CN102190725A - 抗手足口病人免疫球蛋白及其制备、使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是有关于一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备、使用方法和在制药中的应用。该制备方法包括：通过低温乙醇蛋白分离法依次分离组分I+II+III、I+III、II沉淀；对组分II沉淀巴氏灭活；精制纯化；脱醇；配制；除菌分装及低pH孵放灭活。本发明产品的肠道病毒(包括柯萨奇病毒、埃可病毒(Echo)、肠道病毒71型(EV71)中的一种或几种)抗体效价不低于1∶640，免疫球蛋白含量不低于总蛋白含量的95.0％，IgG单体和二聚体之和不低于95％，其使用方法是静脉输注160000～320000滴度的特异性抗体。本发明适于工业化生产，且产品具有高效价的抗肠道病毒特异性，安全可靠，可以成为治疗手足口病的有效药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医学领域的治疗用血液制品及其制备方法，特别是涉及一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备、使用方法和应用。
背景技术
手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)是近年来发病于婴幼儿的广泛流行的传染性疾病之一。主要由柯萨奇病毒(Cox)、埃可病毒(Echo)、肠道型病毒71型(EV71)中的一种或几种引起。该病早期病原体主要为CoxA16型，EV71病毒是1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴幼儿粪便标本中分离出EV71病毒并被首次确认。此后，手足口病在很多国家和地区流行爆发，如澳大利亚、瑞典、日本、保加利亚，匈牙利、马来西亚新加坡、中国内陆、中国香港和中国台湾等。其中有3次大的流行：(1)1975年保加利亚大流行，共有705名患儿受到感染，其中149例发生了瘫痪，44例死亡；(2)1997年马来西亚大流行，共有2628例报告发病，39例急性脊髓灰质炎样麻痹或无菌性脑膜炎，30多例患儿死亡；(3)1998年我国台湾地区手足口病大流行，共发生129106例手足口病和红斑疹，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡。我国自1981年上海首次报道手足口病以来，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东、台湾等十几个省市先后均有报道。自1999年以来，我国广东、福建、上海、重庆、安徽阜阳等地区报告局部流行婴幼儿手足口病，发现EV71是我国南方地区HFMD的主要病原体之一。截止2008年内地累计报道手足口病近25000例，34例患儿死亡。
患者和隐性感染者均为本病的传染源，主要经粪、口和/或呼吸道飞沫传播，亦可经接触患者皮肤、黏膜疱疹液感染。粪便排出之病毒所造成的感染约6-8周；一般病情80％为手足口病；重症出现时机：3-7天；EV71型感染并发重症主要有脑干脑炎、心脏衰竭、肺水肿及肺出血等表现，这些严重病症均于发病后7天内出现，平均为发病后3天左右，所以发病后7天内应及时采取有效的治疗，以减少并发症的发生。
目前，肠道病毒引起的手足口病患者的治疗主要以对症治疗为主，缺乏特异、高效的抗病毒药物。安全有效的疫苗目前还存在诸多未解决的问题，临床应用尚待时日。静脉注射人免疫球蛋白(IVIG)因能有效地抑制炎症的发生，对感染手足口病引起的重症患者有一定的疗效，曾在1998年我国台湾地区和2000年澳大利亚的手足口病流行中得到广泛应用。展开对静注抗手足口病特异性人免疫球蛋白的研制成为亟待解决的课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，使其适于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。
为解决上述技术问题，本发明一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：(1)分离组分I+II+III：将含肠道病毒抗体不低于1∶8的原料血浆加入溶液，调整血浆蛋白质含量并调整pH值，通过低温乙醇蛋白分离法压滤分离组分I+II+III沉淀并称重；(2)分离组分I+III沉淀：溶解组分I+II+III沉淀，控制蛋白液中蛋白质含量并调整pH值，通过低温乙醇蛋白分离法压滤分离组分I+III沉淀；(3)分离组分II沉淀：调整滤过液的离子强度和蛋白质含量，调整pH值，通过低温乙醇蛋白分离法压滤分离组分II沉淀并称重；(4)巴氏灭活；(5)精制纯化；(6)脱醇；(7)配制；(8)除菌分装及低pH孵放灭活。
作为本发明的一种改进，所述的原料血浆为肠道病毒抗体效价介于1∶8～1∶64的血浆，并在所述的步骤(6)(7)之间，还包括一亲和层析和脱盐步骤。
所述的亲和层析和脱盐步骤所采用的介质为偶联手足口病疫苗的琼脂糖亲和介质。
所述的原料血浆为肠道病毒抗体效价不低于1∶64的血浆。
所述的步骤(3)中，调整制品离子强度至0.05～0.09。
所述的步骤(4)中，控制蛋白液的电导率不高于0.3ms/cm。
所述的步骤(1)中的原料血浆为：按单采血浆术规程操作，选择肠道病毒疫苗免疫合格或自然感染愈后获得免疫的符合单采血浆标准的供血浆者，除常规要求的病毒检测外，增加对单人份血浆肠道病毒抗体检测，所述的肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒71型中的一种或几种，筛选出抗体效价不低于1∶8的血浆；
步骤(1)具体为：将原料血浆消毒、破袋、入罐，迅速融化至0～4℃，用0.9％氯化钠溶液调整血浆蛋白质含量至40g/L～65g/L，用pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液调整制品pH至5.7～6.3，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为18％～22％，控制最终温度在-4～-6℃，搅拌反应1小时以上，按2～10g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土、珍珠岩或两者的混合物，继续反应30～60分钟后压滤分离组分I+II+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取I+II+III沉淀称重；
