CN1618965A - 一种新型的日本血吸虫优势抗原分子 - Google Patents

Abstract

本发明克隆表达了具有早期诊断价值的日本血吸虫虫卵主要蛋白P38(SjP38)基因，构建了能高效可溶性表达P38基因的工程菌，建立了简便快捷的重组蛋白纯化方法，获得了具有良好抗原活性的重组蛋白，制备了重组抗原特异的单克隆抗体，为血吸虫病的诊治研究提供了一种新型优势抗原分子，为实现新型的标准化、产业化生产的血吸虫病诊断试剂奠定了工作基础。

Description

一种新型地日本血吸虫优势抗原分子

技术领域

本发明涉及日本血吸虫虫卵主要蛋白P38(SjP38)的cDNA、及利用其表达载体构建工程菌株制备具有抗原活性的重组蛋白、利用重组蛋白制备抗rSjP38单克隆抗体。

背景技术

血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，广泛流行于亚洲、非洲、南美洲的74个国家，是世界卫生组织(WHO)界定的“六大热带病”之一，世界上约有6亿人口受威胁，有2亿人感染。在我国，日本血吸虫病是重点防治的五大寄生虫病之一，主要分布于长江流域及其以南的湖南、湖北、安徽、江西等省个县市，严重威胁着疫区人民群众的生命财产安全。近些年来，在一些过去已得到良好控制的地区血吸虫病又呈现“死灰复燃”趋势，局部地区爆发性流行使全国为之震惊。因此，血吸虫病的防治仍是一个有关国计民生的重大课题。

目前血吸虫病主要的防治对策仍是进行化疗及在易感地区灭螺，但疫区耕牛等大量保虫宿主以及居民大量再感染的存在(再感染率在某些地区可高达54.5％)加大了血防工作的难度，因而，以“诊断—化疗”模式确定治疗和重复治疗人群的措施在我国国情下最为经济实用。血吸虫病的主要危害在于虫卵所分泌的可溶性虫卵抗原(SEA)导致的肉芽肿病变，若能实现早期诊断，便可及时及早地诊治病人与家畜，以阻断疾病严重病变的发生发展，此对劳动力的保护以及生产力的提高都具有重要意义。

目前血吸虫病免疫学诊断方法与试剂不少，但广泛应用于疫区基层与现场的仍然是用粗抗原如可溶性虫卵抗原制备的间接血凝法和ELISA等。不仅方法复杂，难以满足现场查病简便快捷的要求，而且诊断用抗原成分复杂，难以达到早期诊断、疗效考核、高敏特异的查病要求。目前血吸虫病免疫学诊断研究中尚存在着以下几个方面迫切需要解决的问题：1.诊断用抗原、抗体的大批量来源及其质量监控问题；2.诊断方法的进一步标准化、简易快速化、产业化而真正面向基层与现场；3.诊断试剂的诊断效能尚有待提高，尤其是解决早期诊断、区分现症与既往感染等问题。4.循环抗体(CAb)检测和循环抗原(CAg)检测各有利弊，实现CAg和CAb联合检测是今后血吸虫病诊断试剂的发展方向。

一批血吸虫优势诊断分子抗原的鉴定及近年来基因工程技术的发展应用，给抗原生产带来了新的思路。国内外正试图利用基因工程的手段来大规模获取血吸虫诊断性抗原，但尚无商品化产品出现。

发明内容

本发明的目的在于运用日本血吸虫早期感染动物血清筛选cDNA文库，获得具有早期诊断潜能的优势抗原分子日本血吸虫虫卵主要蛋白P38基因(SjP38)，其表达产物和单克隆抗体。

上述目的通过以下技术措施实现：

运用早期感染动物血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库而获得具有早期诊断血吸虫病潜能的优势抗原分子日本血吸虫主要虫卵蛋白P38基因(SjP38)，SjP38的cDNA，序列全长1206bp，1-1065bp为一完整的开放读码框，编码355aa，理论预测分子量为39233Da，蛋白质等电点pI＝6.06；它的核苷酸序列如下：

