CN112225799B - 自动化分离系统快速提取covid-19患者康复期血浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及自动化分离系统快速提取COVID‑19患者康复期血浆的方法，该方法是将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离成三个组分层：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层，接着将得到血浆进行病毒灭活，任选地将所该血浆冻存，得到可用于制备静注免疫球蛋白G的血浆。本发明还包括制备静注免疫球蛋白G制剂的方法，该方法包括如上述方法获得血浆组分，用低温乙醇法沉淀血浆，得到组分I+II+III，使组分II与组分I+III分离，接着分别制得免疫球蛋白G半成品1和半成品2，经除菌和灭活病毒后得到免疫球蛋白G原液，进而制得可供静脉注射使用的静注免疫球蛋白G制剂。本发明方法获得如说明书所述优异技术效果。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种从全血中快速分离成分血浆用以制备静注COVID-19免疫球蛋白的方法。特别涉及一种使用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速提取COVID-19患者康复期血浆的方法。尤其是涉及使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS，ThermoGenesisCorp.)从全血中快速分离成分血浆用以制备静注COVID-19免疫球蛋白G的方法，例如用以制备静脉注射用超免疫球蛋白。该静注COVID-19免疫球蛋白可用于新型冠状病毒COVID-19感染患者的治疗。
背景技术
2019冠状病毒病(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)也称新型冠状病毒，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus2，SARS-CoV-2)所致疾病，潜伏期为1～14d，多为3～7d。临床表现流感样症状，以发热、干咳、乏力为主要表现。根据症状严重程度，临床分为轻型、普通型、重型和危重型。重症病例多在1周后出现呼吸困难，危重型患者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，严重者可导致患者死亡。
随着恢复期血浆被成功的用于治疗多种急性病毒性传染病，如在埃博拉、严重急性呼吸综合症(SARS)病毒和中东呼吸综合征(MERS)病毒流行时均曾制备恢复者的血浆用于治疗或医学研究，其独到的治疗技术优势越来越受到肯定和认同，针对新型冠状病毒目前虽暂无特异性药物治疗，但发现新型冠状病毒肺炎康复者体内有高滴度抗体，能对抗新冠病毒，可以降低患者体内的病毒含量，其中有些可能会中和病毒并防止新一轮感染。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》已经将康复者血浆治疗作为病情进展较快、重型和危重型患者的常规治疗方案。康复者血浆中特异性抗体可中和患者体内SARS-CoV-2病毒，有助于改善患者临床症状和预后转归。新型冠状病毒肺炎康复者血浆治疗的目的是使新型冠状病毒感染者，在当前没有特效药物治疗的情况下，达到对症和支持疗法，尤其是重型和危重型患者能减轻症状，提高患者的活动耐力。
人免疫球蛋白(ImmunoGlobulin，Ig)是人体对外来抗原(如细菌、病毒及其它毒素或异物)进行免疫应答的主要物质，又称抗体。血浆来源的人免疫球蛋白制品按注射途径分为：静注人免疫球蛋白(Intravenous Immunoglobulin G，IVIG)和肌肉注射人免疫球蛋白(Intramuscular Immunoglobulin，IMIG)其主要成分为免疫球蛋白G，它是最重要的血浆蛋白之一，分子量为150kDa，在血浆中的含量约为6.6～14.5g/L，约占血浆免疫球蛋白总量的75％，含糖2～3％。COVID-19患者康复期血浆中存在较高滴度SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白G，能够中和新型冠状病毒，是治愈COVID-19患者关键所在，在当前没有特效药物治疗的情况下，达到对症和支持疗法，尤其是重型和危重型患者能减轻症状，提高患者的活动耐力。
目前绝大多数的供体血浆来源均来自于单采血浆站采集的捐献者的血液成分，经过血浆分离机分离后得到。该方法具有很大的局限性：首先捐赠者需要去单采血站进行登记，这不利于偏远地区的捐赠者进行血浆采集工作；其次在单采血浆的过程中，捐赠者需要注射血液抗凝剂以防止采集的血液在体外凝结；再者，成分血采集时间一般为2～3小时，在采血及血液分离过程中，捐赠者需全程保持固定姿势，相对较长的时间导致一些捐赠者不能耐受采血活动，这也是导致采血失败的主要原因之一。
针对以上问题，本发明提供了一种封闭式多细胞组分自动化分离系统(Multicomponent Automated Cell Separation System，MACSS)可以在短时间内从COVID-19患者康复期的外周血全血中，直接分离出成分血浆而不需要对捐赠者输注抗凝剂或对血浆成分有影响的其他试剂因子如组分Ficoll等，保证了采集的血浆具有高度的原始性，不会破坏血浆中所含有的免疫球蛋白G的活性和功能。并且，外周血全血经由该分离系统分离后，可直接分离为三种组分：红细胞、血浆、单个核细胞悬液；血浆可进一步进行工艺制备，纯化出SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白G用于静脉输注，红细胞及单个核细胞悬液可直接用于其他制备工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速提取COVID-19患者康复期血浆用于制备免疫球蛋白G的方法。或者，本发明的目的在于提供一种快速处理血浆并制备静注COVID-19免疫球蛋白G注射液的方法。或者，本发明的目的在于提供一种快速处理血浆的方法，使该血浆能够用于制备静注COVID-19免疫球蛋白G注射液。已经出人意料的发现，使用本发明的方法，可以获得如本文所述一个或者多个方面的技术效果。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明的第一方面提供了一种快速分离获取用以制备静注COVID-19免疫球蛋白G的血浆的方法，该方法是将取自人的外周血使用封闭式多细胞组分自动化分离系统分离成三个组分层：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层，接着将得到血浆进行病毒灭活，任选地将所该血浆在-20℃以下冻存，得到可用于制备静注COVID-19免疫球蛋白G的血浆。
