CN111172121A - 一种塞内卡病毒的纯化浓缩方法 - Google Patents

一种塞内卡病毒的纯化浓缩方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种塞内卡病毒的浓缩方法，包括塞内卡病毒液预处理，及预处理后的浓缩；所述浓缩依次经过过滤浓缩、洗滤、过滤浓缩。本发明涉及一种可适用于大规模工业化生产的SVV抗原浓缩纯化方法。该方法采用切向流过滤及洗滤相结合的方式对SVV抗原进行浓缩纯化，具有操作方便，易于放大，过程温和、稳定，抗原回收率高等特点。该方法可用于活病毒和灭活病毒的浓缩纯化，抗原回收率>80％，蛋白去除率>90％，可制备出纯化SVV抗原或为后续抗原进一步精细纯化提供原料。

Description

一种塞内卡病毒的纯化浓缩方法
技术领域
本发明涉及制备病毒疫苗的技术领域，特别是涉及一种塞内卡病毒的纯化浓缩方法。
背景技术
塞内卡病毒(Seneca Valley virus，SVV)，又叫做Seneca virus A(SVA)，是无囊膜的单股正链RNA病毒，是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Sene-cavirus)的唯一成员，是近年来新发现的一种能引起猪水泡样症状的病毒，被认为是引起猪原发性水疱病(PIVD)的主要原因。该病毒感染动物(尤其是猪)后,可引起繁殖母猪和公猪的鼻吻、冠状带和蹄部出现水疱性病变，偶见腹泻症状，成年猪感染通常呈亚临床感染。更可怕的是，该病毒会引起新生仔猪的死亡，1-3日龄新生仔猪病死率可达30％-70％。猪被该病毒感染后，在临床上其发病症状与口蹄疫、猪水疱病和猪水泡性口炎很难区分，往往会因诊断不及时而耽误治疗。
自20世纪80年代后期以来，美国猪群中便存在SVV。自2002年确定SVV病毒存在至2015年初，SVV感染的猪病例只有在美国和加拿大零星发生。但自2015年下半年后，在巴西、美国、加拿大、中国、哥伦比亚等多国相继发生了SVV感染的疫情，并且呈蔓延之势。截至2015年9月底,美国已有11个州确诊猪SVV感染病例,加拿大、意大利和巴西出现疑似SVV感染病例。
猪SVV作为近两年在全球多地出现的一种跨境动物疾病病毒，已经对多国养殖业造成了不同程度的影响。特别是随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，猪塞内卡病毒感染和流行日趋严重。我国作为养猪大国，生猪养殖总量约为全球50％，因此，有必要对SVV流行态势密切关注并尽快建立全方位的应对措施。目前，我国对SVV的报道并不多，大多养殖户对该病没有引起足够的重视，目前尚无针对猪塞内卡病毒感染的有效治疗药物及疫苗，主要依靠隔离感染猪群、淘汰隐性感染动物控制猪塞内卡病毒的蔓延。但该病已经形成全球蔓延的趋势，一旦大规模爆发，势必会造不可估量的经济损失。
因此，研制该病毒的疫苗是预防该病毒大规模蔓延的最主要途径之一。为获得高抗原含量的疫苗，从而发挥更强的预防功效，病毒疫苗的制备过程中关键环节之一为病毒的纯化和浓缩，因此，需要寻找一种有效的方法对塞内卡病毒进行纯化和浓缩。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种快速提纯及浓缩塞内卡病毒的方法，包括塞内卡病毒液预处理，及预处理后的浓缩；所述浓缩依次经过病毒液过滤浓缩、洗滤、残留病毒液过滤浓缩。
所述塞内卡病毒液预处理是将塞内卡病毒液(弱毒或强毒)在10000-12000rpm/min下离心20-30min，上清即为病毒液。
所述塞内卡病毒液预处理是将塞内卡病毒液(弱毒或强毒)经筒式过滤器或深层滤膜(0.2μm≤滤膜孔径≤0.65μm)过滤澄清，得到的滤出液即为病毒液。
所述浓缩是按所需浓缩倍数将预处理后的病毒液用中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统进行切向流过滤浓缩，使用PBS溶液进行洗滤，使用PBS溶液流经所述系统收集残留病毒液，从所述系统透过端合并收集的病毒液即为塞内卡病毒浓缩液。
所述系统孔径为400-750Kd。
所述系统的透过端流速为2-4L/min。
所述系统的进口压力≤0.1MPa，跨膜压差≤0.1MPa。
洗滤过程中PBS溶液的浓度为40mmol/L，pH＝7.5-7.6，流速为2-4L/min。
浓缩倍数为10倍以上，单次处理塞内卡病毒液100L以上，优选200L-600L。
所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在使用前包括除菌平衡、完整性检测；
优选的，所述除菌平衡是用NaOH溶液循环清洗中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统30-60min，清洗后将中空纤维或超滤膜包在NaOH溶液中浸泡过夜，完成除菌平衡；