1      GTTATGTCGG GTACACATCA AAACCATGCA GTTAGTATTC CTGTGAACCG TGAGCAATGT

61     TCATTTCCGA GGCATAGACA CGAACTGCTA CAGAATGTGG GGAAAGCCAG TAAAAGCGGT

121    CAGTTGGGTT CAGTAGTGCC ATACACGGAA GACTGGCCCA GTTCAGTGAG TAACTGGATA

181    GAGTCTTCGT TGAAAAGCTG GGACAAAGAA ATGGAACGTT TAAGGCGAGG AATGTTTGCT

241    CTGTTGCCAA TGGATCGCTT CATGGACGGA ATCCCACATG ATCCGTTGGG AATGATGCAT

301    GAAATGGATC GTCACATTGA GGAACTTCAA AATGGGATGG GTTTAAGTGC TGTGGCGCCG

361    CTTGGATCAA CGAGTGACTA CTTGAAGGAT GCCTACGAAG TCGGCGATGA TGGCAAGGTG

421    CATTTCAAGG TGAGATTTGA CGCACAGGGT TTTGCTCCAG AAGACATCAA TGTGACGTCG

481    AGTGACAACC GTGTGACAGT GCACGCGAAG AAGGAGACGA CAACAGGTGG TAAGAAGTGT

541    AGTCATGAGT TCTGTCGTAT GATCCAGTTG CCGAAGAGTA TTGAGAATAA CCAGTTGAAA

601    TGCCGTCTGA CTGATGATGG TGTTTTGATG TTGGAGGCTC CAGTGAAAGT TGGTGAGAAT

661    AAGTCGCTGA CAATGAACGA GTCTGGTCAG GTGGGTATTC AACCGAAATC AGCGAGTCAG

721    ATACAAGCAG TTCCTGCATC GCAAGCTCTC ACTGTGAAAG GTTGTCAAGG TCTGACGGTG

781    TTGGATGATG GTGCAGGTGG CAAGAAACTG CACGTTGAGG TTCAATTGGA CCCAGTGTAC

841    CGACCAGAAG ATTTGTGTGT GAATATTGAT TCGAATCGTG TTGTGGTTAG CGGACGTCAT

901    TACAAGCAAA AGACTGATGC AAGAAGAAAG TCGAGTTCAT TCGCAGAATT CAGTCAGTCG

961    TATTCGATTC CTGAGACTGT GGATCCGTTA ACTGTGTCTG CTCAGGTAGT TGACAATATG

1021   TTGGTTGTAG AGGCACCGAT GATGAAGCAA CACGAAATCG CTCATTAGAC GAAAATATGA

1081   TTGACTGAAA TCACAATAAT TATGGTAATG ATGATATTCA CTTGTGTTAT TTAACAAATA

1141   AATACATTTG CTTACTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAACATGTC GGCCGCCT

日本血吸虫虫卵主要蛋白P38(SjP38)的氨基酸序列如下：

1     VMSGTHQNHA VSIPVNREQC SFPRHRHELL QNVGKASKSG QLGSVVPYTE DWPSSVSNWI

61    ESSLKSWDKE MERLRRGMFA LLPMDRFMDG IPHDPLGMMH EMDRHIEELQ NGMGLSAVAP

121   LGSTSDYLKD AYEVGDDGKV HFKVRFDAQG FAPEDINVTS SDNRVTVHAK KETTTGGKKC

181   SHEFCRMIQL PKSIENNQLK CRLTDDGVLM LEAPVKVGEN KSLTMNESGQ VGIQPKSASQ

241   IQAVPASQAL TVKGCQGLTV LDDGAGGKKL HVEVQLDPVY RPEDLCVNID SNRVVVSGRH

301   YKQKTDARRK SSSFAEFSQS YSIPETVDPL TVSAQVVDNM LVVEAPMMKQ HEIAHTKILT

361   EITIIMVMMI FTCVIQINTF AYSKKKKKKK KNMSAA

将SjP38亚克隆进pET-32a(+)载体，构建原核表达质粒pET-32a(+)-SjP38，转化大肠杆菌BL21(DE3)株，构成工程菌，经优化表达条件，获得高效可溶性表达，SjP38与pET-32a(+)担体蛋白(165aa)融合表达预期57Kda的重组蛋白，表达量达38％。经ELISA、Western-blot鉴定，重组SjP38蛋白可识别4、6周感染兔血清，具有较好的抗原活性。

用Ni-NTA柱纯化的重组SjP38蛋白免疫BABL/C小鼠，制备抗SjP38单克隆抗体，用ELISA、Western-blot鉴定抗SjP38单克隆抗体，可识别重组SjP38蛋白和天然虫卵可溶性蛋白(SEA)中的38kDa蛋白。

