CN105669860B - 一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法 - Google Patents
一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法，其手足口病毒中和抗体效价大于等于1:800。该制备方法包括：(1)筛选出手足口病毒中和抗体效价大于等于1:80的高效特免血浆；(2)将筛选出的高效特免血浆混合；(3)将上述混合血浆采用低温乙醇压滤法分离并结离子交换层析法纯化分离免疫球蛋白组分Ⅱ，经过滤、层析、超滤、配制、低pH孵放灭活病毒、纳米膜过滤去除病毒、分装得到纯度98.5％～100％的免疫球蛋白。该制备和生产方法得到的手足口人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对肠道病毒进行治疗，是治疗肠道病毒感染症的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是涉及一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术
EV71病毒属于微小病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA病毒,主要由柯萨奇病毒(Cox)、埃可病毒(Echo)、肠道型病毒71型(EV71)中的一种或几种引起。该病早期病原体主要为CoxA16型。1969年，研究者首次从患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离得到肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)。1974年以来，EV71病毒曾在世界范围内多次暴发，主要引起婴幼儿(0～6岁)手足口病(HFMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，而中枢神经系统感染导致的肺水肿、肺出血和心肌炎，使其致残和病死率较高。每次疫情暴发，均会夺走许多婴幼儿的生命。1997年以来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1981年，我国在上海发现手足口病，随后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东和安徽等十几个省(市)相继出现疫情。2008年EV71导致的手足口病疫情在多个省市暴发，2009年1～4月，全国累计报告手足口病例115618例，重症773例，死亡50例，由于死亡的都是婴幼儿，引起很大的社会恐慌。到目前为止，临床上尚无预防EV71病毒感染的疫苗或特异、高效的抗病毒治疗药物，静脉注射人免疫球蛋白(IVIG)能有效地抵抗炎症的发生发展，对感染手足口病的患者有一定的治疗作用，但特异性不强。因此开发具有特异性的针对手足口病毒的人免疫球蛋白具有重要的意义，对于治疗因巨细胞病毒引起的重症感染具有不可替代的临床应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效治疗手足口病毒重症感染的人免疫球蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种抗手足口病人免疫球蛋白,其手足口病人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶800。
所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。所述免疫球蛋白的纯度为98.5％～100％。所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
其中，PKA指激肽释放酶原激活剂，ACA指抗补体活性。
本发明所述的抗手足口病人免疫球蛋白具有高效、安全、可靠、特异性强等优点，可以用于大规模的工业化生产。
制备所述免疫球蛋白的原料血浆为肠道病毒抗体效价不低于1∶80的血浆。
本发明所述的抗手足口病人免疫球蛋白可以根据实际需要选择合适的剂型，例如液体制剂或冻干制剂；具体使用时，可以采用静注或其他的方式。
本发明还提供一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)用中和试验的方法筛选出手足口病毒不低于1:80中和抗体效价滴度的原料血浆；
(2)以筛选后的所述原料血浆制备混合血浆供试品，所述混合血浆中手足口病毒中和抗体效价滴度不低于1:160；
(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05～0.3MPa，主要包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品。
进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：
(A)样品稀释：
血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释的样品液；
打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；
在样品试验板的各样品孔中加入25μL细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μL细胞维持液；
将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品25μL，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为3％的胎牛血清的DMEM液；
(B)攻击病毒：
攻击病毒液制备：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；
回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液分别加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；
阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；
将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：
细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：
将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
进一步，步骤(3)所述免疫球蛋白制备具体步骤包括如下：
(A)从血浆中分离组分II+III：
将冷冻血浆在温度1～4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到6.9～7.3，加入浓度为54％的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为8％～10％，使反应液的最终温度为-1～-4℃，离心分离组分I；
用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.85～6.05，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-3.0℃～-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；
(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入4～6倍量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0～2.0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05～5.25，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃～-5.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；
向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.2～7.6，每升溶液加入2.8g氯化钠以提高反应液离子强度；加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-10.0℃～-12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品；
(C)将上步加压过滤后的组分II沉淀用0～3℃注射用水溶解5～7小时，溶解温度控制在0℃～3.0℃；
将充分溶解的组分II过滤澄清，加入3％盐酸调节溶液的pH值至6.50～6.70之间，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导率为1.30～1.50ms/m；
采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；
用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5～6.7后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.50～4.00，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
(D)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在2℃～10.0℃之间，蛋白浓度达到6％～8％(g/mL)时，加入2.0℃～10.0℃注射用水,使液蛋白浓度在2％～5％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCL适量以保持蛋白液pH在3.50～4.00。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～10.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；
(E)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCL调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为50～55g/L，麦芽糖含量为9％～11％(g/mL)，抗体效价不低于1∶800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活；
