量根据抗原性质(毒性及抗原性)而定，通常以小剂量开始渐次递增。

在免疫马匹时注意到如下几点：

(1)免疫原注射时采取皮下、肌内、皮内、静脉、腹腔等途径。注射部位为颈部两侧、脊背两侧、臀部两侧。采用“多点分散、每点少量”的注射方法。

(2)按一般规律，每注射一次免疫原后，抗血清效价会发生波动，波峰逐次升高。达到最高水平后则可能趋于逐次渐降。掌握波动规律，抓住最好时机进行注射与采血，对于抗血清生产很有利。

(3)有的马匹在长期免疫、采血的过程中，抗血清效价达到一定水平后不仅不再上升，反而逐渐跌落，对免疫原的再刺激毫无应答。此现象被称为“免疫麻痹”，可能与免疫原的性质及注射剂量、注射的频率及间隔时间等有关；也可能是免疫原中混杂的免疫抑制性物质引起的。对此，应给该马以足够时间的休息，以解除抑制作用，然后调整免疫方案，重新开始超免疫。

中和抗体

用蛇毒减毒抗原免疫马匹制备的马抗蛇毒血清，主要成分为中和抗体，分子结构与人的IgG基本相同。经胃酶处理，IgG分子在重链间的二硫键的Fc端被切断。切下的Fc片段无抗毒活性，不耐热，经继续消化与热变性而去除。保留下来的F(ab)2片段具有抗毒活性，其作用机理为：中和抗体与蛇毒蛋白分子结合，封闭蛇毒蛋白与细胞膜上受体的结合位点，阻止蛇毒与人体细胞结合，起到抗毒作用。

抗体效价测定

抗血清的效价测定按国际通用的中和试验法进行动物试验，其方法是把抗原和特异性抗体作用一定时间后，再给动物注射，借助动物体的反应情况来判定抗血清的效价。本发明所用的动物试验方法是以动物死亡为反应指征，以小白鼠注射抗蛇毒血清与蛇毒混合液后，动物的生存死亡情况，确定血清的效价。

免疫血浆效价的测定采用固定血清剂量、改变蛇毒剂量的方法，即取1毫升血清加入1毫升含不同浓度蛇毒溶液(蛇毒以LD₅₀、MLD或mg为单位)，混合后置37℃1小时，注射小白鼠体内(iv或im)作中和反应测定之，以含蛇毒最高剂量动物不死亡为中和终点，计算1毫升血清中和蛇毒数量。

成品检定效价常用ED₅₀，参照《免疫检测技术》(第二版，徐宜为编著)文献规定的方法测定。

一、制备免疫血浆

按《中国生物制品规程》中《生物制品生产用马匹检疫及管理规程》的规定，选用健壮、无传染病(包括马传染性贫血、马鼻疽、布氏杆菌病、马副伤寒性流产及其他传染病)和无恶性肿瘤等疾病的马匹制造马抗蝰蛇毒血清，最好是4-12岁的马匹，过幼者免疫器官发育不健全，过老者免疫机能忌退。

抗原及其制备：

抗原为园斑蝰蛇(Vipera russelli Siamensis Smith)蛇毒，选择健康蛇取毒，新鲜毒液经2000-2500转离心处理15分钟左右，按《除菌过滤岗位标准操作细则》(QB/WIBP JS 30003-2002)进行除菌处理以除去杂质，上清经冻干成粉状备用。使用前将蛇毒干粉用注射用水稀释5~10倍，加入0.3～1.0％福尔马林，处理3～10天减毒；得到的减毒蛇毒作为免疫抗原。