本发明运用早期感染动物血清筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库而获得具有早期诊断血吸虫病潜能的优势抗原分子SjP38；SjP38的工程菌能高效表达具有较好抗原活性的可溶性重组蛋白，所制备的单克隆抗体可识别重组SjP38蛋白和天然虫卵可溶性蛋白(SEA)中的38kDa蛋白。血吸虫病的主要危害来自虫卵所分泌的可溶性虫卵抗原(SEA)导致的肝脏等器官组织的肉芽肿病变，若能在疾病的早期尚无特异性临床症状时进行诊断，就可及早诊治病人，防止重要病变的发生与发展，具有重要意义，这些均为构建标准化的血吸虫病诊断试剂盒打下了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明的流程示意图；

图2 pGEM-T-SjP38重组质粒的酶切鉴定图；

图中1.重组质粒Nco/Hind双酶切  2.纯化的SjP38 PCR产物  3.重组质粒Nco单酶切  4.线性化pGEM-T空载体  5.分子量标志物

图3 pET-32a(+)-SjP38的重组质粒酶切鉴定图；

图中1.线性化pET-32a(+)空载体  2.重组质粒Nco单酶切  3.纯化的SjP38插入片段  4.重组质粒Nco/Hind双酶切  5.分子量标志物

图4 pET-32a(+)-P38工程菌诱导时机的优化；

1、诱导前；2、0.5h加入1mM IPTG诱导4小时；3、1h加入1mM IPTG诱导4小时；4、1.5h加入1mM IPTG诱导4小时；5、2h加入1mM IPTG诱导4小时；6、2.5h加入1mM IPTG诱导4小时；7、3h加入1mM IPTG诱导4小时；8、3.5h加入1mM IPTG诱导4小时；9、4h加入1mM IPTG诱导4小时；10、低分子量蛋白标志物

图5 pET-32a(+)-P38工程菌诱导时间的优化；

1、诱导表达1h，2、诱导表达2h，3、诱导表达3h，4、诱导表达4h，5、诱导表达5h，6、诱导表达6h

图6 pET-32a(+)-P38工程菌诱诱导剂浓度的优化；

1、IPTG浓度0.01mM；2、IPTG浓度0.05mM；3、IPTG浓度0.1mM4、IPTG浓度0.5mM；5、IPTG浓度1mM；6、IPTG浓度5mM

图7 SjP38的纯化与SDS-PAGE分析；

1、Ni-NTA纯化rSjP38；2、诱导表达后沉淀；3、诱导表达后上清；4、诱导表达后的全菌蛋白；5、诱导表达前；6、pET-32a(+)空质粒的诱导表达；7、BL21空菌诱导表达；8、低分子量蛋白标志物

图8 rSjP38的Western-blot鉴定；

1、正常兔混合血清；2、紫外线致弱尾蚴免疫兔血清；3、日本血吸虫感染4周兔混合血清；4、日本血吸虫感染6周兔混合血清

图9 SEA与纯化rSjP38 SDS-PAGE分析；

1、SEA

2、纯化rSjP38

M、：低分子量蛋白标志物

图10单抗A6的Western-blot鉴定。

1：SEA，一抗为正常鼠血清

2：PET，一抗为正常鼠血清

3：P38，一抗为正常鼠血清

4：SEA，一抗为A6细胞上清

5：PET，一抗为A6细胞上清

6：P38，一抗为A6细胞上清

具体实施方式

           一、pGEM-T-SjP38的构建

根据TriplEx2-SjP38的测序结果设计合成SjP38 5’端引物P1：5’CAC CATGGA ATT CGT TAT GTC AGG 3’，其中引入Nco酶切位点；3’引物P2：5’CCA AGCTTG TCT AAT GAG CGA TTT CG 3’，其中引入Hind酶切位点。用P1和P2扩增获得完整特异的SjP38cDNA区。

PCR循环条件：95℃，5min；95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃，8min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用冻融法从琼脂糖凝胶中切胶回收目的DNA片段。

按Promega公司pGEM-T载体操作手册，将扩增获得的SjP38cDNA区PCR纯化产物克隆进pGEM-T载体。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种到含有Ampicillin/IPTG/X-gal的LB平板上，用蓝白斑进行初步筛选，挑白斑菌落于氨苄青霉素抗性(LB-Amp+)的LB液体培养基中37℃250rpm摇过夜，收菌提取质粒；用Nco/Hind双酶切进行鉴定。酶切鉴定结果可切出预期约1.1kb大小片段，见图1。