步骤(2)具体为：加入注射用水溶解组分I+II+III沉淀，控制蛋白液中蛋白质含量至6g/L～30g/L，用磷酸盐缓冲液调整蛋白液pH至4.6～5.4，搅拌反应1小时以上，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为12％～19％，控制最终温度在-1～-4℃，搅拌反应1小时以上，按2～10g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土、珍珠岩或两者的混合物，继续反应30～60分钟后压滤分离组分I+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa；
步骤(3)具体为：按每升滤过液加入3～5g氯化钠调整制品离子强度至0.05～0.09后，调整蛋白液中蛋白质含量至3g/L～8g/L，用0.1～0.5mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.0～7.4，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为24％～26％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离组分II沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取组分II沉淀称重；
步骤(4)具体为：加入8～10倍组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液电导率不高于0.3ms/cm，按80～120g/L蛋白液的比例加入甘氨酸保护剂，用0.1～0.5mol/L氢氧化钠溶液调整蛋白液pH至7±0.4，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时；
步骤(5)具体为：巴氏灭活结束后，降温制品至30℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.7～7.3，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇浓度为18％～22％，控制最终温度在-1～6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5～2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土、珍珠岩或两者的混合物，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，沉淀废弃，之后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸溶液调整滤出液pH为7～7.4，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为24％～27％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀A，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀A称重；
步骤(6)具体为：加入5～10倍沉淀A量的注射用水溶解后，经澄清过滤、透析脱醇后浓缩至蛋白质含量不低于50g/L，乙醇浓度不高于0.025％，调整制品pH至3.8～7.4；
若步骤(1)筛选出的血浆抗体效价低于1∶64，则在上述步骤(6)之后进行亲和层析和脱盐步骤，具体为：用磷酸盐缓冲液平衡介质，吸附条件为pH6.4～7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱条件为pH为2～5的缓冲液，洗脱下来的蛋白液采用注射用水透析脱盐后浓缩至蛋白质含量不低于50g/L；若步骤(1)筛选出的血浆抗体效价不低于1∶64，则跳过上述亲和层析和脱盐步骤，直接进行步骤(7)；
步骤(7)具体为：用注射用水稀释制品蛋白质含量为45～55g/L，抗体效价应不低于1∶640，按90～110g/L蛋白液比例加入麦芽糖，按20～100mg/L蛋白液比例加入聚山梨酯80，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L柠檬酸溶液整蛋白液pH至3.8～4.4；
步骤(8)具体为：用规格为不超过0.2μm滤芯除菌过滤分装后，转入21～26℃环境中孵放21～24天灭活病毒。
本发明还提供了一种根据上述方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白，其抗肠道病毒抗体效价不低于1∶640，免疫球蛋白含量不低于总蛋白含量的95.0％，IgG单体和二聚体之和不低于95％。其中，肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒(Echo)、肠道病毒71型(EV71)中的一种或几种，本发明产品为液体剂型，具有高效价的抗肠道病毒特异性，可以成为治疗手足口病的一种新的有效药物。
此外，本发明还提供了上述抗手足口病人免疫球蛋白的使用方法，采用静脉输注160000～320000滴度的特异性抗体。
最后，本发明也提供了上述抗手足口病人免疫球蛋白在制造以其为活性成分的药物中的应用。
采用这样的设计后，本发明至少还具有以下优点和有益效果：
1、本发明的抗手足口病人免疫球蛋白是用于预防和治疗肠道病毒所引起的手足口病的新的有效药物，对手足口病重症患者具有显著疗效，提高患者的存活率。
2、本发明产品将填补国内此类药物空白。
3、本发明的制备工艺采用独特的工艺参数控制，用常规的低温乙醇分离法生产该特异性免疫球蛋白，适于工业化生产，并采用巴氏消毒和低pH孵放两种灭毒措施，产品安全可靠。
4、制造抗肠道型病毒人免疫球蛋白的原料血浆有稳定高效的来源，能满足血浆的供给。
5、由于目前还没有确切的抗手足口病抗体效价在人血液中的有效评估，建议感染手足口病患者使用输注160000～320000滴度的特异性抗体，使最终患者血液中柯萨奇病毒、埃可病毒(Echo)、肠道病毒71型(EV71)抗体水平高于1∶128中和滴度。