根据本发明第一方面的方法，其中所述病毒灭活是亚甲蓝光化学法病毒灭活。
根据本发明第一方面的方法，其中所述外周血是选自下列来源的外周血：①SARS-CoV-2自然感染者(亦可称COVID-19患者)、②SARS-CoV-2自然感染者通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者(即COVID-19患者康复期)、③SARS-CoV-2疫苗注射者、④SARS-CoV-2疫苗注射者并经过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的免疫者。
根据本发明第一方面的方法，其所获得的血浆丙氨酸氨基转移酶活性低于40U/L。
根据本发明第一方面的方法，其所获得的血浆之HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后为阴性。
根据本发明第一方面的方法，其所获得的血浆中，蛋白质含量高于50g/L。
根据本发明第一方面的方法，其中所述外周血是静脉穿刺法采集的外周血并置于包含抗凝剂的血液采集袋内。
根据本发明第一方面的方法，其中在用封闭式多细胞组分自动化分离系统进行分离前，还向所述外周血中添加分离助剂；在一个实施方案中，所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液；在一个实施方案中，所述分离助剂中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.5mol/L；在一个实施方案中，所述分离助剂是照如下方法配制的：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15分钟，即得；在一个实施方案中，所述分离助剂与外周血的体积比为1：100。
根据本发明第一方面的方法，其包括如下步骤：
(1)、通过静脉穿刺法采集的外周血(例如COVID-19患者康复期捐赠的外周血)250mL，置血液采集袋内(例如采集袋内装有抗凝剂，例如为枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15分钟；
(2)、使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated CellSeparation System，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的60ml血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.6ml分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10分钟；
(3)、将一次性分离杯配平后放置于可编程的离心机进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
在离心的初始高速部分即2000RCF期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度至500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；
(4)、离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中分别单独采集红细胞、细胞浓缩层、血浆；
(5)、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存，备用于制备静注COVID-19免疫球蛋白G的制剂。
进一步的，本发明第二方面提供了制备静注COVID-19免疫球蛋白G制剂的方法，该方法包括如下步骤：
(1)利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血(例如COVID-19患者康复期的外周血)以获得血浆组分；
(2)采用低温乙醇法沉淀血浆，得到组分I+II+III；
(3)组分I+II+III压滤后，组分II与组分I+III分离；
(4)组分II的沉淀溶解及柱层析纯化后超滤，得到免疫球蛋白G半成品1；
(5)组分I+III的沉淀溶解及柱层析纯化后超滤，得到免疫球蛋白G半成品2；
(6)将半成品1、2合并，除菌过滤和灭活病毒后，得到COVID-19免疫球蛋白G原液；
(7)免疫球蛋白G原液经配制、分装，得到可供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G制品。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤(1)如本发明第一方面任一实施方案所述。
根据本发明第二方面的方法，其包括如下步骤：
(1)照本发明第一方面任一实施方案所述的方法，利用封闭式多细胞组分自动化分离系统快速分离外周血(例如COVID-19患者康复期的外周血)以获得血浆组分；
(2)将步骤(1)所得冻存的血浆置于融浆罐内进行融化，离心除去冷沉淀，用生理盐水稀释至血浆的蛋白含量在4.5～5.5g/L范围内，调节至pH5.95±0.05，接着缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到19％，静置10～12h，压滤至过滤液澄清透亮，压滤机上的沉淀即为组分I+II+III；将组分I+II+III沉淀用10倍重量的0～4℃低温注射用水溶解，调整pH值至4.70～4.80并充分搅拌，接着调整pH值至5.20±0.05并继续搅拌；缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到14％，调整pH值至5.20±0.05，在-3.5℃～-4.5℃温度范围内放置12h；向物料罐中添加助滤剂，压滤至过滤液澄明透亮时，分离出包含组分I+III的沉淀、包含组分II的上清，向组分II中添加乙醇至乙醇浓度为25％，压滤，得到包含组分II的沉淀物；
(3)将步骤(2)所得组分II沉淀用注射用水溶解稀释后加助滤剂深层过滤至溶液澄清透亮；上样至DEAE Sepharose Fast Flow凝胶柱，用pH4.0醋酸洗脱液进行洗脱，截留的目标组分用孔径为30kD的超滤膜进行超滤透析至蛋白含量≥50g/L，得到免疫球蛋白G半成品1；