          二、pET-32a(+)-SjP38原核表达载体的构建

将鉴定后的SjP38基因亚克隆入原核表达载体。考虑到表达产物的应用，选取了含有能够表达polyHis、从而便于将表达产物过柱纯化的载体高效可溶性表达载体pET-32a(+)。采用双酶切定向克隆法构建表达载体，用Nco/Hind双酶切pGEM-T-P38和pET-32a(+)，切胶纯化获得SjP38cDNA插入片段和pET-32a(+)载体大片段，16℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种到含有Amp+的LB平板上，挑菌落于LB-Amp+液体培养基中37℃250rpm摇过夜，收菌提取质粒；用Nco/Hind双酶切进行鉴定，结果切出预期大小的插入片段，见图2。含有正确插入子的重组质粒送公司进行测序，证实SjP38的读码框完全正确。

         三、pET-32a(+)-SjP38工程菌的诱导表达

同上以氯化钙法制备工程菌BL21(DE3)的感受态细胞，将pET-32a(+)-P38质粒转化进表达菌BL21中，进行表达条件的优化。

将已转化pET-32a(+)-P38工程菌BL21(DE3)甘油菌涂于LB/A+固体培养平板上培养过夜，挑取生长良好的单菌落至LB/A+液体培养基中于37℃，250rpm培养过夜，然后分三个环节进行诱导表达条件的优化：

1.诱导时机：取过夜菌10ul加入1mlLB/A+液体培养基中37℃，250rpm，分别于0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，3.5h，4h后取500ul测OD值，其余分别加入1mMIPTG 0.5ul，均诱导4小时，离心4000rpm 15min，加入PH8.0裂解缓冲液，超声裂菌后取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果用英国UVP公司生产的GDS-7500型凝胶分析系统分析，在过夜菌以1∶100倍稀释后摇菌至对数增长期，在2h，2.5h，3h加入诱导剂IPTG，目的蛋白的表达达到高峰，以2.5h诱导效果最佳，表达量占菌体总蛋白的38％，2.5h加诱导剂前菌液，用721分光光度计测630nm波长OD值为0.4，见图3。

2.诱导时间：由上步取最佳诱导时机，加入0.1mM的IPTG分别诱导1h，2h，3h，4h，5h，6h，裂菌后取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定(图4)。

3.IPTG浓度：取上两步的最条件分别加入0.01mM，0.05mM，0.1mM，0.5mM，1mM，5mM，10mM IPTG进行诱导，裂菌后取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定(图5)。

以上结果可见，诱导表达条件优化，最主要的影响因素为诱导时机的控制，而对诱导时间和IPTG浓度的选择对表达量的影响不太大。最终挑取的最佳诱导表达条件为：挑取单菌落至LB-Amp+液体培养基中37℃250rpm摇过夜，次日以1∶100稀释至新鲜的LB-Amp+液体培养基中250rpm摇2.5hrs左右待细菌生长至对数增长期(OD＝0.4)后，加入1mMIPTG诱导表达4hrs，可收获38％的高效表达的重组蛋白。

       四、SjP38重组蛋白的纯化与活性鉴定

1、rSjP38的纯化

pET-32a(+)-P38表达蛋白中含6-His的担体蛋白，用QIAGEN公司Ni-NTAAgarose进行亲和层析纯化，步骤按试剂盒操作说明。

2、rSjP38的SDS-PAGE分析

pET-32a(+)-P38表达菌BL21在诱导表达前、后各取1支，1.5ml菌液/支，离心沉淀细菌，去上清后用1∶1的双蒸水：2*上样缓冲液重悬，涡旋后煮沸15-30min，12000rpm离心3-5min，用注射器针头来回抽吸以剪切DNA，12000rpm离心1min，取上清电泳。同时设立空菌、空质粒表达情况对照。

可溶性重组蛋白表达上清的制备：收集表达后的细菌，重悬于裂菌缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTA，0.2mg/ml溶菌酶)中，4ε作用过夜后，用超声裂菌或液氮冻融裂菌后，4ε12000rpm离心15min，小心吸取上清备用。沉淀同上用双蒸水：2*上样缓冲液重悬，煮沸离心后取上清电泳。