具体实施方式
本发明所采用的原料血浆，是按单采血浆术规程操作，选择肠道病毒疫苗免疫合格或自然感染愈后获得免疫的符合单采血浆标准的供血浆者，除常规要求的病毒检测外，增加对单人份血浆肠道病毒(包括柯萨奇病毒、埃可病毒(Echo)、肠道病毒71型(EV71)中的一种或几种)抗体检测，筛选出抗体效价不低于1∶8(血清中和试验法)的血浆。若筛选出的血浆抗体效价不低于1∶64的，可不进行亲和层析和脱盐步骤，否则要进行亲和层析和脱盐步骤。
以抗肠道病毒71型(EV71)人免疫球蛋白为例，以下特举几个具体实施例来说明本发明抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法。
具体实施例1
(1)分离组分I+II+III。
筛选出抗EV71型抗体效价介于1∶8～1∶16的原料血浆60L，经75％乙醇溶液浸泡消毒2～3分钟后，用纯化水冲洗血浆袋表面2～3分钟，用手工剪刀破袋于一个带夹套的不锈钢罐中，轻轻搅拌。同时通过35℃循环水解冻。在整个解冻过程中血浆温度控制在0～2℃。用0.9％氯化钠溶液调整血浆蛋白含量至50g/L，用pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液调整制品pH至5.7～6.3，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为20％，控制最终温度在-4～-6℃，搅拌反应2小时，按2g/L蛋白液分别加入助滤剂硅藻土和珍珠岩，继续反应1小时后压滤分离组分I+II+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取I+II+III沉淀3300g。
(2)分离组分I+III沉淀。
加入35L注射用水溶解后，调整制品蛋白质含量至6g/L，用磷酸盐缓冲液调整蛋白液pH至5.25，搅拌反应1小时，降温蛋白液至0～2℃，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为15％，控制最终温度在-2～-3℃，搅拌反应1小时，按2g/L蛋白液分别加入助滤剂硅藻土和珍珠岩，继续反应1小时后压滤分离组分I+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取I+III沉淀4200g。
(3)分离组分II沉淀。
按每升滤过液加入4g氯化钠调整制品离子强度至0.07后，调整制品蛋白质含量至7g/L，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.25，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为25％，控制最终温度在-7～-8℃，搅拌反应1小时，压滤分离组分II沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取组分II沉淀1400g。
(4)巴氏灭活。
加入9倍组分II沉淀量的注射用水溶解后，经澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液的电导率不高于0.3ms/cm，按100g/L蛋白液的比例加入甘氨酸保护剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整蛋白液pH至7.35，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时。
(5)精制纯化。
巴氏活结束后，降温制品至30℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.9，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇浓度为20％，控制最终温度在4℃，搅拌反应1小时以上，按0.5g/L蛋白液分别加入助滤剂硅藻土和珍珠岩，继续反应1小时后压滤分离沉淀480g，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，沉淀废弃。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整滤出液pH为7.2，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为25％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀A，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀A称重1380g。
(6)脱醇。
加入7L注射用水溶解后，经澄清过滤、透析脱醇后浓缩至蛋白质含量55g/L，乙醇浓度不高于0.025％，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.0。
(6.1)层析和脱盐
采用介质为偶联手足口病疫苗的琼脂糖亲和介质，用磷酸盐缓冲液平衡介质，吸附条件为pH7.0的磷酸盐缓冲液，洗脱条件为pH为2的缓冲液；洗脱下来的蛋白液采用注射用水透析脱盐后浓缩至蛋白质含量60g/L。
而流穿下来的蛋白液可以用于制备普通免疫球蛋白制品。
(7)配制。
按成品规格配制：稀释制品蛋白质含量为50g/L，抗体效价应不低于1∶640，按100g/L蛋白液比例加入麦芽糖，按50mg/L蛋白液比例加入聚山梨酯80，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L柠檬酸溶液整蛋白液pH至4.25。
(8)除菌分装及低pH孵放灭活。
用规格为不超过0.2μm滤芯除菌过滤分装后，转入21～26℃环境中孵放22天灭活病毒。
具体实施例2
(1)分离组分I+II+III。
