CN107266537A - 口蹄疫抗原146s浓缩纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，包括：先将口蹄疫病毒培养液离心至澄清，在无菌条件下加二氯甲烷，搅拌均匀，在低温下沉降，过夜，取上清液；过大、小孔径的中空纤维，然后层析，按照浓度为7‑10％的比例加入PEG，搅拌；静置；提取上清液并弃去，将沉淀后的抗原搅拌均匀，无菌下灌装至离心桶内，沉降离心；弃上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的PBS缓冲液稀释，重悬；重悬液用分散机充分匀浆；纯化离心，收集上清液，上清液为纯化抗原；纯化抗原用0.22μm孔径滤器过滤除菌，然后用适量PBS液冲洗滤器和管路。本发明采用二氯甲烷浓缩纯化口蹄疫抗原，比传统的氯仿安全性更好，并且纯化后杂蛋白含量较低。采用二氯甲烷把较大的杂蛋白除去，中控纤维去除特定大小的蛋白颗粒，Sephawse 6FF层析、TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析进一步去除特定大小蛋白进一步提高目标蛋白纯度，PEG只抓取目标物(口蹄疫抗原)，相当于再次除去杂蛋白结构，使得口蹄疫抗原浓缩纯化的效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及抗原浓缩纯化技术领域，具体涉及一种口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法。
背景技术
口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种烈性人畜共患的急性接触性传染病，在世界许多国家和地区广泛流行。由于猪、牛、羊等均可感染此疾病，并能形成全球大规模流行，所以被国际兽疫局是最重要的动物传染病，该病在亚洲、非洲、南美洲的流行极大的限制了这些地区的肉品及其它农产品的出口,阻碍了这些地区的畜牧业、畜产品加工业的发展。口蹄疫严重危害畜牧业的发展,给牧区造成严重经济损失，也可使对外贸易和旅游业遭受惨重损失。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，绵羊是此病的有力传播者；我国部分地区于2005年及2009年分别暴发Asia I型和A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害奶业的健康发展以及相关产品的对外贸易。
接种疫苗是预防该病的重要手段之一，而研制高质量、安全有效的疫苗，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。口蹄疫疫苗生产工艺复杂，特别是抗原的纯化工艺尤其重要，146S抗原是口蹄疫疫苗免疫原性起决定性作用的的抗原，比较脆弱，容易破碎或裂解，会导致免疫原性丧失或下降。口蹄疫病毒培养液中有效抗原(146S抗原)含量较低，疫苗注射后免疫持续期短，疫苗免疫效力不稳定。为提高疫苗的免疫效力，通常采用对抗原浓缩纯化。但浓缩的同时，非目的蛋白也会被浓缩，导致不良反应增加。疫苗中的较高的非目的蛋白成分会造成动物在注苗后出现不同程度的不良反应，轻者减食或停食2-3天或发生流产，重者发生死亡。疫苗中的非目的蛋白包括培养细胞时残留的血清，细胞蛋白和口蹄疫病毒的非结构蛋白，为降低不良反应需要对疫苗进行纯化。
目前，对口蹄疫病毒纯化主要是通过中空纤维过滤达到除去细胞碎片、非结构蛋白等，氯仿去除非目的蛋白，纯化过程口蹄疫抗原损失较大。现阶段对于口蹄疫抗原纯化主要通过过滤除去大颗粒蛋白，过滤过程损失较大；氯仿除非目的蛋白工艺中氯仿毒性较大，每立方米可能会对人体产生慢性毒性的最小浓度10毫升。因此，现在常用的口蹄疫抗原浓缩纯化的方法已经不能适用于口蹄疫疫苗的发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，本发明采用二氯甲烷替纯化口蹄疫抗原，纯化过程不经过过滤抗原损失较小。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，包括以下步骤：
S101先将口蹄疫病毒培养液离心至澄清，在无菌条件下加二氯甲烷，搅拌均匀，在低温下沉降，过夜，取上清液；
S102将上清液过第一中空纤维进行过滤，收集透过液；
S103将透过液过第二中空纤维进行过滤，所述第二中空纤维的孔径比所述第一中空纤维的孔径小，收集回收液；
S104将S103中收集的回收液进行层析；
S105按照浓度为7-15％的比例加入PEG，搅拌；
S106停止搅拌后静置；
S107提取上清液并弃去，将沉淀后的抗原搅拌均匀，在无菌条件下灌装至离心桶内，沉降离心；