基础免疫：采用二针次免疫。

佐剂比例：抗原∶羊毛脂∶液体石蜡

3∶1∶2

注射剂量及时间：第1天1ml，第8天2ml

超免疫：采用五针次免疫

抗原：蝰蛇毒素。

注射剂量及时间：

第一程  第1针：第1天       2-10ml

第2针：第8天      2-20ml

第3针：第15天     2-20ml

第4针：第22天     4-25ml

第5针：第29天     10-25ml

7天后测定血液中抗体水平

采血：免疫成功马匹可采血，按马匹体重进行采血，通常采二次血，间隔一天。采血后休息一星期，然后继续免疫，采血、再免疫。达到预定效价即免疫成功，达不到者继续免疫。

采血量：每千克体重16-20ml。

休息7天后进行下程免疫。

第二程：

第二程及以后各程采用二针次或三针次免疫

二针次  第1针：第1天    10ml

第2针：第8天     20ml

三针次  第1针：第1天    5ml

第2针：第8天     8ml

第3针：第15天    10ml

采血时间在末次注射后第8天起。

休息7天后进行下程免疫。

二、精制提纯

用于精制的血浆应符合《中国生物制品规程》中附录《抗毒素生产用马匹免疫方法》的规定，不得有严重溶血或严重黄疸，投产前混合血浆的效力检定应合格。

对血浆的要求：

制造抗蝰蛇毒血清的血浆，应符合《中国生物制品规程》(2000年版)《抗毒素生产用马匹免疫方法》的规定。

投产精制用的血浆应无染菌、无溶血、无黄疸、应不混入血球。

装盛血浆的立瓶，应无裂缝、无破损、包扎严紧。

血浆效价：抗蝰蛇毒免疫马血浆每瓶血浆效价要求在100U/ml，低于100U/ml不能使用。

血浆的准备：

每批血浆投产量，按大罐容积，计算投入血浆量(按照规程2-4倍稀释)。

在冷库内查对血浆种类、瓶号、马号、分浆日期、装量、效价，选好后，搬运至缓冲间。

收集血浆瓶签，去除瓶口外包装，清洁血浆瓶外壁，作好血浆混合记录。

制造程序：

消化：将注射用水注入大罐内，查对大罐所盛注射用水量，测量水温(要求不高于48℃)。揭开血浆瓶塞，按照2-4倍稀释量将血浆倒入大罐中，启动搅拌马达，慢速搅拌均匀；取血浆稀释液50ml，留样送检定，并测pH值，调温至29-31℃，用2mol/L HCl调节pH至3.0-3.3之间，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速搅拌，消化1-1.5小时。

第一次沉淀及加热处理：取上述消化液20ml，测pH值。快速搅拌，加15％(W/V)硫酸铵。用2mol/L NaOH调至pH4.8-5.2，并测量消化液温度，用流通蒸汽通过消化罐夹层加温至58℃并保温30分钟；通过大罐夹层迅速降温过滤分离，取清液，弃沉淀。

盐析：上述清液，用2mol/L NaOH调节pH7.2-7.4，慢速搅拌，每100ml加硫酸铵20g。过滤分离，取沉淀，弃清液。

明矾沉淀：将适量注射用水贮于大罐内，备用。测量水温不得高于30℃，将捣碎的沉淀称量，置大罐内稀释至蛋白含量约2％(g/ml)，慢速搅拌，使沉淀完全溶解，并测量温度不得高于30℃，加10％(g/ml)明矾溶液，最终含量为0.8-1.2％(g/ml)。取样，测pH值，用2mol/L NaOH调节pH至7.8，搅拌，吸附1小时，过滤分离，取清液，弃沉淀。

浓缩：将上述清液混合通过超过滤装置，用5万分子量的滤膜，进行浓缩，至体积为十分之一时稀释7倍使硫酸铵含量在0.1％(g/ml)以下。

原液处理：将上述浓缩液加入注射用水，调整固体总量不超过20％(g/ml)；加氯化钠使最终含量为0.9％(g/ml)；加入氯仿使最终含量为0.5％(ml/ml)；调pH至6.5。

澄清除菌过滤：

按《除菌过滤岗位标准操作细则》(QB/WIBP JS 30003-2002)进行操作。制成的抗毒素原液，须在冷暗处保存至少1个月作为稳定期。

原液检定：

无菌试验    按《生物制品无菌试验规程》A项进行。

热原质试验    按《生物制品热原质试验规程》进行。

类A型物质含量测定    按《抗毒素制造及检定规程》附录6进行。

半成品配制与除菌

配制：将检定合格的原液，按出品规格以注射用水准确稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量。

除菌过滤：按《除菌过滤岗位标准操作细则》(QB/WIBP JS 30003-2002)进行。

经检定，本发明方法制备的抗蝰蛇毒血清，符合《中国生物制品规程》(2000年版)对抗蛇毒血清的要求：蛋白含量≤170g/L、pH 6.0-7.0、氯化钠含量7.5-9.5g/L、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)₂≥60％、中和效价≥500LD₅₀/ml、类A型物质≤4μg。