优选的，所述完整性检测是先将除菌平衡后的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统用纯化水清洗至洗出液的pH值≤7.0，再向所述系统施加0.08-0.1MPa压力的洁净压缩空气，若1min内无持续气泡逸出，说明完整性合格，备用；最后用PBS溶液(pH＝7.5-7.6)清洗完整性合格的所述系统至洗出液的pH值≤7.5，备用；
优选的，所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在使用之后包括原位消毒，具体为：用0.5mol/L的NaOH溶液循环清洗所述系统30min，清洗后将中空纤维或超滤膜包在NaOH溶液中浸泡保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明涉及一种可适用于大规模工业化生产的SVV抗原纯化浓缩方法。该方法采用切向流过滤及洗滤相结合的方式对SVV抗原进行纯化浓缩，具有操作方便，易于放大，过程温和、稳定，抗原回收率高等特点。该方法可用于活病毒和灭活病毒的纯化浓缩，浓缩倍数可达10倍以上，抗原回收率>80％，蛋白去除率>90％，可制备出纯化SVV抗原或为后续抗原进一步精细纯化提供原料。
具体实施方式
目前一般病毒的浓缩纯化方法主要有蔗糖或氯化铯密度梯度离心法、聚乙二醇(PEG)沉淀法等。以上方法耗时长，使用的部分试剂对环境有污染，且处理过程中病毒的完整性易遭到破坏，使得抗原回收率低(一般为50-60％)，不宜进行工业化生产。
本发明提供了一种塞内卡病毒的浓缩方法，该方法采用切向流膜过滤技术，过滤作用温和，剪切力小，极大程度地保留了病毒的完整性，使得抗原回收率高，能够大规模应用于塞内卡病毒抗原的制备，具体包括以下步骤：
(1)除菌及平衡
用NaOH溶液循环清洗中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统30-60min，清洗后中空纤维或超滤膜包在NaOH溶液中浸泡过夜除菌。
(2)完整性检测
将步骤(1)浸泡在NaOH溶液中的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统取出，用纯化水清洗，待洗出液的pH值≤7.0时，向中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统施加0.08-0.1MPa压力的洁净压缩空气进行检漏，若1min内无持续气泡逸出则为合格，备用；否则为不合格，取下不合格的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统并更换新的系统重复上述步骤，直至合格为止。
用PBS(pH＝7.5-7.6)溶液清洗检漏合格的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统，待洗出液的pH值≤7.5时，结束清洗待用。
(3)塞内卡病毒液预处理
方式1：取塞内卡病毒液(弱毒或强毒)，通过连续流离心机或间歇式高速离心机10000-12000rpm/min离心20-30min，弃去沉淀，取上清(即病毒清液)备用。
方式2：取塞内卡病毒液(弱毒或强毒)，使用筒式过滤器或深层滤膜(0.2μm≤滤膜孔径≤0.65μm)进行过滤澄清，取滤出液(即病毒清液)备用。
(4)预处理后的塞内卡病毒液的浓缩
将步骤(3)得到的预处理后的病毒液(即病毒清液)通过步骤(2)进行完整性检测的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统进行切向流过滤浓缩，系统置于浓缩罐内，孔径为400-750Kd，进口压力≤0.1MPa，透过端流速为2-4L/min，跨膜压差≤0.1MPa；当浓缩罐内浓缩液的浓缩倍数达到5倍及以上时，使用40mmol/L的PBS溶液(PH＝7.5-7.6)，以2-4L/min的流速连续流对中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统进行洗滤，当浓缩罐内液体体积至洗滤前病毒液体积的3-5倍时，停止洗滤。洗滤结束后，用40mmol/L的PBS溶液(pH＝7.5-7.6)流经中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统将其中残留的病毒液收集起来，至浓缩罐中液体体积满足所需的浓缩倍数，得到塞内卡病毒浓缩液。
为了多次利用中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统，本发明方法还可包括：
步骤(5)中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统的原位消毒
