CN110872580A - 一种口蹄疫抗原纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种口蹄疫抗原纯化方法，包括以下步骤：用聚乙二醇处理灭活抗原；添加助滤剂；初滤；稀释；二次过滤从而得到灭活抗原纯化液，本申请采用PEG处理灭活抗原，由于PEG抓取抗原使其粘合在助滤剂上，在过滤过程中，滤片可对抗原进行拦截，而杂质非目的蛋白则随初滤的清液排出，而后采用PBS缓冲溶液对拦截后的抗原固物稀释，使抗原与助滤剂分离。在二次过滤过程中，抗原则会通过滤片，从而完成对抗原的纯化。
Description
技术领域
本发明涉及抗原纯化领域，特别涉及一种口蹄疫抗原纯化方法。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)，是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease virus,FMDV)引起的一种热性、急性、高度接触性动物传染病。侵染对象为猪、牛、羊等偶蹄动物，易感动物多达70余种，并能形成全球大规模流行，所以被国际兽疫局(OIE)列为A类家畜传染疾病之首。口蹄疫是最重要的动物传染病，该病在亚洲、非洲、南美洲的流行极大的限制了这些地区的肉品及其它农产品的出口，阻碍了这些地区的畜牧业、畜产品加工业的发展
接种疫苗是预防该病的重要手段之一，而研制高质量、安全有效的疫苗，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。口蹄疫疫苗生产工艺复杂，特别是抗原的纯化工艺尤其重要，146S抗原是口蹄疫疫苗免疫原性起决定性作用的抗原，比较脆弱，容易破碎或裂解，会导致免疫原性下降或丧失。口蹄疫病毒培养液中有效抗原(146S抗原)含量较低，疫苗注射后免疫持续期短，疫苗免疫效力不稳定。为提高疫苗的免疫效力，通常采用对抗原浓缩，但浓缩的同时，非目的蛋白也会被浓缩，导致不良反应增加。疫苗中的非目的蛋白包括培养细胞时残留的血清，细胞蛋白和口蹄疫病毒的非结构蛋白。
目前，对抗原纯化的常规方法主要是通过对抗原浓缩过滤达到除去细胞碎片、非结构蛋白等，氯仿去除非目的蛋白。
现阶段对于口蹄疫抗原纯化方法主要是通过过滤除去大颗粒蛋白，过滤过程损失较大；通过氯仿去除非目的蛋白工艺中氯仿毒性较大，每立方米可能会对人体产生慢性毒性的最小浓度10毫升；在上述的两类纯化工艺中，均需要通过离心去除非目的蛋白，但离心过程损失较大，且效率较低，成本较高，不宜放大。上述问题是本领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简化纯化步骤、降低纯化过程损失的一种口蹄疫抗原纯化方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将聚乙二醇与灭活抗原液混合，向上述处理过的灭活抗原液中添加助滤剂，形成混合液；
S2、对上述混合液进行初滤，收集固体滤物，所述固体滤物包括助滤剂以及粘合在助滤剂上的抗原；
S3、使用PBS缓冲溶液对上述固体滤物进行洗脱，使抗原与所述助滤剂分离；
S4、二次过滤，滤除助滤剂，收集含有抗原的滤液，得到灭活抗原纯化液。
本申请采用PEG处理灭活抗原，由于PEG抓取抗原使其粘合在助滤剂上，在过滤过程中，滤片可对抗原进行拦截，而杂质非目的蛋白则随初滤的清液排出，而后采用PBS缓冲溶液对拦截后的抗原固洗脱，使抗原与助滤剂分离。在二次过滤过程中，抗原则会通过滤片，从而完成对抗原的纯化。
所述步骤S4之后还包括步骤：
S5、对步骤S4中的滤液除菌，得到无菌灭活抗原纯化液。
进一步的是：所述步骤S5中除菌中采用过滤除菌，其中过滤孔径为0.1-0.2μm。