S108弃去上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的PBS缓冲液稀释，重悬；
S109重悬液用分散机充分匀浆；
S110纯化离心，收集上清液，上清液为纯化抗原；
S111纯化抗原用0.1μm或0.2μm孔径滤器过滤除菌。
优选地，S101中在无菌条件下加入1-7％的二氯甲烷，搅拌均匀后，在2-8℃下沉降。
优选地，所述第一中空纤维的孔径为0.1-0.5μm。
优选地，所述第二中空纤维的孔径为100KDa-300KDa。
优选地，S104层析为Sephawse 6FF层析、Sephawse 4FF层析、TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析。
优选地，S105中PEG为PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000中的一种或几种。
优选地，S105中加入PEG的搅拌方式为：在连续搅拌的状态下加入PEG，在搅拌速度为100-200r/min的状态下持续搅拌4小时；
或者加入PEG，在搅拌速度为100-200r/min的状态下持续搅拌4小时。
优选地，S106中停止搅拌后静置4-20h，静置全过程中，抗原液温度保持在2-8℃。
优选地，S107中在连续流离心机或者冷冻离心机中进行沉降离心，温度为2-8℃，在8000-10000r/min的速度下，离心15-20min。
优选地，S109中重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速为3000-6000r/min；S110中采用连续流离心机或冷冻离心机纯化离心，离心机的转速为8000r/min，离心5-20min。
本发明的有益效果是:
本发明采用二氯甲烷浓缩纯化口蹄疫抗原，比传统的氯仿安全性更好，二氯甲烷每立方米可能会对人体产生慢性毒性的最小浓度为50毫升，而氯仿对人体产生慢性毒性的最小浓度为10毫升。
本发明采用二氯甲烷和PEG联合作用来浓缩纯化口蹄疫抗原，首先采用二氯甲烷把较大的杂蛋白除去，PEG只抓取目标物(口蹄疫抗原)，相当于二次除去杂蛋白结构，纯化后杂蛋白含量较低，使得口蹄疫抗原浓缩纯化的效果更好。
本发明采用大孔径中空纤维进将大颗粒蛋白与目的蛋白分离，然后采用小孔径中空纤维进一步将小颗粒蛋白与目的蛋白分离；层析进一步提高目的蛋白纯度。
本发明采用Sephawse 6FF层析、Sephawse 4FF层析、TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析进一步将蛋白分离纯化，可以得到更高的纯化效果。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
实施例1中公开了一种口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)口蹄疫病毒培养液离心澄清后，在无菌条件下，加1％的二氯甲烷，搅拌均匀，在2-8℃下沉降，过夜，取上清液。沉降时保持低温，能够防止目标产物降解，采用二氯甲烷浓缩纯化口蹄疫抗原，比传统的氯仿安全性更好，二氯甲烷每立方米可能会对人体产生慢性毒性的最小浓度为50毫升，而氯仿对人体产生慢性毒性的最小浓度为10毫升。
(2)将上清液过0.1μm的中空纤维进行过滤，收集透过液。
(3)将透过液经100KDa的中空纤维进行过滤，收集回收液。
(4)将回收液经Sephawse 6FF层析。
(5)层析回收液在连续搅拌的状态下，按最终浓度为7-10％(W/V)的比例加入PEG-6000，持续搅拌4小时，搅拌速度控制在100-200r/min。
首先采用二氯甲烷把较大的杂蛋白除去，中控纤维去除特定大小的蛋白颗粒，Sephawse 6FF层析进一步去除特定大小蛋白进一步提高目标蛋白纯度，PEG只抓取目标物(口蹄疫抗原)，相当于再次除去杂蛋白结构，使得口蹄疫抗原浓缩纯化的效果更好。
(6)停止搅拌后静置4-20小时，静置全过程，抗原液温度保持在2-8℃范围内。
(7)提取上清液并弃去，将沉降后的抗原搅拌混匀(不加PBS液)，在无菌条件下灌装至50ml离心桶内，沉降离心，采用连续流离心机或普通的冷冻离心机，离心条件为：8000～10000r/min、15～20min，2-8℃。此处控制低温离心，目的是防止目标产物降解，并且离心速度在8000～10000r/min离心效果较好，如果离心速度较低，离心不彻底，如果离心速度较快，达到离心的条件要求较高，不易操作。
(8)弃去上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的0.04M PBS缓冲溶液稀释，重悬。在pH值为7.6±0.2时，目标产物的溶解性最好。