筛选出抗EV71型抗体效价不低于1∶64的原料血浆50L，经75％乙醇溶液浸泡消毒2～3分钟后，用纯化水冲洗血浆袋表面2～3分钟，用手工剪刀破袋于一个带夹套的不锈钢罐中，轻轻搅拌。同时通过20℃循环水解冻。在整个解冻过程中血浆温度控制在0～2℃。用0.9％氯化钠溶液调整血浆蛋白含量至40g/L，用pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液调整制品pH至5.7，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为19％，控制最终温度在-4～-6℃，搅拌反应2小时，按5g/L蛋白液加入助滤剂珍珠岩，继续反应1小时后压滤分离组分I+II+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取I+II+III沉淀2900g。
(2)分离组分I+III沉淀。
加入33L注射用水溶解后，调整制品蛋白质含量至15g/L，用磷酸盐缓冲液调整蛋白液pH至5.3，搅拌反应1小时，降温蛋白液至0～2℃，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为15％，控制最终温度在-2～-3℃，搅拌反应1小时，按5g/L蛋白液加入助滤剂珍珠岩，继续反应1小时后压滤分离组分I+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取I+III沉淀3700g。
(3)分离组分II沉淀。
按每升滤过液加入3g氯化钠调整制品离子强度至0.05后，调整制品蛋白质含量至5g/L，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.0，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为24％，控制最终温度在-7～-8℃，搅拌反应1小时，压滤分离组分II沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取组分II沉淀1280g。
(4)巴氏灭活。
加入12L注射用水溶解后，经澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液的电导率不高于0.3ms/cm，按80g/L蛋白液的比例加入甘氨酸保护剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整蛋白液pH至7.0，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时。
(5)精制纯化。
巴氏活结束后，降温制品至30℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.70，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇浓度为22％，控制最终温度在2℃，搅拌反应1小时以上，按1g/L蛋白液加入助滤剂珍珠岩，继续反应1小时后压滤分离沉淀340g，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，沉淀废弃。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整滤出液pH为7.0，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为27％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀A，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀A称重1100g。
(6)脱醇。
加入6L注射用水溶解后，经澄清过滤、透析脱醇后浓缩至蛋白质含量55g/L，乙醇浓度不高于0.025％，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L柠檬酸溶液调整制品pH至3.9。
(7)配制。
按成品规格配制：稀释制品蛋白质含量为50g/L，抗体效价应不低于1∶640，按90g/L蛋白液比例加入麦芽糖，按20mg/L蛋白液比例加入聚山梨酯80，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L柠檬酸溶液调整蛋白液pH至3.9。
(8)除菌分装及低pH孵放灭活。
用规格为不超过0.2μm滤芯除菌过滤分装后，转入21～26℃环境中孵放21天灭活病毒。
具体实施例3
(1)分离组分I+II+III。
筛选出抗EV71型抗体效价介于1∶16～1∶32的原料血浆70L，经75％乙醇溶液浸泡消毒2～3分钟后，用纯化水冲洗血浆袋表面2～3分钟，用手工剪刀破袋于一个带夹套的不锈钢罐中，轻轻搅拌。同时通过20℃循环水解冻。在整个解冻过程中血浆温度控制在0～2℃。用0.9％氯化钠溶液调整血浆蛋白含量至55g/L，用pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液调整制品pH至6.3，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为22％，控制最终温度在-4～-6℃，搅拌反应2小时，按10g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离组分I+II+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取I+II+III沉淀4600g。
(2)分离组分I+III沉淀。
加入37L注射用水溶解后，调整制品蛋白质含量至30g/L，用磷酸盐缓冲液调整蛋白液pH至5.3，搅拌反应1小时，降温蛋白液至0～2℃，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为18％，控制最终温度在-2～-3℃，搅拌反应1小时，按10g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离组分I+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取I+III沉淀5100g。
(3)分离组分II沉淀。
按每升滤过液加入5g氯化钠调整制品离子强度至0.09后，调整制品蛋白质含量至3g/L，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.4，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为25％，控制最终温度在-7～-8℃，搅拌反应1小时，压滤分离组分II沉淀，滤过液温度控制在-3℃～-4℃，压力控制在0～0.15Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干，刮取组分II沉淀1690g。
