CN109694410A - 马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab’)2及制备方法 - Google Patents

马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab’)2及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab’)2及制备方法，是一种高效、安全、可靠的马抗犬瘟热病毒特异性精制免疫球蛋白，用于治疗犬瘟热病毒所引起的犬瘟热病毒病的有效药物，对犬瘟热病毒感染动物具有显著疗效，明显提高感染动物的存活率。本发明的制备工艺采用独特的工艺参数控制，用常规的分离法生产出所述特异性免疫球蛋白，产品安全可靠。用于制备马抗犬瘟热病毒特异性精制免疫球蛋白F(ab′)2的原料血浆有稳定高效的来源，能满足血浆的供给。

Description

马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab’)2及制备方法
技术领域
本发明公开一种马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab’)2及制备方法，是一种高效、安全、可靠的马抗犬瘟热病毒特异性精制免疫球蛋白，属于免疫学及生物工程领域。
背景技术
犬瘟热（canine disease，CD）是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）、麻疹病毒属（Morbilli.virus）犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病具有一定的历史性，可跨物种、国界进行传播，在全世界各地均有分布，各物种中以犬最为易感，其次是狐和水貂，其高致死率对毛皮动物养殖业以及宠物犬的影响尤为严重。近年来随着我国养殖业的快速发展、人们生活水平的提高及对伴侣动物的需求，犬瘟热病（CD）的研究愈来愈受到人们的重视。
该病主要通过直接接触和飞沫传播，入侵门户主要是消化道和呼吸道，带毒动物是该病最主要的传染源。寒冷季节多发，呈散发、地方流行性或爆发，某些地区无季节性。我国主要流行CDV基因型为亚洲1型（Asia-1）和亚洲2型（Asia-2），几十年来，我国各地区犬瘟热（CDV）发病流行情况总体呈上升趋势。自上世纪60年代以来我国多地就有该病的爆发流行，最早要追溯到于1968年爆发的黑龙江省抚远县某貂场。此后，该病的流行由华北地区逐步向华南、华中地区蔓延，直至上世纪80年代已有九省三十多县市七十多个毛皮动物养殖场遭受该病的侵袭。21世纪以来，有研究人员对东北地区以及延边地区的城市内宠物的犬瘟热进行调查。在该项调查中发现犬瘟热的发病率呈明显增长趋势，这可能与城市中宠物数量的增多有密切联系。进一步对长春地区541例疑似病例进行临床调查，结果表明：犬瘟热（CDV）发病率为23.69%，致死率为70.63%。对2014-2016年延边地区的大型动物医院门诊犬粪便进行CDV检查，发现该病平均发病率高达46.82% 。由此可见，犬瘟热（CDV）多分布于我国北方毛皮动物养殖业较发达地区以及一、二线发达城市（养宠较多）如首都北京。此外，我国的一些珍稀动物如大熊猫、东北虎、灵猫、紫貂等也有CDV的报道。
犬瘟热病毒（CDV）感染初期以侵害呼吸消化系统为主，此时该病的治愈率较高，对早期发现的患病动物及时进行治疗能够有效的控制病死率；中后期犬瘟热病毒（CDV）入侵动物机体神经系统时往往难以治愈，故该疾病的诊断和治疗若不及时，则该病的死亡率将难以控制。因此及时有效的诊断和治疗是控制CDV感染动物死亡率的关键。
近几十年来，纵观国内外犬瘟热病（CD）发展趋势总体呈上升状态，目前针对CDV尚无有效治疗手段，临床上多对症治疗。对该病的控制以免疫接种为主要预防途径。虽然CDV弱毒疫苗能较好的控制该病的流行，但经免疫接种动物仍发病的报道频繁出现，因此，新型防治手段和高效疫苗的的研发将是该病的未来研究方向。抗血清用于抗病毒治疗已有100多年的历史，抗血清的优点是特异性强、效价高、作用快、制备周期短，生产量大。我国也早已批准人用马抗狂犬病血清、破伤风抗毒素血清、抗蛇毒血清等异源抗体制剂。因此，精制马抗的研制对日趋严峻的犬瘟热疫情防控十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab’)2及制备方法，用于犬瘟热感染动物的早期治疗。