(4)将步骤(2)所得组分I+III沉淀用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌溶解，升温至20℃±1℃，喷淋方式加入正辛酸至浓度为20mmol/L后，剧烈搅拌以沉淀杂质蛋白，用压滤机压滤，获得澄清透明的滤液，收集上清溶液；将该上清溶液调节pH至5.7±0.3，0.22μm膜过滤，加载到Macro cap Q离子交换柱上用醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱进行柱层析，收集的洗脱液用纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，得到滤液；滤液调整pH4.2±0.2，用含40mmol/L醋酸溶液的注射用水进行超滤脱盐(超滤膜截留规格为10kDa的相对分子质量)，使制品pH维持在4.5±0.05、电导率≤1ms/cm后，进行浓缩，得到蛋白质含量大于50g/L的制品，其为免疫球蛋白G半成品2；
(5)将步骤(3)和步骤(4)所得半成品1和半成品2混合，经纳滤除菌、低孵放灭活病毒后，得到免疫球蛋白G原液(作为半成品)，其亦称为静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着将该静注COVID-19免疫球蛋白G原液用0.9％氯化钠注射液稀释配制可成供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G制剂(注射液)，即为成品。
在本发明的制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与本发明其它任一实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于本发明其它任一实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
目前国内外获取免疫球蛋白G的方法主要是从血浆或其相关组分II+III或其相关组分I+II中纯化，鲜有从组分I+III直接提取制备的，主要是因为组分I+III成分复杂，分离提纯难度大，不宜分离。但经过本发明人初步研究发现，组分I+III中确实含有一定量的免疫球蛋白G大有可回收价值。因此，本发明的一个目的在于提供一种分别从组分II和组分I+III中提取免疫球蛋白G的制备工艺，其目的旨在于提高血浆中免疫球蛋白G的回收效率，更有助于对COVID-19疾病的治疗。
本发明另一目的是提供一种从外周血中快速获得成分血浆用以制备静注COVID-19免疫球蛋白G的制备方法。
如本发明所述的，本发明方法获得了如本文所述一个或者多个方面的技术效果，例如获取血浆速度快，所制得的血浆和静注COVID-19免疫球蛋白G的抗体滴度高。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
本发明处理血样时，如未另外说明，使用封闭式多细胞组分自动化分离系统，即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)或
System，ThermoGenesis Corp.生产的设备，www.thermogenesis.com，其是一种半自动化、功能封闭的系统，可从血样中收集精确容积的细胞浓缩液组分，包括：血浆、红细胞沉淀物、单个有核细胞沉淀物组分。该分离系统由四个主要组件构成：①一次性使用分离杯、②可充电控制模块、③交流供电模块对接、④DataTrak软件系统。其中的一次性使用分离杯包括单独的回收舱室(红细胞回收舱、细胞浓缩回收舱)、中央舱室(血浆回收舱)和集成的夹紧机制。分离系统的控制模块组件是一个微处理器控制的设备，在离心过程中与一次性使用分离杯结合使用，以引导红细胞、浓缩的单有核细胞(细胞浓缩液)及血浆转移到一次性使用分离杯内的独立舱室中。离心后，将控制模块放置在对接站上，以便使用
DataTrak软件下载处理数据。
实施例1、快速分离COVID-19患者康复期的血浆
1、通过静脉穿刺法采集的COVID-19患者(在本文该名患者标记为患者X)康复期捐赠的外周血(多于250mL)，置血液采集袋内(采集袋内装有抗凝剂枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15分钟；[上述SARS-CoV-2感染者亦可称为COVID-19患者，其是SARS-CoV-2自然感染者并且通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者]
2、使用ThermoGenesis Corp.的封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的60ml血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.6ml分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10分钟；[所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.5mol/L。灭菌水溶液的配制方法是本领域技术人员公知的，例如将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15分钟，即得。所述油酸钠是注射用级别的]
3、将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机(本试验使用ThermoScientificTM离心机)进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
| 程序编号 | 加速 | 减速 | 相对离心力(RCF) | 持续时间(min) |
| 1 | 9 | 7 | 2000 | 8.5 |
| 2 | 9 | 7 | 50 | 2 |
| 3 | 9 | 7 | 500 | 2 |
| 4 | 9 | 7 | 50 | 1 |
| 5 | 9 | 7 | 250 | 0.5 |
| 6 | 9 | 7 | 50 | 1 |
4、在离心的初始高速部分(2000RCF)期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：(1)红细胞(RBC)层、(2)细胞浓缩层、以及(3)血浆层；
5、将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
6、短暂增加速度500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
7、再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