(9)重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速控制在3000～6000r/min，7-15min。
(10)纯化离心，采用连续流离心机或普通的冷冻离心机，离心条件为：8000r/min，5～20min，收集上清液即纯化抗原。
(11)纯化抗原用0.22um孔径滤器过滤除菌。
实施例2
(1)口蹄疫病毒培养液离心澄清后，在无菌条件下，加7％的二氯甲烷，搅拌均匀，在2-8℃下沉降，过夜，取上清液。
(2)将上清液过0.2μm的中空纤维进行过滤，收集透过液。
(3)将透过液经200KDa的中空纤维进行过滤，收集回收液。
(4)将回收液经Sephawse 4FF层析。
(5)按最终浓度为7-10％(W/V)的比例加入PEG-4000，持续搅拌4小时，搅拌速度控制在100-200r/min，在其它实施例中PEG还可以是PEG-2000。
(6)停止搅拌后静置4-20小时，静置全过程，抗原液温度保持在2-8℃范围内。
(7)提取上清液并弃去，将沉降后的抗原搅拌混匀(不加PBS液)，在无菌条件下灌装至50ml离心桶内，沉降离心，采用连续流离心机或普通的冷冻离心机，离心条件为：8000～10000r/min、15～20min，2-8℃。
(8)弃去上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的0.04M PBS缓冲溶液稀释，重悬。
(9)重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速控制在3000～6000r/min。
(10)纯化离心，采用连续流离心机或普通的冷冻离心机，离心条件为：8000r/min，5～20min，收集上清液即纯化抗原。
(11)纯化抗原用0.22um孔径滤器过滤除菌。
实施例3
(2)口蹄疫病毒培养液离心澄清后，在无菌条件下，加4％的二氯甲烷，搅拌均匀，在2-8℃下沉降，过夜，取上清液。
(2)将上清液过0.5μm的中空纤维进行过滤，收集透过液。
(3)将透过液经300KDa的中空纤维进行过滤，收集回收液。
(4)将回收液经TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析层析。
(5)按最终浓度为7-10％(W/V)的比例加入PEG-6000，持续搅拌4小时，搅拌速度控制在100-200r/min，在其它实施例中PEG还可以是PEG-2000。
(6)停止搅拌后静置4-20小时，静置全过程，抗原液温度保持在2-8℃范围内。
(7)提取上清液并弃去，将沉降后的抗原搅拌混匀(不加PBS液)，在无菌条件下灌装至50ml离心桶内，沉降离心，采用连续流离心机或普通的冷冻离心机，离心条件为：8000～10000r/min、15～20min，2-8℃。
(8)弃去上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的0.04M PBS缓冲溶液稀释，重悬。
(9)重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速控制在3000～6000r/min。
(10)纯化离心，采用连续流离心机或普通的冷冻离心机，离心条件为：8000r/min，5～20min，收集上清液即纯化抗原。
(11)纯化抗原用0.2um孔径滤器过滤除菌。
实施例4
实施例3中基于实施例1和实施例2中的方法，将O型口蹄疫抗原进行浓缩纯化，具体方法包括：
(1)抗原制备：本品是O型口蹄疫病毒接种BHK21悬浮细胞，收获细胞培养液所得。
(2)沉降除杂：通过4℃静置除去细胞培养液中细胞碎片等大颗粒杂质，收集上清液。
(3)将上清液过0.5μm的中空纤维进行过滤，收集透过液。
(4)将透过液经300KDa的中空纤维进行过滤，收集回收液。
(5)将回收液经Sephawse 6FF层析。
(6)加入二氯甲烷：将已过滤除菌的二氯甲烷通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，补加体积为细胞培养液体积的5％，30rpm搅拌15min后，4℃静置16h过夜。
(7)排放废液：通过罐底阀将静置废液排出，排出体积在7％左右，乳白色废液全部排出。
(8)加入PEG6000：将已经高压灭菌的50％PEG6000通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，补加体积为细胞培养液体积的14％，30rpm搅拌4h后，4℃静置16h过夜。
(9)收集沉淀物：通过罐底阀将静置后沉淀排出，将乳白色沉淀物全部排出。
(10)离心：将收集的沉淀物无菌分装到500mL离心桶内，10000rpm冷冻离心20min，弃上清。