本发明所述的一种马抗犬瘟热病毒特异性免疫球蛋白F(ab′)2，其SDS-PAGE电泳结果如图1所示。
本发明所述一种马抗犬瘟热病毒的特异性免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，包括以下步骤：
1) 在Vero细胞上培养犬瘟热病毒：同步接毒24小时后原传细胞，原传细胞后继续培养48小时收获病毒于-80℃保存，病毒滴度TCID50＞105/0.1mL；
2) 将上述收获病毒液与纳米磷酸钙佐剂按照8:1体积比混合作为免疫原，健康马匹经肋间肌分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，利用病毒中和试验检测马血清效价达到212以上时采血；
3) 高免血浆4℃保存过夜，离心收集上层血清，经饱和硫酸铵溶液粗提免疫球蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切，酶切产物过亲和层析柱，收集洗脱液，经过超滤、浓缩、置换缓冲液即获得马抗犬瘟热病毒精制免疫球蛋白F(ab′)2。
本发明步骤2）所述的纳米磷酸钙佐剂制备方法如下：
将反应浓度为0.01mol/L的CaCl2和Na2HPO4反应3小时后（Ca/P比例为1:1），加入500mM的柠檬酸钠50μl，以0.05%的羧甲基纤维素钠作为助悬剂，通过高压匀质机，冰水浴中循环6次。
本发明步骤3)中饱和硫酸铵纯化免疫球蛋白的方法为：
将获得的高免马血浆置于4℃放置过夜，次日取上清于4℃、7000rpm离心10min，弃沉淀，上清即为抗犬瘟热病毒高免血清；取高免血清1体积加入生理盐水1体积进行混合，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液2体积，使溶液中硫酸铵终浓度达到50％，全部加入后4℃静置30min，接着于4℃、7000rpm离心15min，弃上清；取沉淀以1体积生理盐水重悬，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液1/2体积，使溶液中硫酸铵终浓度达到33.3%，全部加入后4℃静置30min，接着于4℃、7000rpm离心15min，取沉淀；将沉淀溶于生理盐水中，透析除盐，每隔3小时更换一次透析袋，将透析后的球蛋白粗提液收集到盐水瓶中加入1%硫柳汞钠，4℃保存。
本发明步骤3)中过亲和层析柱时使用的洗脱缓冲液为：0.1M醋酸缓冲液pH3.5。
本发明所述的马抗犬瘟热病毒特异性免疫球蛋白F(ab′)2在制备用于治疗犬瘟热病毒感染动物中的应用。
本发明所述马抗犬瘟热病毒特异性精制免疫球蛋白F(ab′)2的制备用于治疗犬瘟热病毒感染动物的药物。
本发明制备的马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab′)2含量不低于总蛋白含量的92.0％。本发明产品为冻干粉剂型，具有高效价的中和犬瘟热病毒特性，可作为治疗感染犬瘟热病毒动物的一种新的有效药物，用于犬瘟热病毒感染动物的紧急救治。
本发明的积极效果在于：
提供了一种马抗犬瘟热病毒特异性精制特异免疫球蛋白F(ab′)2，是用于治疗犬瘟热病毒所引起的犬瘟热病毒病的有效药物，对犬瘟热病毒感染动物具有显著疗效，明显提高感染动物的存活率。本发明的制备工艺采用独特的工艺参数控制，用常规的分离法生产出所述特异性免疫球蛋白，产品安全可靠。用于制备马抗犬瘟热病毒特异性精制免疫球蛋白F(ab′)2的原料血浆有稳定高效的来源，能满足血浆的供给。
附图说明
图1为本发明SDS-PAGE电泳结果如图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
马抗犬瘟热病毒精制免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法，包括以下步骤：
1. 将疫苗株犬瘟热病毒同步接毒vero细胞24小时后原传，继续培养48小时后收获病毒，病毒滴度TCID50﹥105/0.1mL；