8、在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层。
9、再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中。离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中可单独采集红细胞、细胞浓缩层(单有核细胞)及血浆，该分离过程仅需耗时15min。
10、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和100mL转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至100mL转移袋内。用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存、备用。
11、将以上方法快速分离后的血浆经速率法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性应不高于40，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后应为阴性，血浆蛋白质含量应不低于50g/L，满足这些要求的血浆，作为COVID-19患者康复期血浆，其可用于后续步骤。
实施例2、从原料血浆中制备组分I+II+III及组分II与组分I+III的分离过程，
1、缓冲液的配制：
①pH4.75的0.15mol/L的磷酸盐缓冲液：每1kg所需Na2HPO4·12H2O为53g、冰醋酸27mL调节pH至4.75，得到的缓冲液简称Buffer A；
②pH5.25的0.5mol/L的磷酸盐缓冲液：每1kg所需Na2HPO4·12H2O为160.6g、冰醋酸24mL调节pH至5.25，得到的缓冲液简称Buffer B；
③压滤用组分I+III平衡液：每1kg所需95％乙醇0.13kg、Na2HPO4·12H2O为1.9g，冰醋酸0.39mL；
④1mol/L氯化钠溶液：每1kg所需NaCl 58.5g、补加水至1kg；
⑤1mol/L碳酸氢钠溶液：每1kg所需NaCl 84.0g、补加水至1kg；
⑥1mol/L HCL溶液：制10.0L 1.0mol/L HCL，所需HCL量为834ml，补加注射用水至10L；
2、将血浆袋(实施例1方法获得)从冷冻环境中取出，血浆袋表面用75％乙醇消毒，经注射用水洗涤后(洗涤用注射用水温度不得超过30℃)破袋，破袋后的血浆进入融浆罐进行融化，控制血浆温度为≤4℃。融化后的血浆经管式离心机离心，控制离心出液温度为≤4℃，离心机的出液速度≤2000mL/min。
去除离心后血浆中的冷沉淀；
3、将离心后的血浆用生理盐水稀释至血浆的蛋白含量在4.5～5.5g/L范围内(本实施例控制在5.0g/L)。在各种物料控制温度在-5℃的条件下，向100ml稀释的血浆中加入pH4.75的0.15mol/L的磷酸盐缓冲液调节至pH5.95±0.05，接着缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到19％，然后静置血浆制品达10～12h；
4、将静置后的血浆制品用压滤机进行压滤，控制进液压力≤0.24Mpa，出液温度-5℃，使得过滤液澄清透亮，压滤机上的沉淀即为组分I+II+III；
5、在物料罐中将组分I+II+III沉淀用10倍重量的0～4℃低温注射用水溶解，溶解过程的温度控制在0～4℃，溶解时间≥2h；
6、加入Buffer A，调整pH值至4.70～4.80，悬液温度0～3℃，充分搅拌；
7、加入Buffer B，调整pH值至5.20±0.05，继续搅拌30min；
8、缓慢添加乙醇，使乙醇浓度达到14％。加入Buffer B，调整pH值至5.20±0.05，控制温度在-3.5℃～-4.5℃范围内，放置12h；
9、向物料罐中添加助滤剂0.3％硅藻土和0.3％珍珠岩，用压滤机进行压滤。压滤条件控制为：进液压力≤0.24Mpa，出液温度-3.5℃～-4.5℃，直至过滤液澄明透亮时，组分I+II+III中的组分I+III在沉淀中被分离出来，而组分II溶解在上清中，达到组分I+III与组分II分离的目的。
10、向组分II的上清液中滴加1.5mol/L的NaCl溶液，调节电导率为4.4±0.2ms/cm，接着添加乙醇至乙醇浓度为25％；
11、用压滤机进行压滤，调节进液压力≤0.24Mpa，出液温度-6.5～-7.5℃，压滤完成后，得到组分II为沉淀物。
实施例3、组分II沉淀溶解及柱层析纯化免疫球蛋白G
1、缓冲液的配制：
①层析平衡液：每1kg加入Na2HPO4·12H2O 3g，冰醋酸0.27mL，加低温注射用水溶解并调整pH6.6～7.0，电导率1.3～1.5ms/cm、温度0～0.5℃；
②pH4.0磷酸缓冲液：每1kg加入Na2HPO4·12H2O 17.9g、NaCl 29.2g、冰醋酸约1.5mL，用低温注射水溶解；
③pH4.0醋酸洗脱液：每1kg加入NaAc·3H2O 20.7g、NaCl 58.5g、冰醋酸20.5mL，加注射用水调节pH＝4.0；
2、将实施例2所得组分II沉淀用10倍注射用水溶解稀释，溶解温度为0～4℃，溶解时间≥2h，溶解后调整pH为6.6～7.0、电导率1.4ms、蛋白浓度1～2％，加助滤剂0.3％硅藻土和0.3％珍珠岩进行深层过滤，过滤至溶液澄清透亮；
3、将DEAE Sepharose Fast Flow凝胶用pH4.0磷酸缓冲液冲洗至pH6.6～7.4，再用pH6.6～7.0，电导率为1.4ms的层析平衡液平衡DEAE Sepharose Fast Flow层析柱。将上一步骤所得溶液上样至层析柱中，用pH4.0醋酸洗脱液进行洗脱，控制流穿速度为5～10L/min，收集穿流组分免疫球蛋白G(纯度97％以上)，将洗脱下来的目标组分调节pH至3.6～3.7，接着进行下面的超滤。
4、超滤：选用孔径为30kD的超滤膜，将流穿的免疫球蛋白G制品用10倍体积的注射用水进行超滤透析，超滤液的温度应控制在0～15℃，超滤后的蛋白含量应≥50g/L，pH4.0±0.4。在超滤后的滤液中加入麦芽糖至浓度为10％，再次测定pH值为4.0±0.4，蛋白含量≥50g/L。此制品为免疫球蛋白G半成品1；
实施例4、组分I+III的沉淀溶解及柱层析纯化免疫球蛋白G
1、将实施例2所得组分I+III沉淀用pH4.5、7℃的20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌溶解3h，缓冲液用量是沉淀量的3倍(组分I+III沉淀溶解后蛋白质含量需不低于25g/L)；