5％浓缩胶，10％分离胶，80V/120V 1.5h，R250染色。

结果见图6，pET-32a(+)-P38表达菌BL21在IPTG诱导下得到了高效表达，表达产物为预期57kDa大小，主要存在裂菌后的上清中，为可溶性表达，经Ni-NTA柱纯化可得到纯度为80％的重组蛋白。

3、Western Blot分析

用Ni-NTA Agarose纯化后的rSjP38，加等体积的2*上样缓冲液煮沸上样电泳，用Bio-Rad半干转移槽进行转膜。PVDF膜先用甲醇浸透后在转印缓冲液浸泡15min备用。转印条件10V 26min。用丽春红染色证实转印完全后，蒸馏水清洗，甲醇浸透后，PVDF膜置滤纸上于37ε30min干透。裁剪成0.5cm宽的条带，-20ε保存备用。

rSjP38 PVDF膜条加一抗，正常兔混合血清、紫外线致弱尾蚴免疫兔血清、日本血吸虫感染4周、6周兔混合血清均以稀释液1％脱脂奶pH7.4TBS 1∶100稀释，37ε孵育2h；洗涤5min*3次；加二抗37ε孵育2h，AP标记的羊抗兔二抗以1∶5000稀释；洗涤5min*3次；用底物NBT/BCIP显色5-20min，用流水冲洗终止显色。

结果：经Ni-NTA纯化后的rSjP38，可识别紫外线致弱尾蚴免疫兔血清和日本血吸虫感染4周、6周兔混合血清，证实具有较好的抗原活性(见图7)。

4、ELISA鉴定

Ni-NTA纯化后的rSjP38作为包被抗原，以ELISA法对日本血吸虫感染4周、6周兔混合血清以及正常兔混合血清进行检测，方法如下：

用重组抗原以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至2μg/ml包被96孔板，4℃过夜，然后以封闭液(含1％脱脂奶粉、0.05％Tween 20的PBS)于37℃封闭1h后，洗3次(洗液为含0.05％Tween 20的PBS)。每孔加100μl待检血清(原血清用含1％脱脂奶粉的PBS按1∶100稀释)，37℃孵育1h后，洗涤3-5次，每孔加入100μl羊抗人HRP标记的二抗(用含1％脱脂奶粉的PBS按1∶5000稀释)，37℃孵育1h，同上洗3-5次，每孔加入100μl DAB显色液显色10-20min，加入2M H₂SO₄终止显色，于Bio-Rad酶标仪上测定OD(492)值。结果：

一抗	OD值
		4周感染兔血清	1.392
6周感染兔血清	1.955
		正常兔血清	0.259

     五、纯化rSjP38单克隆抗体的制备

1、动物免疫

初次免疫  Ag 10～100μg加福氏完全佐剂皮下多点注射

             (抗原和佐剂等体积混合)

                  ↓2周后

第二次免疫  剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

             (ip剂量不宜超过0.5ml)

                  ↓2周后

第三次免疫  剂量同上，不加佐剂，ip

       (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

                  ↓2周后

加强免疫，剂量50～100μg为宜，ip或iv

                  ↓3天后

取脾融合(此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高)

         结果：rSjP38免疫小鼠血清效价的测定

免疫鼠血清稀释度	1	2	3	4	5
						1∶10000	1.345	1.167	1.347	0.937	0.437
1∶20000	0.959	0.689	0.934	0.665	0.259
						1∶40000	0.565	0.327	0.665	0.372	0.127
正常鼠血清	0.133	0.115	PBS孔	0.000	0.005

以上小鼠的效价均达到10000以上，可用于融合

2、细胞融合

(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。

(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

(6)在37℃融合：

①1min内缓慢地加入预热的1ml 50％PEG 4000

②静置90秒钟

③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，第1、2、3、4分钟分别加入1ml，2ml，5ml，8ml。

(7)离心，800rpm，8分钟。

(8)弃上清，用HAT培养液(含20％小牛血清RPMI1640和1％HAT)轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养。