(4)巴氏灭活。
加入15L注射用水溶解后，经澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液的电导率不高于0.3ms/cm，按100g/L蛋白液的比例加入甘氨酸保护剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整蛋白液pH至7.4，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时。
(5)精制纯化。
巴氏活结束后，降温制品至30℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为7.0，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇浓度为18％，控制最终温度在2℃，搅拌反应1小时以上，按2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀622g，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，沉淀废弃。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整滤出液pH为7.4，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为25％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀A，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀A称重1540g。
(6)脱醇。
加入9L注射用水溶解后，经澄清过滤、透析脱醇后浓缩至蛋白质含量55g/L，乙醇浓度不高于0.025％，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.2。
(6.1)层析和脱盐
采用介质为偶联手足口病疫苗的琼脂糖亲和介质，用磷酸盐缓冲液平衡介质，吸附条件为pH7.0的磷酸盐缓冲液，洗脱条件为pH为2的缓冲液；洗脱下来的蛋白液采用注射用水透析脱盐后浓缩至蛋白质含量60g/L。
而流穿下来的蛋白液可以用于制备普通免疫球蛋白制品。
(7)配制。
按成品规格配制：稀释制品蛋白质含量为50g/L，抗体效价应不低于1∶640，按110g/L蛋白液比例加入麦芽糖，按80mg/L蛋白液比例加入聚山梨酯80，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L柠檬酸溶液整蛋白液pH至4.28。
(8)除菌分装及低pH孵放灭活。
用规格为不超过0.2μm滤芯除菌过滤分装后，转入21～26℃环境中孵放24天灭活病毒。
参考Cohn法和Nitschmann-Kistler法对组分I、II、III分类，上述组分I中主要成分为纤维蛋白原及部分因子VIII，组分II中主要成分为免疫球蛋白，组分III中主要成分为凝血酶原、α及β球蛋白等。
质量检验
按上述工艺制备的抗肠道病毒71型(EV71)人免疫球蛋白，其质量检验如下表1。
表1.静注抗肠道病毒71型(EV71)免疫球蛋白质量检验报告单
本发明产品抗手足口病人免疫球蛋白可直接作为静注药物使用，也可以应用在以其为活性成分的抗病毒药物中。依据病童血中效价的水平和临床医生共同制定使用量，我们建议手足口病患者使用输注160000～320000滴度的特异性抗体，使最终患者血液中抗体水平高于1∶128中和滴度。
本发明的抗手足口病人免疫球蛋白，是使用健康人血浆经多级低温乙醇蛋白分离法提取、病毒灭活和/或层析处理制备而成的特异性免疫球蛋白。本发明的抗手足口病人免疫球蛋白是预防和治疗肠道病毒所引起的手足口病的新的有效药物，对手足口病重症患者具有显著疗效，提高患者的存活率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于主要包括以下步骤：
(1)分离组分I+II+III：将含肠道病毒抗体不低于1∶8的原料血浆加入溶液，调整血浆蛋白质含量并调整pH值，通过低温乙醇蛋白分离法压滤分离组分I+II+III沉淀并称重；
(2)分离组分I+III沉淀：溶解组分I+II+III沉淀，控制蛋白液中蛋白质含量并调整pH值，通过低温乙醇蛋白分离法压滤分离组分I+III沉淀；
(3)分离组分II沉淀：调整滤过液的离子强度和蛋白质含量，调整pH值，通过低温乙醇蛋白分离法压滤分离组分II沉淀并称重；
(4)巴氏灭活；
(5)精制纯化；
(6)脱醇；
(7)配制；
(8)除菌分装及低pH孵放灭活。
2.根据权利要求1所述的抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述的原料血浆为肠道病毒抗体效价介于1∶8～1∶64的血浆，并在所述的步骤(6)(7)之间，还包括一亲和层析和脱盐步骤。
3.根据权利要求2所述的抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述的亲和层析和脱盐步骤所采用的介质为偶联手足口病疫苗的琼脂糖亲和介质。
4.根据权利要求1所述的抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述的原料血浆为肠道病毒抗体效价不低于1∶64的血浆。
5.根据权利要求1所述的抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中，调整制品离子强度至0.05～0.09。
6.根据权利要求1所述的抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中，控制蛋白液的电导率不高于0.3ms/cm。
7.根据权利要求1所述的抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述的：