2、样品充分溶解后，通过全自动升降温系统将制品升温至20℃±1℃，然后加入0.3mol/L的NaOH溶液调整pH值至4.5±0.05，然后以20mL/min的喷淋速度加入正辛酸，使溶液中的正辛酸均匀分布，至溶液中的正辛酸的浓度为20mmol/L后，停止加入正辛酸，剧烈搅拌2h以上，用以沉淀杂质蛋白(非免疫球蛋白G)。用20℃的注射用水，以20kg/min的流速对压滤机的滤板进行冲洗，然后用常温的压缩空气吹干滤板，平衡后压滤制品，制品压滤结束后用20℃的注射用水冲洗滤板，回收蛋白质，获得澄清透明的滤液，收集上清溶液。
3、Macro cap Q离子交换柱平衡：用20mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5±0.05)平衡5倍柱体积，以线流速≤2cm/min冲洗层析柱；
4、离子交换柱层析：将正辛酸沉淀且病毒灭活后所收集的上清溶液用0.3mol/L的NaOH溶液调节pH至5.7±0.3，经0.22μm的滤器过滤，过滤压力≤0.02Mpa，过滤后上预先平衡后的Macro cap Q离子交换柱用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱进行柱层析；上样流速≤2cm/min，使大分子杂质结合到层析柱上，上样结束后用3倍柱体积的平衡液洗脱层析柱，收集洗脱液；[柱再生：依次用5倍柱体积的1mol/L NaCl溶液、5倍柱体积0.1mol/L HCl溶液、3倍柱体积的0.3mol/L NaOH溶液分别处理层析柱，进行柱再生，溶液流速≤2cm/min]
5、纳米膜过滤：洗脱液经0.1μm过滤滤膜预过滤后，用Millipore viresolve Pro纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，得到滤液；
6、超滤：将上述滤液用0.3mol/L HCl溶液调整pH4.2±0.2，制品用10倍体积的含40mmol/L醋酸溶液的注射用水进行超滤脱盐，超滤膜截留规格为10kDa的相对分子质量，使制品pH维持在4.5±0.05、电导率≤1ms/cm后，进行浓缩，得到蛋白质含量大于50g/L的制品，其为免疫球蛋白G半成品2；
实施例5、静注COVID-19免疫球蛋白G注射液的制备
将实施例3和实施例4所得半成品1和半成品2混合，经纳滤除菌、低孵放灭活病毒后，得到免疫球蛋白G原液(作为半成品)，其亦称为静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着将该静注COVID-19免疫球蛋白G原液用0.9％氯化钠注射液稀释配制可成供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G注射液，即为成品。
实施例6、静注人免疫球蛋白G的中和抗体效价检测
当病毒、细菌等病原微生物入侵人体后，会激活人体的内的免疫系统，刺激B细胞产生多种抗体，但只有部分抗体能够迅速识别病原微生物，与其表面的抗原相结合，阻止该病原微生物结合靶细胞表面的受体入侵细胞，从而保护人体不受感染，这个过程叫做中和作用，发挥作用的抗体叫做中和抗体。中和作用的意思为当病毒进入机体，免疫细胞把中和蛋白分泌到血液中，与病毒颗粒相结合，阻止病毒感染细胞，同时破坏病毒颗粒结构，把病毒“中和”掉。而静注的COVID-19免疫球蛋白G原液中含有针对SARS-Cov-2病毒的中和抗体，可以阻断病毒入侵细胞的能力，SARS-CoV-2中和抗体效价情况，体现了其抑制病毒入侵细胞的能力，是静注COVID-19免疫球蛋白G的质量控制重要指标。通过抗体中和实验检测本发明方法所得免疫球蛋白G制品、COVID-19患者康复期血浆及市售的静脉注射用人免疫球蛋白(PH4)的中和SARS-CoV-2病毒的能力。
Elisa中和试验检测结果如下表1。
表1、SARS-CoV-2中和抗体效价
| 样品来源 | 抗体滴度IU/mL |
| 静注COVID-19免疫球蛋白G原液(实施例5产物) | 26.364×10E2 |
| COVID-19患者康复期血浆(实施例1产物) | 12.846×10E2 |
| 注射用免疫球蛋白(PH4，市售) | 0.306×10E2 |
上述结果表明，本方法制备的静注COVID-19免疫球蛋白G制品具有较高的SARS-CoV-2中和抗体效价，表明其能在抵抗病毒入侵中能够发挥显著效果。
实施例7、静注COVID-19免疫球蛋白G注射液的制备
上述实施例1～5的制备过程，在本发明中可称为试验A。
在本实施例的第1个实验(其在本发明中可称为试验B)中，使用实施例1所述患者的外周血60ml，参照实施例1～5的操作方法，唯一不同是在实施例1步骤2所用的分离助剂中未添加镁盐，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例5操作中制得的产物静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着，参照实施例6的方法，测得本实验所得以下两种物料的抗体滴度：COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝4.113×10E2，静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝9.762×10E2。
在本实施例的第2个实验(其在本发明中可称为试验C)中，使用实施例1所述患者的外周血60ml，参照实施例1～5的操作方法，唯一不同是在实施例1步骤2所用的分离助剂中未添加油酸钠，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例5操作中制得的产物静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着，参照实施例6的方法，测得本实验所得以下两种物料的抗体滴度：COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝3.848×10E2，静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝11.273×10E2。
在本实施例的第3个实验(其在本发明中可称为试验D)中，使用实施例1所述患者的外周血60ml，参照实施例1～5的操作方法，唯一不同是在实施例1步骤2中未添加分离助剂，依次制得各种物料，包括在参照实施例1操作中制得的产物COVID-19患者康复期血浆、在参照实施例5操作中制得的产物静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着，参照实施例6的方法，测得本实验所得以下两种物料的抗体滴度：COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝4.514×10E2，静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝12.817×10E2。