3、选择杂交瘤

HAT选择培养液维持培养7-10d，即杂交瘤细胞布满孔底1/10面积，用ELISA法检测特异性抗体。

分别以重组p38抗原1ug/孔、空载蛋白petlug/孔4度包被过夜，于37用5％小牛血清封闭1h后，每孔中加入单抗A6细胞上清100ul，371h，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2500稀释)于37度作用1h后，经显色剂显色后，用2M H2SO4终止剂终止并测OD450。当前者OD450＞0.5，而后者与阴性对照OD相近时，筛选出所需要的杂交瘤细胞系阳性对照为免疫鼠血清，阴性对照为正常鼠血清。

结果：共融合5次，筛选出35株针对硫氧还蛋白位点的克隆，1株针对重组p38抗原位点克隆，命名为A6。

4、杂交瘤的克隆化(用有限稀释法)

经过HAT筛选后的杂交瘤克隆，为了保证获得持续分泌特异性抗体的细胞，采用有限稀释法进行亚克隆

制备饲养细胞悬液，每孔100ul。

阳性孔细胞计数，并分别按10、5、1、0.5个/孔稀释，每个稀释度做96孔板3列，每孔100ul。培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，用ELISA法检测特异性抗体，方法同前。

结果：经亚克隆后，该株体外连续传代2月仍保持良好的分泌p38抗体的功能。

          六、rSjP38单克隆抗体的ELISA、Western-blot鉴定

1、日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的制备

购买日本血吸虫阳性感染钉螺，释放尾蚴，感染新西兰白兔，于感染前、感染后的4周、6周采血，收集血清；于感染后的6周杀兔，取肝脏，以筛网过滤和胰酶消化法获得纯净的日本血吸虫虫卵，于-70℃冻存备用。

自-70℃取出一支压积约2ml的纯净虫卵，置玻璃匀浆器中，加入2-3mlpH5.0的柠檬酸缓冲液(内含0.1mM的PMSF)，在冰浴下匀浆45min-1h，至显微镜下观察基本无完整虫卵。然后，置冰浴下超声粉碎400V、4s/4s*70，4℃14000rpm离心30min，收集上清，即为日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)。

2、ELISA、Western-blot鉴定已筛选的单克隆抗体

1)ELISA法检测特异性rSjP38单抗A6：

分别以1ug rSjP38、1ugPet和20ugSEA包被每孔，4包被过夜；于37℃用5％小牛血清封闭1h后，每孔中加入单抗A6细胞上清100ul，37℃1h，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2500稀释)于37℃作用1h后，经显色剂显色后，用终止剂终止。测OD450。阳性对照为免疫鼠血清，阴性对照为正常鼠血清。

结果：

一抗	Pet		rSjP38		SEA
							阳性血清	0.610	0.504	2.755	2.692	0.551	0.483
正常血清	0.019	0.018	0.259	0.079	-0.072	-0.071
							单抗A6细胞上清	0.017	0.013	2.570	2.533	1.303	1.578

2)Westernblot检测特异性抗体A6

用12％胶经SDS-PAGE电泳120V直落，用半干转印仪16V15min转至PDFV膜上，37℃烤干后加入单抗A6细胞上清，于37℃作用2h，TPBS洗4次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶2500稀释)于37℃作用1h，TPBS洗4次，每次5min；DAB显色5-10min观察有无特异性条带。

结果：单抗A6可特异性识别rSjP38和天然抗原SEA中的38kDa抗原，见图8、9。

        七、rSjP38单克隆抗体A6细胞的冻存与大量扩增

将经检测后的单抗A6细胞冻存(冻存液：50％小牛血清、40％不完全培养液、10％DMSO)同时在小鼠体内进行大量扩增。

腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml液体石腊于BALB/c小鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml。

Claims (10)

1、日本血吸虫虫卵主要蛋白P38(SjP38)的cDNA，序列全长1206bp，1-1065bp为一完整的开放读码框，编码355aa，理论预测分子量为39233Da，蛋白质等电点pI＝6.06；它的核苷酸序列如下：