(F)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品抗手足口病人免疫球蛋白。
进一步，在加压过滤时，加入1％～2％(g/mL)的硅藻土做助滤剂，有利于提高过滤效果。
本发明所述制备方法与现有技术相比有以下优点：
(1)从健康人群中筛选出具有较高滴度的特异性原料血浆，其标准符合《中华人民共和国药典》2015版中“生物制品生产用血浆”规定，经低温乙醇压滤工艺结合柱层析纯化制备出高效价的抗手足口病人免疫球蛋白，是用于预防和治疗肠道病毒所引起的手足口病的新的有效药物，特异性高，对于提高患者的存活率具有重要的意义。
(2)本产品将填补国内缺乏该药物的市场空白。
(3)采用中和试验法对原料及产品进行抗体效价的检测，该方法具有操作性强，灵敏度高、特异性好的优点。
(4)本发明所选用原料血浆中的抗手足口病抗体的中和效价不低于1:80，保证制备出的抗手足口病的中和抗体效价较高，不低于1:800。而现有申请专利相比(申请专利号：CN201110050806)所选用的原料血浆的抗手足口病中和抗体效价为1:8～1:64，低于1:64部分的血浆需要经过偶联手足口病疫苗的介质进行亲和层析浓缩，其中疫苗来源有限，用量大，无形之中增加了成本，同时制备工艺步骤越多，蛋白损失越严重，收率也较低，最后得到手足口病抗体的中和效价为1:640，与本发明相比抗体效价低，收率也较低。
(5)本发明对原料血浆采用离心的方法去除冷沉淀，再用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到6.9～7.3，加入浓度为54％的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为8％～10％，使反应液的最终温度为-1～-4℃，再通过离心分离组分I沉淀，得到组分II+III上清。与现有申请专利相比(申请专利号：CN201110050806)所采用的直接压滤法分离组分I+II+III沉淀相比得到的蛋白纯度更高(蛋白纯度100％)，现有专利最后得到的蛋白纯度为95％，同时离心分离得到的冷沉淀和组分I沉淀可以用于凝血因子类制品如VIII因子、纤维蛋白原的制备，能够充分有效的提高血浆的利用率和提高其附加值。
(6)本发明用1M碳酸氢钠溶液调节组分III上清液pH值为7.2～7.6，然后再通过添加氯化钠调节反应液的离子强度后压滤，现有申请专利(申请专利号：CN201110050806)所采用的是NaOH调节组分III上清液pH，与NaHCO3相比，NaOH无缓冲能力，发明人曾经用NaOH调节过组分III上清液的pH发现：随着酒精浓度的提高，其pH也再变化，不稳定，故影响最终组分II的收率，导致最后免疫球蛋白的收率、纯度很不稳定。NaHCO3较NaOH有一定的缓冲能力，能够使pH在一定范围内稳定，同时NaHCO3也是弱碱性物质，较NaOH强碱性物质相比，其对制品的破坏影响较小，故最终免疫球蛋白的收率、纯度和效价也较稳定。
(7)收集的特异性原料血浆，采用压滤机为主要分离设备，代替离心机进行静注人免疫球蛋白的生产，使分离的温度等条件容易控制，分离速度快，而且没有高速运转设备，生产安全性高；同时，采用离子交换层析法进行产品的进一步纯化，制备出的免疫球蛋白制剂纯度达到98.5％以上，抗体效价不低于1∶800，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。较现有申请手足口病毒人免疫球蛋白的专利(申请专利号：CN201110050806)效价1:640相比，效价更高、质量更稳定、回收率也更高。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
各实施例中，RD细胞，中文名称为人横纹肌瘤细胞，购自ATCC。
细胞维持液为体积百分比3％胎牛血清，购自Gibco；DMEM细胞培养液购自Gibco。
实施例1
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的抗手足口病抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:80；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于55g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3％胎牛血清的DMEM细胞培养液)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，在样品板中每孔加入25μL细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液25μL/孔，每样品平行2孔。
(C)取手足口病毒EV71用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，5％(v/v)的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞：
细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞(人横纹肌瘤细胞，ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的DMEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:80；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价＝1:80；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:80。血浆样品以中和效价大于或等于1:80判为合格的高效价抗手足口病特免血浆。
含较高滴度的特异性血浆在投产前进行混合检测，抗体滴度不低于1:160，连续三批混合血浆检测结果见表1-3。
表1第一批混合血浆检测结果
表2第二批混合血浆检测结果
| 检测项目 | A(普通血浆) | B(高低度特异性血浆) |
| 蛋白含量 | 56.5g/L | 57.5g/L |
| EV71中和抗体效价 | 1:85 | 1:196 |
表3第三批混合血浆检测结果
| 检测项目 | A(普通血浆) | B(高低度特异性血浆) |
| 蛋白含量 | 56g/L | 56.5g/L |
| EV71中和抗体效价 | 1:80 | 1:200 |
3.抗手足口病人免疫球蛋白的制备：
(A)将1600名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为950L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:226；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆(即步骤A中的混血浆)950L在温度4℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.02，加入浓度为54％(v/v)的乙醇溶液168Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-2.5℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.90，加入浓度为95％(v/v)的乙醇溶液150Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-4.8℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂14.3Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀80.75Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入5倍量预冷的注射用水403Kg溶解，使反应温度控制在1.2℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.10，加入41Kg浓度为95％(v/v)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-5.2℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.40，每升溶液加入2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-11.2℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取22Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品。
(D)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用2℃注射用水溶解6小时，溶解温度控制在2℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％(m/v)盐酸调节溶液的pH值至6.59，用5％(m/v)氯化钠溶液调节溶液的电导率为1.39ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.6的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.6后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.6的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％(m/v)盐酸调节溶液pH至3.95，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(E)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在6℃，蛋白浓度达到7％(g/mL)时，加入6℃注射用水,使蛋白浓度达到3％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCL适量以保持蛋白液pH在3.50～4.00。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～10.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.95，使最终制品中免疫球蛋白含量为55g/L，麦芽糖含量为10％(g/mL)(100mL溶液10g麦芽糖)，抗体效价不低于1∶800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活。
(G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注抗手足口病人免疫球蛋白。