从本试验的结果可见，出人意料的发现是，使用封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)处理血样时，向血样中同时添加油酸钠和镁盐可以显著提到所得血浆的抗体滴度。另外，由于油酸钠和镁盐添加量相当少，并且它们都是常用的可以注射使用的药用辅助剂，即使残余在最终的静脉注射制剂中亦是容许的。
实施例8、静注COVID-19免疫球蛋白G注射液的制备
通过静脉穿刺法采集的另一名COVID-19患者(在本文该名患者标记为患者Y)康复期捐赠的外周血250mL，置血液采集袋内(采集袋内装有抗凝剂枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15分钟；
使用ThermoGenesis Corp.的封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的60ml血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.6ml分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10分钟；[所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.5mol/L；灭菌水溶液的配制方法：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15分钟，即得；所述油酸钠是注射用级别的]
将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机(本试验使用ThermoScientificTM离心机)进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
在离心的初始高速部分(2000RCF)期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：(1)红细胞(RBC)层、(2)细胞浓缩层、以及(3)血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中可单独采集红细胞、细胞浓缩层(单有核细胞)及血浆，该分离过程仅需耗时15min；
利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和100mL转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至100mL转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存、备用；
将以上方法快速分离后的血浆经速率法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性应不高于40，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后应为阴性，血浆蛋白质含量应不低于50g/L，满足这些要求的血浆，作为COVID-19患者康复期血浆，其可用于后续步骤；该COVID-19患者康复期血浆可称为试验8A的COVID-19患者康复期血浆。
接着使用上述试验8A的COVID-19患者康复期血浆，照本发明实施例2～5的方法进行处理，制得在本实施例8中称作为试验8A的静注COVID-19免疫球蛋白G原液。
本实施例以上操作可称为试验8A。
在本实施例的另一个实验(其在本发明中可称为试验8B)中，使用试验8A所涉患者的外周血60ml，参照试验8A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加镁盐，依次制得各种物料，包括制得的产物：试验8B的COVID-19患者康复期血浆、试验8B的静注COVID-19免疫球蛋白G原液；
在本实施例的再一个实验(其在本发明中可称为试验8C)中，使用试验8A所涉患者的外周血60ml，参照试验8A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加油酸钠，依次制得各种物料，包括制得的产物：试验8C的COVID-19患者康复期血浆、试验8C的静注COVID-19免疫球蛋白G原液；
在本实施例的再另一个实验(其在本发明中可称为试验8D)中，使用试验8A所涉患者的外周血60ml，参照试验8A的操作方法，唯一不同是未添加分离助剂，依次制得各种物料，包括制得的产物：试验8D的COVID-19患者康复期血浆、试验8D的静注COVID-19免疫球蛋白G原液。
参照实施例6的方法，测定本实施例所得两类物料的抗体滴度，结果如下：试验8A之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝11.538×10E2，试验8A之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝23.794×10E2；试验8B之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝3.627×10E2，试验8B之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝9.514×10E2；试验8C之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝4.016×10E2，试验8C之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝9.537×10E2；试验8D之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝3.836×10E2，试验8D之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝11.748×10E2。
实施例9、静注COVID-19免疫球蛋白G注射液的制备
通过静脉穿刺法采集的另一名COVID-19患者(在本文该名患者标记为患者Z)康复期捐赠的外周血250mL，置血液采集袋内(采集袋内装有抗凝剂枸橼酸钠)，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15分钟；