三、分包装

按《生物制品分装规程》进行，规格为5000U/瓶。本品有液体及冻干两种类型，冻干制品分装后应立即在-30℃以下进行冷冻，根据水含量调整干燥时间，干燥完毕后进行真空封口。

四、效价测定

1.试验动物：体重为18-20g的小白鼠。

2.抗蝰蛇毒血清血清参考标准品：由中国药品生物制品检定所制备及提供。

3.待检定血清样品的稀释

稀释液：硼酸盐缓冲液，灭菌后pH应为7.1；

将待检抗蛇毒血清稀释成数个稀释度，使每ml抗蝰蛇毒血清约含5U或其上下；各稀释度间隔7.5％。

具体的稀释方法：

待检血清稀释	稀释血清量	预估待检血清效价
			100倍	1ml	100U
120倍	1ml	120U
			140倍	1ml	140U
160倍	1ml	160U
			180倍	1ml	180U

4.抗蝰蛇毒血清参考标准品的稀释

使每1ml含抗蝰蛇毒血清各5U，即与5个相应蛇毒试验量混合后每0.4ml注射量中含1U或2U。

5.蛇毒稀释

蛇毒试验量指：蛇毒稀释后，与血清参考标准品混合，注射动物后表现出的结果，为50％受保护。

使其5个试验量不超过0.8ml，在与抗蛇毒血清混合时补加稀释液至2ml，即每0.4ml注射量中含1个试验量。

6.混合

待检组：量取不同稀释度之抗蛇毒血清各1ml，分别装于小试管中，每管加入5个试验量与待检抗蛇毒血清相应的稀释蛇毒液，补加稀释液至2ml，混合均匀，封口。

对照组：按下表量取已稀释之标准抗蛇毒血清，分别装入小试管中：

                                    对照①    ②对照

抗蝰蛇毒血清参考标准品(5U/ml)       1ml       1.2ml

每管加入5个试验量之相应稀释蛇毒液，补加稀释液至2ml，混合均匀，封口。

将以上两组，置水浴箱中于37℃结合45分钟后立即注射小鼠。

7.注射

每个稀释度的待检抗蛇毒血清，对照①及对照②各注射小鼠4只，每只腹腔注射0.4ml。

8.观察

试验小鼠每日观察一次，观察48小时，并记录发病及死亡情况。

9.结果判断

对照①小鼠死亡50％以上，对照②小鼠应比对照①死亡晚或不死亡。

待检血清之效价应以与对照①小鼠同时死亡的最高稀释度判定。

试验小鼠死亡情况发生倒置或对照不成立，应重试。

经检验，本产品效价为≥500U。

五、临床试验

本产品在广州医学院协作进行了小量人体临床疗效考核，用于蝰蛇咬伤患者的治疗。采用静脉注射，也可做肌内或皮下注射。

治疗剂量：注射量7500-U，1次注射，儿童与成人用量相同。以后视病情决定注射剂量与间隔时间。过敏试验为阳性反应者慎用。

使用中出现过敏反应的处理：

(1)过敏休克  可在注射中或注射后数分钟至数十分钟内突然发生者突然表现沉郁或烦躁、脸色苍白或潮红、胸闷或气喘、出冷汗、恶心或腹痛、脉搏细速、血压下降，重者神志昏迷或虚脱，如不及时抢救可以迅速死亡。轻者注射肾上腺素后即可缓解；重者需输液输氧，使用升压药物维持血压，并使用抗过敏药物及肾上皮质激素等进行抢救。

(2)血清病  主要症状为荨麻疹、发热淋巴结肿大、局部浮肿，偶有蛋白尿、呕吐、关节痛，注射部位可出现红斑、瘙痒及水肿。一般系在注射后7～14天发病，称为延缓型。有在注射后2～4天发病，称为加速型。对血清病应进行对症疗法，可使用钙剂或抗组织胺药物，一般数日至十数日即可痊愈。