进一步的是：所述步骤S1中，聚乙二醇为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中的一种或多种。
进一步的是：所述步骤S1中处理过的灭活抗原液中聚二醇的浓度为7-20％W/V。
进一步的是：所述步骤S2中初滤采用孔径为0.1μm-0.65μm或截留分子量为100KD-700KD的滤片。
进一步的是：所述步骤S4中二次过滤采用孔径为0.1μm-0.65μm或截留分子量为100KD-700KD的滤片。
进一步的是：所述步骤S1中助滤剂的添加量为30-50g。
进一步的是：所述步骤S3中的PBS缓冲溶液的pH值为7.6±0.5。
本发明的有益效果是：采用聚乙二醇抓取抗原使其与助滤剂结合，通过超滤装置对助滤剂过滤的替代离心步骤，直接降低生产成本，提高纯化效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
一种口蹄疫抗原纯化方法，包括以下步骤：
S1、用聚乙二醇处理灭活抗原，将聚乙二醇与灭活抗原液混合，将上述处理过的灭活抗原液与助滤剂进行混合形成混合液，具体的是，向搅拌釜中加入灭活抗原液和PEG(聚乙二醇)，其中，PEG可以是PEG2000、PEG4000和PEG6000中的一种或多种，PEG的浓度为总体系的7％-20％W/V，而后在搅拌釜中对上述混合有PEG的灭活款原液进行搅拌，在本申请中，其搅拌速度为200-400r/min，搅拌时间为3-7小时，向搅拌结束后的溶液中加入30g-50g的助滤剂，该助滤剂可以是本领域常用的助滤剂，例如硅藻土、珍珠岩、纤维素、石棉、石墨粉、锯屑、氧化镁、石膏、活性炭、酸性白土等。
S2、对上述混合液进行初滤，并收集得到固体滤物，所述固体滤物包括助滤剂以及粘合在助滤剂上的抗原，具体的是，在本申请中，采用超滤澄清过滤纯化系统对步骤S1中的混合液进行过滤，其中，该超滤澄清过滤纯化系统中采用孔径为0.1-0.65μm或截留分子量为100KD-700KD的滤片进行过滤。
在保持0.2-0.8MPa的条件下向上述超滤澄清过滤纯化系统中注入步骤S1中的混合液，并使该混合液在过料液罐中循环5分钟用以润湿过超滤装置中的滤片，而后打开该超滤澄清过滤纯化系统的过滤阀，通过滤片对混合液进行循环过滤10分钟，排出滤液，收集滤片上的固体滤物，此步骤的目的在于去除灭活抗原液中的非目的蛋白等杂质，使抗原被截留在过滤片上。
S3、取上述固体滤物，并使用PBS缓冲溶液对该固体滤物进行洗脱，使抗原从助滤剂上分离下来，具体的是，将过超滤装置中滤片上拦截的固体滤物取下，并使用pH值在7.6±0.5的PBS缓冲溶液对该固体滤物进行稀释得到稀释液。
S4、二次过滤，滤除助滤剂，收集含有抗原的滤液，得到灭活抗原纯化液，具体的是，采用超滤澄清过滤纯化系统对步骤S1中的混合液进行过滤，其中，该超滤澄清过滤纯化系统中采用孔径为0.1-0.65μm或截留分子量为100KD-700KD的滤片进行过滤，在一种优选的实施例当中，步骤S4和步骤S2可共用同一超滤澄清过滤纯化系统，在保持0.2-0.8MPa的条件下将稀释后的稀释液注入到步骤S3中的超滤澄清过滤纯化系统中，并在超滤澄清过滤纯化系统中循环5分钟以润湿滤片，而后打开该滤澄清过滤纯化系统的过滤阀，通过滤片对混合液进行循环过滤10分钟，此步骤的目的在于将抗原从固体滤物上分离下来，使其可以通过滤片，将步骤S4中的滤液收集起来则可以得到抗原纯化液。
S5、对步骤S4中的滤液除菌，得到无菌灭活抗原纯化液，具体的是，采用0.1μm至0.2μm孔径滤器对上述抗原纯化液进行过滤除菌，优选的，该过滤器的空间可以是0.1μm或0.2μm，除菌后的抗原纯化液则可以投入使用。