步骤(1)中的原料血浆为：按单采血浆术规程操作，选择肠道病毒疫苗免疫合格或自然感染愈后获得免疫的符合单采血浆标准的供血浆者，除常规要求的病毒检测外，增加对单人份血浆肠道病毒抗体检测，所述的肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒71型中的一种或几种，筛选出抗体效价不低于1∶8的血浆；
步骤(1)具体为：将原料血浆消毒、破袋、入罐，迅速融化至0～4℃，用0.9％氯化钠溶液调整血浆蛋白质含量至40g/L～65g/L，用pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液调整制品pH至5.7～6.3，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为18％～22％，控制最终温度在-4～-6℃，搅拌反应1小时以上，按2～10g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土、珍珠岩或两者的混合物，继续反应30～60分钟后压滤分离组分I+II+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取I+II+III沉淀称重；
步骤(2)具体为：加入注射用水溶解组分I+II+III沉淀，控制蛋白液中蛋白质含量至6g/L～30g/L，用磷酸盐缓冲液调整蛋白液pH至4.6～5.4，搅拌反应1小时以上，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使蛋白液中乙醇终浓度为12％～19％，控制最终温度在-1～-4℃，搅拌反应1小时以上，按2～10g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土、珍珠岩或两者的混合物，继续反应30～60分钟后压滤分离组分I+III沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa；
步骤(3)具体为：按每升滤过液加入3～5g氯化钠调整制品离子强度至0.05～0.09后，调整蛋白液中蛋白质含量至3g/L～8g/L，用0.1～0.5mol/L氢氧化钠溶液调整制品pH至7.0～7.4，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为24％～26％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离组分II沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取组分II沉淀称重；
步骤(4)具体为：加入8～10倍组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液电导率不高于0.3ms/cm，按80～120g/L蛋白液的比例加入甘氨酸保护剂，用0.1～0.5mol/L氢氧化钠溶液调整蛋白液pH至7±0.4，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时；
步骤(5)具体为：巴氏灭活结束后，降温制品至30℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.7～7.3，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇浓度为18％～22％，控制最终温度在-1～6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5～2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土、珍珠岩或两者的混合物，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，沉淀废弃，之后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸溶液调整滤出液pH为7～7.4，搅拌加入-15℃以下的95％乙醇，使制品中乙醇终浓度为24％～27％，控制最终温度在-6～-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀A，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0～0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀A称重；
步骤(6)具体为：加入5～10倍沉淀A量的注射用水溶解后，经澄清过滤、透析脱醇后浓缩至蛋白质含量不低于50g/L，乙醇浓度不高于0.025％，调整制品pH至3.8～7.4；
若步骤(1)筛选出的血浆抗体效价低于1∶64，则在上述步骤(6)之后进行亲和层析和脱盐步骤，具体为：用磷酸盐缓冲液平衡介质，吸附条件为pH6.4～7.4的磷酸盐缓冲液，洗脱条件为pH为2～5的缓冲液，洗脱下来的蛋白液采用注射用水透析脱盐后浓缩至蛋白质含量不低于50g/L；
若步骤(1)筛选出的血浆抗体效价不低于1∶64，则跳过上述亲和层析和脱盐步骤，直接进行步骤(7)；
步骤(7)具体为：用注射用水稀释制品蛋白质含量为45～55g/L，抗体效价应不低于1∶640，按90～110g/L蛋白液比例加入麦芽糖，按20～100mg/L蛋白液比例加入聚山梨酯80，用0.5mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L柠檬酸溶液整蛋白液pH至3.8～4.4；
步骤(8)具体为：用规格为不超过0.2μm滤芯除菌过滤分装后，转入21～26℃环境中孵放21～24天灭活病毒。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白，其特征在于：其肠道病毒抗体效价不低于1∶640，免疫球蛋白含量不低于总蛋白含量的95.0％，IgG单体和二聚体之和不低于95％。
9.权利要求8所述的抗手足口病人免疫球蛋白的使用方法，其特征在于采用静脉输注160000～320000滴度的特异性抗体。
10.权利要求8所述的抗手足口病人免疫球蛋白在制造以其为活性成分的药物中的应用。
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