使用ThermoGenesis Corp.的封闭式多细胞组分自动化分离系统即Multicomponent Automated Cell Separation System(MACSS)，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的60ml血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.6ml分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10分钟；[所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5％，硫酸镁以镁离子计为0.5mol/L；灭菌水溶液的配制方法：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45μm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121℃热压灭菌15分钟，即得；所述油酸钠是注射用级别的]
将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机(本试验使用ThermoScientificTM离心机)进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
在离心的初始高速部分(2000RCF)期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：(1)红细胞(RBC)层、(2)细胞浓缩层、以及(3)血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中可单独采集红细胞、细胞浓缩层(单有核细胞)及血浆，该分离过程仅需耗时15min；
利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和100mL转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至100mL转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存、备用；
将以上方法快速分离后的血浆经速率法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性应不高于40，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后应为阴性，血浆蛋白质含量应不低于50g/L，满足这些要求的血浆，作为COVID-19患者康复期血浆，其可用于后续步骤；该COVID-19患者康复期血浆可称为试验9A的COVID-19患者康复期血浆。
接着使用上述试验9A的COVID-19患者康复期血浆，照本发明实施例2～5的方法进行处理，制得在本实施例9中称作为试验9A的静注COVID-19免疫球蛋白G原液。
本实施例以上操作可称为试验9A。
在本实施例的另一个实验(其在本发明中可称为试验9B)中，使用试验9A所涉患者的外周血60ml，参照试验9A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加镁盐，依次制得各种物料，包括制得的产物：试验9B的COVID-19患者康复期血浆、试验9B的静注COVID-19免疫球蛋白G原液；
在本实施例的再一个实验(其在本发明中可称为试验9C)中，使用试验9A所涉患者的外周血60ml，参照试验9A的操作方法，唯一不同是所用的分离助剂中未添加油酸钠，依次制得各种物料，包括制得的产物：试验9C的COVID-19患者康复期血浆、试验9C的静注COVID-19免疫球蛋白G原液；
在本实施例的再另一个实验(其在本发明中可称为试验9D)中，使用试验9A所涉患者的外周血60ml，参照试验9A的操作方法，唯一不同是未添加分离助剂，依次制得各种物料，包括制得的产物：试验9D的COVID-19患者康复期血浆、试验9D的静注COVID-19免疫球蛋白G原液。
参照实施例6的方法，测定本实施例所得两类物料的抗体滴度，结果如下：试验9A之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝13.637×10E2，试验9A之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝25.382×10E2；试验9B之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝4.183×10E2，试验9B之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝9.736×10E2；试验9C之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝4.528×10E2，试验9C之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝10.381×10E2；试验9D之COVID-19患者康复期血浆的抗体滴度＝3.948×10E2，试验9D之静注COVID-19免疫球蛋白G原液的抗体滴度＝8.974×10E2。
以上实施例1～5、实施例7～9所得各种血浆的丙氨酸氨基转移酶活性均低于40U/L，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后均为阴性，蛋白质含量均高于50g/L，60ml外周血经封闭式多细胞组分自动化分离系统处理后可得到30.4～32.1ml可用于制备静注COVID-19免疫球蛋白G的血浆；例如，实施例1所得COVID-19患者康复期血浆，其丙氨酸氨基转移酶活性为16.4U/L，HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后均为阴性，蛋白质含量均高于53.7g/L，60ml外周血经封闭式多细胞组分自动化分离系统处理后可得到31.2ml。
虽然本发明上文以SARS-CoV-2自然感染者康复期外周血为例进行静注COVID-19免疫球蛋白G的制备，然而，众所周知，这些制备方法同样还适用于来自①SARS-CoV-2自然感染者、②SARS-CoV-2自然感染者通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者、③SARS-CoV-2疫苗注射者、④SARS-CoV-2疫苗注射者并经过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的免疫者的外周血。