上述方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白其手足口病毒中和抗体效价大于等于1:800，纯度为98.5％～100％，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
利用上述方法得到的手足口人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对肠道病毒进行治疗，是治疗肠道病毒(包括柯萨奇病毒、埃可病毒(Echo)、肠道病毒71型(EV71)中的一种或几种)感染症的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。
实施例2
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的抗手足口病抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:80；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于55g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3％胎牛血清的DMEM细胞培养液)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒型号和代次，在样品板每孔中加入25μL细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液25μL/孔，每样品平行2孔。
(C)取手足口病毒EV71用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，5％(v/v)的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞：
细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞(ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的DMEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:80；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价＝1:80；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:80。血浆样品以中和效价大于或等于1:80判为合格的高效价抗手足口病特免血浆。
3.抗手足口病人免疫球蛋白的制备：
(A)将1770名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1100L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:196；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆(即步骤A中的混血浆)1100L在温度2℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到6.9，加入浓度为54％(v/v)的乙醇溶液185Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-1℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.85，加入浓度为95％(v/v)的乙醇溶液171Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-4.5℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂16.9Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀85.25Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入6倍量预冷的注射用水515Kg溶解，使反应温度控制在0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.25，加入47Kg浓度为95％(v/v)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-5.5℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.20，每升溶液加入2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-11.5℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取25.6Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品。
(D)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用0℃注射用水溶解5小时，溶解温度控制在2℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％(m/v)盐酸调节溶液的pH值至6.62，用5％(m/v)氯化钠溶液调节溶液的电导率为1.37ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.7后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.7的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％(m/v)盐酸调节溶液pH至3.5，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(E)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在2℃，蛋白浓度达到7％(g/mL)时，加入2℃注射用水,使蛋白浓度达到3％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～10.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8，使最终制品中免疫球蛋白含量为50g/L，麦芽糖含量为10％(g/mL)(100mL溶液10g麦芽糖)，抗体效价不低于1∶800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活。
(G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注抗手足口病人免疫球蛋白。
上述方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白其手足口病毒中和抗体效价大于等于1:800，纯度为98.5％～100％，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
实施例3
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的抗手足口病抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:80；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于55g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比3％胎牛血清的DMEM细胞培养液)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒型号和代次，在样品板每孔中加入25μL细胞维持液，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液25μL/孔，每样品平行2孔。
(C)取手足口病毒EV71用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，5％(v/v)的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞：
细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞(ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的DMEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:80；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价＝1:80；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:80。血浆样品以中和效价大于或等于1:80判为合格的高效价抗手足口病特免血浆。
3.抗手足口病人免疫球蛋白的制备：
(A)将1670名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1000L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:200；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆(即步骤A中的混血浆)1000L在温度1℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.3，加入浓度为54％(v/v)的乙醇溶液171Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-4℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到6.05，加入浓度为95％(v/v)的乙醇溶液166Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-5.5℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂15.5Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀83.75Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入4倍量预冷的注射用水500Kg溶解，使反应温度控制在2℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05，加入45Kg浓度为95％(v/v)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.55，每升溶液加入2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(v/v)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-10.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取25.2Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品。