本申请的纯化原理是，采用PEG处理灭活抗原，由于PEG会抓取抗原并起到一定的粘合作用，因此，采用PEG处理过的抗原会粘合在助滤剂上，此步骤相当于增大了抗原的粒径，因此在过滤过程中，滤片可对抗原进行拦截，而杂质非目的蛋白则随初滤的清液排出，而后采用PBS缓冲溶液对拦截后的抗原固物稀释，使抗原与助滤剂分离，此步骤相当于减小抗原的粒径，因此。在二次过滤过程中，抗原则会通过滤片，收集滤清液则可以得到抗原纯化液。
为了便于理解，本申请进一步的提供了以下几种具体的实施例，以O型口蹄疫抗原纯化为例：
实施例1
制备灭活抗原液：
制备灭活抗原，该灭活抗原液是O型口蹄疫病毒接种BHK21悬浮细胞，收获细胞培养液所得。
沉降除杂，通过4℃静置除去细胞培养液中细胞碎片等大颗粒杂质，将上清液转移至另一个高压灭菌的反应器罐体，该上清液即为灭活抗原液。
S1、将已经高压灭菌的PEG6000通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，其中，PEG6000的浓度为总体系的7％W/V，对上述混合抗原液在200rpm的条件下搅拌4h后，添加20g助滤剂，并充分混匀。
S2、打开动力泵，在保持正压0.2-0.8MPa的条件下，将通过步骤S1得到的混合液体打入超滤澄清过滤纯化系统的料液罐中，并打开循环阀门，使其在料液罐中循环5分钟，超滤澄清过滤纯化系统中的滤片充分润湿，随后打开过滤阀门，关闭循环阀门，使液体通过滤片在料液罐中进行循环过滤10分钟，该滤片的截留分子量为100KD-700KD。
S3、循环完成后打开气吹阀，将过滤清液排出料液罐，同时收集滤片上拦截的固体滤物，将收集到的固体滤物在无菌条件与pH值为7.6±0.5的PBS缓冲溶液充分混匀。
S4、随后打开动力泵，在保持正压0.2-0.8MPa的条件下，将步骤S4中稀释混匀后的液体，打入超滤澄清过滤纯化系统中的料液罐，并打开循环阀门，使其在料液罐中循环5分钟，使料液罐中的滤片充分润湿，随后打开过滤阀门，关闭循环阀门，使液体通过滤片在超滤澄清过滤纯化系统中进行循环过滤10分钟，循环完成后打开气吹阀，将滤液转移至另一个高压灭菌的反应器罐体收集，得到抗原纯化液。
S5、抗原纯化液用0.2um孔径滤器过滤除菌后，得到无菌的抗原纯化液。
对的的抗原纯化液进行抗原及总蛋白检测：
根据农业部颁发文件灭活抗原并进行抗原及总蛋白检测。
其中，病毒培养液146S含量为6.3μg/mL、6.6μg/mL、3.5μg/mL，
纯化后含量为42μg/mL、14.9μg/mL、16μg/mL，总蛋白含量为350μg/mL。
实施例2
制备灭活抗原，该灭活抗原液是O型口蹄疫病毒接种BHK21悬浮细胞，收获细胞培养液所得。
沉降除杂，通过4℃静置除去细胞培养液中细胞碎片等大颗粒杂质，将上清液转移至另一个高压灭菌的反应器罐体，该上清液即为灭活抗原液。
S1、将已经高压灭菌的PEG6000通过无菌管路加入装有口蹄疫病毒液的反应器罐体内，其中，PEG6000的浓度为总体系的15％W/V，对上述混合抗原液在200rpm的条件下搅拌4h后，添加20g助滤剂，并充分混匀。
S2、打开动力泵，在保持正压0.2-0.8MPa的条件下，将通过步骤S1得到的混合液体打入超滤澄清过滤纯化系统的料液罐中，并打开循环阀门，使其在料液罐中循环5分钟，超滤澄清过滤纯化系统中的滤片充分润湿，随后打开过滤阀门，关闭循环阀门，使液体通过滤片在料液罐中进行循环过滤10分钟，该滤片的孔径为0.1μm-0.65μm。
S3、循环完成后打开气吹阀，将过滤清液排出料液罐，同时收集滤片上拦截的固体滤物，将收集到的固体滤物在无菌条件与pH值为7.6±0.5的PBS缓冲溶液充分混匀。