(11)匀浆重悬：用pH7.6±0.2的无菌0.04M PBS重悬，重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速控制在6000r/min，10min。
(12)纯化离心：普通的冷冻离心机，8000r/min，10min，收集上清液(即纯化抗原)；
(13)过滤除菌：纯化抗原用0.22um孔径滤器过滤除菌。
对比例1
对比例的纯化方法与实施例4中一致，对比例采用氯仿和PEG6000，实施例仅采用二氯甲烷和PEG6000纯化，具体步骤如下：
(1)抗原制备：本品是O型口蹄疫病毒接种BHK21悬浮细胞，收获细胞培养液所得。
(2)沉降除杂：通过4℃静置除去细胞培养液中细胞碎片等大颗粒杂质，收集上清液。
(3)加入氯仿：将已过滤除菌的氯仿通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，补加体积为细胞培养液体积的5％，30rpm搅拌15min后，4℃静置16h过夜。
(4)排放废液：通过罐底阀将静置废液排出，排出体积在7％左右，乳白色废液全部排出。
(5)加入PEG6000：将已经高压灭菌的50％PEG6000通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，补加体积为细胞培养液体积的14％，30rpm搅拌4h后，4℃静置16h过夜。
(6)收集沉淀物：通过罐底阀将静置后沉淀排出，将乳白色沉淀物全部排出。
(7)离心：将收集的沉淀物无菌分装到500mL离心桶内，10000rpm冷冻离心20min，弃上清。
(8)匀浆重悬：用pH7.6±0.2的无菌0.04M PBS重悬，重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速控制在6000r/min，10min。
(9)纯化离心：普通的冷冻离心机，8000r/min，10min，收集上清液(即纯化抗原)；
(10)过滤除菌：纯化抗原用0.2um孔径滤器过滤除菌。
抗原及总蛋白检测
根据农业部颁发文件灭活抗原并进行抗原及总蛋白检测。实施例4中病毒培养液146S含量7μg/mL、6.6μg/mL、3.8μg/mL，纯化后46μg/mL、35.5μg/mL、16μg/mL，总蛋白415μg/mL、391g/mL、382μg/mL。
对比例中的病毒培养液146S含量5.9μg/mL、4.7μg/mL、2.5μg/mL，纯化后42μg/mL、33μg/mL、14.2μg/mL，总蛋白753μg/mL、754μg/mL、771μg/mL。
通过检测结果可知，采用上述实施例中测得的总蛋白含量较低，总蛋白含量越低，说明杂蛋白越少。
对比例2
对比例的纯化方法与实施例4中一致，对比例采用氯仿，具体步骤如下：1)抗原制备：本品是O型口蹄疫病毒接种BHK21悬浮细胞，收获细胞培养液所得。
(2)将上清液过0.5μm的中空纤维进行过滤，收集透过液。
(3)将透过液经300KDa的中空纤维进行过滤，收集回收液。
(4)将回收液经Sephawse 6FF层析。
(5)沉降除杂：通过4℃静置除去细胞培养液中细胞碎片等大颗粒杂质，将上清液转移至另一个高压灭菌的反应器罐体。
(6)加入氯仿：将已过滤除菌的氯仿通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，补加体积为细胞培养液体积的5％，30rpm搅拌15min后，4℃静置16h过夜。
(7)排放废液：通过罐底阀将静置废液排出，排出体积在7％左右，乳白色废液全部排出。
(8)加入PEG6000：将已经高压灭菌的50％PEG6000通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，补加体积为细胞培养液体积的14％，30rpm搅拌4h后，4℃静置16h过夜。
(9)收集沉淀物：通过罐底阀将静置后沉淀排出，将乳白色沉淀物全部排出。
(10)离心：将收集的沉淀物无菌分装到500mL离心桶内，10000rpm冷冻离心20min，弃上清。
(11)匀浆重悬：用pH7.6±0.2的无菌0.04M PBS重悬，重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速控制在6000r/min，10min。
(12)纯化离心：普通的冷冻离心机，8000r/min，10min，收集上清液(即纯化抗原)；
(13)过滤除菌：纯化抗原用0.2um孔径滤器过滤除菌后用适量PBS液冲洗滤器及管路。
抗原及总蛋白检测
根据农业部颁发文件灭活抗原并进行抗原及总蛋白检测。实施例4中病毒培养液146S含量7μg/mL、6.6μg/mL、3.8μg/mL，纯化后44.5μg/mL、33.4μg/mL、15.6μg/mL，总蛋白276μg/mL、240.4g/mL、197μg/mL。