2. 将上述病毒液与纳米磷酸钙佐剂（佐剂主要成分有氯化钙、磷酸氢二钠、柠檬酸钠和羧甲基纤维素钠）按8：1的体积比混合均匀，挑选健康马匹经肋间肌分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测抗犬瘟热病毒马血清效价达到212以上时采血；
3. 采用饱和硫酸铵沉淀法，分离纯化IgG：将获得的高免马血浆置于4℃放置过夜，次日取上清于4℃、7000rpm离心10min，弃沉淀，上清即为抗犬瘟热病毒高免血清。取高免血清1体积（400mL）加入生理盐水1体积（400mL）进行混合，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液2体积（800 mL），使溶液中硫酸铵终浓度达到50％，全部加入后4℃静置30min，然后4℃、7000rpm离心15min，弃上清；取沉淀以1体积（400mL）生理盐水重悬，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液1/2体积（200mL），使溶液中硫酸铵终浓度达到33.3%，全部加入后4℃静置30min，4℃、然后7000rpm离心15min，取沉淀（硫酸铵终浓度达到33.3%这一步骤可以重复3次，以获得高纯度的免疫球蛋白）。将沉淀溶于适量（100mL）生理盐水中，4℃透析除盐，每隔3小时更换一次透析袋，将透析后的IgG粗提液收集到盐水瓶中加入1%硫柳汞钠，4℃保存；
4. 胃蛋白酶酶切免疫球蛋白（IgG），具体为首先将上述IgG溶液用1M HCI溶液调整pH值至3.0，接着向上述溶液中加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与免疫球蛋白质量比为1:50)，混匀，于30℃消化2.0-2.5h。酶解完成后用1mol/LNaOH调溶液pH值至7.5，终止酶解反应。F(ab′)2粗品于4℃保存；
5. 酶切后F(ab′)2溶液于4℃，12000rpm离心5min，取上清加入已平衡的LambdFabSelect亲和层析柱中进行纯化，收集活性峰，洗脱缓冲液为：0.1M acetateBuffer pH3.5；
6. 将上述获得的F(ab′)2溶液置于30KD MWCO超滤管中，于4℃、7000rpm离心15min，浓缩并置换缓冲液为生理盐水（0.9%NaCI溶液）；制备的马抗犬瘟热病毒精制免疫球蛋白F(ab′)2SDS-PAGE电泳如图1所示；
7. 冻干，将超滤浓缩置换缓冲液的F(ab′)2蛋白溶液经0.22μm滤膜过滤后装瓶平铺于冻干盘上，进行冻干，冻干温度不超过40℃，水分低于3％时完成冻干。于-20℃保存，可用于犬瘟热病毒感染动物紧急治疗。
实施例2
马抗犬瘟热病毒特异性免疫球蛋白F(ab′)2体外病毒中和活性研究以固定病毒-稀释精制免疫球蛋白F(ab′)2(调整F(ab′)2的浓度为1mg/mL)的方法测定F(ab′)2体外抗犬瘟热病毒的中和活性：于96 孔细胞培养板内，每孔加入50μL含6%血清的DMEM培养基，将纯化并置换缓冲液的F(ab′)2连续作2 倍系列稀释，与标准抗原（含100 TCID50/0.05 mL 的CDV疫苗株）各50 μL 混合，各稀释度8 孔，置37℃、含5% CO2 培养箱中孵育1 h，每孔补加0.1 mL含6%血清的DMEM培养基（含1.5×104 个Vero细胞），同时设阴性、阳性对照各8 孔。5 d判定结果，以每孔完全不出现蜘蛛样融合性细胞病变作为中和阳性判定标准，以出现中和阳性的血清最高稀释度为终点，按照Reed-Muench 法计算精制免疫球蛋白F(ab′)2的中和抗体效价可以达到27，即精制免疫球蛋白F(ab′)2浓度为0.01mg/mL时可保护50%的组织细胞培养物不出现CPE(计算方法如下):。
按Reed-Muench两氏法计算，能保护50%组织细胞培养物的F(ab′)2稀释度介于10-1.8和10-2.1之间；
距离比例=91.7-50/91.7-33=41.7/58.7=0.71；
高于50%保护率F(ab′)2稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=-1.8+0.71×（-0.3）=-2.013；
-2.013的反对数=1/103，即1:103稀释待检F(ab′)2可保护50%的组织细胞培养物不出现CPE；调整F(ab′)2浓度为1mg/mL做抗体中和活性测定实验，结果表明浓度为0.01mg/mL F(ab′)2可保护50%的组织细胞培养物不出现CPE。