S4、随后打开动力泵，在保持正压0.2-0.8MPa的条件下，将步骤S4中稀释混匀后的液体，打入超滤澄清过滤纯化系统中的料液罐，并打开循环阀门，使其在料液罐中循环5分钟，使料液罐中的滤片充分润湿，随后打开过滤阀门，关闭循环阀门，使液体通过滤片在超滤澄清过滤纯化系统中进行循环过滤10分钟，循环完成后打开气吹阀，将滤液转移至另一个高压灭菌的反应器罐体收集，得到抗原纯化液。
S5、抗原纯化液用0.2um孔径滤器过滤除菌后，得到无菌的抗原纯化液。
其中，病毒培养液146S含量为6.3μg/mL、6.6μg/mL、3.5μg/mL，
纯化后含量为54.6μg/mL、19.4μg/mL、20.8μg/mL，总蛋白含量为338μg/mL。
根据现有的常规方法对口蹄疫抗原进行纯化，根据农业部颁发文件灭活抗原并进行抗原及总蛋白检测。
其中，病毒培养液146S含量为6.3μg/mL、6.6μg/mL、3.5μg/mL，
纯化后含量为25.2μg/mL、9μg/mL、9.0μg/mL，总蛋白含量为280μg/mL。
由此可见，通过本申请的方法对口蹄疫抗原进行纯化后损失更小。
本申请通过PEG抓取抗原，使其与助滤剂结合，在滤片过滤助滤剂替代离心步骤，直接降低生产成本，提高纯化效率。
以上所述实施例仅是为充分说明发明而所举的较佳的实施例，发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在发明基础上所作的等同替代或变换，均在发明的保护范围之内。发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.一种口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将聚乙二醇与灭活抗原液混合，向上述处理过的灭活抗原液中添加助滤剂，形成混合液；
S2、对上述混合液进行初滤，收集固体滤物，所述固体滤物包括助滤剂以及粘合在助滤剂上的抗原；
S3、使用PBS缓冲溶液对上述固体滤物进行洗脱，使抗原与所述助滤剂分离；
S4、二次过滤，滤除助滤剂，收集含有抗原的滤液，得到灭活抗原纯化液。
2.如权利要求1所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S4之后还包括步骤：
S5、对步骤S4中的滤液除菌，得到无菌灭活抗原纯化液。
3.如权利要求2所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S5中采用过滤除菌，其中过滤孔径为0.1-0.2μm。
4.如权利要求1所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中，聚乙二醇为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中处理过的灭活抗原液中聚二醇的浓度为7-20％W/V。
6.如权利要求1所述的一种口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中初滤采用孔径为0.1μm-0.65μm或截留分子量为100KD-700KD的滤片。
7.如权利要求1所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S5中二次过滤采用孔径为0.1μm-0.65μm或截留分子量为100KD-700KD的滤片。
8.如权利要求1所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中助滤剂的添加量为30-50g。
9.如权利要求1所述的口蹄疫抗原纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中的PBS缓冲溶液的pH值为7.6±0.5。
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