对比例中的病毒培养液146S含量5.9μg/mL、4.7μg/mL、2.5μg/mL，纯化后32μg/mL、13μg/mL、14.2μg/mL，总蛋白287.3μg/mL、254μg/mL、208μg/mL。
通过检测结果可知，采用上述实施例中测得的总蛋白含量较低，总蛋白含量越低，说明杂蛋白越少。
综合上述实施例1-4和对比例1-2，采用二氯甲烷浓缩纯化口蹄疫抗原，比传统的氯仿安全性更好，二氯甲烷每立方米可能会对人体产生慢性毒性的最小浓度为50毫升，而氯仿对人体产生慢性毒性的最小浓度为10毫升。
采用二氯甲烷和PEG联合作用来浓缩纯化口蹄疫抗原，首先采用二氯甲烷把较大的杂蛋白除去，PEG只抓取目标物(口蹄疫抗原)，相当于二次除去杂蛋白结构，纯化后杂蛋白含量较低，使得口蹄疫抗原浓缩纯化的效果更好。
采用大孔径中空纤维进将大颗粒蛋白与目的蛋白分离，然后采用小孔径中空纤维进一步将小颗粒蛋白与目的蛋白分离；层析进一步提高目的蛋白纯度。
采用Sephawse 6FF层析、Sephawse 4FF层析、TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析进一步将蛋白分离纯化，可以得到更高的纯化效果。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101先将口蹄疫病毒培养液离心至澄清，在无菌条件下加二氯甲烷，搅拌均匀，在低温下沉降，过夜，取上清液；
S102将上清液过第一中空纤维进行过滤，收集透过液；
S103将透过液过第二中空纤维进行过滤，所述第二中空纤维的孔径比所述第一中空纤维的孔径小，收集回收液；
S104将S103中收集的回收液进行层析；
S105按照浓度为7-15％的比例加入PEG，搅拌；
S106停止搅拌后静置；
S107提取上清液并弃去，将沉淀后的抗原搅拌均匀，在无菌条件下灌装至离心桶内，沉降离心；
S108弃去上清液，沉淀物用pH值为7.6±0.2的PBS缓冲液稀释，重悬；
S109重悬液用分散机充分匀浆；
S110纯化离心，收集上清液，上清液为纯化抗原；
S111纯化抗原用0.1μm或0.22μm孔径滤器过滤除菌。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S101中在无菌条件下加入1-7％的二氯甲烷，搅拌均匀后，在2-8℃下沉降。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，所述第一中空纤维的孔径为0.1-0.5μm。
4.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，所述第二中空纤维的孔径为100KDa-300KDa。
5.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S104层析为Sephawse 6FF层析、Sephawse 4FF层析、TOYOPEARL、TSKgel离子交换层析。
6.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S105中PEG为PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000中的一种或几种。
7.根据权利要求1或6中所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S105中加入PEG的搅拌方式为：在连续搅拌的状态下加入PEG，在搅拌速度为100-200r/min的状态下持续搅拌4小时；
或者加入PEG，在搅拌速度为100-200r/min的状态下持续搅拌4小时。
8.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S106中停止搅拌后静置4-20h，静置全过程中，抗原液温度保持在2-8℃。
9.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S107中在连续流离心机或者冷冻离心机中进行沉降离心，温度为2-8℃，在8000-10000r/min的速度下，离心15-20min。
10.根据权利要求1所述的口蹄疫抗原146S浓缩纯化方法，其特征在于，S109中重悬液用分散机充分匀浆，分散机转速为3000-6000r/min，7-15min；S110中采用连续流离心机或冷冻离心机纯化离心，离心机的转速为8000r/min，离心5-20min。
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