使用本发明药物的注意事项：

本品有液体及冻干两种类型。制品混浊，有摇不散的沉淀、异物或安瓿有裂纹，标签不清，过期失效者均不可使用。安瓿打开后应一次用完。冻干制品应加标签规定量灭菌注射用水，轻摇使完全溶解。每次注射须保存详细记录，包括姓名、性别、年龄、住址、注射次数、上次注射后的反应情况、本次过敏试验结果及注射后反应情况、所用抗血清的生产单位名称及批号等。使用抗血清须特别注意防止过敏反应。注射前须详细询问既往过敏史，凡本人及其直系亲属曾有支气管哮喘、枯草热、湿疹或血管神经性水肿等病史，或对某种物质过敏，或本人过去曾注射过马血清制剂者，均须特别提防过敏反应的发生。注射前必须做过敏试验。

过敏试验  用氯化钠注射液将抗血清稀释20倍(0.1ml抗血清加1.9ml氯化钠注射液)，在前臂掌侧皮内注射0.1ml，观察30分钟。注射部位无明显反应者，即为阴性，可在严密观察下直接注射抗血清。如注射局部出现皮丘增大、红肿、浸润，特别是形似足或有痒感者，为阳性反应，必须用脱敏法进行注射。如注射局部反应特别严重或除局部反应外并伴有全身症状，如荨麻疹、鼻咽刺痒、喷嚏等，为强阳性反应，则应采用脱敏注射，并做好一切准备，一旦发生过敏休克，立即抢救。无过敏史或过敏反应阴性者，也并非没有发生过敏休克的可能。为慎重起见，可先注射小量于皮下进行试验，观察30分钟，无异常反应，再将全量注射于皮下或肌内。

脱敏注射法  在一般情况下，可用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍，分小量数次作皮下注射，每次注射后观察20～30分钟。第1次可注射1ml，观察无紫绀、气喘或显著呼吸短促、脉搏加速时，即可注射第2次2ml，如注射量达到4ml仍无反应，可缓慢地将全量注入。门诊病人注射抗血清后，须观察至少30分钟方可离开。

结果：共治疗67例蝰蛇咬伤中毒患者，有效率为98.5％，治愈率达91％，在用血清治疗过程中没有出现不良反应，证实抗蝰蛇毒血清用于治疗蝰蛇咬伤是一种副作用小，而且安全的特效药。

Claims (3)

1.一种抗蝰蛇毒血清，以园斑蝰蛇蛇毒为抗原，免疫马匹获得免疫血浆，经胃酶消化后用硫酸铵盐析法制备，其蛋白含量≤170g/l、pH 6.0-7.0、氯化钠含量7.5-9.5g/l、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)₂≥60％、中和效价≥500LD₅₀/ml、类A型物质≤4μg。

2.一种抗蝰蛇毒血清的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备免疫血浆：

以园斑蝰蛇毒作为免疫用抗原，选择健康马匹，进行基础免疫、超免疫待血浆抗体效价超过100U/ml后采血，分离血浆；

(2)精制提纯：

消化：将制得的免疫血浆2-4倍稀释，调温至29-31℃，调节pH至3.0-3.3之间，加入溶化胃酶，消化1-1.5小时；

第一次沉淀及加热处理：上述消化液加浓度为18~22％(g/ml)硫酸铵，调pH至4.8-5.2，加温至56~60℃，保温20~40分钟，降温过滤分离，取清液，弃沉淀；

盐析：上述清液调节pH至7.2-7.4之间，每100ml加硫酸铵15~25g，取沉淀，弃清液；

明矾沉淀：上述沉淀稀释至蛋白含量为1~3％(g/ml)，使沉淀溶解，在温度为10~30℃下加入明矾溶液使最终含量为0.8-1.2％(g/ml)，调节pH至7.7-7.9，吸附05~1.5小时，过滤分离，取清液，弃沉淀；

浓缩：将上述清液用4.5~5.5万分子量的滤膜超滤浓缩至原体积的5~15％时稀释5-8倍使硫酸铵含量在0.1％(g/ml)以下；

原液处理：将上述浓缩液加入注射用水，调整固体总量不超过20％(g/ml)；加氯化钠使最终含量为0.85-0.95％(g/ml)；加入氯仿使最终含量为1.4~0.6％(ml/ml)；调pH至6.0-7.0，得抗蝰蛇毒血清原液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以园斑蝰蛇取毒，新鲜毒液经2000-2500转离心处理10~20分钟，取上清冻干，用福尔马林处理减毒，获得免疫用抗原。