浓缩结束后，使用0.5mol/L的NaOH溶液循环清洗中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统30min，清洗后将中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在NaOH溶液浸泡保存待用。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1：A型塞内卡病毒液的纯化浓缩
(1)除菌及平衡
用0.5mol/L的NaOH溶液100L循环清洗中空纤维浓缩系统30-60min，清洗后在0.5mol/L的NaOH溶液中浸泡过夜。
(2)完整性检测
用纯化水清洗中空纤维浓缩系统，待洗出液的pH值≤7.0时，向中空纤维浓缩系统施加洁净压缩空气至0.10MPa压力进行检漏，1min内无持续气泡逸出为合格，用40mmol/L的PBS(pH＝7.5-7.6)溶液100L清洗完整性检测合格的中空纤维浓缩系统，待洗出液的pH值≤7.5时，结束清洗待用。
(3)塞内卡病毒液预处理
取塞内卡病毒液(强毒)，通过间歇式高速离心机12000rpm/min离心20min，弃去沉淀，取上清备用。
(4)浓缩(以10倍浓缩为例)
将离心后病毒上清液400L通过750Kd中空纤维浓缩系统进行切向流过滤浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到5倍时，使用40mmol/L的PBS溶液(pH＝7.5-7.6)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为2000L PBS溶液。洗滤结束后，继续按上述条件过滤浓缩至30L，使用40mmol/L的PBS溶液(PH＝7.5-7.6)，流经中空纤维浓缩系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积40L，得到塞内卡病毒浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的浓缩液进行检测，结果见表1。
表1浓缩前后检测结果
Figure BDA0001863437290000051
表1的结果表明，用本发明方法对塞内卡灭活毒液进行纯化浓缩，抗原回收率能达到100％，蛋白去除率能达到91％以上，不仅可以提高生产效率，还可降低生产成本。
实施例2：A型塞内卡灭活毒液的纯化浓缩
(1)塞内卡病毒的灭活
按照病毒液体积的0.25‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活。
(2)除菌及平衡
用0.5mol/L的NaOH溶液100L循环清洗超滤膜包系统，30-60min，清洗后用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡过夜。用40mmol/L的PBS(PH＝7.5-7.6)溶液100L清洗超滤膜包系统，待洗出液的pH值≤7.5时，结束清洗。
(3)塞内卡病毒液预处理
取步骤(1)灭活后的塞内卡病毒液(弱毒)，使用筒式过滤器(0.2μm≤滤膜孔径≤0.65μm)进行过滤澄清，取滤出液备用。
(4)浓缩
将步骤(3)预处理后的病毒上清液(即滤出液)400L通过300-750Kd超滤膜包系统进行切向流过滤浓缩，控制进口压力≤0.1MPa，控制透过端流速为1L/min，跨膜压差≤0.1MPa，浓缩倍数达到5倍时，使用40mmol/L的PBS溶液(PH＝7.5-7.6)，以1L/min的流速连续流加至浓缩罐内进行洗滤，洗滤体积为2000L PBS溶液。洗滤结束后，继续按上述条件过滤浓缩至30L，使用40mmol/L的PBS溶液(PH＝7.5-7.6)，流经超滤膜包系统至浓缩罐内达到最终浓缩体积40L，得到塞内卡病毒浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的浓缩液进行检测，结果见表2。
(5)超滤膜包系统的原位消毒
使用0.5mol/L的NaOH溶液循环清洗超滤膜包系统30min，然后用NaOH溶液浸泡保存待用。
表2浓缩前后检测结果
Figure BDA0001863437290000061
表2的结果表明，用本发明方法对塞内卡灭活毒液进行纯化浓缩，抗原回收率能达到85％以上，蛋白去除率能达到90％以上，不仅可以提高生产效率，还可降低生产成本。
比较例1：A型塞内卡灭活毒液的密度梯度离心法纯化浓缩
(1)塞内卡病毒的灭活
按照病毒液体积的0.25‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活。
(2)取24ml病毒灭活液，4℃,5000rpm/min离心30min,取上清；向超速离心管中依次加入60％、45％、35％蔗糖溶液形成密度梯度；向铺好蔗糖密度梯度的超速离心管中加入2ml灭活病毒离心后上清；30000rpm/min,离心3.5小时；用长针头吸取蔗糖密度为45％与60％之间明亮的区带，得到塞内卡病毒浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的浓缩液进行检测，结果见表3。