实施例3
马抗犬瘟热病毒免疫球蛋白F(ab')2治疗效果评价 将在宠物医院确诊为犬瘟热病毒感染的犬配合补液通过肌肉注射方式以1mgF(ab')2/kg体重/天的剂量对感染犬进行治疗，每天1次，连续用3天，继续观察15天。结果表明：在病毒感染早期以F(ab')2进行治疗，可有效保护犬瘟热病毒对感染犬的攻击。
实施例4
马抗犬瘟热病毒特异性免疫球蛋白F(ab')2的毒理学试验
1、ICR小鼠单次给药毒性试验 ICR小鼠单次静脉注射免疫球蛋白F(ab')2的最大耐受剂量大于20mg/kg，未见与给药相关的毒性反应；
2、SD大鼠14天重复给药毒性试验 SD大鼠静脉注射免疫球蛋白F(ab')2，给药剂量20mg/kg，连续给药14天，临床观察未见异常。给药结束后，血液学、凝血、尿液、脏器、重量等指标未见异常改变。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种马抗犬瘟热病毒特异性免疫球蛋白F(ab′)2，获得的F(ab′)2的SDS-PAGE电泳见说明书附图1所示。
2.根据权利要求1所述一种马抗犬瘟热病毒的特异性免疫球蛋白F(ab′)2，其获得过程包括以下步骤：
1) 在Vero细胞上培养犬瘟热病毒：同步接毒24小时后原传细胞，原传细胞后继续培养48小时收获病毒于-80℃保存，病毒滴度TCID50＞105/0.1mL；
2) 将上述收获病毒液与纳米磷酸钙佐剂按照8:1体积比混合作为免疫原，健康马匹经肋间肌分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，利用病毒中和试验检测马血清效价达到212以上时采血；
3) 高免血浆4℃保存过夜，离心收集上层血清，经饱和硫酸铵溶液粗提免疫球蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切，酶切产物过亲和层析柱，收集洗脱液，经过超滤、浓缩、置换缓冲液即获得马抗犬瘟热病毒精制免疫球蛋白F(ab′)2。
3.根据权利要求2所述一种抗犬瘟热病毒的特异性免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，其特征在于：
步骤2）所述纳米磷酸钙佐剂的成分包括氯化钙、磷酸钙、柠檬酸钠和羧甲基纤维素钠，制备方法如下：
将反应浓度为0.01mol/L的CaCl2和Na2HPO4反应3小时后（Ca/P比例为1:1），加入500mM的柠檬酸钠50μl，以0.05%的羧甲基纤维素钠作为助悬剂，通过高压匀质机，冰水浴中循环6次。
4.根据权利要求2所述一种抗犬瘟热病毒的特异性免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，其特征在于步骤3)中饱和硫酸铵纯化免疫球蛋白的方法为：
将获得的高免马血浆置于4℃放置过夜，次日取上清于4℃、7000rpm离心10min，弃沉淀，上清即为抗犬瘟热病毒高免血清；取高免血清1体积加入生理盐水1体积进行混合，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液2体积，使溶液中硫酸铵终浓度达到50％，全部加入后4℃静置30min，接着于4℃、7000rpm离心15min，弃上清；取沉淀以1体积生理盐水重悬，边搅拌边逐滴加入饱和硫酸铵溶液1/2体积，使溶液中硫酸铵终浓度达到33.3%，全部加入后4℃静置30min，接着于4℃、7000rpm离心15min，取沉淀；将沉淀溶于生理盐水中，透析除盐，每隔3小时更换一次透析袋，将透析后的球蛋白粗提液收集到盐水瓶中加入1%硫柳汞钠，4℃保存。
5.根据权利要求2所述一种抗犬瘟热病毒的特异性免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，其特征在于：
步骤3)中过亲和层析柱时使用的洗脱缓冲液为：0.1M醋酸缓冲液pH3.5。
6.权利要求1所述的马抗犬瘟热病毒特异性免疫球蛋白F(ab′)2在制备用于治疗犬瘟热病毒感染动物中的应用。
7.由权利要求6所述马抗犬瘟热病毒特异性精制免疫球蛋白F(ab′)2的制备用于治疗犬瘟热病毒感染动物的药物。
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