以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.快速分离获取用以制备静注COVID-19免疫球蛋白G的血浆的方法，其包括如下步骤：
(1)、通过静脉穿刺法采集的SARS-CoV-2自然感染并通过血清抗体滴度/血清中和抗体滴度确认后的康复者的外周血250mL，置血液采集袋内，将血液采集袋置于水平摇床上充分混匀15分钟；
(2)、使用封闭式多细胞组分自动化分离系统，将一次性使用分离杯的塑料针头插入到血液采集袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的60ml血液自然流入分离杯内的中央舱室；在加入血液前所述中央舱室内预先添加有0.6ml分离助剂；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离，再使该一次性分离杯置于水平摇床上充分混匀10分钟；所述分离助剂是包含油酸钠和硫酸镁的灭菌水溶液，其中油酸钠浓度为5%，硫酸镁浓度以镁离子计为0.5mol/L；所述封闭式多细胞组分自动化分离系统是ThermoGenesis Corp.生产的PXP® System；
(3)、将一次性分离杯配平后放置于可编程的离心机进行离心操作，并按照如下程序设定离心机的参数：
在离心的初始高速部分即2000RCF期间，外周血样本中的细胞通过密度分层在一次性使用分离杯中分为三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
将速度降低至50RCF，并且在此第一次低速离心期间，大部分红细胞被引导至红细胞回收舱；
短暂增加速度至500RCF，以进一步将处理室中的细胞分层；
再次降低至50RCF，进一步除去红细胞；
在采集血浆之前，相对离心力短暂增加至250RCF，在此期间，细胞浓缩层和血浆进一步分层；
再次降低至50RCF，细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，使大部分血浆保留在中央舱室中；
(4)、离心机减速并停止旋转，在一次性分离杯中分别单独采集红细胞、细胞浓缩层、血浆；
(5)、利用无菌接管机连接一次性分离杯上中央舱室的管路和转移袋的管路，将中央舱室中的分离后的血浆转移至转移袋内；用无菌接合仪焊接管路后，将分离后的血浆用亚甲蓝光化学法病毒灭活，然后在6h内快速冻结至-20℃以下，保存，得到血浆，其备用于制备静注COVID-19免疫球蛋白G的制剂。
2.根据权利要求1的方法，其所获得的血浆中丙氨酸氨基转移酶活性低于40U/L。
3.根据权利要求1的方法，其所获得的血浆之HbsAg、梅毒、HIV-I、HIV-II抗体、HCV抗体用经批准的检测试剂盒检测后为阴性。
4.根据权利要求1的方法，其所获得的血浆中，蛋白质含量高于50g/L。
5.根据权利要求1的方法，步骤(1)所述血液采集袋内包含抗凝剂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述抗凝剂是枸橼酸钠。
7.根据权利要求1的方法，所述分离助剂是照如下方法配制的：将规定量的油酸钠和硫酸镁溶解于注射用水中，用0.45µm微孔滤膜过滤，封装于玻璃瓶中，121°C热压灭菌15分钟，即得。
8.制备静注COVID-19免疫球蛋白G制剂的方法，该方法包括如下步骤：
(1)如权利要求1~7任一项所述获得血浆组分；
(2)采用低温乙醇法沉淀血浆，得到组分I+II+III；
(3)组分I+II+III压滤后，组分II与组分I+III分离；
(4)组分II的沉淀溶解及柱层析纯化后超滤，得到免疫球蛋白G半成品1；
(5)组分I+III的沉淀溶解及柱层析纯化后超滤，得到免疫球蛋白G半成品2；
(6)将半成品1、2合并，除菌过滤和灭活病毒后，得到COVID-19免疫球蛋白G原液；
(7)免疫球蛋白G原液经配制、分装，得到可供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G制剂。
9.根据权利要求8的方法，其包括如下步骤：
(1)如权利要求1~7任一项所述获得血浆组分；
(2)将步骤(1)所得冻存的血浆置于融浆罐内进行融化，离心除去冷沉淀，用生理盐水稀释至血浆的蛋白含量在4.5~5.5g/L范围内，调节至pH5.95±0.05，接着缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到19%，静置10~12h，压滤至过滤液澄清透亮，压滤机上的沉淀即为组分I+II+III；将组分I+II+III沉淀用10倍重量的0～4℃低温注射用水溶解，调整pH值至4.70～4.80并充分搅拌，接着调整pH值至5.20±0.05并继续搅拌；缓慢添加乙醇使乙醇浓度达到14%，调整pH值至5.20±0.05，在-3.5℃ ~ -4.5℃温度范围内放置12h；向物料罐中添加助滤剂，压滤至过滤液澄明透亮时，分离出包含组分I+III的沉淀、包含组分II的上清，向组分II中添加乙醇至乙醇浓度为25%，压滤，得到包含组分II的沉淀物；
(3)将步骤(2)所得组分II沉淀用注射用水溶解稀释后加助滤剂深层过滤至溶液澄清透亮；上样至DEAE Sepharose Fast Flow凝胶柱，用pH4.0醋酸洗脱液进行洗脱，截留的目标组分用孔径为30kD的超滤膜进行超滤透析至蛋白含量≥50g/L，得到免疫球蛋白G半成品1；
(4)将步骤(2)所得组分I+III沉淀用20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液搅拌溶解，升温至20℃±1℃，喷淋方式加入正辛酸至浓度为20mmol/L后，剧烈搅拌以沉淀杂质蛋白，用压滤机压滤，获得澄清透明的滤液，收集上清溶液；将该上清溶液调节pH至5.7±0.3，0.22μm膜过滤，加载到Macro cap Q离子交换柱上用醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱进行柱层析，收集的洗脱液用纳米膜过滤，除去包括细小病毒在内的潜在病毒，得到滤液；滤液调整pH4.2±0.2，用含40mmol/L醋酸溶液的注射用水进行超滤脱盐，超滤膜截留规格为10kDa的相对分子质量，使制品pH维持在4.5±0.05、电导率≤1ms/cm后，进行浓缩，得到蛋白质含量大于50g/L的制品，其为免疫球蛋白G半成品2；
(5)将步骤(3)和步骤(4)所得半成品1和半成品2混合，经纳滤除菌、低孵放灭活病毒后，得到作为半成品的免疫球蛋白G原液，其亦称为静注COVID-19免疫球蛋白G原液；接着将该静注COVID-19免疫球蛋白G原液用0.9%氯化钠注射液稀释配制成可供静脉注射使用的静注COVID-19免疫球蛋白G制剂，即为成品。
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