表3浓缩前后检测结果
Figure BDA0001863437290000062
表3的结果表明，用密度梯度离心法对塞内卡灭活毒液进行纯化浓缩，抗原回收率太低，降低生产效率，增加生产成本。
比较例2：A型塞内卡灭活毒液的聚乙二醇(PEG)沉淀法纯化浓缩
(1)塞内卡病毒的灭活
按照病毒液体积的0.25‰加入β-丙内酯，4℃孵育24h，37℃水解2h，进行病毒灭活。
(2)取灭活抗原液500ml,4℃,5000rpm/min离心30min,取上清。向离心上清液中加入终浓度为6％(w/v)PEG 8000,4℃,搅拌1h,8000rpm/min,离心30min,弃掉上清液，用冰冷的40mmol/LPBS溶液(PH＝7.5-7.6)将沉淀重悬至终体积50ml，得到塞内卡病毒灭活浓缩液。对浓缩前的病毒液和浓缩后的浓缩液进行检测，结果见表4。
表4浓缩前后检测结果
Figure BDA0001863437290000071
表4的结果表明，用聚乙二醇沉淀法对塞内卡灭活毒液进行纯化浓缩，抗原回收率太低，降低生产效率，增加生产成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (10)

1.一种塞内卡病毒的纯化浓缩方法，其特征在于，包括塞内卡病毒液预处理，及预处理后的浓缩；所述浓缩依次经过病毒液过滤浓缩、洗滤、残留病毒液过滤浓缩。
2.根据权利要求1所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述塞内卡病毒液预处理是将塞内卡病毒液(弱毒或强毒)在10000-12000rpm/min下离心20-30min，上清即为病毒液。
3.根据权利要求1所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述塞内卡病毒液预处理是将塞内卡病毒液(弱毒或强毒)经筒式过滤器或深层滤膜(0.2μm≤滤膜孔径≤0.65μm)过滤澄清，得到的滤出液即为病毒液。
4.根据权利要求2或3所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述浓缩是按所需浓缩倍数将预处理后的病毒液用中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统进行切向流过滤浓缩，使用PBS溶液进行洗滤，使用PBS溶液流经所述系统收集残留病毒液，从所述系统透过端合并收集的病毒液即为塞内卡病毒浓缩液。
5.根据权利要求4所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述系统孔径为400-750Kd。
6.根据权利要求4或5所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述系统的透过端流速为2-4L/min。
7.根据权利要求4-6任一所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述系统的进口压力≤0.1MPa，跨膜压差≤0.1MPa。
8.根据权利要求4-7任一所述纯化浓缩方法，其特征在于，洗滤过程中PBS溶液的浓度为40mmol/L，pH＝7.5-7.6，流速为2-4L/min。
9.根据权利要求1-8任一所述纯化浓缩方法，其特征在于，浓缩倍数为10倍以上，单次处理塞内卡病毒液100L以上，优选200L-600L。
10.根据权利要求1-9任一所述纯化浓缩方法，其特征在于，所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在使用前包括除菌平衡、完整性检测；
优选的，所述除菌平衡是用NaOH溶液循环清洗中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统30-60min，清洗后将中空纤维或超滤膜包在NaOH溶液中浸泡过夜，完成除菌平衡；
优选的，所述完整性检测是先将除菌平衡后的中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统用纯化水清洗至洗出液的pH值≤7.0，再向所述系统施加0.08-0.1MPa压力的洁净压缩空气，若1min内无持续气泡逸出，说明完整性合格，备用；最后用PBS溶液(pH＝7.5-7.6)清洗完整性合格的所述系统至洗出液的pH值≤7.5，备用；
优选的，所述中空纤维浓缩系统或超滤膜包系统在使用之后包括原位消毒，具体为：用0.5mol/L的NaOH溶液循环清洗所述系统30min，清洗后将中空纤维或超滤膜包在NaOH溶液中浸泡保存。
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