(D)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用3.0℃注射用水溶解7小时，溶解温度控制在2.0℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％(m/v)盐酸调节溶液的pH值至6.5，用5％(m/v)氯化钠溶液调节溶液的电导率为1.5ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.51的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.51后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.51的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％(m/v)盐酸调节溶液pH至4.01，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(E)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在10℃，蛋白浓度达到7％(g/mL)时，加入10℃注射用水,使蛋白浓度达到3％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～10.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(F)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为54g/L，麦芽糖含量为10％(g/mL)(100mL溶液10g麦芽糖)，抗体效价不低于1∶800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活。
(G)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注抗手足口病人免疫球蛋白。
上述方法制备的抗手足口病人免疫球蛋白其手足口病毒中和抗体效价大于等于1:800，纯度为98.5％～100％，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
质量检验
按上述工艺制备的抗肠道病毒71型(EV71)人免疫球蛋白，其质量检验如下表4。
表4.抗手足口病人免疫球蛋白检验报告书
通过以上数据可以看出，本发明所述的手足口人免疫球蛋白抗体具有高效、安全、可靠、特异性好等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用中和试验的方法筛选出手足口病毒不低于1:80中和抗体效价滴度的原料血浆；
(2)以筛选后的所述原料血浆制备混合血浆供试品，所述混合血浆中手足口病毒中和抗体效价滴度不低于1:160；
(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05～0.3MPa，主要包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品；
步骤(3)所述免疫球蛋白制备具体步骤包括如下：
(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度1～4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到6.9～7.3，加入乙醇使血浆中乙醇的最终浓度为8％～10％，使反应液的最终温度为-1～-4℃，离心分离组分I；调节组分I上清液的pH到5.85～6.05，加入乙醇，使血浆中乙醇的浓度达到20％，使反应液的最终温度控制在-3.0℃～-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；
(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀加入4～6倍量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0～2.0℃；用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05～5.25，加入乙醇使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-4.5℃～-5.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.2～7.6，每升溶液加入2.8g氯化钠以提高反应液离子强度；加入乙醇使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-10.0℃～-12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品；
(C)将上步加压过滤后的组分II沉淀用0～3℃注射用水溶解5～7小时，溶解温度控制在0℃～3.0℃；将充分溶解的组分II过滤澄清，调节溶液的pH值至6.50～6.70之间，并调节溶液的电导率为1.30～1.50ms/m；采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液，平衡至出液的pH值为6.5～6.7后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.5～6.7的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.50～4.00，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
(D)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在2℃～10.0℃之间，蛋白浓度达到6％～8％，其单位为g/mL，时，加入2.0℃～10.0℃注射用水,使液蛋白浓度在2％～5％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定；透析过程中保持蛋白液pH在3.50～4.00；透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用2.0℃～10.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；
(E)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8～4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为50～55g/L，麦芽糖含量为9％～11％，其单位为g/mL，抗体效价不低于1∶800，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃～25℃下21天进行病毒灭活；
(F)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品抗手足口病人免疫球蛋白；
所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG；
步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括如下：
(A)样品稀释：血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续10倍稀释，即最终1:40倍稀释的样品液；打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒型号和代次；在样品试验板的各样品孔中加入25μL细胞维持液,病毒回滴孔与阴性对照孔加入50μL细胞维持液；将预先灭活的样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品25μL，每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为3％的胎牛血清的DMEM液；
(B)攻击病毒：攻击病毒液制备：根据试验的标本数用维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液分别加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：细胞悬液的配制：取足够量的RD细胞，即人横纹肌瘤细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养7天，病毒接种后的第5天显微镜下观察细胞生长情况，第7天最终判定结果，并记录统计。
2.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法,其特征在于，步骤(3)的步骤(F)得到的抗手足口病人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶800。
3.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法,其特征在于，步骤(3)的步骤(F)得到的抗手足口病人免疫球蛋白的纯度为98.5％～100％。
4.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法,其特征在于，步骤(3)的步骤(F)得到的抗手足口病人免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
5.根据权利要求1所述一种抗手足口病人免疫球蛋白的制备方法,其特征在于，步骤(3)的步骤(F)得到的抗手足口病人免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干制剂。
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