1      GTTATGTCGG GTACACATCA AAACCATGCA GTTAGTATTC CTGTGAACCG TGAGCAATGT

61     TCATTTCCGA GGCATAGACA CGAACTGCTA CAGAATGTGG GGAAAGCCAG TAAAAGCGGT

121    CAGTTGGGTT CAGTAGTGCC ATACACGGAA GACTGGCCCA GTTCAGTGAG TAACTGGATA

181    GAGTCTTCGT TGAAAAGCTG GGACAAAGAA ATGGAACGTT TAAGGCGAGG AATGTTTGCT

241    CTGTTGCCAA TGGATCGCTT CATGGACGGA ATCCCACATG ATCCGTTGGG AATGATGCAT

301    GAAATGGATC GTCACATTGA GGAACTTCAA AATGGGATGG GTTTAAGTGC TGTGGCGCCG

361    CTTGGATCAA CGAGTGACTA CTTGAAGGAT GCCTACGAAG TCGGCGATGA TGGCAAGGTG

421    CATTTCAAGG TGAGATTTGA CGCACAGGGT TTTGCTCCAG AAGACATCAA TGTGACGTCG

481    AGTGACAACC GTGTGACAGT GCACGCGAAG AAGGAGACGA CAACAGGTGG TAAGAAGTGT

541    AGTCATGAGT TCTGTCGTAT GATCCAGTTG CCGAAGAGTA TTGAGAATAA CCAGTTGAAA

601    TGCCGTCTGA CTGATGATGG TGTTTTGATG TTGGAGGCTC CAGTGAAAGT TGGTGAGAAT

661    AAGTCGCTGA CAATGAACGA GTCTGGTCAG GTGGGTATTC AACCGAAATC AGCGAGTCAG

721    ATACAAGCAG TTCCTGCATC GCAAGCTCTC ACTGTGAAAG GTTGTCAAGG TCTGACGGTG

781    TTGGATGATG GTGCAGGTGG CAAGAAACTG CACGTTGAGG TTCAATTGGA CCCAGTGTAC

841    CGACCAGAAG ATTTGTGTGT GAATATTGAT TCGAATCGTG TTGTGGTTAG CGGACGTCAT

901    TACAAGCAAA AGACTGATGC AAGAAGAAAG TCGAGTTCAT TCGCAGAATT CAGTCAGTCG

961    TATTCGATTC CTGAGACTGT GGATCCGTTA ACTGTGTCTG CTCAGGTAGT TGACAATATG

1021   TTGGTTGTAG AGGCACCGAT GATGAAGCAA CACGAAATCG CTCATTAGAC GAAAATATGA

1081   TTGACTGAAA TCACAATAAT TATGGTAATG ATGATATTCA CTTGTGTTAT TTAACAAATA

1141   AATACATTTG CTTACTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAACATGTC GGCCGCCT

2、日本血吸虫虫卵主要蛋白P38(SjP38)的氨基酸序列如下：

1     VMSGTHQNHA VSIPVNREQC SFPRHRHELL QNVGKASKSG QLGSVVpYTE DWPSSVSNWI

61    ESSLKSWDKE MERLRRGMFA LLPMDRFMDG IPHDPLGMMH EMDRHIEELQ NGMGLSAVAP

121   LGSTSDYLKD AYEVGDDGKV HFKVRFDAQG FAPEDINVTS SDNRVTVHAK KETTTGGKKC

181   SHEFCRMIQL PKSIENNQLK CRLTDDGVLM LEAPVKVGEN KSLTMNESGQ VGIQPKSASQ

241   IQAVPASQAL TVKGCQGLTV LDDGAGGKKL HVEVQLDPVY RPEDLCVNID SNRVVVSGRH

301   YKQKTDARRK SSSFAEFSQS YSIPETVDPL TVSAQVVDNM LVVEAPMMKQ HEIAHTKILT

361   EITIIMVMMIFTCVIQINTF AYSKKKKKKK KNMSAA

3、包括权利要求1的cDNA的表达载体。

4、包括权利要求1的cDNA的表达载体pET-32a(+)-SjP38。

5、制备重组日本血吸虫虫卵主要蛋白P38(SjP38)的方法，包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的SjP38。

6、根据权利要求5所述的方法，其中寄主细胞是大肠杆菌。

7、重组日本血吸虫虫卵主要蛋白P38，包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组的SjP38的步骤的方法制备。

8、制备抗日本血吸虫虫卵主要蛋白P38单克隆抗体的方法，包括用纯化的重组SjP38蛋白免疫BABL/C小鼠，获得抗SjP38单克隆抗体。

9、抗日本血吸虫虫卵主要蛋白P38单克隆抗体，包括用纯化的重组SjP38蛋白免疫BABL/C小鼠的步骤的方法制备。

10、抗日本血吸虫虫卵主要蛋白P38单克隆抗体，可识别重组SjP38蛋白和天然虫卵可溶性蛋白(SEA)中的38kDa蛋白。

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